Title:
Aufreinigung von Epidaunorubicin
Kind Code:
A1
Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von Epidaunorubicin, insbesondere die Abtrennung der Verunreinigung epi-Feudomycin wie es bei der biotechnologischen Herstellung von Epidaunorubicin als Nebenprodukt auftritt.



Inventors:
Bindernagel, Holger (63571, Gelnhausen, DE)
Kunnari, Tero, Dr. (63739, Aschaffenburg, DE)
Application Number:
DE102014208194A
Publication Date:
11/05/2015
Filing Date:
04/30/2014
Assignee:
Heraeus Deutschland GmbH & Co. KG, 63450 (DE)
International Classes:
Foreign References:
EP19904052008-11-12
EP23019432014-01-08
EP00302951983-05-25
WO2010028667A12010-03-18
EP20426082010-02-03
Other References:
Li, Wei-ping [et al.]: Study on the separation and purification of 4'-epi-daunorubicin produced by gene engineering strain SIPI-A0707. In: Zhong guo kang sheng su za zhi : shuang yue kan = Chinese journal of antibiotics, Vol. 36, 2011, No. 11, S. 839-843. - ISSN 1001-8689
Attorney, Agent or Firm:
Brand, Normen, Dipl.-Chem. Univ. Dr. rer. nat., 63450, Hanau, DE
Claims:
1. Verfahren zur Aufreinigung von Epidaunorubicin umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer Mischung enthaltend Epidaunorubicin, epi-Feudomycin und wenigstens ein halogenhaltiges L?sungsmittel;
b) Einstellen des pH-Wertes der Mischung auf einen Bereich von 5,0 bis 7,5;
c) Erw?rmen der Mischung aus Schritt b) auf ?ber 25 ?C; und
d) Aufreinigen des Epidaunorubicins,
dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen an der Mischung in den Schritten a) und b) maximal 5 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt.

2. Verfahren gem?? Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an Wasser an der Mischung in Schritt a) maximal 1 Vol-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt.

3. Verfahren gem?? Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Butanol, Isopropanol, Ethanol, Propanol, Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2,2-Dimethylpropanol und Isobutanol.

4. Verfahren gem?? einem oder mehrerer der Anspr?che 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Epidaunorubicins in Schritt a) 6 bis 13 g/L, vorzugsweise 8 bis 13 g/L betr?gt.

5. Verfahren gem?? einem oder mehrerer der Anspr?che 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das halogenhaltige L?sungsmittel ausgew?hlt ist aus der Gruppe der chlorierten L?sungsmittel, insbesondere Chloroform (CHCl3).

6. Verfahren gem?? einem oder mehrerer der Anspr?che 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellen des pH-Wertes in Schritt b) mit Hilfe einer oder mehrerer S?uren, vorzugsweise einer organischen S?ure, besonders bevorzugt Essigs?ure, erfolgt.

7. Verfahren gem?? Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der S?ure 0,1 bis 0,3 Vol-%, vorzugsweise 0,15 bis 0,25 Vol-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt.

8. Verfahren gem?? einem oder mehrerer der Anspr?che 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung in Schritt c) auf eine Temperatur in einem Bereich von 55 bis 75 ?C, vorzugsweise 60 bis 65 ?C, erw?rmt wird.

9. Verfahren gem?? einem oder mehrerer der Anspr?che 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung in Schritt c) f?r einen Zeitraum von maximal 48 Stunden, vorzugsweise f?r einen Zeitraum von 10 bis 30 Stunden, besonders bevorzugt 15 bis 25 Stunden, ger?hrt wird.

10. Verfahren gem?? einem oder mehrerer der Anspr?che 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufreinigen des Epidaunorubicins in Schritt d) mittels w?ssriger Extraktion erfolgt.

11. Verfahren gem?? Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass w?ssrige Extraktion des Epidaunorubicins in Schritt d) bei einem pH-Wert von 8 bis 10, vorzugsweise 8,5 bis 9,5, erfolgt.

12. Verfahren gem?? einem oder mehrerer der Anspr?che 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sich Schritt d) ein weiterer Schritt e) anschlie?t, wobei es sich bei Schritt e) um eine chromatographische Reinigung des Epidaunorubicin handelt.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von Epidaunorubicin, insbesondere die Trennung von Epidaunorubicin und epi-Feudomycin, wie es bei der biotechnologischen Herstellung von Epidaunorubicin als Nebenprodukt auftritt.

Epidaunorubicin ist ein 4'-Epimer des Daunorubicins, das zur Gruppe der Glycoside geh?rt und ein Antibiotikum aus der Gruppe der Anthracycline darstellt. Es dient haupts?chlich als Vorstufe f?r Epirubicin, das als Zytostatikum bei der Chemotherapie von Brustkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen, Sarkomen, Magenkarzinomen und anderen soliden Krebsarten eingesetzt wird. Epidaunorubicin kann synthetisch, semisynthetisch und biotechnologisch hergestellt werden. Biotechnologisch wird es mit Hilfe verschiedener Streptomyces peucetius-St?mme hergestellt. Epidaunorubicin kann durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt werden:

Bei der mikrobiellen Synthese des Epidaunorubicins ergibt sich das Problem, dass neben dem gew?nschten Produkt unter anderem epi-Feudomycin als Nebenprodukt gebildet wird, das sich aufgrund der strukturellen ?hnlichkeit nur schwer vom Epidaunorubicin abtrennen l?sst. Die Anwesenheit des Nebenproduktes wirkt sich nachteilig auf die Ausbeute und den Reinheitsgrad des in einem weiteren Verfahrensschritt aus dem Epidaunorubicin gebildeten Epirubicins aus. ?blicherweise erfolgt die Abtrennung und Reinigung des Epidaunorubicin aus der Fermentationsbr?he mittels fl?ssig-fl?ssig-Extraktion, Chromatographie und Kristallisation. Dies ist allerdings aufgrund der Anwesenheit des epi-Feudomycins mit einem hohen Aufwand und einem verh?ltnism??ig gro?en Verlust an Epidaunorubicin verbunden.

EP 1 990 405 A1 beschreibt verschiedene mikrobielle St?mme, die f?r die biotechnische Herstellung von Epidaunorubicin geeignet sind. Die Abtrennung des Epidaunorubicins aus der Fermentationsbr?he erfolgt durch Extraktion mit Chloroform bei einem alkalischen pH-Wert. Die erhaltene Rohmischung wird anschlie?end mit Chloroform als mobile Phase chromatographisch weiter aufgereinigt. In einem letzten Schritt wird das Epidaunorubicin durch Zugabe von Butanol und Einstellen eines sauren pH-Wertes auskristallisiert.

EP 2 301 943 B1 beschreibt die Kristallisation vom Epidaunorubicin in Form seines Hydrochloridsalzes aus einem Alkohol/Chloroform-Gemisch, wobei die Zugabe des Alkohols bei 60 ?C erfolgt.

EP 0 030 295 B1 offenbart die synthetische Herstellung von Epidaunorubicin.

WO 2010/028667 beschreibt die Gewinnung von 13-DHED, Epidaunorubicin und epi-Feudomycin aus einer Fermentationsbr?he mit Hilfe eines Austauscherharzes.

EP 2 042 608 B1 beschreibt die Extraktion von Aglyconen aus einer Fermentationsbr?he enthaltend 13-DHED, Epidaunorubicin und Feudomycin. Dabei werden die Glycoside mittels Chloroform aus der w?ssrigen Phase bei einem leicht-basischen pH-Wert extrahiert. Der pH-Wert wird dabei mit Hilfe von ges?ttigter NaHCO3-L?sung stabil gehalten.

Die ?blichen Verfahren zur Aufreinigung von Epidaunorubicin aus der Fermenationsbr?he sind mit einem hohen technischen und finanziellen Aufwand verbunden. Insbesondere die Separation von Epidaunorubicin und epi-Feudomycin gestaltet sich aufgrund der strukturellen ?hnlichkeit der beiden Verbindungen als sehr schwierig, so dass ein annehmbarer Reinheitsgrad des Epidaunorubicin nur in Verbindung mit einem erheblichen Ausbeuteverlust erreicht werden kann. Bedingt durch die schwierige Abtrennung des epi-Feudomycins findet sich diese Verunreinigung auch in den Folgeprodukten des Epidaunorubicins, was sich insbesondere st?rend auf die Umsetzung zu Epirubicin auswirkt. Andererseits sind gerade ein hoher Reinheitsgrad und eine hohe Ausbeute entscheidend f?r die weitere Umsetzung von Epidaunorubicin zu Epirubucin. Es besteht daher Bedarf an einem Verfahren, das eine effektive Trennung des Nebenproduktes epi-Feudomycin von dem gew?nschten Produkt Epidaunorubicin erlaubt, ohne dass die Ausbeute an Epidaunorubicin durch die Trenn- und Reinigungsschritte signifikant erniedrigt wird.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das eine effektive Trennung von Epidaunorubicin und epi-Feudomycin nach der mikrobiellen Herstellung erlaubt, wobei die Ausbeute an gereinigtem Epidaunorubicin gegen?ber den im Stand der Technik ?blichen Verfahren gesteigert ist.

Die Aufgabe wird durch den Gegenstand des unabh?ngigen Anspruchs gel?st. Bevorzugte Ausf?hrungsformen sind in den abh?ngigen Anspr?chen beschrieben.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Aufreinigung von Epidaunorubicin umfassend die folgenden Schritte:

  • a) Bereitstellen einer Mischung enthaltend Epidaunorubicin, epi-Feudomycin und wenigstens ein halogenhaltiges L?sungsmittel;
  • b) Einstellen des pH-Wertes der Mischung auf einen Bereich von 5,0 bis 7,5;
  • c) Erw?rmen der Mischung aus Schritt b) auf ?ber 25 ?C; und
  • d) Aufreinigen des Epidaunorubicins,

dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil an Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen an der Mischung in den Schritten a) und b) maximal 5 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt.

Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, dass es unter den Bedingungen des erfindungsgem??en Verfahrens zu einer selektiven Zersetzung des epi-Feudomycins kommt, dessen Zersetzungsprodukte sich jedoch einfacher von dem gew?nschten Epidaunorubicin abtrennen lassen. Es wird vermutet, dass es beim erfindungsgem??en Verfahren ferner zu einer Umwandlung der Reaktionsmischung und dadurch bedingt zu einer Verringerung des epi-Feudomycins kommt. Massenspektrometrische Untersuchungen legen nahe, dass der Zucker abgespalten und der verbleibende Ring aromatisiert wird. Es wird weiterhin angenommen, dass es sich dabei um eine spezifische Zersetzung des epi-Feudomycins handelt, da Abbauprodukte von Epidaunorubicin nicht detektiert werden konnten. Insofern unterscheidet sich die im erfindungsgem??en Verfahren erfolgende Zersetzung von der herk?mmlichen sauren Hydrolyse der Anthrazycline, von der auch Epidaunorubicin betroffen w?re.

Das erfindungsgem??e Verfahren geht von Epidaunorubicin als Ausgangsmaterial aus, das in verschiedenen Schritten aufgereinigt wird. Dabei sind Herkunft und Herstellungsart des Epidaunorubicins nicht weiter eingeschr?nkt. So kann beispielsweise kommerziell erh?ltliches Epidaunorubicin eingesetzt werden, das einen Anteil an epi-Feudomycin enth?lt, der es f?r weitere Anwendungen ungeeignet macht.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Aufreinigungsverfahrens wird das Epidaunorubicin der Mischung in Schritt a) mittels biotechnologischer Methoden, beispielsweise durch geeignete Mikroorganismen, gewonnen. Dabei liegt das Epidaunorubicin vorzugsweise zusammen mit epi-Feudomycin in der Fermentationsbr?he vor. Geeignete Mikroorganismen sind beispielsweise Bakterien aus der Gruppe der Actinobacteria, vor allem St?mme aus der Gruppe der Streptomyces sp., beispielsweise S. peucetius, S. coeruloruidus, S. griseus, Streptomyces sp. C5, S. peicetius var. caesius und S. bifurcus. Ebenso k?nnen modifizierte St?mme oder Mutanten verwendet werden.

Vorzugsweise werden das Epidaunorubicin und das epi-Feudomycin der Mischung in Schritt a) des erfindungsgem??en Verfahrens durch Extraktion aus der Fermentationsbr?he gewonnen. Die Extraktion kann dabei mehrere Schritte umfassen, beispielsweise die Extraktion mittels eines geeigneten Polymerharzes gefolgt von einer Fl?ssigextraktion. Die Mischung a) wird vorzugsweise aus dem eingeengten Konzentrat der Fl?ssigextraktion der Fermentationsbr?he und gegebenenfalls durch Zugabe des halogenhaltigen L?sungsmittels gewonnen.

In einer besonders bevorzugten Ausf?hrungsform weist die Ausgangsmischung in Schritt a) einen basischen pH-Wert, besonders bevorzugt einen pH-Wert in einem Bereich von 8 bis 10,5 auf.

Das Epidaunorubicin liegt in der Mischung a) in gel?ster Form in Gegenwart wenigstens eines halogenhaltigen L?sungsmittels vor. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform ist das halogenhaltige L?sungsmittel ausgew?hlt aus der Gruppe der chlorierten L?sungsmittel, insbesondere Chloroform (CHCl3).

Der Gehalt an Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in der Mischung der Schritte a) und b) des erfindungsgem??en Verfahrens betr?gt maximal 5 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung. Es hat sich ?berraschend gezeigt, dass ein h?herer Gehalt an Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen zu einer verringerten Reaktionsgeschwindigkeit f?hrt, was sich wiederum negativ auf den Reinheitsgrad des Epidaunorubicins auswirkt.

Daher ist eine Ausf?hrungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt, in der der Anteil an Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in der Mischung der Schritte a) und b) maximal 4 Vol.-% betr?gt, besonders bevorzugt 0,1 bis 4 Vol.-%, im Speziellen 1,0 bis 3 Vol.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung. Ein Alkoholgehalt im angegebenen, erfindungsgem??en Bereich stellt sicher, dass das Epidaunorubicin vollst?ndig in L?sung bleibt und die Reaktion in einem zufriedenstellenden Zeitrahmen abl?uft.

Weiterhin bevorzugt ist eine Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens, bei der der Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Butanol, Propanol, Ethanol, Isopropanol, Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2,2-Dimethylpropanol und Isobutanol. Im Speziellen ist eine Ausf?hrungsform bevorzugt, in der der Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen Methanol ist.

Weiterhin bevorzugt ist eine Ausf?hrungsform, in der der Anteil an Wasser an der Mischung in Schritt a) maximal 1 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt.

Es wurde weiterhin ?berraschend gefunden, dass das durch das erfindungsgem??e Verfahren gewonnene Epidaunorubicin einen besonders hohen Reinheitsgrad aufweist, wenn die Konzentration des Epidaunorubicin in der Mischung von Schritt a) nicht mehr als 13 g/L betr?gt.

Daher ist eine Ausf?hrungsform bevorzugt, bei der die Konzentration des Epidaunorubicins in der Mischung in Schritt a) maximal 13 g/L, bevorzugt 6 bis 13 g/L, insbesondere 8 bis 13 g/L betr?gt. Es hat sich gezeigt, dass sich unerw?nschte Nebenreaktionen und St?rungen der Reaktion vermeiden lassen, wenn die Konzentration des Epidaunorubicins in der Mischung in Schritt a) in dem angegeben Bereich liegt. So konnte beispielsweise die Gefahr eines Ausfallens des Epidaunorubicins reduziert werden. Ein Ausfallen des Epidaunorubicins f?hrt zu einem unerw?nschten Ausbeuteverlust, da das ausgefallene Epidaunorubicin dem Reinigungsprozess entzogen wird. Dar?ber hinaus wurde beobachtet, dass zusammen mit dem Epidaunorubicin auch die abzutrennende Verunreinigung epi-Feudomycin ausf?llt, so dass das Ausf?llen keine geeignete Aufreinigungsmethode darstellt.

Gem?? Schritt b) des erfindungsgem??en Verfahrens zur Aufreinigung von Epidaunorubicin wird der pH-Wert der Mischung auf einen Bereich von 5,0 bis 7,5 eingestellt. Es hat sich ?berraschend gezeigt, dass es zu einer Zersetzung des Epidaunorubicins kommt, wenn der pH-Wert oberhalb des erfindungsgem??en Bereichs liegt. Wird der pH-Wert zu sauer, also auf einen Wert von unter 5 eingestellt, kommt es zu einer unerw?nschten teilweisen Protonierung des Epidaunorubicins, was dazu f?hrt, dass das Epidaunorubicin zusammen mit dem Feudomycin ausf?llt und dem weiteren Prozessablauf entzogen wird.

Vorzugsweise erfolgt das Einstellen des pH-Werts der Mischung auf einen Bereich von 5,0 bis 7,5 mit Hilfe einer S?ure, die ?ber einen geeigneten pKa-Wert und gleichzeitig ?ber eine gute L?slichkeit in dem halogenhaltigen L?sungsmittel, insbesondere Chloroform, verf?gt. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens erfolgt das Einstellen des pH-Wertes der Mischung in Schritt b) mit Hilfe einer oder mehrerer S?uren, vorzugsweise einer organischen S?ure, besonders bevorzugt Essigs?ure.

Weiterhin bevorzugt ist eine Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens, in der die Menge der S?ure 0,05 bis 0,3 Vol-%, vorzugsweise 0,1 bis 0,25 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt. Nach Zugabe der S?ure konnte eine deutliche Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet werden. Liegt der S?uregehalt dagegen oberhalb von 0,3 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, kann es zu L?slichkeitsproblemen kommen, die dazu f?hren, dass das Epidaunorubicin und das epi-Feudomycin aus der L?sung ausfallen und so dem weiteren Prozessvorgang entzogen werden.

In einer besonders bevorzugten Ausf?hrungsform wird die S?ure, die zum Einstellen des pH-Wertes der Mischung verwendet wird, vor der Zugabe in einem Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen gel?st, vorzugsweise Methanol. Wie sich ?berraschend gezeigt hat, kann auf diese Weise Problemen betreffend die L?slichkeit des Epidaunorubicins vorgebeugt und ein Ausfallen des Epidaunorubicins verhindert werden. Dabei sollte der Gesamtgehalt an Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methanol, in der Mischung den erfindungsgem??en Wert von 5 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, nicht ?bersteigen.

Gem?? Schritt c) des erfindungsgem??en Verfahrens zur Aufreinigung von Epidaunorubicin wird die Mischung aus Schritt b), nach Einstellen des pH-Wertes auf den erfindungsgem??en Bereich, auf ?ber 25 ?C erw?rmt. Es wurde ?berraschend gefunden, dass sich die Aufreinigung beschleunigen l?sst, wenn die Mischung auf eine Temperatur oberhalb von 25 ?C erw?rmt wird. Vorzugsweise erfolgt eine Erw?rmung der Mischung auf eine Temperatur, die dem Siedepunkt des halogenhaltigen L?sungsmittels entspricht. Als besonders geeignet haben sich dabei Temperaturen von oberhalb von 50 ?C erwiesen, da ab dieser Temperatur eine deutliche Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet werden konnte.

Daher ist eine Ausf?hrungsform bevorzugt, in der die Mischung in Schritt c) auf eine Temperatur in einem Bereich von 55 bis 75 ?C, vorzugsweise 60 bis 65 ?C, erw?rmt wird.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform wird die Mischung in dem erfindungsgem??en Verfahren f?r einen bestimmten Zeitraum bei einer Temperatur von ?ber 25 ?C, vorzugsweise bei einer Temperatur oberhalb von 35 ?C, im Speziellen in einem Bereich von 60 bis 65 ?C, ger?hrt. Dabei sollte die Zeitspanne in einem Rahmen liegen, der eine effiziente und zeitoptimierte Durchf?hrung des erfindungsgem??en Verfahrens erlaubt, wobei gleichzeitig ein befriedigender Reinheitsgrad des Epidaunorubicins erzielt wird.

Folglich ist eine Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens bevorzugt, in der die Mischung in Schritt c) f?r einen Zeitraum von maximal 48 Stunden, vorzugsweise f?r einen Zeitraum von 10 bis 30 Stunden, besonders bevorzugt 15 bis 25 Stunden, ger?hrt wird. Eine Reaktionsdauer von mehr als 48 Stunden hat sich aus prozesstechnischer Sicht als nachteilig erwiesen, w?hrend bei einer Reaktionsdauer von weniger als 10 Stunden, die Abnahme des Anteils an epi-Feudomycin an der Mischung als nicht ausreichend beurteilt wurde. Besonders bevorzugt ist eine Ausf?hrungsform, in der die Mischung in Schritt c) solange ger?hrt wird, bis der Gesamtgehalt an epi-Feudomycin weniger als 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Epidaunorubicins, betr?gt, sofern eine Reaktionsdauer von 48 Stunden nicht ?berschritten wird. Die Menge an epi-Feudomycin in der Mischung kann dabei beispielsweise mittels standardisierten Chromatographieverfahren, wie RP-18 HPLC, bestimmt werden.

Wie in Schritt d) des erfindungsgem??en Verfahrens beschrieben, wird das Epidaunorubicin aufgereinigt. Diese Aufreinigung erfolgt vorzugsweise zu einem Zeitpunkt, an dem der Gesamtgehalt an epi-Feudomycin unterhalb eines Grenzwertes von 1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Epidaunorubicins, bestimmt mittels analytischer Chromatographie, abgesunken ist. Weiter bevorzugt erfolgt die Aufreinigung des Epidaunorubicins in Schritt d) mittels w?ssriger Extraktion.

W?hrend der Aufreinigung des Epidaunorubicins in Schritt d) hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die w?ssrige Extraktion des Epidaunorubicins in Schritt d) im alkalischen durchgef?hrt wird. Daher ist eine Ausf?hrungsform bevorzugt, in der die w?ssrige Extraktion des Epidaunorubicins in Schritt d) des erfindungsgem??en Verfahrens bei einem pH-Wert von 8 bis 10, vorzugsweise 8,5 bis 9,5, erfolgt. Das Einstellen des pH-Wertes kann beispielsweise mit Hilfe von Ammoniak erfolgen, wobei es sich als besonders vorteilhaft erwiesen hat, wenn dieser etwa 0,5?1,5 Gew.% NaCl, so zum Beispiel etwa 1 Gew.-% NaCl, enth?lt, um einen teilweisen ?bergang des Epidaunorubicins von der organischen Phase in die w?ssrige Phase zu verhindern. Die ben?tigte Menge an Ammoniak, um den gew?nschten pH-Wert einzustellen, kann variieren und h?ngt von der zugegebenen Menge an S?ure ab. So kann die Menge an Ammoniak, die ben?tigt wird, beispielsweise das 2,5fache der Menge an S?ure in Gramm betragen.

Ein hoher Reinheitsgrad des Epidaunorubicins ist essentiell f?r eine weitere Umsetzung des Epidaunorubicins zu Epirubicin, da nur so dessen Ausbeute gesteigert werden kann. Daher ist eine Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens bevorzugt, in dem sich Schritt d) ein weiterer Schritt e) anschlie?t, wobei es sich bei Schritt e) um eine chromatographische Reinigung des Epidaunorubicins handelt. Dabei erfolgt die chromatographische Reinigung vorzugsweise mit Kieselgel (SiO2) als station?re Phase, w?hrend als mobile Phase vorzugsweise ein Gemisch aus Methanol und Chloroform verwendet wird. Dies hat den Vorteil, dass kein Wechsel des L?sungsmittels vorgenommen werden muss, was wiederum zu der gesteigerten Effizienz des erfindungsgem??en Verfahrens beitr?gt.

Es wurde ?berraschend gefunden, dass die Beladung der Chromatographies?ule mit Epidaunorubicin, das nach dem erfindungsgem??en Verfahren aufgereinigt wurde, im Vergleich zu Epidaunorubicin, das nach den herk?mmlichen Verfahren gereinigt wurde, gesteigert werden konnte, ohne dass eine Verschlechterung der Trennleistung beobachtet wurde. Hier liegt ein weiterer Vorteil des erfindungsgem??en Verfahrens, da eine h?here Beladung der S?ule bei gleichbleibender Trennleistung einen effizienteren und ?konomischeren Prozessablauf erm?glicht. So hat sich ?berraschend gezeigt, dass die Beladung der S?ule mit Epidaunorubicin, das gem?? dem erfindungsgem??en Verfahren gereinigt wurde, auf bis zu 7 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der S?ulenmatrix, gesteigert werden konnte, w?hrend bei herk?mmlichen Verfahren die maximale Beladung der S?ule bei etwa 4 Gew.-% liegt.

Weiterhin bevorzugt ist eine Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens, bei der das Epidaunorubicin aus Schritt e) weiteren Reinigungsverfahren, beispielsweise einer Kristallisation unterzogen wird. Dabei kann die Kristallisation beispielsweise in Form des Hydrochloridsalzes erfolgen. Hierbei hat es sich gezeigt, dass die Qualit?t des gem?? dem erfindungsgem??en Verfahren aufgereinigten Epidaunorubicins bereits nach einem Kristallisationsschritt so hoch war, dass auf den bei herk?mmlichen Trennverfahren nach dem Stand der Technik ?blichen zweiten Kristallisationsschritt verzichtet werden konnte.

Besonders bevorzugt ist eine Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens, bei der das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

  • a) Bereitstellen einer Mischung enthaltend Epidaunorubicin, epi-Feudomycin und wenigstens ein halogenhaltiges L?sungsmittel, vorzugsweise Chloroform, wobei der Anteil an Feudomycin oberhalb von 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht von Epidaunorubicin und epi-Feudomycin, liegt;
  • b) Einstellen des pH-Wertes der Mischung auf einen Bereich von 5,0 bis 7,5;
  • c) Erw?rmen der Mischung aus Schritt b) auf eine Temperatur in einem Bereich von 55 bis 75 ?C, vorzugsweise 60 bis 65 ?C;
  • d) Aufreinigen des Epidaunorubicins, vorzugsweise mittels w?ssriger Extraktion;
  • e) Chromatographische Reinigung des Epidaunorubicins aus Schritt d),
wobei der Anteil an Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen an der Mischung der Schritte a) und b) 0,1 bis 4 Vol.-%, vorzugsweise 1,0 bis 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt und der Anteil an Wasser an der Mischung in Schritt a) maximal 1 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt.

Weiter bevorzugt ist eine Ausf?hrungsform, in der das erfindungsgem??e Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

  • a) Bereitstellen einer Mischung enthaltend Epidaunorubicin, epi-Feudomycin und wenigstens ein halogenhaltiges L?sungsmittel, vorzugsweise Chloroform, wobei der Anteil an epi-Feudomycin oberhalb von 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht von Epidaunorubicin und epi-Feudomycin, liegt und die Konzentration des Epidaunorubicins in einem Bereich von 6 bis 13 g/L liegt;
  • b) Einstellen des pH-Wertes der Mischung auf einen Bereich von 5,0 bis 7,5;
  • c) Erw?rmen der Mischung aus Schritt b) auf eine Temperatur in einem Bereich von 55 bis 75 ?C, vorzugsweise 60 bis 65 ?C;
  • d) Aufreinigen des Epidaunorubicins mittels w?ssriger Extraktion, wobei der pH-Wert der Extraktionsmischung in einem Bereich von 8 bis 10, vorzugsweise 8,5 bis 9,5, liegt;
  • e) Chromatographische Reinigung des Epidaunorubicins aus Schritt d),
wobei der Anteil an Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen an der Mischung der Schritte a) und b) 0,1 bis 4 Vol.-%, vorzugsweise 1,0 bis 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt und der Anteil an Wasser an der Mischung in Schritt a) maximal 1 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung, betr?gt.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform sind die einzelnen Verfahrensschritt a) bis e) nicht austauschbar. Besonders bevorzugt erfolgt das Verfahren in der festgelegten Reihenfolge.

Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele n?her erl?utert werden, wobei diese keineswegs als Einschr?nkung des Erfindungsgedanken zu verstehen sind.

Beispiele:Beispiel 1:

Die Konzentration an Epidaunorubicin in einer Mischung enthaltend Chloroform (CHCl3), Epidaunorubicin und epi-Feudomycin wurde mittels Destillation auf einen Gehalt von 8 bis 12 g/L eingestellt. Eine entsprechende Ausgangsmischung kann beispielsweise durch Abtrennung der Chloroformphase aus der Fermentationsbr?he erhalten werden. Zu der aufkonzentrierten L?sung (128 L) wurden 194 g Essigs?ure (0,15 Vol.-%) und 2,4 kg Methanol (2 Vol.-%) zugegeben, wobei sich die Angaben der Vol.-% jeweils auf das Gesamtvolumen der L?sung beziehen, und der pH-Wert so auf einen Bereich von 5,0 bis 7,5 eingestellt. Die erhaltene L?sung wurde auf 60 bis 65 ?C erw?rmt und f?r 17 Stunden in diesem Temperaturbereich ger?hrt. Dann wurde die Mischung auf 25 ?C abgek?hlt und der Gehalt der Verunreinigung epi-Feudomycin, bezogen auf das Gewicht von Epidaunorubicin mittels analytischer HPLC (RP18-HPLC) und Integration der gemessenen Peaks bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 wiedergegeben.

Beispiel 2 dient als Vergleichsbeispiel und zeigt das Ergebnis einer herk?mmlichen Aufreinigung des Epidaunorubicins, bei der auf das Erw?rmen der Mischung auf eine Temperatur von 60 bis 65 ?C und die Zugabe von Essigs?ure verzichtet wurde. Die Angaben des epi-Feudomycins beziehen sich jeweils auf die Menge an Epidaunorubicin. Tabelle 1:

Beispiel epi-Feudomycin (%)1 0,62 (Vgl.) 3,3

Wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, konnte mittels des erfindungsgem??en Verfahrens ein deutlich h?herer Reinheitsgrad des Epidaunorubicin erreicht werden, der sich in einem geringeren Anteil an epi-Feudomycin wiederspiegelt.

In einem weiteren Schritt wurde das nach dem erfindungsgem??en Verfahren aufgereinigte Epidaunorubicin mittels w?ssriger Extraktion bei einem pH-Wert von 8 bis 9 und anschlie?ender chromatographischer Reinigung weiter behandelt. Dabei wurden verschiedene Beladungsmengen der S?ule getestet. Die bei der chromatographischen Reinigung gewonnen Fraktionen wurden vereinigt und es wurde der Reinheitsgrad des Epidaunorubicins sowie der Anteile an epi-Feudomycin bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Dabei bezieht sich die Beladung der S?ule auf das Gewichtsverh?ltnis von Epidaunorubicin zu dem Trockengewicht der S?ulenmatrix, multipliziert mit 100%. Tabelle 2:

BeispielBeladung (%) Reinheit (%)Ausbeute (%)Anteil epi- Feudomycin (%)3 5,1 91 87 0,34 5,8 86 97 0,25 7,2 90 97 0,2

Wie Tabelle 2 zu entnehmen ist, bleibt auch bei hoher Beladung der S?ule die Trennleistung nicht nur unvermindert, sondern konnte sogar noch gesteigert werden.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse von Versuchen, bei denen die Menge an Essigs?ure, die zur Einstellung des pH-Wertes verwendet wurde, variiert wurde. Wie Tabelle 3 zu entnehmen ist, sinkt der Anteil an epi-Feudomycin bei zunehmender Menge an S?ure. Als L?sungsmittel wurde Chloroform verwendet. Die Mischungen enthielten jeweils 1 Vol.-% Methanol und wurden jeweils bei 60 ?C f?r 25 Stunden ger?hrt, bevor der Anteil an epi-Feudomycin bestimmt wurde. Der Anteil an epi-Feudomycin an der Ausgangsmischung betrug 8,7%. Bei Beispiel 6 handelt es sich um ein Vergleichsbeispiel, bei dem der Mischung keine Essigs?ure hinzugef?gt wurde. Tabelle 3:

BeispielEssigs?ure (Vol.-%)epi-Feudomycin(%)6 0 7,77 0,1 3,38 0,2 1,99 0,3 1,310 0,5 0,8

Wie Tabelle 3 zeigt, f?hrt bereits die Zugabe von 0,1 Vol.-% an Essigs?ure zu einer Mischung enthaltend Chloroform, Epidaunorubicin, epi-Feudomycin und 1 Vol.-% Methanol zu einer deutlichen Abnahme der Verunreinigung epi-Feudomycin bei einer Reaktionsdauer von 25 Stunden bei einer Temperatur von 60 ?C. Somit kann der Reinheitsgrad des erhaltenen Epidaunorubicins gesteigert werden, ohne dass es aufgrund aufwendiger Reinigungsmethoden zu Einbu?en bei der Ausbeute kommt.

Wie den aufgef?hrten Beispielen zu entnehmen ist, f?hrt das erfindungsgem??e Verfahren nicht nur zu einem deutlich h?heren Reinheitsgrad des Epidaunorubicins im Vergleich zu herk?mmlichen Reinigungsmethoden, sondern erm?glicht auch eine Steigerung der Effizienz und ?konomie des Reinigungsprozesses durch eine h?here S?ulenbeladung bei mindestens gleichbleibender Trennleistung sowie der Reduktion der erforderlichen Prozessschritte, wie beispielsweise durch die Entbehrlichkeit eines zweiten Kristallisationsschrittes.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 1990405 A1 [0004]
  • EP 2301943 B1 [0005]
  • EP 0030295 B1 [0006]
  • WO 2010/028667 [0007]
  • EP 2042608 B1 [0008]