Title:
Lösung zur Verwendung in der Proteinbestimmung
Kind Code:
B3


Abstract:

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine wässrige Lösung zur Verwendung in der Proteinbestimmung umfassend a. bis zu ca. 5% SDS, b. bis zu ca. 1% mindestens eines elektrisch neutralen PHB Esters, und c. bis zu ca. 2% mindestens eines organischen Lösungsvermittlers auf Basis substituierter ein- und mehrwertiger Alkohole, sowie ein eine solche Lösung enthaltendes System und diese Lösung verwendende Verfahren.




Inventors:
Hogeback, Alfred (77793, Gutach, DE)
Helmes, Hendrik (78048, Villingen-Schwenningen, DE)
Application Number:
DE102014101778A
Publication Date:
07/30/2015
Filing Date:
02/12/2014
Assignee:
ProCheck GmbH, 58256 (DE)
International Classes:



Foreign References:
GB2443161A2008-04-30
200903047992009-12-10
Attorney, Agent or Firm:
Westphal, Mussgnug & Partner Patentanwälte mit beschränkter Berufshaftung, 78048, Villingen-Schwenningen, DE
Claims:
1. Wässrige Lösung zur Aufnahme von Proben zur Proteinbestimmung umfassend
a. bis zu ca. 5% SDS
b. bis zu ca. 1% mindestens eines elektrisch neutralen PHB Esters
c. bis zu ca. 2% mindestens eines organischen Lösungsvermittlers auf Basis substituierter ein- und mehrwertiger Alkohole

2. Wässrige Lösung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an SDS zwischen ca. 0,5% und ca. 2% beträgt.

3. Wässrige Lösung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an SDS ca. 1% beträgt.

4. Wässrige Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an mindestens einem elektrisch neutralen PHB Ester zwischen 0,01% und 0,04% beträgt.

5. Wässrige Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an mindestens einem organischen Lösungsvermittler zwischen 0,2% und 2% beträgt.

6. Wässrige Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an mindestens einem organischen Lösungsvermittler 50% des Gehalts an SDS beträgt.

7. Wässrige Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine PHB Ester ausgewählt ist aus Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl- und Benzylparaben.

8. Wässrige Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Lösungsvermittler ausgewählt ist aus Ethylenglykol, Propylenglykol, und/oder Butyldiglykol und aromatischen Ethanol-Ethern wie Phenolxyethanol.

9. Wässrige Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Aufnahme einer Probe geeignet ist, deren Proteinkonzentration gemessen werden soll.

10. Verfahren zur Proteinbestimmung umfassend
a. Zurverfügungstellen einer Lösung (1), die eine Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie eine darin aufgenommene Probe umfasst.
b. Versetzen eines Aliquots der Lösung (1) mit einem Aliquot einer wässrigen Lösung umfassend o-Phthaldialdehyd sowie eine Thiolkomponente (Lösung (2)), um eine Lösung (3) zu erhalten;
c. Bestimmen des Proteingehalts der Lösung (3) mittels photometrischer Messung gegen einen Blindwert..

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung (1) durch Versetzen einer zu bestimmenden Probe mit einer wässrigen Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 erhalten wurde.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Aliquots der Lösungen (1) und (2) gleich groß sind.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Proteinbestimmung an und/oder in medizinischen Instrumenten.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den medizinischen Instrumenten um zahnmedizinische Turbinen, Hand- oder Winkelstücke handelt.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Thiolkomponente ausgewählt ist aus Mercaptoethanol und N,N-Dimethyl-2-mercaptoethylammoniumchlorid.

16. Verfahren zur Konservierung von zur Proteinbestimmung einzusetzenden wässrigen Lösungen, umfassend das Ansetzen einer wässrigen Lösung, umfassend bis zu ca. 5% SDS, bis zu ca. 1% mindestens eines elektrisch neutralen PHB Esters und bis zu ca. 2% mindestens eines organischen Lösungsvermittlers auf Basis substituierter ein- und mehrwertiger Alkohole.

17. Verwendung einer wässrigen Lösung gemäß eines der Ansprüche 1 bis 9 in der Proteinbestimmung.

18. System zur Bestimmung von Proteinen, umfassend die Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie eine wässrige Lösung umfassend o-Phthaldialdehyd sowie eine Thiolkomponente.

Description:

Der Gesamtproteingehalt wird bei vielen Anwendungen in Wissenschaft, klinischer Forschung und in der ärztlichen Anwendung bestimmt. Hierzu sind viele verschiedene, auf kolorimetrischen oder Fluoreszenzmessungen basierende Techniken verfügbar. Die am häufigsten verwendeten Techniken basieren auf der Reduktion von Kupfer in Gegenwart eines chromogenen Reagenzes. Auch wenn diese Verfahren praktikabel sind, so sind sie doch anfällig für Interferenzen durch viele in der Proteinabreinigung etc. verwendete Verbindungen, z. B. Detergenzien und reduzierende Agenzien. Als Alternative bietet sich die einfache Absorptionsmessung von Proteinlösungen bei 280 nm an, diese ist allerdings anfällig für Interferenzen durch in der Probe befindliche Nukleinsäuren.

Daher wurden bereits früh auf Farbreaktionen basierende Proteinbestimmungsmethoden erfunden, die gebräuchlichste von allen ist das Verfahren nach Bradford. Diese Verfahren leidet allerdings an der Bildung von Aggregaten über die Zeit, die einen Signalverlust bedingen.

Ein anderes Verfahren verwendet o-Phthaldialdehyd (OPA), welches in Verbindung mit reduzierten Sulfhydrylgruppen mit primären Aminen zu fluoreszierenden Verbindungen reagiert.

Das Problem der OPA-Methode zum Protein-Nachweis an Medizinprodukten besteht darin, dass die verwendete Spüllösung absolut proteinfrei sein muss. Die übliche und bewährte Methode des Ausspülens besteht in mit sterilem Wasser frisch hergestellter Natriumdodecylsulfat(SDS)-Lösung. Da es sich bei SDS um ein biologisch abbaubares anionisches Tensid handelt, ist die mikrobiologische Stabilität der Lösung ein entsprechendes Risiko. Die Gefahr von mikrobieller Kontamination ist bereits bei einmaligem Öffnen einer Lösung gegeben. Dadurch kann sich Biofilm bilden, welcher einerseits den SDS-Gehalt reduziert, und der zum anderen durch die Proteine des Biofilms zu einer Messwertverfälschung führen kann. Bislang war es nicht möglich, vorgefertigte SDS Lösungen nach dem öffnen über längere Zeit aufzubewahren, ohne dass die Lösung verdirbt und für die Proteinbestimmung nicht mehr verwendbar ist. Es ist also wünschenswert, eine konservierte Lösung bereitzustellen, welche eine Standzeit von mindestens einem halben Jahr hat und deren Reinheit mit einfachen Methoden überprüfbar ist.

Aus der GB 2 443 161 A und in der US 2009/0304799 A1 sind wässerige Lösungen bekannt, welche die im Patentanspruch 1 beanspruchten Bestandteile aufweisen.

Diese Aufgaben werden durch die erfindungsgemäße wässrige Lösung und Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine wässrige Lösung, vorzugsweise zur Aufnahme von Proben zur Proteinbestimmung, umfassend (a.) bis zu ca. 5% SDS, (b.) bis zu ca. 1% mindestens eines elektrisch neutralen PHB Esters, und (c.) bis zu ca. 2% mindestens eines organischen Lösungsvermittlers auf Basis substituierter ein- und mehrwertiger Alkohole.

Der Gehalt an SDS kann zwischen 0,5% und 5% liegen, z. B. bei 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4% oder 4,5%.

PHB-Ester sind Ester der para-Hydroxybenzoesäure, auch Parabene genannt. Parabene haben antimikrobielle und fungizide Wirkung und werden häufig in der pharmezeutischen Industrie, in Kosmetika und auch in bestimmten Lebensmitteln als Konservierungsmittel eingesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt der wässrigen Lösung an SDS zwischen ca. 0,5 und ca. 2%, z. B. 0,8%, 1%, 1,2%, 1,5% oder 1,8%.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt der wässrigen Lösung an SDS ca. 1%.

Der Gehalt der wässrigen Lösung an mindestens einem oder mehreren elektrisch neutralen PHB Estern kann zwischen 0,01% und 1% liegen, z. B. bei 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8% oder 0,9%. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt der wässrigen Lösung an elektrisch neutralen PHB Estern zwischen 0,01% und 0,04%, z. B. 0,02%, 0,025%, 0,03% oder 0,035%.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt der wässrigen Lösung an mindestens einem organischen Lösungsvermittler zwischen 0,2 und 2%, z. B. 0,4%, 0,5%, 0,8%, 1%, 1,2%, 1,5% oder 1,8%.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt der wässrigen Lösung an mindestens einem organischen Lösungsvermittler 50% des Gehalts an SDS, kann jedoch auch 40%, 45%, 55% oder 60% des Gehalts an SDS betragen.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt an SDS ca. 1% und der Gehalt an mindestens einem organischen Lösungsvermittler ca. 0,5%.

In einer weiteren Ausführungsform ist mindestens ein oder mehrere PHB Ester ausgewählt aus Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl- und Benzylparaben, bevorzugt die ersten vier.

In einer weiteren Ausführungsform ist mindestens einer der Lösungsvermittler ausgewählt aus Ethylenglykol, Propylenglykol und/oder Butyldiglykol und aromatischen Ethanol-Ethern wie z. B. Phenolxyethanol.

In einer weiteren Ausführungsform ist die wässrige Lösung geeignet zur Aufnahme einer Probe, deren Proteinkonzentration gemessen werden soll.

Hierzu muss die Lösung derartig beschaffen sein, dass man sie problemlos mit einem darin zu lösenden oder zu suspendierenden Feststoff versetzen kann oder sie auf Oberflächen von Gegenständen entlang laufen oder durch Gegenstände hindurch laufen lassen kann. Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Lösung zum Spülen von medizinischen Instrumenten verwendet werden und deren Proteingehalt nachher gemäß dem weiter unten beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden. Des Weiteren kann die Lösung zur Überprüfung der erfolgten Reinigung eines medizinischen Instruments über bzw. durch das medizinische Instrument geführt werden, um den Restproteingehalt zu bestimmen, der indikativ für die Sauberkeit des Instrumentes ist.

Auch wenn die erfindungsgemäße Lösung vorzugsweise nur in sterilem Wasser angesetzt ist, kann sie doch in einigen Fällen auch eine Puffersubstanz enthalten. So kann der pH Wert die Reaktivität von OPA gegenüber Proteinen nachteilig beeinflussen. Eine Lösung mit einem pH-Wert von ca. 9,0 ist für die Messung mit OPA optimal, da die resultierende Fluoreszenz aufgrund der deprotonierten und damit reaktiveren Aminogruppen größer ist. Allerdings kann die OPA-Methode auch im physiologischen pH-Bereich zwischen pH 6,0 und 9,0 mit akzeptablen Ergebnissen angewendet werden. Für diesen pH-Bereich geeignete Puffersystem sind z. B. PBS oder Natriumborat. Puffersysteme sollten allerdings keine Amine wie z. B. Tris oder Glycin, enthalten.

Üblicherweise müssen SDS-Lösungen zur Proteinbestimmung zeitnah zur Anwendung hergestellt werden, die Gefahr der mikrobiellen Kontamination besteht im nachträglichen Proteineintrag. Mit der hier beschriebenen Rezeptur ist eine Haltbarkeit der wässrigen Lösung von mindestens sechs Monaten gegeben. Eine Besonderheit dieser konservierten SDS-Lösung besteht darin, dass hier ausschließlich SDS eine ionische und somit elektrisch leitfähige Substanz ist. Der elektrische Leitwert beträgt 1.500 μS/cm, die Konzentrationsabhängigkeit des Leitwertes ist linear. Durch die Konservierung mit elektrisch ungeladenen Desinfektionsrohstoffen und Emulgierhilfsmitteln bleibt die Möglichkeit zur Konzentrationsüberwachung von SDS mittels elektrischen Leitwerts erhalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Proteinbestimmung, umfassend (a) Zurverfügungstellung einer Lösung (1), die eine Lösung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie eine darin aufgenommene Probe umfasst; (b) Versetzen eines Aliquots der Lösung (1) mit einem Aliquot einer wässrigen Lösung umfassend o-Phthaldialdehyd sowie eine Thiolkomponente (Lösung (2)), um eine Lösung (3) zu erhalten; und (c) Bestimmen des Proteingehalts der Lösung (3) mittels photometrischer Messung gegen einen Blindwert.

Beispielhaft können 500 μl Lösung (1) mit 500 μl Lösung (2) in einer Küvette gemischt werden. Anschließend erfolgt eine Inkubation von 1 bis 10 min, z. B. 3, 5 oder 8 min, während der die chemische Reaktion, welche mit der Bildung der fluoreszierenden Substanzen einhergeht, stattfindet. Die Absorption der resultierenden Lösung bei 340 nm wird gegen einen Blindwert bestimmt. Dieser kann z. B. Lösung (1) ohne Probe sein. Zusätzlich kann in einer zweiten Messung die Eigenabsorption der Probe bei 340 nm bestimmt werden. Da in der entsprechenden Referenzprobe kein OPA enthalten ist, kommt es nicht zur Bildung des Farbstoffes und es wird nur die Eigenabsorption der Probe gemessen. Die Werte der Kontrollmessung werden von den ermittelten Absorptionswerten der OPA Messung abgezogen und aus dem dann erhaltenen Wert die Proteinkonzentration in der Probe basierend auf Vergleichswerten einer Standardreihe aus Rinderserumalbumin (BSA) berechnet.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Lösung (1) durch Versetzen einer zu bestimmenden Probe mit einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung erhalten. Die Probe kann flüssig oder fest sein, jedoch auch aus eventuellen festen Rückständen auf Oberflächen, z. B. von medizinischen Instrumenten bestehen. Bei der Aufnahme der Probe in die erfindungsgemäße wässrige Lösung wird die Probe vorzugsweise gelöst.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Aliquots der Lösungen (1) und (2) gleich groß.

Beispielsweise kann die Größe der Aliquots je nach Messapparatur zur Messung der Fluoreszenz zwischen 10 μl und 500 μl liegen, z. B. bei 20 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl oder 500 μl.

In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Proteinbestimmung an und/oder in medizinischen Instrumenten angewendet.

Medizinische Instrumente werden z. T. mit Öl gepflegt, welches man vor der Proteinbestimmung aus der Lösung (1) entfernen will, um Störungen der Messung zu vermeiden. Hierzu kann man die Lösung (1) in einem zusätzlichen Schritt durch Hinzufügen eines nicht wässrigen Lösungsmittels zur Aufnahme des Öls und anschließendes Ausschütteln oder Zentrifugieren behandeln. Beispielsweise kann die Lösung (1) mit Ether versetzt und zentrifugiert werden. Hierdurch wird bei Anwesenheit von Öl eine Phasentrennung in drei Phasen erreicht. Die untere Phase enthält die zu messenden Proteine, die mittlere die Ölrückstände, die obere Phase enthält den Ether.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den medizinischen Instrumenten um zahnmedizinische Turbinen, Hand- oder Winkelstücke. Jedoch können auch Proteinrückstände an anderen wiederverwendbaren medizinischen Instrumenten wie z. B. Kathetern, wie z. B. Gefäßkatheter, Peritonealkatheter oder Blasenkatheter, Rohrschaftinstrumenten wie Endoskope, und Trokare, welche die Haut durchdringen, wie z. B. für die Arthroskopie, Laparoskopie und andere operative Verfahren, Elektroden, Shunts, Drainagen, Venenverweilkanülen, für die Blutentnahme bestimmte Kanülen, Ports und Pins (nach außen ragende Drähte eines Fixateurs) gemessen werden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Thiolkomponente N,N-Dimethyl-2-mercaptoethylammoniumchlorid doppelt konzentriert vorhanden. Dies erlaubt den Einsatz hoher Probenvolumen und senkt die Nachweisgrenze.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt auch die Konzentration an o-Phthaldialdehyd dopplelt konzentriert vor. Auch dies erhöht die Sensitivität des Verfahrens.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Konservierung von zur Proteinbestimmung einzusetzenden wässrigen Lösungen, umfassend das Ansetzen einer wässrigen Lösung, umfassend bis zu ca. 5% SDS, bis zu ca. 1% mindestens eines elektrisch neutralen PHB Esters und bis zu ca. 2% mindestens eines organischen Lösungsvermittlers auf Basis substituierter ein- und mehrwertiger Alkohole.

Die Vorgehensweise, um die erfindungsgemäße wässrige Lösung zu erhalten ist dem Fachmann geläufig.

Überdies betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung in der Proteinbestimmung.

Zuletzt betrifft die Erfindung ein System bzw. ein Kit zur Bestimmung von Proteinen, umfassend die erfindungsgemäße wässrige Lösung.

In einer Ausführungsform umfasst das System bzw. der Kit zusätzlich eine wässrige Lösung umfassend o-Phthaldialdehyd sowie eine Thiolkomponente.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst das System weiterhin mindestens eine Komponente aus den folgenden: einen Adapter zum Verbinden mit medizinischen Instrumenten, einen Luer-Lock-Adapter, eine Spritze, ein Leer-Röhrchen zur Aufnahme der Proteinbestimmungslösung (1) sowie eine Bedienungsanleitung.