Title:
Perlenketten-Sequenzierung
Kind Code:
A1
Abstract:

Es wird ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren beschrieben unter Verwendung markierter Nukleotide. Zum Einen können die Nukleotide an der Ribose bzw. Desoxyribose markiert sein und mittels einer Polymerase Reaktion in einen Nukleinsäurestrang integriert werden. An diesem Nukleinsäurestrang hängen die Markierungen dann wie Perlen an einer Perlenkette. Anschließend wird der Nukleinsäurestrang mitsamt den Markierungen durch eine Nanopore hindurch geleitet. Die Markierungen führen dabei zu einem deutlicheren Signal. Da die Markierungen basenspezifisch gewählt wurden, kann die Basenabfolge so bestimmt werden. Zum Anderen können die Nukleotide am 5OH der Phosphatgruppe mit Nanospheren markiert sein. Bei einer Polymerase Reaktion werden in diesem Fall die Nanospheren freigesetzt und können sodann durch eine Nanopore hindurch geleitet werden. Bei der Passage der Nanospheren durch die Nanopore ergibt sich das Detektionssignal. Auch hier werden basenspezifische Nanospheren verwendet und erlauben so die Bestimmung der Basenabfolge.



Inventors:
Antrag auf Nichtnennung
Application Number:
DE102014013397A
Publication Date:
03/10/2016
Filing Date:
09/10/2014
Assignee:
Arneth, Borros, 61348 (DE)
International Classes:
Claims:
1. Ein Apparat zur DNA Sequenzierung mittels Hindurchleiten eines modifizierten DNA/RNA Strangs durch eine biologische oder nicht-biologische (z. B. halbleiterbasierte solid state oder z. B. auch ein DNA Transistor) Nanopore hindurch, gekennzeichnet dadurch, daß zuvor mit einer DNA- oder RNA-Polymerase (bzw. mit einem Fragment einer solchen Polymerase) chemisch modifizierte Nukleotide (z. B. mit über einen Linker mit Nanopheren bzw. Nanobeads markierte Nukleotide) in den DNA/RNA-Strang eingebaut wurden.

2. Chemisch modifizierte Nukleotide bei welchen Markermoleküle (z. B. Nanospheren) über einen Linker an das Nukleotid gebunden sind zum Einsatz in einem Apparat nach Schutzanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß jede Base durch ein spezifisches Markermolekül (z. B. durch eine spezifische Nanosphere oder einen Nanobead) codiert ist, so daß anhand der Signaländerung bei Durchtritt der modifizierten DNA/RNA durch die Nanopore auf die entsprechende Base rückgeschlossen werden kann.

3. Chemisch modifizierte Nukleotide zum Einbau in eine modifizierte DNA/RNA- und zur Verwendung nach Schutzanspruch 1 bzw. 2, zusätzlich gekennzeichnet dadurch, daß diese Nukleotide am Ribosemolekül bzw. am Desoxyribosemolekül über einen Linker mit einem basenspezifischen Markermolekül (z. B. mit einer Nanosphere) verbunden sind, so daß anhand der Signaländerung bei Durchtritt der modifizierten DNA/RNA durch die Nanopore auf die entsprechende Base rückgeschlossen werden kann.

4. Abweichend von Schutzanspruch 1 bis 3 eine Methode zur DNA-Sequenzierung mittels einem oder vieler Sensoren, die biologischen oder nicht-biologischen Nanoporen, also auf einem Halbleiter gelegenen Nanoporen bzw. Öffnungen oberhalb von Vertiefungen in der Halbleiteroberfläche, entsprechen, und die jeweils mit Elektroden auf beiden Seiten der Nanopore bzw. Öffnung versehen sind, sowie die jeweils mit einem Molekül DNA- oder RNA Polymerase an nur einem Ende der Nanopore bzw. der Öffnung versehen sind, wobei die Polymerase markierte Nukleosidtriphosphate in den entstehenden DNA Strang einbaut, der selber an der Nanopore vorbeigeführt wird, gekennzeichnet dadurch, daß jeweils Nano-Beads (Nanospheren), welche an die Phosphatgruppen der Nukleosidtriphosphate (dNTPs) gebunden waren, durch die halbleiterbasierten Nanoporen hindurch geführt werden und bei Passage der Nanopore jeweils eine Leitfähigkeitsänderung nach dem Coulter Prinzip hervorrufen, die jeweils durch die entsprechenden Elektroden detektiert wird.

5. Mit Beads bzw. Nanospheren markierte Nukleosidtriphosphate zum Einsatz in einer halbleiter basierten solid-state Nanopore mit Elektroden auf beiden Seiten der Nanopore, nach Schutzanspruch 4, zusätzlich gekennzeichnet dadurch, daß die Beads bzw. Nanospheren an die 5'OH Gruppen der Nukleosidtriphosphate basenspezifisch über einen Linker gebunden sind und so einen Rückschluß der detektierten Messsignal-Änderung auf die jeweils inkorporierte Base erlauben.

6. Markierte Nukleosidtriphosphate zum Einsatz in einer halbleiter basierten solid-state Nanopore mit Elektroden auf beiden Seiten der Nanopore, nach Schutzanspruch 4 und 5, zusätzlich gekennzeichnet dadurch, daß die chemischen Markierungen der Nukleosidtriphosphate (dNTPs) an den 5'OH Gruppen der Phosphatgruppen der dNTPs durch Anbringen unterschiedlich großer Beads (Nanospheren) erfolgen, die somit zu unterschiedlichen basenspezifisch modifizierten Nukleosidtriphosphaten führen.

7. Markierte Nukleosidtriphosphate zum Einsatz in einer halbleiter basierten solid-state Nanopore mit Elektroden auf beiden Seiten der Mikropore, nach Schutzanspruch 1 bis 6, zusätzlich gekennzeichnet dadurch, daß die Markierungen (Beads, Nanospheren) dabei unterschiedliche Mengen an elektrischen Ladungen aufweisen, so daß sie dadurch leichter unterscheidbar da unterschiedlich schnell beim Durchtritt durch die Nanopore und so besser detektierbar werden und dabei eine bessere Unterscheidung der unterschiedlichen Nukleosidtriphosphate und damit der jeweils inkorporierten Basen ermöglichen.

8. Eine Methode zur DNA-Sequenzierung mittels einer Nanopore und einer DNA-Polymerase, die Beads-(Nanospheren-)markierte Nukleosidtriphosphate einbaut, gekennzeichnet dadurch, daß genau ein einzelnes Molekül DNA-Polymerase an den Eingang der Nanopore kovalent oder nichtkovalent gebunden ist, so daß die Markierungen der Nukleosidtriphosphate, d. h. die Nanospheren beim Synthesevorgang in den Eingang der Nanopore bzw. der Öffnung und somit in die Detektionszone (sogenannte sensing zone) gelangen und dort zu einer Messsignaländerung nach dem Coulter Prinzip führen.

9. Ein halbleiterbasierter Mikrochip zur DNA-Sequenzierung, gekennzeichnet dadurch, daß auf diesem Mikrochip eine große Vielzahl an einzelnen Nanoporen mit Elektroden auf beiden Seiten jeder Nanopore vorliegen zur Sequenzierung der DNA nach Schutzanspruch 1 bis 3 bzw. nach Schutzanspruch 4.

10. Ein halbleiterbasierter Mikrochip zur DNA-Sequenzierung, gekennzeichnet dadurch, daß auf diesem Mikrochip eine große Vielzahl an einzelnen Nanoporen mit jeweils nur einer Elektrode auf nur einer Seite einer jeden einzelnen Nanopore und mit einer gemeinsamen Referenzelektrode für alle Nanoporen gemeinsam vorliegend zur Sequenzierung der DNA nach Schutzanspruch 1 bis 3 bzw. nach Schutzanspruch 4.

Description:

Die Sequenzierung der DNA im großen Stil ist eines der großen Abenteuer, das die Menschheit in Kürze erwartet. Hierzu ist es jedoch notwendig große DNA Mengen in kurzer Zeit kostengünstig zu sequenzieren.

Eine Möglichkeit die DNA Sequenzierung durchzuführen besteht im Hindurchleiten des DNA bzw. RNA Strangs durch eine Nanopore.

Entsprechend dem Coulter Prinzip kommt es dabei zu einer Unterbrechung des Ionenflusses durch diese Nanopore hindurch. Diese Änderung des Ionenflusses lässt sich in Form einer Änderung eines elektischen Messsignals (Spannung, Leitfähigkeit und/oder Widerstand) in einer entsprechenden Schaltung regisitrieren.

Ein wesentlicher Nachteil besteht in der strukturellen Ähnlichkeit der Basen, so daß die Unterbrechung des Ionenflusses bei allen Basen sehr ähnlich ist. Hier setzt die vorliegende Erfindung an (Schutzansprüche 1 bis 3). Durch Anbringen einer Markierung an die Basen bzw. bevorzugt an die Ribosereste bzw. Desoxyribosereste der Nukleotide werden diese deutlich unterschiedlich und somit leichter detektierbar. Dabei soll die Markierung basenspezifisch erfolgen, d. h. jede Base erhält ihre eigene basenspezifische Markierung. Hierzu wird eine Polymerase Reaktion mit Einsatz markierter Nukleotide durchgeführt. Dabei sind die Nukleotide so markiert, daß über einen Linker Molekülgruppen (z. B. Nanosheren) an die Nukleotide (z. B. an die Ribose bzw. an die Desoxyribosemolekül-Gruppe) gebunden werden, die zu deutlichen Signaländerungen bei Passage der dann modifizierten Nukleinsäure durch die Nanopore hindurch führen. Zudem werden Molekülgruppen verwendet, die basenspezifisch sind, so daß auf diese Weise eine Unterscheidung der Basen möglich wird. Auf diese Weise wird die Sequenzierung des DNA bzw. RNA Strangs erreicht.

Hierzu kann eine biologische oder eine halbleiterbasierte Nanopore mit Elektroden auf beiden Seiten der Nanopore verwendet werden. Im einfachsten Fall handelt es sich um eine Öffnung der obersten Schicht des Halbleitermaterials mit einer darunter gelegenen Vertiefung des Halbleitermaterials mit Elektroden auf beiden Seiten der Öffnung.

Die Nanopore kann auch einer biologischen Nanopore in einer biologischen Lipid-Doppelmembran entsprechen.

Ferner kann die Nanopore eine halbleiterbasierte Nanopore bzw. Öffnung im Halbleitermaterial mit Elektroden auf beiden Seiten dieser Nanopore bzw. Öffnung sein. Bislang wird hierbei meist das DNA Molekül selbst durch die halbleiter-basierte solid-state Nanopore hindurchbewegt. Auf diesem Weg kann dann die DNA Sequenz beim Transit ausgelesen. Dieser Prozess ist bislang sehr fehleranfällig, da sich die einzelnen Nukleotide nur sehr wenig in ihrer chemischen Struktur voneinander unterscheiden.

Hier setzt die vorliegende Erfindung an. Im ersten Teil (Schutzansprüche 1 bis 3) werden die Nukleotide selbst chemisch modifiziert, so daß sie sich deutlicher voneinander unterscheiden und so daß bei Durchleiten der modifizierten Nukleinsäure durch eine Nanopore eine direkte Sequenzierung möglich wird.

Im zweiten Teil (Schutzanspruch 4) wird nicht der DNA-Strang selbst durch die Pore hindurch bewegt, sondern es werden Beads (Nanospheren) durch die Pore geleitet, mit denen die zu inkorporierenden Nukleosidtriphosphate an der 5'OH Gruppe der Phosphatreste versehen und damit markiert worden sind. Diese werden in die Lösung der halbleiterbasierten Mikropore mit Elektroden auf beiden Seiten der Nanopore eingebracht. Beim Vorgang der DNA Synthese werden die Beads (Nanospheren) hydrolytisch von den Nukleosidtriphosphaten abgespalten.

Die Beads (Nanospheren) bewegen sich anschließend durch die halbleiterbasierte Nanopore hindurch, während sich der DNA Strang selber an der Pore vorbeibewegt oder während sich der DNA Strang selber ebenfalls durch die Pore hindurchbewegt. Da sich die Nanospheren bzw. Beads wesentlich deutlicher voneinander unterscheiden, als die Basen selbst es tun, erfolgt das Auslesung der Nanospheren bzw. Beads und somit der Markierungen stellvertretend für die Basen und damit wesentlich genauer und mit geringerer Fehlerrate.

Dabei kann die Öffnung einer solchen Nanopore sogar deutlich größer sein. Die Öffnung einer Nanopore liegt meist in der Größenordnung der verwendeten größenunterschiedlichen Nanospheren. Aus diesem Grund kann der Querschnitt einer Nanopore bei Passage einer Nanosphere auch deutlich eingeschränkt werden, was zu einer deutlichen Änderung der Leitfähigkeit der Lösungsflüssigkeit führt, die nach dem Coulter Prinzip zu einem messbaren Signal führt.

In der vorliegenden Erfindung wird ein Apparat beschieben, der eine DNA Sequenzierung auf Einzelmolekül-Ebene ermöglicht. Dieser Apparat arbeitet ähnlich einer bekannten halbleiterbasierten Nanopore. Bislang wurde dabei das DNA Molekül selbst durch eine Pore hindurch geführt.

Beim Durchlaufen der Pore wird dabei die DNA Sequenz ausgelesen. Im Gegensatz zu diesem bisherigen Vorgehen, wird im Fall der im Schutzanspruch 4 beschriebenen Methode jedoch eine halbleiterbasierte Mikropore mit Elektroden auf beiden Seiten der Mikropore und mit einem einzelnen Molekül DNA Polymerase kovalent oder nicht-kovalent am Eingang der Mikropore gebunden verwendet. Es handelt sich also um die DNA-Sequenzierung nach dem Sequenzing-by-Synthesis Prinzip.

Zum Einen können die Nukleotide am Ribosemolekül selbst über einen Linker mit dem Marker (z. B. mit der Nanosphere) markiert sein (Schutzansprüche 1 bis 3). Zum Anderen kann nicht der DNA Strang selbst sondern vielmehr die abhydrolysierten Phosphatgruppen mit Beads bzw. Nanospheren, die an die 5'OH Phosphatgruppe der jeweiligen Nukleosidtriphosphate angehängt wurden, markiert sein (Schutzanspruch 4). Diese werden beim Syntheseschritt hydrolytisch abgespaltet und durch die halbleiterbasierte Nanopore hindurch geführt. Dabei führen die Beads bzw. Nanospheren zu einer spezifischen Messsignal Änderung, die ihrerseits den Rückschluß auf das jeweils inkorporierte Nukleosidtriphosphat und damit auf die jeweilige Base erlaubt. Mittels spezifischer Markierung der Nukleosidtriphophate kann so unterschieden werden welche Base gerade von der Polymerase eingebaut worden ist.

Beschreibung der Zeichnung

Zu sehen ist eine Öffnung im Halbleitermaterial. Die Nukleosidtriphosphate sind mit Mikrospheren an den Riboseresten markiert, in der Zeichnung als Kugeln gekennzeichnet. Beim Synthesevorgang werden die Nanospheren an den DNA/RNA Strang angebaut. Beim Durchtritt durch die Nanopore gelangen sie so in die sensing zone der Messanordnung und es erfolgt nach dem Coulter Prinzip ein Messsignal. Da jeweilige Nanosphere basenspezifisch ist, lässt das Messsignal postwendend einen Rückschluß auf das jeweilige Nukleotid und damit auf die Basenfolge zu.