Title:
Pilze aus der Ordnung Sebacinales sowie ihre Verwendung und Verfahren zur Förderung des Pflanzenwachsstums
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft Pilze aus der Ordnung Sebacinales, Gattung Sebacina. Es handelt sich dabei um eine für Europa heimische, neu charakterisierte Pilzart der Gattung Sebacina, die in der Lage ist, ihr Myzel in Ketten zu septieren und Chlamydosporen zu bilden. Die neue Pilzart geht mit vielen krautigen Pflanzenarten, darunter Kulturpflanzen, eine Symbiose ein. Die Erfindung betrifft ferner das Verfahren zur Induktion der Chlamydosporen-Bildung bei diesem Pilz in künstlichen Medien, wobei das Kulturmedium als Kohlenstoffquelle Glukose und als Stickstoffquelle NaNO3 enthält. Die Erfindung betrifft ferner das Verfahren und die Verwendung des neu charakterisierten Pilzes, seiner Chlamydosporen oder seines Myzel zur Wachstumsförderung, Erhöhung der Resistenz gegen Pathogene und Umweltstress und/oder zur Ertragssteigerung bei Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung seine Verwendung im land-, garten- und/oder forstwirtschaftlichen Bereich.




Inventors:
Riess, Kai (72070, Tübingen, DE)
Garnica, Sigisfredo, Dr. (72072, Tübingen, DE)
Application Number:
DE102013012983A
Publication Date:
02/05/2015
Filing Date:
08/03/2013
Assignee:
Eberhard Karls Universität Tübingen, 72074 (DE)
International Classes:



Foreign References:
EP10357762003-03-26
201000240762010-01-28
Other References:
1. OBERWINKLER, F.; [u. a.]: Enigmatic Sebacinales. Review. Online veröffentlicht am: 04.01.2013. In: Mycol. Progress, Vol. 12, S. 1-27.
Claims:
1. Pilz der Gattung Sebacina, der in der Lage ist, Chlamydosporen zu bilden.

2. Pilz der Gattung Sebacina, der in der Lage ist, seine Hyphen in Ketten einzuschnüren.

3. Pilz nach einem der Ansprüche 1 bis 2 mit der Hinterlegungsnummer DSM 27505.

4. Pilz, Chlamydosporen und/oder Myzel des Pilzes nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in Flüssigkultur oder als Filtrat.

5. Zusammensetzung, enthaltend Pilz, Chlamydosporen und/oder Myzel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, und ggf. geeignete Träger oder Zusätze.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, die ein Düngemittel darstellt.

7. Verfahren zur Induktion der Chlamydosporen-Bildung bei dem Pilz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Pilz in einem Kulturmedium kultiviert wird, welches 0,01% bis 0,5% Glukose, insbesondere 0,1% Glukose, und 0,01% bis 0,5% NaNO3, insbesondere 0,1% NaNO3, enthält.

8. Verwendung des Pilzes, der Chlamydosporen, des Myzels und/oder der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Wachstumsförderung, Erhöhung der Resistenz gegen Pathogene und Umweltstress und/oder zur Ertragssteigerung bei Pflanzen.

9. Verwendung des Pilzes, der Chlamydosporen, des Myzels und/oder der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 im land-, garten- und/oder forstwirtschaftlichen Bereich.

10. Verfahren zur Wachstumsförderung, Erhöhung der Resistenz gegen Pathogene und Umweltstress und/oder zur Ertragssteigerung bei Pflanzen, wobei der Pilz, die Chlamydosporen, das Myzel und/oder die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dem Pflanzensubstrat, den Pflanzenwurzeln, Pflanzensetzlingen und/oder den Pflanzensamen zugegeben werden.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Pilze aus der Ordnung Sebacinales, Gattung Sebacina, sowie ihre Verwendung und das Verfahren zur Wachstumsförderung, Erhöhung der Resistenz gegen Pathogene und Umweltstress und/oder zur Ertragssteigerung.

Zur Unterstützung oder Förderung des Pflanzenwachstums und zur Steigerung des Ernteertrags sind aus dem Stand der Technik unterschiedliche Methoden bekannt. Dazu gehört beispielsweise der Einsatz von Düngemitteln sowie verschiedener Chemikalien, welche die Photosynthese-Fähigkeit einer Pflanze verbessern, und von Pflanzenwachstumsregulatoren wie Pflanzenhormone. Eine nachhaltige und umweltgerechte Verbesserung des Pflanzenwachstums bzw. des Ernteertrags kann mit diesen konventionellen Methoden jedoch nicht erzielt werden.

Pflanzen können in der Natur mit Pilzen eine Lebensgemeinschaft zu beiderseitigem Vorteil eingehen (Mykorrhiza). Zahlreiche im Boden lebende Pilze interagieren mit den Wurzeln und verbessern die Nährstoffversorgung ihrer Wirtspflanzen oder stimulieren diese durch Wachstumshormone. Pilze erhalten von den Pflanzen im Gegenzug Photosynthese-Produkte. Pflanzen wachsen mit symbiontischen Pilzen allgemein besser und haben eine erhöhte Resistenz gegen schädliche Umwelteinflüsse.

Aus dem Stand der Technik ist die Verwendung lebender Pilze zur Förderung von Kulturpflanzen bekannt:

  • (1) Endomykorrhiza: Kommerzielle Produkte enthalten Mischungen von Sporen und/oder Myzel-Fragmenten von Endomykorrhiza-Pilzen aus der Abteilung Glomeromycota, welche Samen oder Setzlingen zugegeben werden. Allerdings ist nur ein Teil dieser Pilze tatsächlich für eine bestimmte Pflanzenart wirksam und/oder für die vorliegenden Bodenverhältnisse geeignet. Zudem werden vielen Produkten anorganische Nährstoffe (sogenannte ”Biostimulanzien”) zugesetzt, die allgemein das Wachstum von Pilzen hemmen. Es kann außerdem nicht ausgeschlossen werden, dass der Wachstumseffekt im Wesentlichen auf diese zugegebenen Nährstoffe zurückzuführen ist. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass Endomykorrhiza-Pilze nicht in Reinkultur gezüchtet werden können, was zur Einschränkung bei der Verwendung dieser Pilze in der Praxis führt. [1–4]
  • (2) Ektomykorrhiza: Im Handel wird Erde aus Wäldern angeboten, in der von Natur aus Ektomykorrhiza-Pilze enthalten sind. Dabei ist nicht jedoch gewährleistet, dass eine ausreichende Menge an lebensfähigem Pilz im Substrat enthalten ist. Bei diesen Produkten besteht zudem immer die Gefahr, Pflanzenschädlinge, Krankheitserreger und/oder Unkräuter in die Kulturböden mit einzubringen. Zudem haben Ektomykorrhiza-Pilze oftmals eine enge Bindung an eine oder wenige bestimmte Pflanzenarten, diese Wirtsspezifität verhindert eine breite Anwendung. [5–6]
  • (3) Endophyten: Aus EP1035776B1 ist die Verwendung des Endophyten Piriformospora indica (Sebacinales), der aus der indischen Thar-Wüste isoliert wurde, bekannt. Viele positive Effekte an co-kultivierten Pflanzen wurden beobachtet, u. a. stärkeres Wachstum, gesteigerter Widerstand gegen Pathogene und erhöhte Salztoleranz. Trotz dieser positiven Eigenschaften ist eine erfolgreiche Anwendung dieses Pilzes in Europa unwahrscheinlich und zudem kritisch zu bewerten. So geht aus der „Stellungnahme der ZKBS zur Bewertung des Pilzes Piriformospora indica” des Bundesamts für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit aus dem Jahr 1998 hervor, dass dieser Pilz in Deutschland als Fremdorganismus gelten muss, da bislang keine Hinweise auf Vorhandensein des Pilzes in Europa vorliegen. „Bevor nicht ausreichende Untersuchungen über den Wirtbereich des Pilzes und sein Ausbreitungspotential vorliegen, phytopathogene und parasitäre Eigenschaften nicht ausgeschlossen werden können und weitere Untersuchungen zur Taxonomie noch ausstehen, wird der Pilz vorläufig der Risikogruppe 2 zugeordnet”. Das bedeutet, dass alle Arbeiten mit Piriformospora indica nur unter Quarantänebedingungen erfolgen dürfen und das Ausbringen des Pilzes ins Freiland bis auf weiteres verboten ist. Ferner müsste die Anpassungsfähigkeit dieses neobiotischen, aus einer tropischen Region stammenden Pilzes an die heimischen Standorte, Bedingungen und Wirtspflanzen für seine erfolgreiche Anwendung in Europa zuerst untersucht werden.

Die Patentanmeldung US2010/0024076A1 beansprucht ein Symbiose-Produkt aus einem endophytischen Pilz Sebacina vermifera (Sebacinales) und einer Wirtspflanze, insbesondere einer Graspflanze, sowie seine Verwendung zur Förderung des Wurzelwachstums, Vermehrung der Biomasse, Ertragssteigerung sowie Erhöhung der Stresstoleranz der Wirtspflanze. Bis jetzt wurde nicht beschrieben, dass Sebacina vermifera Dauersporen bildet. Daher kann sie nicht in Form einer lagerfähigen Reinkultur gehalten werden, was ein erhebliches Hindernis für seine Verwendung in der Landwirtschaft darstellt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen für Europa heimischen Pilz für die Verwendung im land-, garten- und forstwirtschaftlichen Bereich bereitzustellen, der gute wachstumsfördernde und ertragssteigernde Eigenschaften bei Pflanzen aufweist und dabei lagerfähig ist und in Reinkultur gehalten werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Pilzes der Gattung Sebacina, der in der Lage ist Chlamydosporen zu bilden, gelöst.

Bisher war von keiner Pilzart der Gattung Sebacina bekannt, dass sie ihre Hyphen in Ketten einschnürt (moniloide Hyphen) und in der Folge Chlamydosporen bilden kann. In der vorliegenden Erfindung konnte zum ersten Mal ein Pilz isoliert und charakterisiert werden, der unter bestimmten Bedingungen Chlamydosporen bildet. Diese Eigenschaft ermöglicht es erst, dass der Pilz als lagerfähiges Produkt gehandelt und vom Endverbraucher, z. B. im Bereich der Landwirtschaft, ohne zusätzlichen Aufwand eingesetzt werden kann.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neu isolierte und charakterisierte Pilzart aus der Ordnung Sebacinales, Gattung Sebacina, die am 15. Juli 2013 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig (DSMZ) unter der Nummer DSM 27505 hinterlegt wurde, gelöst.

Die neue Pilzart wurde in den Bayerischen Alpen aus Wurzeln des Knöterichgewächses Bistorta vivipara isoliert. Es handelt sich dabei um einen endophytischen Pilz aus der Gattung Sebacina, Ordnung Sebacinales, Abteilung Basidiomyacota. Dieser Pilz wurde als eine neue bislang unbekannte Art identifiziert, charakterisiert und bekam die Artbezeichnung Sebacina herbamans, welche verdeutlichen soll, dass der neue Pilz in der Natur mit vielen krautigen Pflanzenarten assoziiert ist. Auch wurde Sebacina herbamans in den Wurzeln wichtiger Kulturpflanzen, u. a. Weizen, Triticale und Erbsen nachgewiesen. In der vorliegenden Erfindung konnte außerdem gezeigt werden, dass der Pilz Sebacina herbamans das Wachstum krautiger Pflanzen fördert.

Bei Sebacina herbamans handelt es sich um den ersten heimischen endophytischen Pilz, der in Abwesenheit der Wirtspflanzen kultiviert werden kann. Der Stamm kann kostengünstig in künstlichen Medien vermehrt werden und eignet sich daher hervorragend zur Produktion eines Inokulums, welches industriell eingesetzt werden kann.

Die Erfindung betrifft ferner Chlamydosporen sowie das Myzel des erfindungsgemäßen Pilzes. In einem speziell entwickelten Verfahren werden Bedingungen geschaffen, unter denen sich ein Pilzmyzel zuerst in Ketten einschnürt und in der Folge in zahlreiche Chlamydosporen zerfällt, welche in der Natur als widerstandsfähige Überdauerungsstrukturen realisiert werden. Diese sind schwach pigmentiert, haben verdickte Zellwände und weisen – im Vergleich zu Myzel – eine höhere Resistenz gegen Trockenheit, Temperaturschwankungen und UV-Strahlen auf. Durch die in der vorliegenden Erfindung optimierten Kulturbedingungen wird eine Septierung der Hyphen induziert, die in der Folge in zahlreiche, ellipsoide bis kugelförmige Chlamydosporen zerfallen. In dieser Form kann der Pilz als widerstands- und lagerfähiges Pilzinokulum für die Symbiose mit Kulturpflanzen verwendet werden. Nach Auskeimung der Chlamydosporen stehen zudem deutlich mehr Einheiten im Vergleich zu Myzel zur Verfügung, welche Pflanzenwurzeln besiedeln können.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine flüssige oder feste Zusammensetzung, bestehend aus dem Pilz, den Chlamydosporen, dem Pilzmyzel im Kulturmedium oder als Filtrat, in einer beliebigen Kombination. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ferner land-, garten- bzw. forstwirtschaftlich geeignete Träger oder Zusätze enthalten. In einer weiteren Ausführung stellt die Zusammensetzung ein Düngemittel dar.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren zur Induktion der Bildung moniloider Hyphen und der Chlamydosporen-Bildung bei Sebacina herbamans in künstlichen Medien und unter kontrollierten Bedingungen. Erfindungsgemäß wird der Pilz dazu in flüssigen Kulturmedien mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kultiviert. Das Medium zur maximalen Chlamydosporenbildung setzt sich erfindungsgemäß aus 0,01% bis 0,5% Glukose, insbesondere 0,1% Glukose, und 0,01% bis 0,5% NaNO3, insbesondere 0,1% NaNO3, zusammen. Normale Hyphen septieren unter diesen Bedingungen regelmäßig, es bilden sich moniloide Hyphen, die bei Reife ab sechs Wochen in Chlamydosporen zerfallen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Pilzes, seiner Chlamydosporen, seines Myzel oder der oben beschriebenen Zusammensetzung zur Wachstumsförderung, Erhöhung der Resistenz gegen Pathogene und Umweltstress und/oder zur Ertragssteigerung bei Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung im land-, garten- und/oder forstwirtschaftlichen Bereich. Weil der erfindungsgemäße Pilz mit vielen Wirtspflanzen eine Symbiose eingeht, kann er bei einem breiten Spektrum von Kultur- und/oder Wildpflanzen vorteilhaft eingesetzt werden. Da es sich dabei um eine einheimische Pilzart handelt, ist seine Verwendung auf dem Gebiet des Naturschutzes im Rahmen der Wiederherstellung geschädigter Ökosysteme ebenfalls denkbar.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren zur Wachstumsförderung, Erhöhung der Resistenz gegen Pathogene und Umweltstress und/oder zur Ertragssteigerung bei Pflanzen, wobei der erfindungsgemäße Pilz, seine Chlamydosporen, sein Myzel und/oder die oben beschriebene Zusammensetzung dem Pflanzensubstrat, den Pflanzenwurzeln, Pflanzensetzlingen und/oder den Pflanzensamen zugegeben werden.

Gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verwendungen von Pilzen bei Pflanzen weist die vorliegende Erfindung mehrere Vorteile auf:
Erstens stellt der erfindungsgemäße Pilz eine heimische Art dar. Dadurch ist er ökophysiologisch bestens an heimische Standorte, Bedingungen und Wirtspflanzen angepasst. Dies ermöglicht es dem Pilz, sich bei Ausbringung problemlos im Boden zu etablieren und mit den Pflanzen eine Symbiose einzugehen. Dies wiederum dürfte seine erfolgreiche Verwendung im land-, garten- und/oder forstwirtschaftlichen Bereich erleichtern. Zudem dürfte die Tatsache, dass es sich um einen in Mitteleuropa natürlich vorkommenden Pilz handelt, das Zulassungsverfahren für die Nutzung des Pilzes im land-, garten- und/oder forstwirtschaftlichen Bereich deutlich vereinfachen, welches seine wirtschaftliche Verwertung erst ermöglichen wird.

Zweitens ist es möglich, aufgrund seiner Fähigkeit Chlamydosporen zu bilden, den Pilz über längere Zeit widerstands- und lagerfähig zu machen. Bei einer Ausbringung in Form von Chlamydosporen kann sich der Pilz zudem einfacher im Pflanzensubstrat etablieren und mit einer größeren Zahl an Wurzeln von Wirtspflanzen eine Symbiose eingehen als im Fall einer Ausbreitung durch die Hyphen.

Drittens kann der Pilz in Reinkultur in synthetischen, sterilen Medien und ohne Wirtspflanzen vermehrt werden. Dadurch kann ausgeschlossen werden, dass zusammen mit dem Pilz potentielle Krankheitserreger, Pflanzenschädlinge o. ä. ausgebracht werden.

Viertens bildet der Pilz in der Natur Symbiose mit zahlreichen Wirtspflanzen, darunter vielen Kultur- und Nutzpflanzen und ist nicht wie viele andere bekannte Pilze auf wenige Pflanzenarten beschränkt.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand des unten beschriebenen Ausführungsbeispiels mit Bezug auf die Abbildungen beschrieben.

: Kolonien des Pilzes Sebacina herbamans in Malz-Hefeetrakt-Pepton-Medium, kultiviert bei 18°C. Festmedium, (a) 5 Tage, (b) 6 Monate nach Überimpfung; Flüssigmedium, 6 Monate nach Überimpfung (c).

: Mikromorphologie des Pilzes Sebacina herbamans. (a) Normale Hyphen ohne Schnallen und Einschnürungen in Ketten zu moniloiden Hyphen. (b) Elektronenmikroskopische Aufnahme moniloider Hyphen, der Septenporus entspricht einem Doliporus (Pfeile). (c–d) Lichtmikroskopische Aufnahmen moniloider Hyphen vor dem Zerfall (b) und nach dem Zerfall in freie Chlamydosporen (c). Der Balken entspricht 5 μm.

: Phylogenetische Beziehungen von Sebacina herbamans (fett) und verwandten, kultivierbaren Pilzarten innerhalb der Ordnung Sebacinales (Gruppe B). Basierend auf Sequenzen der Internal Transcribed Spacer (ITS1, ITS2), 5.8S und der D1/D2-Regionen der großen Untereinheit der ribosomalen DNA (28S rDNA), Alignment mit 1318 Basenpaaren. Maximum-Likelihood-Analyse mit RAxML, Bootstrap-Wahrscheinlichkeiten ≥ 60 aus 1000 Bootstrap-Runden sind angegeben. In Klammern Länder, in denen die Pilzstämme isoliert wurden.

: Co-Kultivierung von Sebacina herbamans und Piriformospora indica mit der Modellpflanze Arabidopsis thaliana nach 24 Tagen bei 16°C auf ½ MS-Medium. Die Wurzeln von co-kultivierten Pflanzen zeigen eine stärkere Verzweigung und ein stärkeres Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen ohne Pilz.

: Gesamt- und Wurzelfrischgewicht von Arabidopsis thaliana, co-kultiviert mit Sebacina herbamans und Piriformospora indica nach 24 Tagen bei 16°C auf ½ MS-Medium (n = 40). Mit Sebacina herbamans inokulierte Pflanzen hatten ein siginifikant höheres Wurzel- und Gesamtgewicht im Vergleich zu Kontrollpflanzen ohne Pilz (t-Test, P < 0.001).

: Wurzelfläche von Arabidopsis thaliana, co-kultiviert mit Sebacina herbamans und Piriformospora indica nach 24 Tagen bei 16°C. auf ½ MS-Medium (n = 40), gemessen mit ImageJ. Mit Sebacina herbamans inokulierte Pflanzen hatten eine siginifikant größere Wurzelfläche im Vergleich zu Kontrollpflanzen ohne Pilz (t-Test, P < 0.001).

: Sebacina herbamans in Wurzelzellen von Poa annua nach 34 Tagen Co-Kultur bei 16°C auf ½ MS-Medium. (a) Übersicht: eine Rindenzelle wurde vollständig von Sebacina herbamans besiedelt (Stern), der Balken entspricht 50 μm. (b–d) Detailaufnahmen besiedelter Rindenzellen (b–c) und einer Wurzelhaarzelle (d), der Balken entspricht 10 μm.

AusführungsbeispieleIsolierung des Pilzes Sebacina herbamans aus Pflanzenwurzeln

Pflanzen von Bistorta vivipara (synonym Polygonum viviparum), Familie Polygonaceae, wurden am 30.07.2010 in Bad Hindelang-Oberjoch (47°31' N, 10°24' E), Bayerische Alpen, Deutschland, gesammelt. Vitale Wurzeln wurden im Labor mehrfach mit sterilem Wasser gewaschen und den Wurzeln aufsitzende Mikroorganismen mit 30% Wasserstoffperoxid (1 min.) und 70% Ethanol (5 min.) abgetötet. Das Isolationsmedium setzte sich aus destilliertem Wasser mit 1% Agar zusammen, welches durch Autoklavieren (120°C, 20 min.) sterilisiert wurde. Nach dem Abkühlen auf ca. 40°C wurden in 99% Ethanol gelöste Antibiotika (0,002% Streptomycin und 0,005% Tetracyclin) zugegeben, das Medium in Petrischalen gegossen und vor dem Aushärten mit einer sterilen Pinzette in jede Petrischale ein 5 mm langes Stück der gereinigten und oberflächensterilisierten Wurzeln in das Medium überführt.

Entscheidend für den Isolationserfolg ist die Kombination dieser Schritte: (a) Auswahl lebender Wurzeln, (b) schonende, aber gründliche Oberflächensterilisation der Wurzeln, (c) Auswahl des geeigneten Isolationsmediums, das den zu isolierenden Pilz fördert und zugleich das Wachstum anderer, ebenfalls in der Wurzel wachsender Mikroorganismen zu hemmen, (d) Einbringen der Wurzeln in das Medium vor dem Aushärten, um oberirdisch wachsende Pilze auszuschließen.

Nach 21 Tagen Inkubation bei 18°C und in Dunkelheit wurde das Myzel des Pilzes Sebacina herbamans auf Malz-Hefeextrakt-Pepton-Agar überimpft () und durch Licht- und Elektronenmikroskopie () sowie molekulare Marker () identifiziert (siehe nächste Kapitel).

Kultivierung und morphologische Charakterisierung von Sebacina herbamans

Der Pilz Sebacina herbamans ist in unterschiedlichen Pilz- oder Bakterienmedien dauerhaft kultivierbar, u. a. in Malzextrakt-Agar (MEA), Potato-Dextrose-Agar (PDA), Malz-Hefeextrakt-Pepton-Agar (MYP) und Lysogeny-Broth-Medium (LB). In MYP-Festmedium wächst Sebacina herbamans in einem sehr kompakten, zunächst weißem (), nach wenigen Tagen hellbraunen bis ockerfarbenen Myzel in konzentrischen Ringen, die Oberfläche ist matt (). Die Kultur in Flüssigmedien ist ebenfalls möglich, wobei das Myzel in zahlreiche Tochtermyzelien zerfällt, die in kompakten Hyphenknäulen wachsen (). Durch die einfachere Abtrennung des Pilzmyzels vom Medium ist die Kultur in Flüssigmedium der Kultur in Festmedium vorzuziehen.

Die Hyphen von Sebacina herbamans haben einen Durchmesser von 1–1,5(–2) μm, sie sind schwach verzweigt, farblos, dünnwandig und septiert und haben keine Schnallen (). Die Septenporen sind Doliporen mit kontinuierlichem, leicht gebogenem Parenthesom (). Das Myzel schnürt sich durch spezielle Kulturbedingungen (siehe unten) zu moniloiden Hyphen ein () und bildet in der Folge Ketten ellipsoider bis kugelförmiger Chlamydosporen (3–5 × 4–5 μm) mit glatter, farbloser bis gelblicher Oberfläche ().

Charakterisierung von Sebacina herbamans mittels PCR und Sequenzierung(a) Phylogenetische Beziehungen mit verwandten Arten

Aus Kulturen von Sebacina herbamans, Sebacina vermifera und Piriformospora indica wurde die Gesamt-DNA isoliert und mit der Primerkombination ITS1 F/NL4 PCRs durchgeführt. Aus gereinigten PCR-Produkten wurden die Internal Transcribed Spacer (ITS1, ITS2, 5.8S) und die D1/D2-Regionen der großen Untereinheit der ribosomalen DNA (28S rDNA) sequenziert. Ergänzt wurde der Datensatz durch publizierte Sequenzen von Sebacina vermifera MAFF 305828 (DQ520096) und Sebacina vermifera MAFF 305830 (EU626002) aus GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), die uns als Kulturen nicht zur Verfügung standen. Die Sequenzen wurden mit MAFFT nach dem E-INS-i-Algorithmus aligniert und die phylogenetischen Beziehungen in einer Maximum-Likelihood-Analyse und 1000 Bootstrap-Runden mit RAxML berechnet ().

Sebacina herbamans zeigte in den ITS-D1/D2-Regionen einen Sequenzunterschied von 42 Basenpaaren (= 3,2%) zur nächsten verwandten Sequenz Sebacina vermifera MAFF 305828 (vgl. Patent US 20100024076 A1) und einen Sequenzunterschied von 230 Basenpaaren (= 17,5%) zu Piriformospora indica DSM 11827 (vgl. Patent EP 1 035 776 B1). Ein Sequenzunterschied von mehr als 3% in der ITS-Region ist als Kriterium zur Artabgrenzung in Pilzen allgemein anerkannt, wodurch der Pilz Sebacina herbamans eine eigenständige Art gegenüber Sebacina vermifera und Piriformospora indica darstellt.

Zusätzlich wurden von Sebacina herbamans die Gene der kerncodierten, zweiten großen Untereinheit der RNA-Polymerase II, Tpb2, und der mitochondrial codierten Adenosintriphosphatase-Untereinheit 6, atp6, sequenziert. Alle Sequenzen wurden in GenBank hinterlegt und können dort unter den Nummern KF061285 (ITS+28S), KF061317 (rpb2) und KF061262 (atp6) abgerufen werden.

(b) Nachweise von Sebacina herbamans in Pflanzenwurzeln

Von landwirtschaftlichen Nutzflächen wurden Pflanzen entnommen, deren Wurzeln gewaschen und mit molekularen Markern (siehe oben) auf Pilze untersucht. Dabei wurde Sebacina herbamans mit 100% Sequenzübereinstimmung im ITS-Bereich in Wurzeln zahlreicher krautiger Arten nachgewiesen, u. a. in Weizen (Triticum aestivum) und Triticale (× Triticosecale), dem Gras Ausdauernder Lolch (Lolium perenne), das in Rasenmischungen enthalten ist, der Speiseerbse (Pisum sativum), der Futter- und Gründüngungspflanze Rotklee (Trifolium pratense) sowie der Arzneipflanze Spitz-Wegerich (Plantago lanceolata).

Mittels PCR konnte gezeigt werden, dass Sebacina herbamans über die Wurzeln mit zahlreichen krautigen Pflanzenarten des Grünlandes und der Getreideäcker assoziiert ist und an Boden und Klima lokal optimal angepasst ist.

Induktion der Chlamydosporen-Bildung bei Sebacina herbamans

Zur Bildung von Chlamydosporen wurde Sebacina herbamans in flüssigen Nährmedien mit unterschiedlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen kultiviert. Je 50 ml Nährlösung wurden drei durchwachsene Agarblöcke von 5 × 5 mm Durchmesser zugefügt und in 250-ml-Erlenmeyerkolben auf dem Schüttler bei 20°C in Dunkelheit kultiviert. Die Produktion von Chlamydosporen wurde mikroskopisch überprüft. Das Medium zur maximalen Chlamydosporenbildung setzt sich aus 0,1% Glukose und 0,1% NaNO3 zusammen. Normale Hyphen septieren hier regelmäßig, es bilden sich moniloide Hyphen, die bei Reife ab sechs Wochen in dickwandige und schwach pigmentierte Chlamydosporen zerfallen ().

Co-Kultivierung von Sebacina herbamans mit Pflanzen

Die Pilze Sebacina herbamans und Piriformospora indica DSM 11827 wurden auf MYP-Agar (Festmedium) vier Wochen bei 18°C in Dunkelheit vorkultiviert. Samen der Versuchspflanzen Arabidopsis thaliana (Brassicaceae) und Poa annua (Poaceae) wurden auf folgende Weise gereinigt: mehrfach spülen mit sterilem Wasser, 1 min. in 70% Ethanol, 5 min. in 1% NaOCl, mehrfach spülen mit sterilem Wasser (je auf dem Schüttler). Die Samen wurden im Anschluss auf ½ Murashige-Skoog-Medium (MS) [7] ausgebracht. Dem MS-Medium wurden weiterhin 1% Agar, 1% Saccharose und 0,01% Casaminosäuren zugegeben (pH 5,8) und bei 4°C in Dunkelheit für 48 h zur Brechung der Samenruhegelagert. Die Keimung der Samen erfolgte anschließend bei 16°C und acht Stunden Tageslicht.

Um die Effekte zu messen, die ein Pilz auf das Pflanzenwachstum ausübt, wurden beide Organismen zusammen in Petrischalen kultiviert (Co-Kultur). Dazu wurden 10 Tage alte Pflanzenkeimlinge mit einer sterilen Pinzette auf frisches MS-Medium überführt und unter der Hauptwurzel ein ca. 5 × 5 mm großer Agarblock mit Sebacina herbamans oder Piriformopsora indica oder ohne Pilz (Kontrolle) platziert (n = 40 Pflanzen). Die Co-Kultur wurde in einer Klimakammer bei 16°C und acht Stunden Tageslicht durchgeführt. Nach 24 Tagen (Arabidopsis thaliana) bzw. 34 Tagen (Poa annua) Co-Kultur wurde die Wurzelfläche mit ImageJ Version 1.45s (http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html) vermessen und die Zahl der Wurzelspitzen gezählt. Die Wurzeln wurden getrennt von Spross und Blättern gewogen (Frischgewicht) und nach vollständiger Trocknung (2 Tage bei 60°C) erneut gewogen (Trockengewicht).

Nach 24 bzw. 34 Tagen Co-Kultur zeigten die Versuchspflanzen eine deutlich abweichende Wurzelmorphologie im Vergleich zu Kontrollpflanzen ohne Pilz (). Zusammen mit Sebacina herbamans kultivierte Arabidopsis-theliana-Pflanzen hatten signifikant mehr Wurzelspitzen, ein signifikant höheres Wurzel- und Gesamtgewicht (Frisch- und Trockengewicht, ) und signifikant mehr Wurzelfläche ().

Die lichtmikroskopische Analyse bestätigte, dass Sebacina herbamans die Wurzeln der Versuchspflanzen besiedelt. Der Pilz kolonisiert nur einzelne Wurzelhaarzellen und Rindenzellen von Pflanzenwurzeln, füllt diese aber vollständig aus ().

Literatur

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  • [7] Murashige T & Skoog F 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum 15: 473–497.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 1035776 B1 [0004, 0035]
  • US 20100024076 A1 [0035]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • http://blast.ncbi.nlm.nih.gov [0034]
  • http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html [0041]