Title:
Iterative Assemblierung und Deassemblierung von vorbestimmten, artifiziellen DNA -Konstrukten und dem spezifischen Austausch von funktionalen genetischen Elementen
Kind Code:
A9
Abstract:

Vielfältige Assemblierungsverfahren für DNA-Konstrukte höherer Ordnung für die Integration molekularer Funktion sind beschrieben und auch patentiert worden. Für den gezielten Rück- und Umbau von hochintegrierten, molekularen Konstrukten bestehen keine einheitlichen Konzepte, die in die praktische Arbeit der Molekular- und Synthetischen Biologen Eingang gefunden haben. Die gezielte und positionsgenaue Desintegration bzw. eine Option zur spezifischen Deassemblierung oder Substitution von molekularen Bauteilen muss konzeptionell bereits in die verwendeten Assemblierungsverfahren vorgesehen sein, um bereits verbaute Sequenzelemente als sequenzidentische Funktionsmodule regenerieren und erneut für molekulare Funktionsintegrationen bereitstellen zu können. Nur im Sinne der Assemblierungsreaktion sequenzidentische Module können in weiteren DNA-Konstruktionen erneut wieder eingesetzt werden. Diese Konzeptionen flexibler modularer Handhabung molekularer Funktionalität sind bislang nicht hinreichend verfolgt und verfahrenstechnisch gelöst worden. Mit den vorgestellten molekularen Strukturen ist die Wiederverwendung von Sequenzmodulen in Assemblierungsreaktionen mittels unterschiedlicher Verfahren möglich und in ihrem Aufbau sowie der daran gekoppelten Funktionalität konzeptionell implementiert. Die molekulare Konstellation eines natürlich vorkommenden restringierenden Enzympaars eröffnet diese Möglichkeit und impliziert die Weiterbildung dieser Vorlage auf der Basis artifizieller Enzymsysteme für denselben Zweck und auch für erweiterte Anwendungsbereiche. Erst die konsequente Anwendung erfindungsgemäßer molekularer Werkzeuge, wie entsprechende Enzymspezifitäten, bestimmte Konfigurationen von Ziel-DNA-Sequenzen in speziellen Vektoren und standardisierte Assemblierungsverfahren eröffnen ein weites Feld der Möglichkeit zur wiederholten Nutzung kompatibler, molekularer Bauelemente mittels bereitgestellter Sequenzelemente definierter modularer Funktionalität. Dies erhöht das Potenzial diese Sequenzelemente gegen funktional überlegene Sequenzen flexibel ...



Inventors:
Bernauer, Hubert (79249, Merzhausen, DE)
Application Number:
DE102013006487A
Publication Date:
11/06/2014
Filing Date:
04/10/2013
Assignee:
ATG: biosynthetics GmbH, 79249 (DE)
International Classes:
Claims:
1. Artifizielle, synthetische Nukleins?uremolek?le mit einer beabsichtigten Basenabfolge von 0?100% Sequenzidentit?t zu mindestens einer nat?rlichen Sequenz, die derart gestaltet sind, dass diese eine oder mehrere, hoch strukturierte, auch nat?rlich vorkommende, funktionale Sequenzmotive enthalten, die geeignet sind:
a spezifische Integrationsreaktionen von DNA zur Assemblierung in h?here-molekulare Einheiten erlauben durchzuf?hren und
b aus den zuvor assemblierten Sequenzbl?cken re-assemblierungs-kompatible, funktionale Einheiten durch De-assemblierung wieder regenerieren zu k?nnen oder
c der gezielten, positionsgenauen Substitution von spezifischen DNA-Teilsequenzen aus integrierten molekularen Funktionseinheiten zu dienen.
d diese Eigenschaften a bis c unter geeigneten Bedingungen in vitro, wie auch in vivo durchf?hren k?nnen.

2. Erfindungsgem??e Konfiguration nach (1a?d) von mindestens zwei nat?rlich vorkommenden oder artifiziell konstruierten Sequenzmotiven, mit jeweils spezifischer Motiverkennung und -bindung durch spezifische Molek?le, dadurch charakterisiert, da? diese mindestens ein Paar kompatible, jeweils sequenzspezifische Ligations- oder Rekombinations- oder Exonuclease-kompatible Enden zur Fusion zweier unterschiedlicher Molek?le beinhaltet.
Nach Aus?bung der jeweils spezifischen molekularen Reaktionen stehen die generierten Enden f?r eine nachfolgende Additionsreaktionen an den zwei Enden zweier unterschiedliche Molek?le zur Verf?gung. Die spezifische, verfahrensgerechte Fusion der verbindenden Molek?le kann an der Fusionsposition die urspr?ngliche Erkennungsspezifit?t verlieren, erfindungsgem?? muss aber
a eine, den beiden Termini eigene Sequenz derart erhalten bleiben oder neu entstehen, die man mit einer dritten Spezifit?t, an den zuvor verbundenen multiplen Sequenzelemente wieder spezifisch, en block, parallel oder sequenziell positionsgerecht voneinander trennen kann oder
b die bei der erfindungsgem??en Trennung der zuvor fusionierten Sequenzkomponenten entstehende Teilsequenzen m?ssen in der Form regenerierbar sein, wie sie f?r wiederholte erfindungsgem??e Additionsreaktionen geeignet sind.

3. Erfindungsgem??e Applikations-Box-A-BoX Konfiguration der Sequenzmotive Rn + m ... Rn + 2, Rn + 1, Rn ... GoI ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m* flankierten zu assemblierende DNA-Sequenzen derart, dass die jeweils zusammengeh?rigen, spezifischen Motivpaare erfindungsgem?? verschachtelt sind und 3' an eine Selektorbox (S-BoX) angrenzen. A-BoX-Elemente k?nnen auch per Definiton S-, T- oder M-Box-Elemente enthalten, sofern die Funktion im Zielwirt dies erfordert.
S-BOX derart gestaltet,
a dass diese f?r mindestens einen spezifischen, austauschbaren Selektionsmarker- und/oder Reportergene kodiert und diese exprimiert.
b Strukturell mindestens eine spezifische Funktion besitzt, die Toggle Ligation, -Exonukleasereaktion oder -Rekombination unterst?tzt.
c Durch mindestens eine R-site e. g. die Toggle- oder T-R-site von der an diese anschlie?ende T-BoX getrennt ist und
T-BOX ? derart gestaltet, da? diese
a f?r Elemente vorgesehen ist, die die Transferfunktionen f?r die Etablierung und Aufrechterhaltung der transferierten Sequenzen im Zielwirt (Genom, Episom) zu gew?hrleisten.
b und durch mindestens eine spezifische R-site von der M-BoX getrennt sind.
M-BoX ? derart gestaltet, da? diese
a Elemente enthalten Replikationsfunktionen f?r den die DNA-Konstrukte propagierenden/proliferierenden Wirt aufrecht erhalten (maintenance functions).
b und durch mindestens eine spezifische R-site von der A-BoX getrennt sind.

4. Erfindungsgem??e Konfiguration nach 1, 2 und 3, dass die jeweils zusammen geh?renden spezifischen Funktionselemente zu spezifischen Assemblierungsreaktionen, die mittels geeignter Sequenzelemente durch verschiedener Verfahren wie Restriktion-Ligation, Rekombination und Exonukleasereaktion herangezogen werden k?nnen.
a Erfindungsgem??e Konfiguration f?r exemplarische erfindungsgem??e Paare von TypII-Restriktionsschnittstellen nach 1 und 2 derart:
AscI(BssHII)-MauBI(BssHII) Toggle Assembly 1 und Deassemblierung
(die Reihenfolge spielt keine Rolle)
AbsI(XhoI)-SgrDI(SalI) Toggle Assembly 1
(die Reihenfolge spielt keine Rolle)
AsiSI(PvuII)-PacI Toggle Assembly 2
(die Reihenfolge spielt keine Rolle)
b exemplarisch erfindungsgem??e Paare von TypIIS-Restriktionsschnittstellen nach 1, 2 und 3 derart:
AarI 11/15(BfuAI 10/14)-BfuAI 10/14 (die Reihenfolge spielt eine Rolle)
SapI 8/11(EarI 7/10)-EarI 7/10 (die Reihenfolge spielt eine Rolle)
Hier m?ssen die Erkennungssequenzen teilweise ?ber die zu ligierenden Enden immer wieder mitgeliefert werden durch eine spezifische erfindungsgem??e Konstruktion der zu assemblierenden Sequenzen
c exemplarisch erfindungsgem?? derart,
da? insbesonders auch frei designte, konstruierte und realisierte Zielsequenz spezifisch erkennende, bindende und modifiziernede Molek?le der Typen verwendet werden:
Zinkfinger/Krab, TALEN, CRISPR von Nukleasen o. ?. mit vordefinierbaren Sequenzmotiven zur spezifischen Steuerung der Spezifit?t von Restriktions- bzw. Nickingreaktionen

5. Erfindungsgem??e Konfiguration von Sequenzmotiven zur Spaltung von DNA nach 1, 2, 3 und 4 Rn + m ... Rn + 2, Rn + 1, Rn ... GoI ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m* flankierend zu zu assemblierenden DNA-Sequenzen e. g. Expressionsboxen (A-BOX) der erfindungsgem??en Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn (DONOREN und ACCEPTOREN), mit der die zwischen den Restriktionsschnittstellen liegenden Sequenzabschnitte der jeweiligen, verschachtelten Paaren von Funktionseinheiten, wie z. B. Restriktionssschnittstellen 5'-Rm-hs-Rm-1 und Rm*-hs-Rm-1*-3' homologe Sequenzen (hs) rekombinativ assembliert werden k?nnen derart, da?
a diese alternierend mit jeweils der zugewandten homologen Seite auf Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn liegend in der seriellen Orientierung homologer Enden ... -5'.5'-3'.3'-5'.5'-3'.3'- ... derart angeordnet sind, dass die Assemblierung auch durch Rekombination in rekombinationskompetenten Organismen in vivo aber auch in vitro durchgef?hrt werden kann.
b Bezieht die Rekombination spezifische erfindungsgem??e Deassemblierungssites nach (4) mit ein, so ist die Situation gegeben, da? eine spezifische Deassemblierung dereproduzierbar Assemblate nach erfindungsgem?? nach 1, 2, 3 und 4 spezifisch erfolgen kann.
Hier m?ssen die Erkennungssequenzen ?ber die zu rekombinierenden Enden 3' immer wieder mitgeliefert werden durch eine spezifische, erfindungsgem??e Konstruktion der zu assemblierenden Sequenzen

6. Erfindungsgem??e Konfiguration von Sequenzmotiven zur Spaltung von DNA nach 1, 2, 3, 4 und 5 Rn + m ... Rn + 2, Rn + 1, Rn ... GoI ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m* flankierend zu zu assemblierenden DNA-Sequenzen e. g. Expressionsboxen (A-BOX) der erfindungsgem??en Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn (DONOREN und ACCEPTOREN), mit der die zwischen den Restriktionsschnittstellen liegenden Sequenzabschnitte der jeweiligen, verschachtelten Paaren von Funktionseinheiten, wie z. B. Restriktionssschnittstellen 5'-Rm-hs-Rm-1 und Rm*-hs-Rm-1*-3 homologe Sequenzen (hs) mittels Exonuklease reaktionen assembliert werden k?nnen derart, da?
a diese alternierend mit jeweils der zugewandten homologen Seite auf Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn liegend in der seriellen Orientierung homologer Enden ... -5'.5'-3'.3'-5'.5'-3'.3'- ... derart angeordnet sind, dass die Assemblierung auch durch Erzeugung von ?berlappenden Einzelstr?nigen DNA-Bereichen in vitro oder wenn m?glich in vivo durchgef?hrt werden kann.
b Bezieht die Exonukleasereaktion spezifische erfindungsgem??e Deassemblierungssites nach (4) mit ein, so ist die Situation gegeben, da? eine spezifische Deassemblierung dereproduzierbar Assemblate nach erfindungsgem?? nach 1, 2, 3, 4 und 5 spezifisch erfolgen kann.

7. Erfindungsgem??e Assemblierung von 5'-Rn + m ... Rn + 2, Rn + 1, Rn ... GoI ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m*-3' flankierten zu assemblierende A-BOX-DNA Sequenzen nach dem erfindungsgem??en Toggle Verfahren, das die S-BOX mit einbezieht, um alternierende Selektionsbedingungen in jedem Assemblierungszyklus zu schaffen, und damit die Selektionsbedingungen stringent auf das im Zyklus gew?nschte Assemblierungskonstrukt zu richten mit den Merkmalen:
(a) Alternierender Austausch der Selektionsmarker f?r gerade und ungerade Zykluszahlen
(b) Aufteilung der verwendeten Assemblierungsvektoren in DONOR und ACCEPTOR-Vektoren
(c) Zyklus n: ACCEPTOR-Vektor A-BOX-Elemente werden zum Assemblierungsprozess mono-terminal mit A-Rm* und T-R-site restringiert.
(d) Zyklus n: DONOR-Vektor A-BOX-Elemente werden bi-terminal mit jeweils der 5'-D-Rm und 3'- mit der ?Toggle? T-R-site restringiert.
(e) Zyklus n: Das restringierte DONOR-Sequenzelement besteht aus dem zu assemblierenden Sequenzteil und der S-BOX mit der Expressionsbox des Selektionsmarkergens.
(f) Das Sequenzelement aus Zyklus n wird in den Zyklus n: ACCEPTOR-Vektor eingesetzt (Ligation, Rekombination)
(g) Der ACCEPTOR-Vektor wird f?r die weitere Addition des DONOR-Sequenzelements Zyklus n + 1 aus (f) zur Assemblierung vorbereitet, indem mit A-Rn*-3' und T-R-site die Expressionsbox des Selektionsmarkergens herausgeschnitten wird.
(h) F?r das DONOR-Sequenzelement im Zyklus n + 1 verf?hrt man analog wie bei (d, e).

8. Erfindungsgem??e individuelle Sequenzmotive nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 in A-Box-Elementen derart, dass diese zum spezifischen Austausch individueller Sequenzelemente verwendet werden k?nnen, wie Expressionsboxen oder einzelne Regulatorelemente, codierende Sequenzen etc.
a nat?rliche Sequenzmotive
b artifziell konstruierte Sequenzmotive

9. Erfindungsgem??e Applikationskits bestehend aus sinnhaften Kombinationen von konstruktions-, funktions- und spezies-spezifischen Sequenzelementen die die erfindungsgem??en, beschriebenen Eigenschaften des Systems nach 1?8 umfassen und deren Elemente erfindungsgem?? in sich kompatibel sind.

10. Erfindungsgem??e Verwendung aller erfindungsgem??en Sequenzelemente nach 1?9, das die Automation von
a Assemblierung,
b Deassemblierung,
c Regenerierung assemblierungsf?higer Sequenzelemente, wie auch dem
d Austausch von Sequenzelementen in analytischen, sowie produktiven Expressionsverfahren
erm?glicht und das Handling von erfindungsgem?? modular aufgebauten DNA-Konstruktionen, wie Genekluster erleichtert und Deassemblierung und/oder die Substitution von Sequenzelementen erlaubt.

Description:
Oberbegriff: DNA-Assemblierung, DeassemblierungAllgemeine Einleitung

Die Struktur von nat?rlich evolvierten, biochemisch-physiologisch aktiven Molek?len und mit diesen verbundene Funktionsrelationen sind die wohl am h?ufigsten patentierten Eigenschaften von Molek?len ?berhaupt. Diese werden meist direkt mit spezifischen molekularen Affinit?ten nach dem Schl?ssel-Schloss-Prinzip oder dem ?induced fit?-Modell f?r andere, ganz kleine bis hin zu sehr gro?en Biomolek?len in Verbindung gebracht. Oft werden diese auch gepaart mit katalytischen Aktivit?ten oder prozessiven molekularen Vorg?ngen, wie molekularen Motoren beschrieben. Auch die Sequenz, Struktur und die biologische Funktion von DNA und RNA-Molek?len ist direkt mit verschiedenen Funktionsrelationen, in Verbindung mit spezifischen Interaktionen mit Ihresgleichen, sowie mit anderen Biomolek?len, wie Proteinen und Zuckerverbindungen verkn?pft, wobei die RNA neben interaktiven Prim?r- auch Sekund?r- und Terti?rstrukturen ausbilden kann. In der DNA sind Sequenzmotive der Prim?rsequenz, die sich z. T. ?berlappen und in einander geschachtelt sein k?nnen als CIS-Elemente ebenfalls funktional und treten meistens in Verbindung mit der strukturell gesteuerten, spezifischen Bindung von Proteinen in der Aus?bung einer molekularen Funktion auf. Die Bindung eines Proteins an die DNA kann weitere Bindung von weiteren Molek?len als Multi-Proteinkomplexe nach sich ziehen. DNA-Modifikations-Ligations- und Restriktionsprozesse sind durch die strukturelle Spezifit?t und den katalytischen Eigenschaften der beteiligten Enzyme in ihrer Funktion sehr zielgerichtet einsetzbar. In der Synthetischen Biologie nutzt man die nat?rlich evolvierten Funktionen von speziellen Enzymen als Werkzeuge f?r die k?nstliche Modulation und Modifikation von DNA-Molek?len zur Schaffung von artifiziellen DNA-Konstrukten mit gew?nschten, vorbestimmten Sequenzen und beabsichtigten funktionalen Eigenschaften. Die funktional optimierten individuellen Expressionsboxen und den in diesen funktional verbesserten Genen kann man z. B. zu Enzymensembles von Einheiten h?herer struktureller Ordnung (Genkluster) und integrierter Funktion (Pathways) assemblieren. Idealerweise werden die in ihrer Sequenzstruktur und Anordnung funktional definierten Sequenzelemente aus strukturell standardisierten modular aufgebauten DNA-Molek?le in einem Baukastensystem derart zusammen gebaut, so dass deren Einzelnen Komponenten wieder deassembliert werden k?nnen und in eine Form gebracht werden, die die Sequenzelemente identisch wieder zu assemblierungs-kompetenten Einheiten regeneriert und ihre Wiederverwendung flexibel in jeder Konfiguration zul?sst.

Die bekannten Assemblierungsverfahren lassen allerdings nur den Zusammenbau von doppelstr?ngiger DNA, d. h. in eine Richtung zu. Sie erm?glichen die Umkehrreaktion nicht, die spezifische Deassemblierung von bereits assemblierten, funktional abgeschlossenen modularen Sequenzelementen. Dies auch dann nicht, wenn die vorassemblierten Sequenzelemente funktional autark w?ren und in weiteren Konstrukten in anderer Konfiguration verbaut werden k?nnten. Eine molekulare R?ckbauoption kann demnach Zeit und Kosten f?r die ansonsten anfallende de novo Synthese des gesamten Konstruktes sparen. Mit den erfindungsgem??en Verfahren ist es m?glich die molekularen Strukturen einzelner Elemente aus den bereits integrierten Gesamtkonstrukten f?r neue Kombinationen in weiteren Experimenten wieder zur?ck zu gewinnen. Im dem Falle kann man bei der Reassemblierung auch neue funktionale Varianten testen. Insbesondere bei der Testung von verschiedenen Varianten einzelner Bauelemente ist eine R?ckbauoption und Wiedergewinnung f?r definierte molekulare Einzelteile mit genau denselben Eigenschaften, wie die, die vorher verbaut wurden, von gro?em Vorteil. Insbesondere auch eine Substitutionsreaktion von einzelnen Sequenzbauteilen durch eine bis mehrere Sequenz- und Funktionsvarianten ist f?r funktionale Optimierungsaufgaben des Gesamtkonstruktes von gro?em Wert.

Die hier exemplarisch vorgestellte, erfindungsgem??e Struktur und Anordnung von Sequenzelementen, der durch das erfindungsgem??e Assemblierungverfahrens erzeugten Gesamtkonstrukte generiert bei der Assemblierung automatisch eine Struktur, die den gew?nschten R?ckbau und die Wiedergewinnung einzelner Komponenten mittels der erfindungsgem??en molekularen Werkzeuge erlaubt.

Insbesondere ist diese auf den spezifischen Zielsequenzstrukturen eines Paares von Restriktionsenzymen basierende Vorgehensweises sehr einfach zu handhaben und geeignet Sequenzelemente wiederverwertbar zu machen, auch wenn die Assemblierung der Sequenzelemente mittels Rekombinationsverfahren oder 3' -> 5' bzw. 5' -> 3' Exonuklease basierten Klonierungs- bzw. Assemblierungsverfahren durchgef?hrt wurde. Einzige Voraussetzung ist es erfindungsgem??e Sequenzmotive in die Zielsequenzen zu integrieren.

Stand der Technik

Als Stand der Technik wird in diesem Dokument die ?Assemblierung? von DNA-Molek?len vorbestimmter Sequenz mit mehreren seriellen bis (semi-)parallelen Klonierungen auf der Basis verschiedener enzymatischer Prozesse ausgef?hrt.

Gegenstand dieses Dokuments bei der Darstellung des erfindungsgem??en Verfahrens ist einerseits der Aufbau eines Nebenreaktionen ausschlie?enden Selektionsdrucks auf das gew?nschte, richtige Produkt w?hrend der Assemblierung. Dies wird erreicht durch die B?ndelung verschiedener Ma?nahmen, wie unten beschrieben. Ein weiterer ma?geblicher Aspekt liegt aber andererseits auf der Eigenschaft der Deassemblierbarkeit der entsprechenden Assemblate f?r die sequenzidentische Wiedergewinnung und die Substitution von Sequenzelementen.

Die Assemblierung von DNAs kann durch eine Reihe von meist enzymatischen Prozessen in vitro, wie auch in vivo erreicht werden. Die am l?ngsten bekannten und etablierten Verfahren f?r die Assemblierung von doppelstr?ngigen DNA-Molek?len beruhen auf der Verwendung von Restriktion und Ligation (McKnight 2003), Varianten der enzymatischen DNA-Polymerisation (z. B. PCR) und verschiedene Enzyme, die Nebenreaktionen der DNA-Polymerisation, wie die enzymatischen ?proof reading? Aktivit?ten ? aber auch Verfahren wie die klassische Verwendung von Exonukleaseaktivit?ten zur Klonierung in vitro (Hsiao K 1993; Kaluz S 1992). Die F?higkeit der Exonuklease-III ?berlappende, einzelstr?ngige adh?sive 3'-Termini f?r Klonierung und Assemblierung zu schaffen wurde extensiv genutzt. Andere Enzymaktivit?ten wurden verschiedentlich jahrelang in house genutzt, wie die T7Gene6-Aktivit?t (Bernauer H 2001 pers. Komm.) manche publiziert, und z. T. auch patentiert, wie beispielsweise einfach nur die Verwendung alternativer Enzymaktivit?ten, aus z. T. hochgradig homologen genetischen Systemen, wie die T-Phagenreihe (Gibson D et al. 2009). Die erfolgreiche Patentierungen l?ngst bekannter molekularer Prinzipien mit gleichartigen Enzymen ?hnlicher Funktion in den letzten Jahren ber?hren das Thema der Neuheitlichkeit und der erfinderischen H?he von Erfindungen sehr direkt. Dies wirft Fragen ?ber das Patentsystem auf. Andere Assemblierungsverfahren nutzen spezielle Rekombinationssysteme in vitro, wie auch in vivo (Shao 2009; Yu D et al. 2000). Die Kombination verschiedener, der genannten Verfahren ist ebenso verbreitet (Gibson et al. 2009; Bang D and M Church G 2008; Yehezkel T et al. 2008).

Rekombinationsverfahren basieren oft auf spezifischen Zielsequenzen ganz spezieller Rekombinasen und Transposasen. Andere Verfahren basieren auf Enzymsystemen der generellen Rekombination. Deren Spezifit?t zur Ziel-DNA richtet sich auf die Homologien flankierender Sequenzen der zu assemblierenden Zielkonstrukte. Dies zielen auf homologe Sequenzelemente, die meist in vivo im Genom oder in episomalen Elementen liegen. Diese Rekombinasen, die beliebige Homologien zwischen Ziel-DNA und der zu addierenden DNA zur Rekombination (Murphy K 1998), nutzen k?nnen sehr viel universeller eingesetzt werden.

Eine auf einer zyklischen Ligationsreaktion basierende Variante zur DNA-Assemblierung ist besonders bekannt geworden. Bei dieser wird eine spezielle, gew?nschte ?unique?-Restriktionsschnittstelle (R-site) in jedem Assemblierungszyklus immer wieder f?r jeweils eine weitere Assemblierungsreaktion regeneriert. Die wichtigsten Protagonisten dieses Verfahrens stellen ein Reservoir von standardisierten genetischen Elementen ?Parts? im Internet zur Verf?gung, die ?Registry of Standard Biological Parts? (McKnight, 2003).

Das Verfahren beruht im Wesentlichen auf einer benachbarten terminalen Konfiguration kompatibler, uniquer Restriktionsschnittstellen, deren Sequenzhomologie sich auf den bei der Restriktion entstehenden einzelstr?ngigen ?berlappungsbereich beschr?nkt. Die durch die Restriktion entstehenden identischen, einzelstr?ngigen, terminalen ?berlappungsbereiche sind ligationskompatibel. Werden diese mit den ligationskompatiblen aber sonst nicht sequenzidentischen Erkennungsstellen zusammenligiert, so geht die Erkennungssequenzen f?r beide Enzymspezifit?ten verloren. Verwendet man demnach ein DNA-Molek?l mit jeweils einer sequenzidentischen terminalen Schnittstelle und einer, die ligationskompatibel ist, sonst aber nicht sequenzidentisch, dann wird jeweils die vollst?ndig sequenzidentische R-site regeneriert und steht f?r Folgereaktionen zur Verf?gung aber die ligationskompatible und nicht vollst?ndige R-site geht vollst?ndig verloren. In den meisten F?llen ist dieser Verkn?pfungspunkt in dem verwendeten Additionsprodukt an dieser Stelle nicht mehr spezifisch trennbar. Das Verfahren ist wegen der gro?en Redundanz gleicher Spezifit?ten und der Entstehung zu kleiner Einzelteile nicht geeignet die einmal ligierten genetischen Elemente wieder sinnvoll zu regenerieren. Ohne Aus?bung alternierenden Selektionsdrucks ist die Automatisierbarkeit des Verfahrens schlecht m?glich, wenn nicht teilweise unm?glich.

Der Nachteil der oben beschriebenen Assemblierungsverfahren ist die fehlende systemimmanente, molekulare R?ckbaum?glichkeit zu molekularen Einheiten hinreichender Gr??e, die sequenzidentisch mit den Vorl?ufermolek?len sind, und die demnach wieder in neuen Assemblierungszyklen mit ver?nderten molekularen Konfigurationen wiederverwendet werden k?nnen.

Neben den beschriebenen parallelen Assemblierungsverfahren f?r Genkonstrukte ist die hier als Toggle-Assemblierung beschriebene Prozedur einerseits als sequenzielle Methode beschrieben. Sie kann allerdings auch semi-parallel betrieben werden. Sie ist ausgelegt auf robuste Reproduzierbarkeit und stringente Selektion auf das richtige Additionsprodukt und kommt deshalb ohne die Aufreingung von Sequenzelementen aus.

BeschreibungAufgabe

Die Bereitstellung synthetischer DNA beispielsweise zum Aufbau von artifiziellen Stoffwechselwegen und Genclustern kodierend f?r die Komponenten von spezifischen Proteinkomplexen ist ein betr?chtlicher Kostenfaktor, der die M?glichkeiten f?r molekulares Design und dessen Realisierung begrenzt. Mittels der Wiederverwendbarkeit molekularer Bauteile definierter Funktion w?ren die M?glichkeiten f?r DNA-Konstruktionen und die Reichweite von Entwicklungsbudgets betr?chtlich erweiterbar. Die bislang fehlende flexible Handhabung einzelner genetischer Komponenten von artifiziell in einer gew?nschten Logik zusammengesetzten, integrierten Genfunktionen ist deshalb ein Problem. Gro?e DNA-Konstrukte mit kombinatorisch aufgebauten genetischen Elementen m?ssen unter betr?chtlichem Kostenaufwand immer wieder de novo synthetisiert werden, ohne auf Komponenten, die bereits in anderen funktional optimierte Konstrukten verwendet wurden, reproduzierbar zur?ckgreifen zu k?nnen. Die Regenerierbarkeit sequenzidentischer molekularer Einheiten und der Substituierbarkeit von molekularen Bauelementen aus bestehenden Sequenzclustern zur wiederholten Assemblierung ist Gegenstand der ?berlegungen hierf?r eine L?sung herbeizuf?hren.

L?sung

Die exemplarische, erfindungsgem??e Struktur und Anordnung von Sequenzelementen, die zur Assemblierung von doppelstr?ngiger DNA zu h?her-molekularen DNA-Assemblaten besonders geeignet sind, beruht auf der Verwendung eines beispielhaften Paares von Restriktionsenzymen mit achtmerigen Erkennungssequenzen mit bislang einzigartiger Eigenschaft. Die Nutzung dieser spezifischen Eigenschaft eignet f?r eine gezielte artifizielle und reproduzierbare, konstruktive Integration und Desintegration von DNA-Molek?len im Falle die Erkennungssequenzen sind erfindungsgem?? arrangiert.

Bei dem erfindungsgem??en, nat?rlichen Paar von Restriktionenzymen besitzen beide eine acht-merige, palindromische Erkennungssequenz (R-site). Deren Erkennungssequenzen und Schnittstellen sind re-ligationskompatibel. Die homologe Ligation derselben R-sites rekonstituiert die 8merigen R-sites AscI (GG|CGCGCC) und MauBI (CG|CGCGCG) Sequenzerkennung jeweils f?r die individuellen, korrespondierenden Restriktionsendonukleasen. Nach der Kreuzligation der beiden unterschiedlichen heterologen Restriktionstermini aber wird die Symmetrie der acht-merigen R-site gest?rt GG|CGCGCG. Der bei beiden Molek?len vorkommende sechs-merige symmetrische Sequenzkern mit der Spezifit?t f?r BssHII (G|CGCGC) bildet sich aber wieder aus. In der Gruppe der Restriktionsendonukleasen mit einer acht-merigen Erkennungssequenz ist diese Paarung von Enzymen die einzige kommerziell erh?ltliche und bekannte mit einer solchen integrierten Spezifit?t. Die zwei weiteren, in die Vektoren integrierten ligationskompatiblen, achtmerigen Restriktionsenzympaare R-sites des TypsII verdeutlichen dies. Die Toggle-sites AbsI/SgrDI und PacI/AsiSI sind zwar ligations-kompatibel aber sie regenerieren keine n?tzliche sechs-merige Kernsequenz zur positionsgerechten Deassemblierung. Ebenso die erfindungsgem??en TypIIS-Enzympaare (s. 1-b), die eine Translationsraster-gerechte Ligation von kodierenden Sequenzen erm?glichen. Sechsmerige Erkennungssequenzen mit einer gemeinsamen, sich regenerierenden vier-merigen Kernsequenz sind wegen der sehr hohen Frequenz ihres statistischen Auftretens und der zumeist kleinen Restriktionsfragmente in der Anwendung nicht praktikabel. Die Ausbildung einer sechs-merigen Kernerkennung aber ist im Vergleich der bekannten und verf?gbaren Restriktionsspezifit?ten bislang einzigartig und kann als Einzige verwendet werden, eine zuvor erfindungsgem?? assemblierte DNA wieder spezifisch und funktional intakt und reproduzierbar wieder herzustellen. Hierzu ist es jedoch erforderlich, die Sequenzspezifit?ten der erfindungsgem??en Restriktionserkennungssequenzen (R-sites) aus den anderen verwendeten synthetischen Sequenzen der zu (de-)assemblierenden Sequenzelemente herauszurechnen und diese Sequenzen in ihrer Funktion damit im Sinne des Assemblierungsverfahrens vorzubestimmen. Dies ben?tigt i. d. R. synthetische Gene. Alterniert man die Selektionsmarker bei jedem Additionsschritt der Assemblierungsreaktion, indem man den Selektionsmarker mittels der speziellen erfindungsgem??en Toggle-site (exemplarisch ist dies bei den A-Elementen AsiSI), in die Assemblierungsreaktion mit einbezieht, dann nennt sich diese erfindungsgem??e Assemblierungsreaktion ?Toggle-Assembly?. Diese ist von der Verwendung von speziellen Toggle-Vektoren abh?ngig, da nur die besondere Konfiguration der funktionalen Elemente die beschriebene zyklische Reaktionsfolge erm?glichen. Die alternierenden Selektionsmarker in Verbindung mit der Inaktivierung der Ori-Funktion bei den DONOR-Molek?len erlaubt es auf das gew?nschte Additionsprodukt einen spezifischen Selektionsdruck zu erzeugen, der die Assemblierungsreaktionen ohne Isolierung von Komponenten in die richtige Richtung steuert.

Neben dem exemplarisch dargestellten Ligationsverfahren ist es zudem m?glich DNA-Konstrukte die durch Toggle-basierte Rekombinations- oder Exonuklease-vermittelte Assemblierungsverfahren erzeugt wurden positionsgenau wieder aufzul?sen, die Sequenzelemente sequenzidentisch zu regenerieren und einer gew?nschten, vorbestimmten Wiederverwendung zuzuf?hren. Dies ist wegen der Kompatibilit?t der Standardkomponenten m?glich.

Solche strukturgebenden, genetischen Elemente lassen sich f?r viele Applikationsbereiche erweitern und verfeinern, insbesondere in die Richtung eines spezifischen Austausches von einzelnen internen Funktionselementen. F?r bestehende komplexe Assemblate mit dem Ziel hoch aktive funktional integrierte genetische Elementen konzertierter molekularer Funktion zu etablieren werden sich immer weitere Verbesserungen finden lassen. Eine strukturelle Formalisierung und Standardisierung der Assemblierung von DNA-Konstrukten ist f?r die Etablierung von funktional reproduzierbar arbeitenden und funktional autarken aber auch gegen?ber anderen genetischen Elementen abgeschlossenen molekularen Einheiten, die in verschiedenen Varianten immer wieder in neuen kombinatorischen Einheiten zusammengebaut werden sollen, von gro?em Interesse, insbesondere f?r die Automation dieser Verfahren.

F?r zuk?nftige Entwicklungen in der molekularen Medizin und der Biopharmaindustrie, aber auch der ?Wei?en Biotechnologie? sind artifizielle, multi-genische Konstrukte mit konzertierter molekularer Funktionalit?t von gro?en Wert, da Genfunktionen meist in synergistisch aktiven Genensembles abgerufen werden. Strukturell reproduzierbar aufbauende, wie auch spezifisch abbauende strukturgebende Funktionen, sowie Substitutionsfunktionen, wie auch die Systematisierung in standardisierte autark funktionale Funktionselemente sollten von gro?em konstruktivem Wert sein und die reproduzierbare Funktionalit?t von Genklustern gew?hrleisten. In weiteren erfindungsgem??en Schritten kann man solche nat?rlichen Eigenschaften wie die des exemplarischen, erfindungsgem??en Enzympaares auch mittels z. B. TypIIS-Restritionsendonukleasen, TALENS (Zhang F, et al., 2011; Miller J et al. (2010); Moscou, M and Bogdanove A (2009); CRISPR (Cong L, et al., 2013), Zinkfinger (Isalan M, 2011) oder Krab-Molek?len oder auch TALENS-Molek?len vorherbestimmen und damit logische ON und OFF Kombinationen von Fusions- bzw. Additionsprodukten herstellen, die man f?r die Konstruktion artifiziellen GenClustern verwenden kann (s. 5). Dies erlaubt es strukturell eindeutige, reproduzierbare und standardisierte Systematisierungen von autark funktionalen Funktionselementen zur freien Bildung von Arrangements besonders auch zum spezifischen Austausch von Komponenten zu nutzen. Dann kann man mit den hier vorgeschlagenen strukturellen Merkmalen deren Zielsequenzen auch zu funktional vorbestimmten Genkonstruktionen von Stoffwechselwegen und dem gezielten Austausch von genetischen Elementen verwenden. Mittels der hier vorgeschlagenen strukturellen Basis ist ein Weg vorgegeben, wie man dies organisieren kann.

DNA und auf ihr codierte genetische Funktionalit?t kann direkt als Medikament in Gentherapien, artifiziellen Zusatzorganen und auch in Verbindung mit gentechnisch vorteilhaft ver?nderten Stammzellen in Zelltherapien eingesetzt werden. Dies wird eine der schlagkr?ftigsten M?glichkeiten des Einsatzes von Synthetischer Biologie in Zukunft werden. Ebenso werden artifizielle Stoffwechselweg zuk?nftig die biologisch orientierte Chemie zum gro?en Teil mitbestimmen. Die zur Assemblierung und Deassemblierung vorgeschlagene Struktur ist in 1 dargestellt.

Beispielhaftes und erfindungsgem??es pBoX-?TOGGLE-ASSEMBLY-VECTOR SYSTEM? bestehend aus:
A-BoX-Elementen: Assembly-BoX f?r Genassemblierung Genkluster: Pathways, Proteinkomplexe
S-BoX-Elementen: Selector BoX-Elements (negativen und positiven ? Selectionsdruck generierende Gene)
T-BoX-Elementen: Assembly Box f?r multiple Zielorganismusfunktionen (Oris, Target Integration Sites)
M-BoX-elementen: ?Maintenance? Wirtsfunktionen f?r konstruktive DNA-Arbeiten (Oris, Tags, Selektoren)

Vorteile konstruktiv modularer genetischer Shuttle-Vector Systeme, wie die pBoX-Vektoren:

  • ? Genetisches Tool-box-System f?r dokumentierte und verl?ssliche Funktionalit?t
  • ? Merkmal stringenter, durchgehende, strukturelle Konformit?t bei allen Konstrukten
  • ? ?bergreifende Modularit?t durch Standardisierung der Konstruktion und Funktion
  • ? Flexible Handhabbarkeit durch ?bergreifendes Kompatibilit?tskonzept
  • ? Flexibilit?t bei der Realisierung von multi-genischen Applikationen
  • ? In Assemblierungsreaktion implementierte parallele Deassemblierungsfunktion
  • ? Austausches von Sequenzelementen bei spezifischem Substitutionsklonierungs-Designs
  • ? Spart Kosten und Zeit durch Wiederverwendbarkeit der genetischen Elemente
  • ? Funktionale Adaptapierbarkeit an viele weitere genetische Systeme
  • ? In der Summe: Schnellste Realisierungsgeschwindigkeit-time to market-Optimierung

Bei den in 1-a und -b detailliert dargestellten pBoX-Toggle-Assembly-Vektoren handelt es sich um ein konstruktiv standardisiertes Vektorsystem f?r die Integration von molekular-genetischen Einheiten zu einer artifiziellen Struktur h?herer funktionaler Ordnung. Das Vektorsystem stellt die Ausgangssituation f?r die Bereitstellung der integrierten Struktur und Anordnung dar, die aus einzelnen funktionalen genetischen Elementen mit einer vorbestimmten Position besteht. Diese ?ben ihre Funktionen auf verschiedenen molekularen Funktionsebenen aus. Einerseits gibt es zusammengesetzte genetische Elemente und andererseits genetische Prim?relemente, deren Sequenz zur Aufrechterhaltung der spezifischen Funktion nicht mehr reduziert, bzw. ver?ndert werden darf. Die h?chste Ebene sind die verschiedenen Funktionsgruppen BoX-Elemente (A-, S-, T- und M-BoX), deren Positionen genormt und unver?nderbar sind. Vier Typen von BoX-Elementen mit verschiedenen Auspr?gungen der verschiedenen Elemente sind hinreichend, um alle Funktionen einer h?her integrierten molekular-biologischen Funktionalit?t in verschiedenen genetischen Systemen abzubilden. Die A-BoX-Elemente bestehen in der jeweiligen, gew?nschten Applikation aus einer bis mehreren Expressionskassetten mit vorbestimmter funktionaler und struktureller Sequenzzusammensetzung. Die strukturellen Eigenschaften der Enzymspezifit?ten des inneren, der zwei verschachtelten Restriktionspaares AscI und MauBI wie sie in der A-BoX des Vektors (1-a) dargestellt sind, erlauben es eine DNA, die zwei terminale AscI-sites besitzt, in die zuvor durch spezifische Restriktion ge?ffnete 5'-AscI-site des Vektors einzuligieren. Dabei wird die AscI-site 5'-strukturell wiederhergestellt und die MauBI-site am 3'-Ende wird zerst?rt. Es bleibt eine BssHII-site zur?ck. Im Falle das zu addierende DNA-Konstrukt hat terminale MauBI-sites und die MauBI-site des ACCEPTORS wird ge?ffnet, so wird die 5'-AscI-site zerst?rt, es bleibt an dieser Stelle eine BssHII-site zur?ck und die 3'-MauBI-site wird regeneriert.

In jeden Fall aber wird die sechs-merige BssHII-Kernsequenz beibehalten wenn die heterologen, strukturellen Sequenzvarianten ligiert werden. In welcher Orientierung die internen Elemente im ein-zu-ligierende Konstrukt einer ExpressionsboX vorliegen soll, wird durch das Design der DONOR-Konstrukte vorbestimmt. Die Orientierung der zwischen den AscI und MauBI befindlichen (i. d. R.) Expressionsboxen kann durch die symmetrische Restriktion der beiden achtmersequenzen eignen sechsmerigen Kernsequenz BssHI umgedreht werden. Dies aber ohne die Integrit?t der beiden achtmerigen Sequenzen zu verletzen. Diese k?nnen dann wie gehabt f?r die Toggle Reaktion eingesetzt werden. Die Orientierung der internen Sequenzen ist dann vertauscht, wenn dies gew?nscht ist.

Wie oben schon erw?hnt kann die Effizienz und die Selektivit?t des Assemblierungsprozesses weiter gesteigert werden, wenn man verschiedene, alternierende Selektionsmarker der S-BoX-Elemente bei den DONOR-Konstrukten zur Selektion abwechselnd einsetzt (zyklischer Toggle-Prozess). Bezieht man nun den Selektor der S-BoX in das Assemblierungsverfahren mit ein, so entfernt man das gesamte S-BoX-Element des vorangegangenen Additionsschritts mittels MauBI und AsiSI aus dem ACCEPTOR-Vektor. Im folgenden Additionsschritt und setzt man aus dem zu diesem Schritt vorgesehenen DONOR-Konstrukt ein AscI-AsiSI-DNA-Konstrukt mittels Restriktion frei. Dann wird der Selektionsdruck immer auf das Additionsprodukt gelenkt, sofern man die DONOR-Vektoren entsprechend ausw?hlt und vorbehandelt. ?berlappende Enden f?r erfindungsgem??e Additionreaktionen basierend auf Exonuklease- oder Rekombinationsreaktionen kann man ebenso erzeugen, wenn man die Ausgangsvektoren entsprechend molekular designed hat (s. u.).

Die Erzeugung eines zus?tzlichen Selektionsdrucks auf die Entstehung der Additionsprodukte entsteht durch die funktionelle Inaktivierung der DONOR-Oris bei der Assemblierungsreaktion in vivo. Entweder die DONOR-Konstrukte besitzen spezielle pir(+)-abh?ngige ?Origins of Replication? (R6Kgamma) und werden in speziellen pir(+)-Bakterienst?mmen propagiert, oder die DONOR-Oris m?ssen durch Restriktion o. ?. in Verbindung mit einer Dephosphorylierung zerst?rt werden, damit sich diese sich bei der Religation nicht wieder rekonstituieren k?nnen.

In den beispielhaften TogBAC-A3.X.X.-Vektoren ist dies durch R6Kgamma-split-Oris gel?st, die die Insertion eines ColEI-ori (Typ: pXPG) tragen. Der zur Klonierung verwendete ColEI-ori (Typ: pXPG) wird mittels EarI bzw. SapI, TypIIS-Restriktionsendonukleasen heraus gespalten. Die Religation des Vektors alleine ergibt einen R6kgamma-ori. Bei einer m?glichen Regeneration des Vektors wird also ein Konstrukt erzeugt, das in pir(?)-E. coli-Zellen auf der ACCEPTOR-Seite nicht repliziert wird. Wird dies aber gew?nscht, dann sind diese Konstrukte in pir(+)-St?mmen von E. coli replikations-kompetent. Alternativ ist es m?glich die ApaLI-site des ColEI-Ori der DONOR-Vektoren zu zerst?ren und die Religation mittels Dephosphorylierung zu verhindern. So wird das gew?nschte Additionsprodukt durch zwei unabh?ngige Mechanismen erzwungen, die alternierende S-BoX-Selektion und die exklusive Replikationskompetenz des ACCEPTOR-Konstrukts.

Man kann auf diese Art die Aufreinigung der DNA-Konstrukte aus dem Gel verzichten und in einer ?one tube?-Reaktion die Komponenten mischen ligieren, re-transformieren und einen Selektionsdruck ausschlie?lich auf das gew?nschte Additionsprodukt erzeugen.

Dieses besteht aus dem gew?nschten, zu addierenden Sequenzelement und zus?tzlich dem alternierenden Selektionsmarker. Mittels Ligation wird dieses in den zur Ligation vorbereiteten ACCEPTOR-Vektor hineingesetzt. Dieses besitzt relativ zu dem vorangegangenen Assemblierungsschritt einen alternativen Selektor, auf den nach der Transformation die dann folgende Selektion hin erfolgt (s. 3). Das so vorgeschlagene Verfahren wurde wegen des zyklischen Umschaltens auf einen alternativen Selektionsmarker in dem S-BoX-Element Toggle-Assembly-Verfahren genannt.

Eine Reihe weiterer molekular-biologische Verfahren sind in den Jahren der molekularbiologischen Historie ausgearbeitet geworden, mit denen man DNA-Molek?le mit vorbestimmten Sequenzen assemblieren kann. Entsprechend der historischen Entdeckung verschiedener f?r die DNA-Assemblierungserfahren n?tzlicher enzymatischer Aktivit?ten teilen sich diese in Ligationsverfahren (Klassische Verfahren, iGEM-Assembly of Parts, Golden Gate), Polymerase-basierte Verfahren, wie die Exonuklease-Klonierung (5' -> 3': T7Gen6 (Bernauer pers. Comm.), T5- bzw. Lambda Exonuklease (Gibson(200); 3' -> 5': LIC (Aslandis and De Jong, 1990), SLIC) verschiedene Techniken basierend auf der PCR-Reaktion und Rekombinationsverfahren, sowie sinnhafte Kombinationen aus den genannten Verfahren, wie z. B. das k?rzlich publizierte Gibson Cloning*.

Die beschriebenen Assemblierungsverfahren lassen nur die Assemblierung in eine Richtung zu. Nach der jeweilig verwendeten Assemblierungsreaktion sind die Sequenzen nicht mehr spezifisch an den jeweiligen Verkn?pfungspunkten spaltbar und erm?glichen keine sp?tere Deassemblierung von bereits assemblierten Sequenzelementen, auch wenn diese als einfache oder aber auch zusammengesetzte genetische Funktion funktional autark sind und wieder zur?ckgewonnen in weiteren Konstrukten verbaut werden k?nnten.

Das Toggle Assembly Verfahren ist so konzipiert, dass zwischen den verschachtelten Paaren der R-sites AbsI(XhoI) und AscI am 5'-Ende und 3'- zwischen MauBI und SgrDI(SalI) Sequenzen eingebaut werden k?nnen, mit denen einerseits Rekombinationsprozesse ?ber mehrere Assemblierungsstufen hin oder eine Serie von vorbestimmten Exonuklease-Klonierungen vorgenommen werden k?nnen. Beide dieser Reaktionstypen k?nnen zur Assemblierung von DNA von der Togglereaktion und der erfindungsgem??en Konfiguration der gew?hlten Restriktionsenzympaare zur Deasemblierung der DNA-Cluster profitieren. Eine strukturelle Formalisierung und Standardisierung der Assemblierung von DNAs mit spezifischen Sequenzelementen ist von gro?em Interesse, insbesondere dort wo f?r die Etablierung von reproduzierbar funktionierenden molekular-genetischen Einheiten verschiedene Sequenzvarianten immer wieder in neuen Kombinationen zusammengebaut werden sollen.

Die hier vorgestellte Strukturierung von DNA-Assemblaten beruht auf der einzigartigen Eigenschaft eines beispielhaften Paares von Restriktionsenzymen mit einer achtmerigen Erkennungssequenz, die ligationskompatibel sind und nach Ligation der beiden unterschiedlichen Restriktionstermini einen bei beiden Molek?len vorkommenden Sequenzkern mit der Spezifit?t f?r BssHII wieder ausbilden, mit dem man nach einer erfolgten Verbindung der Molek?le z. B. mittels Ligation, aber auch Exonuklease- oder Rekombinations-vermittelt die Sequenzelemente wieder regenerieren und einer standardisierten Wiederverwendung zuf?hren kann.

Mittels der pr?diktiven Spezifit?t von nukleolytischen Molek?len, wie TALEs, CRISPR, Krab oder Zinkfingermolek?len in enger Verbindung mit der gezielten Assemblierung von molekularen Funktionseinheiten sollten sich solche strukturellen Standards f?r viele Applikationsbereiche erweitern und insbesondere auch verfeinern lassen. Deshalb ist die Erweiterung des hier dargestellten nat?rlichen Enzympaares auf weitere artifiziel konstruierte Enzymspezifit?ten mit k?nstlich vorbestimmten Zielsequenzen erfindungsgem?? mit dem hier formulierten Patent.

Insbesondere in die Richtung eines spezifischen Austausches von einzelnen Funktionselementen in komplexen Assemblaten mit konzertierten und integrierten molekularen Funktionen sollte sich weitere Verbesserungen finden lassen.

2: Zeigt erfindungsgem??e A-BoX-Expressionskassette, wie sie im erfindungsgem??en Toggle-(De-Assemblierungsprozess) f?r die Sequenzelemente AA, AB und AC dargestellt sind:

Toggle-Assembly-Prozess-Beispiel:

Beispielhafte Ausf?hrungsform: Die Kombination der optimierten Expressionskassetten mit den Genen AA, AB, AC f?r die gleichzeitige-multiple Genexpression auf einem DNA-Konstrukt unter Beibehaltung der M?glichkeit jede der verwendeten Expressionskassetten duch positionsgerechte, parallele Deassemblierung wieder in der urspr?nglichen Funktionalit?t regenerieren zu k?nnen. Die zyklisch wiederkehrende Ko-assemblierung der jeweiligen Expressionskassette erfolgt in Verbindung mit den alternierenden Selektionsmarkern S-A und S-B. F?r die Propagation und die Stabilisierung der ACCEPTOR-Vektor-DNA im Wirt der Assemblierungsreaktion wird der ?origin of replication? M2 verwendet, der sich von dem der DONOR-DNA-Konstrukte unterscheiden kann. Die T-BoX-Elemente SR-L, -R werden f?r die genetische Persistenz im Zielwirtsorganismus benutzt, um die genetischen Funktionen die Ziel-DNA (Genom oder Episom) im Zielorganismus stabil einzubringen und dort zu vermehren. (hier: spezifische Zielrekombinationsstellen SR-L links und SR-R rechts). Sie befinden sich im ACCEPTOR-Vektor.

3 zeigt das Grundprinzip des automatisierbaren Toggle-Processes unter Verwendung alternativer Selektoren, die durch Austausch der gesamten S-Box-Elemente jeweils den Selektionsdruck auf eine andere physiologische Basis stellen und auf die Bildung des jeweiligen Additionsproduktes gerichtet ist.

Toggle-AssemblierungsstrategieBeispiel mit drei Expressionsboxen:

Drei zu assemblierende Expressionsboxen (A-BoX-Elemente) jeweils mi den Genen AA, AB und AC jeweils flankiert von den zugeh?rigen Kontrollelementen sind in den DONOR Vektoren kloniert und werden mit diesen propagiert. Ein ACCEPTOR-Vektor mit den f?r den Zielwirt spezifischen T-BoX-Elementen (hier: Tn7-Rekombinationssites SR-L/-R) wird f?r die Aufnahme eines kombinierten DONOR-Elements aus A- und S-BoX, also z. B. AA und S-A durch die Restriktion mit MauBI und AsiSI vorbereitet, wobei das ACCEPTOR-S-BoX-Element mit dem S-B-Box-Element herausgeschnitten wird. Der so gespaltene ACCEPTOR-Vektor wird auf vollst?ndige Spaltung kontrolliert. Der ACCEPTOR-Vektor ohne Additionsprodukt kann wegen der Inkompatibilit?t der Restriktionsenden nicht religieren.

Der DONOR-Vektor (mit R6Kgamma-ori aus einem pir(+)-Stamm oder dem ApaLI-zerst?rten ColEI-ori) wird mit AscI und AsiSI gespalten. Durch diese Restriktion wird das DONOR-A-BoX-Fragment (hier: entweder AA, AB oder AC) gemeinsam mit dem jeweils alternativen Selektor-S-BoX-Element freigesetzt. Derart pr?parierte DONOR und ACCEPTOR Spaltprodukte werden nun zu einer Ligationreaktion zusammengebracht und gemischt. Dadurch wird das DONOR-Fragment in das ACCEPTOR-DNA-Molek?l, das das S-BoX-Element nicht mehr enth?lt, weil es mit MauBI und AsiSI herausgeschnitten wurde, einligiert. Der DONOR-Vektor kann im ACCEPTOR pir(?) E. coli Stamm nicht persistieren (alternativ ist der ColEI-Ori des DONORs zerst?rt). Die Selektion mittels des immer wieder alternierenden Selektionsdruck geht von dem einzuligierenden DONOR-Fragment auf den ACCEPTOR aus. Nur mit dem einzuligierenden Additionsprodukt plus dem alternativem Selektionsmarker, der mit dem DONOR-Konstrukt des jeweiligen Zyklus eingebracht wird kann der ACCEPTOR gegen die Selektion persistieren. Dies l?sst die Reaktion in nur eine Richtung zu. Alle weiteren denkbaren Ligationsprodukte sind nicht vital.

In dieser Situation k?nnen die zyklischen Additionsreaktion in einem Reaktionsgef?? durch bloses Mischen, ohne vorhergehende Aufreinigung und Isolierung der Komponenten mittels der Ligation des Gemisches und der anschlie?enden Selektion auf den alternativen, mit dem neuen A-BoX-Element eingebrachten Selektor durchgef?hrt werden. Der Selektionsdruck ist direkt auf das gew?nschte Additionsprodukt gerichtet. A A-Box-Toggle AssemblierungMonomere A-BoX-DONOR-Sequenzelemente:

An
= A-BoX-Element (0 ... n) mit Genen A, B, C ... N
Tf
= Transcriptions Faktoren
P
= Promotoren
T
= Terminatoren
S-A, S-B
alternierende Selektionsmarker n* (DONOR ? ACCEPTOR)
SR-L, SR-R
= linkes und rechtes Integrationsmotiv in den Zielwirt (T-BoX-Elemente)

Beschreibung des Toggle-Assembly (Assemblierungsschritte S0, S1, S2 und S3):

  • Additionsschritt-1: S0 Addition des Gen-A1A in das leere A0-BoX-Element des ACCEPTOR-Vektors,
  • Restriktion von A1A-pBoX-DONOR/AscI/AsiSI und pBoX-ACCEPTOR S0/MauBI/AsiSI (s. 3)

In diesem Schritt wird das DONOR-DNA-Element A1A, das addiert werden soll aus dem DONOR-Vektor freigesetzt und das S-Box-Element S0 vom ACCEPTOR-Vektor f?r den folgenden Additionsschritt wird entfernt, um die Addition des DONOR-Fragments pBoX-Donor-A1A in S1 vorzubereiten. Dies wird dann durch eine AscI-An-MauBI-AsiSI-Toggle-Ligation in den ACCEPTOR-Vektor eingebracht.

Additionsschritt-2: S1 Addition des Gens A1B zu dem Gen A1A-ACCEPTOR Vektor

A1B pBoX-DONOR/AscI/AsiSI und A1A-pBoX-ACCEPTOR S1/MauBI/AsiSI (s. unten)

In diesem Schritt wird das DONOR-DNA-Element A2 das addiert werden soll vom DONOR-Vector freigesetzt und das S-Box-Element S1 vom ACCEPTOR-Vektor f?r den n?chsten Additionsschritt wird entfernt, um die Addition des DONOR-Fragments A2. vorzubereiten. Dies wird dann durch eine AscI-An-MauBI-AsiSI-Toggle-Ligation in den ACCEPTOR-Vektor eingebracht.

Additionsschritt-3: S2 Addition des Gens A1C zu den Genen A1A-A1B-pBoX-ACCEPTOR Vector

A1C pBoX-DONOR/AscI/AsiSI und pBoX-ACCEPTOR S1/MauBI/AsiSI (s. unten)

In diesem Schritt wird das DONOR-DNA-Element A1C das addiert werden soll vom DONOR-Vector freigesetzt und das S-BoX-Element S2 vom ACCEPTOR-Vektor f?r den n?chsten Additionsschritt wird entfernt, um die Addition des DONOR-Fragments A1C vorzubereiten. Dies wird dann durch eine AscI-An-MauBI-AsiSI-Toggle-Ligation in den ACCEPTOR-Vektor eingebracht.

Im Ergebnis sind alle drei Gene mit Ihren jeweiligen Expressionsboxen zu einem Cluster assembliert:

S3-AssemblyCycle2: Acceptor-Vektor:

A-BoX(AbsI-AscI-SR-L-BssHII-A1A-BssHII-A1B-BssHII-AC-MauBI-SgrDI)-S-BoX:S-A-AsiSI-T-BoX-PacI-M-BoX-AbsI

Zusammenfassung der Assemblierung der Expressions-A-BoX-Elemente A1A, A1B und A1C:

A ToggleCycleCloning A-BoX: A1 zu A0 und A2 zu A1 und A3 zu A1A2 = S1, S2, S3 = A1A2A3 + S-BoX
S0 ? AssemblyCycle0: AbsI-SR-L-AscI-MauBI-SgrDI-S-B-AsiSI (Acceptor-Vector)
S1 ? AssemblyCycle1: AbsI-SR-L-BssHII-A1A-MauBI-SgrDI-S-A-AsiSI (Acceptor-Vector)
S2 ? AssemblyCycle1: AbsI-SR-L-BssHII-A1A-BssHII-A1B-MauBI-SgrDI-S-B-AsiSI (Acceptor-Vector)
S3 ? AssemblyCycle2: AbsI-SR-L-BssHII-A1A-BssHII-A1B-BssHII-A1C-MauBI-S-A-AsiSI (Acceptor-Vector)

Das fertig asssemblierte Konstrukt ist ein GenCluster von drei Genen, die jedes f?r sich mit einem Set der jeweilig beabsichtigten Kontrollelementen f?r den gew?nschten Zielwirt ausgestattet sind. Die Gene sind durch BssHII-Schnittstellen von einander getrennt und sind von Toggle sites flankiert. Mit diesen kann man entweder ganze Cluster miteinander verbinden (AbsI(XhoI) und SgrDI(SalI))
A1A-A1B-A1C + A2A-A2B ? A1A-A1B-A1C-A2A-A2B
oder weitere A-BoX-Elemente addieren (DONOR: AscI-AsiSI, ACCEPTOR: MauBI-AsiSI).

Das assemblierte A-BoX-GenCluster A1A, A1B A1C ist 5' und 3' von jeweils einer zur Zielsequenz im Zielkonstrukt homologen Rekombinationsequenz SR-L und -R flankiert f?r die stabile Integration in das Zielkonstrukt (z. B. ein BAC bzw. ein Bacmid etc.) Sie besitzen einen Selektionsmarker S-A oder S-B und ein M-BoX-Element f?r die Proliferation des Konstruktes in E. coli.

B S-BoX-Toggle Assembly

  • B1 Rekombinations Zielsequenz 3'-rechts: SR-R: AsiSI-SR-R-PacI-oriM2-AbsI (DONOR-Vektor)

AsiSI und PacI haben eine ligations-kompatible zwei-merige Kernsequenz, die sich aber nach Ligation nicht zu einem Palindrom erg?nzen. Die urspr?nglichen Restriktionsschnittstellen existieren nicht mehr. Die Kombination der beiden Enzymschittstellen ist geeignet eine Toggle-Reaktion mit der T-BoX durchzuf?hren indem man das jeweilige S-BoX-Element mit einbezieht.

Cloning B1: (AsiSI-PacI) into B2 (AsiSI-PacI)

-MauBI-S-B-AsiSI-SR-R-PacI-M2-AbsI (S-B Selektion des Toggle-Assembly der SR-R-Recombinationssite in den ACCEPTOR-Vektor:

DONOR:
A0-BoX(AbsI-AscI-MauBI-SgrDI)-S-BoX:S-A-AsiSI-T-BoX-PacI-M-BoX-AbsI

> A1-BoX(AbsI-AscI-SR-L-BssHII-AA-BssHII-AB-BssHII-AC-MauBI-SgrDI)-S-BoX:S-A-AsiSI-T-BoX: SR-R-PacI-M-BoX-AbsI
(s. 3, 8, 9).

Spezifischer Austausch von Funktionselementen:

2 und 4 zeigt die formalisierte Darstellung einer erfindungsgem??en, beispielhaften molekularen Konfiguration von Sequenzelementen f?r eine molekulare Substitutionsreaktion unter Verwendung von einzigartigen, nat?rlichen oder konstruierten (5 und 6) spezifische Affinit?t und Restriktion vermittelten molekularen Werkzeugen. In einem erfindungsgem??en ?setup? werden spezifische Parameter Restriktionsenzyme verwendet, die aus den Sequenzen einer Applikation errechnet werden zur Verf?gung zu stehen. Ein Sequenzsubstitutionskonzept sowohl auf der Ebene der intergenischen Bereiche, zum Austausch der kodierenden Sequenzen oder ganzen Expressionskassetten auf der Basis von nat?rlich vorkommenden Restriktionsschnittstellen verlangt ein ?bergreifendes Konzept zur Ermittlung der m?glichen Konfigurationen (O?wald C et al. (2012).

Hat man die M?glichkeit molekulare Zielsequenzen vorzubestimmen wie z. B. kombinatorische auf TALENS-Zielsequenzhalbseiten (5; Miller J et al. (2010); Moscou, M and Bogdanove A (2009) basierten Systeme zur Erzeugung artifizieller erfindungsgem??er Funktionalit?t, wie die Generierung von vorbestimmten Restriktionsschnittstellen (s. 5 und 6) so lie?en sich weitaus komplexere Fragen im Bereich des Pathwayengineering in vivo l?sen. Insbesondere medizinische Applikationsbereiche wie Gentherapeutische Ans?tze w?ren pl?tzlich wesentlich leichter machbar.

Die 6 zeigt mindestens zwei funktionale Fusionen von TALENs-Molek?lhalbseiten. Diese k?nnen in einer Expressionskassette eines repetitiven TALENS-Dom?nen multiplex Gene-Clusters so organisiert sein, dass sie die Zielsequenzen erkennen.

7 stellt eine formalisierte Genklustersituation dar, die f?r den spezifischen Austausch von ganzen Expressionskassetten konstruiert wurde. In 7 sind in einem integrierten molekularen Kontext mit X die De-Assemblierungs-sites; A und S: R-sites f?r die Integration verschiedener Gencluster auf ?bergeordneter Ebene; E1?E5 sind multiple Expressionskassetten mit vorbestimmten identischen R-sites X f?r Assembly and De-assembly von allen Expressionsboxen eines DNA-Konstrukts; E1?E5 ein experimenteller Setup hat kalkulierte Paare von R-sites R0-0'-R4-4' sind identische R-sites (e. g. TALENS) f?r die Substitution individueller Expressionsboxen.

Neben den nat?rlichen TypII und TypIIS-Enzymspezifit?ten eignen sich Zinkfinger, TALENS, CRISPR- und auch Krab-Molek?le f?r artifizielle Ans?tze der Modifikation von Einzelgenen und artifiziellen Stoffwechselwegen in vivo und in vitro.

Beispielhafte erfindungsgem??e Toggle-Vektoren f?r die (De-)Assemblierung von Genklustern:

Das unten in Sequenz dargestellte Expressionssystem (8 und 9) ist ausgelegt f?r die simultane Expression von mehreren Genen in mehreren Expressionskassetten auf einem Konstrukt in Insektenzellen. Die Konfiguration der Toggle-Elemente entspricht der des Basis Vektors in 1. Die Vektoren sind ausgestattet mit den A-BoX-Kontrollelementen f?r die Expression in Insektenzellen mit Baculovirus-Promotoren.
TogBAC-A3.1.1 ist ein ACCEPTOR-Vektor mit Polyhedrin-Promoter und SV40-Terminator
S-BoX: Gentamicin-Resitenz (GmR)
T-BoX: Tn7-L und Tn7-R
M-BoX: Split R6Kgamma-ColEI-ori(pXPG-Typ)
TogBAC-A3.1.2 ist ein DONOR-Vektor mit P10-Promoter und HSV-tk-Terminator
S-BoX: Gentamicin-Resitenz (KmR)
T-BoX: -
M-BoX: Split R6Kgamma-ColEI-ori(pXPG-Typ)
TogBAC-A3.2.1 ist ein ACCEPTOR-Vektor mit Polyhedrin-Promoter und SV40-Terminator
S-BoX: Gentamicin-Resitenz (GmR)
T-BoX: Tn7-L und Tn7-R
M-BoX: Split R6Kgamma-ColEI-ori(pXPG-Typ)
TogBAC-A3.2.2 ist ein DONOR-Vektor mit P10-Promoter und und HSV-tk-Terminator
S-BoX: Gentamicin-Resitenz (KmR)
T-BoX: -
M-BoX: Split R6Kgamma-ColEI-ori(pXPG-Typ)-gelb-blau-gelb

Auf den DONOR-Vektoren liegen die Gene des Interesses (GoI) in Expressionsboxen, welche durch Toggle Assemblierung zu Genklustern einer h?heren funktionalen Integration der Gene zusammengefasst werden sollen. Die Restriktionsschnittstellen NdeI (CATATG) und BclI (sind vorgesehen, um die codierenden Sequenzen der interessierenden Gene einzuklonieren. Die fertig assemblierten Genkluster, die am Ende auf dem ACCEPTOR-Vektor vorliegen, werden ?ber eine Phage T7-Transposase, deren Gen in einem E. coli-Stamm auf einem Episom vorliegt und von dort exprimiert wird in eine entsprechend spezifische Transposon-7 (Tn7) Zielsequenz einrekombiniert, die auf einem Bacmid lokalisiert ist. Das Bacmid entspricht einem modifizierten baculoviralen Genom, das als BAC (= bacterial artificial chromosome) mit einem F1-ori vorliegt. Die Integration des Genclusters wird durch ein blau-weiss-Screening unter Nutzung der ?-Gal (LacZ), ?-Komplementation mittels IPTG und dem X-Gal-Farbstoff detektiert.

Das Bacmid mit dem integrierten GenCluster von Interesse 9 wird in Insektenzellen (z. B. SF9) transfiziert. Dort entwickeln sich infekti?se Viruspartikel, die wiederum andere Insektenzellen infizieren k?nnen und sich dort replizieren. Die Vermehrung der Viruspartikel wird verwendet um Kultur?berst?nde mit gro?en Virustitern zu erzeugen, die f?r die Infektion von weiteren Zellen verwendet werden k?nnen, z. B. f?r gro?angelegte Screeningverfahren etc. Da Baculoviren auch S?ugetierzellen, z. B. humane Zellen infizieren k?nnen, dort aber nicht repliziert werden und liegen bleiben, verwendet man sie als Transduktorviren f?r eine transiente Expression mit gro?er Transduktionseffizienz.

Vorteile der Erfindung

Diese Erfindung begr?ndet sich auf der Einfachheit einer einheitlichen, modularen, molekularen Struktur eines Paares von Restriktionsenzymen, der Nachahmung ?hnlicher aber dar?ber hinaus funktional erweiterten und auch der molekularen Konstruktion Strukturen mit h?herer Selektivit?t. Insbesondere erm?glicht diese Erfindung, die aus verschiedenen, molekularen Assemblierungsverfahren hervorgegangenen integrierten Sequenzkomponenten sequenzidentisch derart wieder zu regenerieren, so dass diese erneut wieder f?r Assemblierungsreaktionen eingesetzt werden k?nnen. Die mit der beschriebenen Systematik regenerierten Sequenzmodule sind dabei in jedem der m?glichen weiteren zur Assemblierung geeigneten Verfahren, wie die Assemblierung mittels Ligation, Rekombination und Exonukleaseklonierung erneut einsetzbar, sofern es f?r die Assemblierung zuvor konzeptionell so ausgearbeitet wurde. Dieses modulare, molekulare System eignet sich als genereller Standard. F?r diese Eigenschaft ist es zweckdienlich, die Regeneration der Sequenzkomponenten in zuvor entsprechend der weiteren Verwendung pr?parierten erfindungsgem??en Toggle-Vektoren zu klonieren (s. Beispiel 1 und 8). Die Verwendung konzeptionell einheitlicher modularer Systeme in der molekularen und synthetischen Biologie kann dabei helfen, in der Forschung und Entwicklung viel Geld einzusparen. Die maximale Verf?gbarkeit von kompatiblen funktionalen genetischen Elementen kann gew?hrleistet werden. Es entstehen geringere Kosten weil die leichte Adaptierbarkeit von molekularen Konstruktionen an neue funktionale Anforderungen im Redesign kurze Entwicklungszeiten verursachen. Dabei wird wesentlich weniger Personal im Vergleich mit Einzelanfertigungen ben?tigt. Es geht einher mit einem geringen Resourcenverbrauch, geringerem Materialeinsatz und vor Allem auch einer dramatischen Reduktion von Ausbildungs- und Trainingseinheiten f?r die Einarbeitung von Mitarbeitern in das einheitliche System. Die maximale Flexibilit?t im Austausch von kompatiblen Elementen erlaubt eine flexible molekulare Konstruktion leichte Adaptierbarkeit von Toggle-Vektor basierten molekularen Applikationen mit einer erweiterten Optionen f?r kombinatorische Konstrukte. Damit einher geht ein hohes Potenzial f?r eine gesteigerte Produktivit?t. Alle genannten Eigenschaften verk?rzen die Zeit f?r den Markteintritt (?time to market?). Bei der Verwendung von standardisierten Bauteilen definierte Funktion entsteht m?glicherweise eine Reduktion von Haftungskosten im Servicebereich.

Weiterbildung der Erfindung

Im Weiteren wird die Erfindung der Nutzung nat?rlicher, enzymatischer Spezifit?ten, wie die Beschriebenen auf artifizielle Spezifit?ten mit ?hnlichen aber auch neuen Eigenschaften erweitert werden. Diese k?nnen neuerdings konstruiert werden. Konstruktive, molekulare Verfahren mit pr?determinierenden Eigenschaften f?r die Vorherbestimmung der Bindungsspezifit?t an Ziel-DNAs sind bekannt geworden. Dies trifft insbesondere f?r TALEN, CRISPR, Krab und Zinkfingerproteine zu. Die hier erfindungsgem?? dargestellte Nutzung vorbestimmter enzymatischer Erkennungssequenzen kann durch Spezifit?ten und Funktionen artifiziell hergestellter enzymatischer Entit?ten erg?nzt werden und deren Wirkungsspektren hinsichtlich eines weithin verbesserten Engineering von multiplen Genkonstrukten, Genklustern im Sinne der Regenerierbarkeit der einzelnen Komponenten, aber auch f?r den gezielten Austausch von Komponenten aus bestehenden Konstrukten in vitro, wie auch in vivo verwendet werden. Insbesondere f?r die Realisierung von artifiziellen Stoffwechselwegen mit vorbestimmten Eigenschaften ist die flexible Handhabung molekulare Bauteile von au?erordentlichen Wert. Die Automatisierbarkeit der beschriebenen erfindungsgem??en Verfahren und die zur Verf?gungstellung der molekulare Werkzeuge zur Realisierung der Verfahren in der Form von spezifischen Kits f?r eine Vielzahl verschiedener genetischer Systeme, wie z. B. hier exemplarisch dargestellt f?r das Bakulovirussystem sind die Ausrichtungen, in die diese Erfindung weiter ausgebildet werden kann. Diese Verfahren k?nnen bei der Etablierung und Nutzung vieler Anwendungen im Bereich der artifiziellen Stoffwechselwege zur aufbauenden Bereitstellung von Molek?len oder aber auch bei abbauenden Prozessen in Biorafineration dienen. Insbesondere im Bereich der molekularen Medizin bei der genetischen Modulation von Stammzellen, aber auch bei der Entwicklung von zellbasierten Diagnostika sind funktionale, artifizielle Genkluster mit integrierter, konzertierter Funktionalit?t gut denkbar.

Bezugszeichenliste

  • GoI
    (= Gene of Interest)
    An
    = A-BoX-Element (0 ... n) mit Genen A, B, C ... N (A1A, A1B ...)
    Tf
    = Transkriptionsfaktoren
    P
    = Promotoren
    T
    = Terminatoren
    S-A, S-B
    alternierende Selektionsmarker n* (DONOR ? ACCEPTOR)
    SR-L, SR-R
    = linkes und rechtes Integrationsmotiv in den Zielwirt (T-BoX-Elemente)
    T-R
    = Toggle Restriction site

Referenzen:

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  • Zengyi S et al. (2009) DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways, Nucleic Acids Research 37, e16 doi: 10.1093/nar/gkn991.
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  • Kaluz S (1992) Directional cloning of PCR products using exonuclease III. Nucleic Acids Res. 20: 4369?4370.
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Patente:

  • EP 09 154 567.3, PCT/EP2010/052892, EP 10 707 041.9, US 13/254,831, CA 2,754,161
  • EP 1047706 A2 (Text aus WO 1999047536 A2) Verfahren zur Synthese von Nucleins?uremolek?len
  • WO 2000034299 A1 Spaltung von chemisch synthetisierten Oligo-/Polynucleotiden an einer vorbestimmten Stelle (15-Jun-2000), applicants: Biochip Technologies GmbH, Klapproth Holger, Bernauer Hubert S.
  • AU 2000016578 A patent Cleavage of chemically synthesized oligonucleotides/polynucleotides in a defined position BIOCHIP TECHNOLOGIES GMBH
  • http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2013009525
  • http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2012138939
  • http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO201213892

Anlage Bezugszeichenliste

  • GoI
    (= Gene of Interest)
    An
    = A-BoX-Element (0 ... n) mit Genen A, B, C ... N (A1A, A1B ...)
    Tf
    = Transkriptionsfaktoren
    P
    = Promotoren
    T
    = Terminatoren
    S-A, S-B
    alternierende Selektionsmarker n* (DONOR ? ACCEPTOR)
    SR-L, SR-R
    = linkes und rechtes Integrationsmotiv in den Zielwirt (T-BoX-Elemente)
    T-R
    = Toggle Restriction site

Erkl?rung zu Figur 1:

1: Ausf?hrung des basalen Assemblierungsvektor-System mit einer erfindungsgem??en Konfiguration von Restriktionsenzymschnittstellen zur Toggle-(De-)Assemblierung. A Zu assemblierende A-BOX-Elemente sind mit verschachtelten Paaren kompatibler Restriktionsendonuklease-Schnittstellen versehen A: TypII, B: Typ2S, C: A und B gemischt (nicht gezeigt). A: Beide Enzymspezifit?ten des inneren Paares (AscI/MauBI) besitzen eine acht-merige Erkennungssequenz, die wiederum jeweils eine identische, sechsstellige BssHII-Kernsequenz besitzt, die nach der Ligation von Enden der unterschiedlichen Spezifit?ten wieder regeneriert wird. Die durch die Restriktion der Spezifit?ten erzeugte viermerige ?berlappungssequenz ist bei allen Spezifit?ten kompatibel. Diese Eigenschaft bei den bekannten Restriktionsenzymen mit achtmeriger Erkennungssequenz ist einzigartig und der hat technisch verwertbare Konsequenzen auf die Anwendung von Assemblierungszyklen mittels Ligation oder Rekombination. Das ?u?ere Paar der verschachtelten Restriktionsenzyme besitzt diese Eigenschaft nicht. Die beispielhafte sechsmerige kompatible Kernsequenz von AbsI ist XhoI und die von SgrDI ist SalI. XhoI und SalI haben dieselbe viermerige ?berlappung nach Restriktion und sind deshalb ligations-kompatibel. Mit diesem Enzympaar kann man auch zyklisch assemblieren. Als S-BOX-Elemente sind positive, wie auch negative Selektionsmarker vorgesehen. Die S-BOX-Elemente flankierend vorgesehenen beispielhaften Restriktionssites sind SgrDI und AsiSI. AsiSI ist die sogenannte Toggle-site. Die T-BOX ist f?r die Klonierung von Transferfunktionen vorgesehen, wie Shuttle-oris f?r Zielorganismen oder aber flankierende und spezifische Rekombination-sites. Die M-BOX-Elemente (beispielhaft flankiert von PacI und AbsI sind vorgesehen f?r die jeweiligen Wirtsfunktionen zur Vermehrung der Plasmid und Vektor-DNAs der erfindungsgem??en ACCEPTOREN und DONOREN f?r die Toggle (De-)Assemblierungsfunktionen. B: pToP-Vektoren: die TypIIS-Paare AarI/BfuAI und SapI/EarI sind jeweils bis auf eine Base sequenzidentisch, dies bei einem identischen Abstand der Restriktionsstelle von der Erkennungsstelle. Diese Variante der Toggle-Assemblyreaktion l?sst sich sehr gut auf kodierende Sequenzen anwenden. C: Iteratives Assembly eines multigenen Applikationsvektors mit Zielwirtfunktionen in det T-BoX aus DONOREN in das ACCEPTOR-Konstrukt, wie beschieben. Mischformen aus A und B

Erkl?rung zu Fig. 2:

2: Erfindungsgem??e A-BoX-Expressionskassette. Aus den individuellen A-BoX-Expressionscassetten A-1 ... An kann man Genecluster mit den Genen A-1: AA, A-2: AB, A-3: AC ... A-n: AN aufbauen (die jeweils wieder aus einzelnen Proteindom?nen-CDS um eine zentrale ?Central Gene-CDS?) aufgebaut sein k?nnen. Jede dieser Expressionskasetten sind f?r jeweils ein Gen expressionsoptimiert. Fehlen die transkriptionalen Kontrollelemente teilweise und zwischen den CDS finden sich ausschlie?lich translationale Kontrollelemente, so k?nnen die Gencluster spezies-spezifisch auch teilweise bis vollst?ndig bi-, tri- bis oligo-cistronisch als Operone aufgebaut sein. Jede dieser Expressionsboxen ist von der jeweilg anderen durch jeweils eine BssHII site (X, Y) getrennt (mit X und Y sind die ACDC = assembly cloning de-assembly cloning sites markiert), die durch den Assemblierungsprozess mittels der AscI-MauBI vermittelten DONOR/ACCEPTOR basierten Assemblierungsreaktion automatisch entstehen. Intrinsische, ?unique? Zielsequenzen f?r Restriktionsenzyme werden in die CDS der Gencluster hinein gerechnet, um nach deren Assemblierung neben der generellen De-assemblierungsfunktion auch spezifische, interessierende Sequenzelemente austauschen zu k?nnen (SD = substitution cloning). Die Substitution von einer Expressionsbox kann durch ein oder mehrere Varianten einer Variantenbibliothek erfolgen. Erkl?rung zu Figur 3:

3: Grundprinzip des automatisierbaren Toggle-Processes. A Toggle-multiple-Genassemblierung kann wird durch die Kombination der DONOR-Vektoren pBoX-A- and S- kann aber auch mit kombinierten T- and S-BoXen durchgef?hrt werden. In jedem der Zyklen wird das S-box SELECTOR Gen ausgetauscht. So wird ein alternierendes Selektionsmuster in jedem der Toggle-Zyklen erzeugt (hier: 0 ... 9). Zu transformierende Bakterien werden auf verschiedenen Selektionsmedien (markiert in hell S-A und dunkel S-B) jeweils spezifisch f?r das verwendete SELECTOR-Gen. Dies sichert eine spezifische Zwischenselektion f?r das jeweils korrekt assemblierte Produkt in jedem Additionszyklus. DONOR-Vectoren k?nnen mit R6Kg-ORIs ausgestattet sein, die in pir+-St?mmen voneinander E. coli gezogen sind und selectiv f?r DNAs in pir(?)-minus genetischem Hintergrund. B Mit alternierenden Selektionsmarkeren k?nnen iterative Assemblierungsprozesse in vitro etabliert werden. Im Restriktionsmodus mit den Enzympaaren AbsI(XhoI) und SgrDI(SalI) sowie dem die nachfolgende Deassemblierung von zuvor assemblierten Konstrukten erm?glichenden Enzympaar AscI(BssHII) und MauBI(BssHII). B Mittels Rekombination sind ?hnliche Schemata in vivo m?glich. Die Voraussetzung hierf?r ist die Insertion rekombinations-spezifischer Sequenzen, die die gew?nschte Reihenfolge der Assemblierung vorgeben. Voraussetzung ist ein entsprechende Vorpr?paraton der verwendeten Vektoren B Mittels Exonukleasereaktionen sind ?hnlich wie in B und C aufgebaute Assemblierungsreaktionen m?glich. SLIC beispielsweise mit 3' -> 5'-Exonukleaseaktivit?t, (z. B. die T4-?proof reading? Aktivit?t und zus?tzlich sind verschiedene 5'-3'-Enzymaktivit?ten m?glich, wie Lambda Exonuklease sowie T7Gen6, T5 oder T3 etc.).

Erkl?rung zu Fig. 4:

4: Feinaufl?sung der A-BoX-Region eines Gene-clusters mit den Genen ? A-1, A-2, A-3 ... A-n. C1 ... Cn sind Kontrolregionen. Die 3'-terminale Terminationskontrolle der n ? 1 Gene wird mit der 5'-Initiationskontrollregion des nachfolgenden Gens n ausgetauscht. Hier sind die CDS internen 5'- and 3'-Restriktionsschnittstellen f?r den Austausch der Kontrolregionen T = terminator T1 and der transcriptionalen and translationalen Initiationsstellen I2 ... IN and CDS1 ... CDSn R1 and R1', R2 and R2' ... Rn and Rn'.

Erkl?rung zu Fig. 5:A Kombinatorisches auf TALENS-Zielsequenzhalbseiten basierten Systems zur Erzeugung artifizieller erfindungsgem??er Funktionalit?t, wie die Generierung von vorbestimmten Restriktionsschnittstellen:

  • *ein t-Nukleotid wird am 5' Terminus ben?tigt.

5: Kombinatorische Halbseiten von vorbestimmten Zielsequenzen konstruierter TALENS-Molek?le. Die TALENs Molek?le k?nnen vorbestimmt so organisiert werden, dass sich kombinatorische Halbseiten ergeben, die sich nach Bedarf funktional steuern lassen, Zielesequenzen aufl?sen, neue generieren, sich erg?nzen und regenerieren lassen. (A) Beispielhafte kombinatorische Zielsequenz bestehend aus zwei Halbseiten f?r vorbestimmte Talensmolek?le. Zielsequenzhalbseiten k?nnen partial z. B. terminal unterschiedlich sein, wie es bei dem erfindungsgem??en nat?rlichen Molek?l der Fall ist. Aber auch andere funktional interessante Kombinationen sind erlaubt. (B) k?nnen kombiniert werden und sind geeignet f?r die Substitution von e. g. Expressions-A-BoXen oder diese beinhaltende Teil- bzw. Unterelemente und Sequenzmotive. Bei der Vermeidung von sich wiederholenden Strukturen auf der Zielsequenzeben k?nnen (n ? k)! m?gliche Variationen erzeugt werden.

Erkl?rung zu Fig. 6:verf?gbare RVDs (repeat variable domains)

6: Mindestens zwei funktionale Fusionen von TALENs-Molek?lhalbseiten k?nnen in einer Expressionskassette eines repetitiven TALENS-Dom?nen multiplex Gene-Clusters so organisiert sein, dass sie die Zielsequenzen erkennen. Die Kombinatorik sorgt f?r die Spezifit?t mit der die einzelnen Kassetten ausgetauscht werden k?nnen. Der Austausch kann durch eine oder mehrere Kassetten gleichzeitig erfolgen. Die entsprechenden Zielsequenzhalbseiten k?nnen so organisiert werden, dass sie sich zu neuen Entit?ten erg?nzen, oder sich nach dem erfindungsgem??en Vorbild es AscI-MauBI Paares so verhalten, dass eine Core-Sequenz sich regeneriert. Insbesonders f?r Substitutionen von Genen und Geneensembles (GenClusters) sinmit kombinatorischen Eigenschaften der Ziel sequenzen sind TALENs besonders gut geeignet f?r das Design von k?nstlicher, molekularer Funktionalit?t.

zu Fig. 8:Erfindungsgem??es Beispiel von Toggle-Vektoren auf denen das Assemblierungs- und De-Assemblierungsystem basiert:Erkl?rung zu Fig. 7:

7: X De-Assemblierungs-sites; A und S: R-sites f?r die Integration verschiedener Gencluster auf ?bergeordneter Ebene; E1?E5 sind multiple Expressionskassetten mit vorbestimmten identischen R-sites X f?r Assembly and De-assembly von allen Expressionsboxen eines DNA-Konstrukts; E1?E5 ein experimenteller Setup hat kalkulierte Paare von R-sites R0-0'-R4-4' sind identische R-sites (e. g. TALENS) f?r die Substitution individueller Expressionsboxen.

Erkl?rung zu Fig. 8: s. SequenzprotokollErfindungsgem??es Beispiel eines Toggle-Vektoren basierten Assemblierungs- und De-Assemblierungsystems:Fig. 8: Exemplarische Sequenzdarstellungen des erfindungsgem??en Toggle-(De-)Assembly-Systems f?r Baculovirus-Transfervektoren: TogBAC-A3.1.1, TogBAC-A3.1.3, TogBAC-A3.2.1 und TogBAC-A3.1.2.

  • >TogBAC ? A3.1.1(ACCEPTOR) GmR (2719 bp) Polyhedrin-SV40_PA-term-latePolyA
  • PacI-splitR6K?(ColEI(pXPGI-Type))R6K? ? AbsI ? Tn7L ? AscI ? Polyhedrin-Promoter ? CDS-Insertionsite ? SV40_PA-Terminator-latePolyA ? MauBI ? SgrDI ? Gentamicin-resistance ? AsiSI ? Tn7R ? PacI

  • >TogBAC ? A3.1.2. (ACCEPTOR) GmR (2813 bp) p10-Promoter-HSV tk terminator-polyA
  • PacI-splitR6K?(ColEI(pXPGI-Type))R6K? ? AbsI ? Tn7L ? AscI ? p10-Promoter ? CDS-Insertionsite ? HSV tk terminator-polyA ? MauBI ? SgrDI ? Gentamicin-resistance ? AsiSI ? Tn7R ? PacI

  • >TogBAC ? A3.2.1.(DONOR) KmR 2780 bp Polyhedrin-SV40_PA-term-latePolyA
  • PacI-splitR6K?(ColEI(pXPGI-Type))R6K? ? AbsI ? AscI ? Polyhedrin-Promoter ? CDS-Insertionsite ? SV40_PA-Terminator-latePolyA ? MauBI ? SgrDI ? Kanamycin-resistance ? AsiSI ? PacI

  • >TogBAC ? A3.2.2.(DONOR) KmR 2872 bp p10-Promoter-HSV-tk-polyA
  • PacI-splitR6K?(ColEI(pXPGI-Type))R6K? ? AbsI ? AscI ? p10-Promoter ? CDS-Insertionsite ? HSV tk terminator-polyA ? MauBI ? SgrDI ? Kanamycin-resistance ? AsiSI ? PacI

Erkl?rung zu Figur 9:Erfindungsgem??es formales Beispiel einer auf Toggle-Vektoren basierenden DNA-Assemblat:

Legende:

  • AA = A-BoX (Gene-A)
  • AB = A-BoX (Gene-B)
  • AC = A-BoX (Gene-C)
  • AD = A-BoX (Gene-D)
  • TC = total construct

9: Sequenzdarstellungen eines realisierten, erfindungsgem??en Toggle-(De-)Assembly-Systems f?r Baculovirus bestehend aus den Genen AA, AB, AC und AD. Die Sequenzen der Gene sind nicht offengelegt, da diese der Geheimhaltung unterliegen. Die Promotoren Polydedrinpromotor (polh) und p10-Promotor (p10) alternieren im Konstrukt: polh-p10-polh-p10. Das Genkluster wurde mit den Transfervektoren TogBAC-A3.1.1(ACCEPTOR), TogBAC-A3.1.2(DONOR), (TogBAC-A3.2.1(ACCEPTOR)) und TogBAC-A3.2.2.(DONOR) aufgebaut.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Ver?ffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgef?hrten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschlie?lich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA ?bernimmt keinerlei Haftung f?r etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

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  • EP 2010/052892 [0058]
  • EP 10707041 [0058]
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  • CA 2754161 [0058]
  • EP 1047706 A2 [0058]
  • WO 1999047536 A2 [0058]
  • WO 2000034299 A1 [0058]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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