Title:
Iterative Assemblierung und Deassemblierung von vorbestimmten, artifiziellen DNA -Konstrukten und dem spezifischen Austausch von funktionalen genetischen Elementen
Kind Code:
A1
Abstract:

Vielfältige Assemblierungsverfahren für DNA-Konstrukte höherer Ordnung für die Integration molekularer Funktion sind beschrieben und auch patentiert worden. Für den gezielten Rück- und Umbau von hochintegrierten, molekularen Konstrukten bestehen keine einheitlichen Konzepte, die in die praktische Arbeit der Molekular- und Synthetischen Biologen Eingang gefunden haben. Die gezielte und positionsgenaue Desintegration bzw. eine Option zur spezifischen Deassemblierung oder Substitution von molekularen Bauteilen muss konzeptionell bereits in die verwendeten Assemblierungsverfahren vorgesehen sein, um bereits verbaute Sequenzelemente als sequenzidentische Funktionsmodule regenerieren und erneut für molekulare Funktionsintegrationen bereitstellen zu können. Nur im Sinne der Assemblierungsreaktion sequenzidentische Module können in weiteren DNA-Konstruktionen erneut wieder eingesetzt werden. Diese Konzeptionen flexibler modularer Handhabung molekularer Funktionalität sind bislang nicht hinreichend verfolgt und verfahrenstechnisch gelöst worden. Mit den vorgestellten molekularen Strukturen ist die Wiederverwendung von Sequenzmodulen in Assemblierungsreaktionen mittels unterschiedlicher Verfahren möglich und in ihrem Aufbau sowie der daran gekoppelten Funktionalität konzeptionell implementiert. Die molekulare Konstellation eines natürlich vorkommenden restringierenden Enzympaars eröffnet diese Möglichkeit und impliziert die Weiterbildung dieser Vorlage auf der Basis artifizieller Enzymsysteme für denselben Zweck und auch für erweiterte Anwendungsbereiche. Erst die konsequente Anwendung erfindungsgemäßer molekularer Werkzeuge, wie entsprechende Enzymspezifitäten, bestimmte Konfigurationen von Ziel-DNA-Sequenzen in speziellen Vektoren und standardisierte Assemblierungsverfahren eröffnen ein weites Feld der Möglichkeit zur wiederholten Nutzung kompatibler, molekularer Bauelemente mittels bereitgestellter Sequenzelemente definierter modularer Funktionalität. Dies erhöht das Potenzial diese Sequenzelemente gegen funktional überlegene Sequenzen flexibel auszutauschen. Molekularen Entwicklern, die sich auf diesen molekularen Baukasten eingelassen haben und als modularen Standard führen, kann dies wegen der immensen Synergieeffekte eine erhebliche Beschleuningung Ihrer Entwicklungen im Bereich der Synthetischen Biologie bringen.



Inventors:
Bernauer, Hubert (79249, Merzhausen, DE)
Application Number:
DE102013006487A
Publication Date:
11/06/2014
Filing Date:
04/10/2013
Assignee:
ATG: biosynthetics GmbH, 79249 (DE)
International Classes:
Foreign References:
WO2010100278A22010-09-10
EP24039402012-01-11
CA2754161A12010-09-10
EP10477062000-11-02
WO1999047536A21999-09-23
WO2000034299A12000-06-15
Other References:
McKnight 2003
Hsiao K 1993; Kaluz S 1992
Bernauer H 2001 pers. Komm.
Gibson D et al. 2009
Shao 2009; Yu D et al. 2000
Gibson et al. 2009
Bang D and M Church G 2008
Yehezkel T et al. 2008
Murphy K 1998
"Registry of Standard Biological Parts" (McKnight, 2003)
Zhang F, et al., 2011
Miller J et al. (2010)
Moscou, M and Bogdanove A (2009)
Cong L, et al., 2013
Isalan M, 2011
Bernauer pers. Comm.
Aslandis and De Jong, 1990
Oßwald C et al. (2012)
Cong, L et al. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 15; 339(6121): 819-23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3
Oßwald C et al. (2012) Modular Construction of a Functional Artificial Epothilone Polyketide Pathway, ACS Synthetic Biology, DOI: 10.1021/sb300080t http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/sb300080t
Zhang F et al. (2011) Programmable Sequence-Specific Transcriptional Regulation of Mammalian Genome Using Designer TAL Effectors Biotechnol. 2011 February; 29(2): 149-153
Isalan, M. (2011) Zinc-finger nucleases: how to play two good hands. Nat Methods 9, 32-34
Miller J et al. (2010) A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 29, 143-148
Gibson D et al. (2009) Enzymatic Assembly of DNA Molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods 6, 343-345
Zengyi Shao Z (2009) DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research 37, e16
Zengyi S et al. (2009) DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways, Nucleic Acids Research 37, e16 doi:10.1093/nar/gkn991
Engler C (2009) Golden Gate Shuffling: A One-Pot DNA Shuffling Method Based on Type IIs Restriction Enzymes, PLoS ONE 4:e5553-e5553, www.plosone.org
Moscou, M and Bogdanove A (2009) A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326, 1501
Bang D and Church G (2008) Gene synthesis by circular assembly amplification Nature Methods 5: 37-39
Yehezkel T et al. (2008) De novo DNA synthesis using single molecule PCR, Nucleic Acids Res. 36:e107
Knight T (2003) Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. Boston: MIT Synthetic Biology Working Group
Li M and Elledge S (2007) Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods 4: 251-256
Bernauer H. (2001) In house knowledge: use of T7 Gene6 Exonuclease activity for gene assembly for years without patenting
Zhang Y et al. (2000) DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli Nature Biotechnology 18, 1314-1317
Yu D et al. (2000) An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli PNAS 97, 5978-5983
Zhang, Y. Et al. (1998) A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics 20: 123-128
Murphy K. (1998) Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J. Bacteriol. 180: 2063-2071
Hsiao K. (1993) Exonuclease III induced ligase-free directional subcloning of PCR products, Nucleic Acids Res. 21: 5528-9
Kaluz S (1992) Directional cloning of PCR products using exonuclease III. Nucleic Acids Res. 20: 4369- 4370
Matsuoka T, et al. (1991) Direct cloning of a long restriction fragment aided with a jumping clone. Gene. Oct 30; 107(1): 27-35
Aslanidis C and de Jong P (1990) Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18: 6069-74
http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2013009525
http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2012138939
http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO201213892
Claims:
1. Artifizielle, synthetische Nukleinsäuremoleküle mit einer beabsichtigten Basenabfolge von 0–100% Sequenzidentität zu mindestens einer natürlichen Sequenz, die derart gestaltet sind, dass diese eine oder mehrere, hoch strukturierte, auch natürlich vorkommende, funktionale Sequenzmotive enthalten, die geeignet sind:
a spezifische Integrationsreaktionen von DNA zur Assemblierung in höhere-molekulare Einheiten erlauben durchzuführen und
b aus den zuvor assemblierten Sequenzblöcken re-assemblierungs-kompatible, funktionale Einheiten durch De-assemblierung wieder regenerieren zu können oder
c der gezielten, positionsgenauen Substitution von spezifischen DNA-Teilsequenzen aus integrierten molekularen Funktionseinheiten zu dienen.
d diese Eigenschaften a bis c unter geeigneten Bedingungen in vitro, wie auch in vivo durchführen können.

2. Erfindungsgemäße Konfiguration nach (1a–d) von mindestens zwei natürlich vorkommenden oder artifiziell konstruierten Sequenzmotiven, mit jeweils spezifischer Motiverkennung und -bindung durch spezifische Moleküle, dadurch charakterisiert, daß diese mindestens ein Paar kompatible, jeweils sequenzspezifische Ligations- oder Rekombinations- oder Exonuclease-kompatible Enden zur Fusion zweier unterschiedlicher Moleküle beinhaltet.
Nach Ausübung der jeweils spezifischen molekularen Reaktionen stehen die generierten Enden für eine nachfolgende Additionsreaktionen an den zwei Enden zweier unterschiedliche Moleküle zur Verfügung. Die spezifische, verfahrensgerechte Fusion der verbindenden Moleküle kann an der Fusionsposition die ursprüngliche Erkennungsspezifität verlieren, erfindungsgemäß muss aber
a eine, den beiden Termini eigene Sequenz derart erhalten bleiben oder neu entstehen, die man mit einer dritten Spezifität, an den zuvor verbundenen multiplen Sequenzelemente wieder spezifisch, en block, parallel oder sequenziell positionsgerecht voneinander trennen kann oder
b die bei der erfindungsgemäßen Trennung der zuvor fusionierten Sequenzkomponenten entstehende Teilsequenzen müssen in der Form regenerierbar sein, wie sie für wiederholte erfindungsgemäße Additionsreaktionen geeignet sind.

3. Erfindungsgemäße Applikations-Box-A-BoX Konfiguration der Sequenzmotive Rn + m ... Rn + 2, Rn + 1, Rn ... Gol ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m* flankierten zu assemblierende DNA – Sequenzen derart, dass die jeweils zusammengehörigen, spezifischen Motivpaare erfindungsgemäß verschachtelt sind und 3' an eine Selektorbox (S-BoX) angrenzen. A-BoX-Elemente können auch per Definiton S-, T- oder M-Box-Elemente enthalten, sofern die Funktion im Zielwirt dies erfordert.
S-BOX derart gestaltet,
a dass diese für mindestens einen spezifischen, austauschbaren Selektionsmarker- und/oder Reportergene kodiert und diese exprimiert.
b Strukturell mindestens eine spezifische Funktion besitzt, die Toggle Ligation, -Exonukleasereaktion oder -Rekombination unterstützt.
c Durch mindestens eine R-site e. g. die Toggle- oder T-R-site von der an diese anschließende T-BoX getrennt ist und
T-BOX-derart gestaltet, daß diese
a für Elemente vorgesehen ist, die die Transferfunktionen für die Etablierung und Aufrechterhaltung der transferierten Sequenzen im Zielwirt (Genom, Episom) zu gewährleisten.
b und durch mindestens eine spezifische R-site von der M-BoX getrennt sind.
M-BoX-derart gestaltet, daß diese
a Elemente enthalten Replikationsfunktionen für den die DNA-Konstrukte propagierenden/proliferierenden Wirt aufrecht erhalten (maintenance functions).
b und durch mindestens eine spezifische R-site von der A-BoX getrennt sind.

4. Erfindungsgemäße Konfiguration nach 1, 2 und 3, dass die jeweils zusammen gehörenden spezifischen Funktionselemente zu spezifischen Assemblierungsreaktionen, die mittels geeignter Sequenzelemente durch verschiedener Verfahren wie Restriktion-Ligation, Rekombination und Exonukleasereaktion herangezogen werden können.
a Erfindungsgemäße Konfiguration für exemplarische erfindungsgemäße Paare von TypII-Restriktionsschnittstellen nach 1 und 2 derart:
AscI(BssHII)-MauBI(BssHII) Toggle Assembly 1 und Deassemblierung
(die Reihenfolge spielt keine Rolle)
AbsI(XhoI)-SgrDI(SalI) Toggle Assembly 1
(die Reihenfolge spielt keine Rolle)
AsiSI(PvuII)-PacI Toggle Assembly 2
(die Reihenfolge spielt keine Rolle)
b exemplarisch erfindungsgemäße Paare von TypIIS-Restriktionsschnittstellen nach 1, 2 und 3 derart:
AarI 11/15(BfuAI 10/14)-BfuAI 10/14 (die Reihenfolge spielt eine Rolle)
SapI 8/11(EarI 7/10)-EarI 7/10 (die Reihenfolge spielt eine Rolle)
Hier müssen die Erkennungssequenzen teilweise über die zu ligierenden Enden immer wieder mitgeliefert werden durch eine spezifische erfindungsgemäße Konstruktion der zu assemblierenden Sequenzen
c exemplarisch erfindungsgemäß derart,
daß insbesonders auch frei designte, konstruierte und realisierte Zielsequenz spezifisch erkennende, bindende und modifiziernede Moleküle der Typen verwendet werden: Zinkfinger/Krab, TALEN, CRISPR von Nukleasen o. ä. mit vordefinierbaren Sequenzmotiven zur spezifischen Steuerung der Spezifität von Restriktions- bzw. Nickingreaktionen

5. Erfindungsgemäße Konfiguration von Sequenzmotiven zur Spaltung von DNA nach 1, 2, 3 und 4 Rn + m Rn + 2, Rn + 1, Rn ... Gol ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m* flankierend zu zu assemblierenden DNA-Sequenzen e. g. Expressionsboxen (A-BOX) der erfindungsgemäßen Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn (DONOREN und ACCEPTOREN), mit der die zwischen den Restriktionsschnittstellen liegenden Sequenzabschnitte der jeweiligen, verschachtelten Paaren von Funktionseinheitn, wie z. B. Restriktionssschnittstellen 5'-Rm-hs-Rm-1 und Rm*-hs-Rm-1*-3' homologe Sequenzen (hs) rekombinativ assembliert werden können derart, daß
a diese alternierend mit jeweils der zugewandten homologen Seite auf Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn liegend in der seriellen Orientierung homologer Enden ... -5'. 5'-3'. 3'-5'. 5'-3'. 3'- ... derart angeordnet sind, dass die Assemblierung auch durch Rekombination in rekombinationskompetenten Organismen in vivo aber auch in vitro durchgeführt werden kann.
b Bezieht die Rekombination spezifische erfindungsgemäße Deassemblierungssites nach (4) mit ein, so ist die Situation gegeben, daß eine spezifische Deassemblierung dereproduzierbar Assemblate nach erfindungsgemäß nach 1, 2, 3 und 4 spezifisch erfolgen kann.
Hier müssen die Erkennungssequenzen über die zu rekombinierenden Enden 3' immer wieder mitgeliefert werden durch eine spezifische, erfindungsgemäße Konstruktion der zu assemblierenden Sequenzen

6. Erfindungsgemäße Konfiguration von Sequenzmotiven zur Spaltung von DNA nach 1, 2, 3, 4 und 5 Rn + m ... Rn + 2, Rn + 1, Rn ... Gol ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m* flankierend zu zu assemblierenden DNA-Sequenzen e. g. Expressionsboxen (A-BOX) der erfindungsgemäßen Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn (DONOREN und ACCEPTOREN), mit der die zwischen den Restriktionsschnittstellen liegenden Sequenzabschnitte der jeweiligen, verschachtelten Paaren von Funktionseinheitn, wie z. B. Restriktionssschnittstellen 5'-Rm-hs-Rm-1 und Rm*-hs-Rm-1*-3 homologe Sequenzen (hs) mittels Exonuklease reaktionen assembliert werden können derart, daß
a diese alternierend mit jeweils der zugewandten homologen Seite auf Assemblierungsvektoren V1, V2 ... Vn liegend in der seriellen Orientierung homologer Enden ... -5'. 5'-3'. 3'-5'. 5'-3'. 3'- ... derart angeordnet sind, dass die Assemblierung auch durch Erzeugung von überlappenden Einzelstränigen DNA-Bereichen in vitro oder wenn möglich in vivo durchgeführt werden kann.
b Bezieht die Exonukleasereaktion spezifische erfindungsgemäße Deassemblierungssites nach (4) mit ein, so ist die Situation gegeben, daß eine spezifische Deassemblierung dereproduzierbar Assemblate nach erfindungsgemäß nach 1, 2, 3, 4 und 5 spezifisch erfolgen kann.

7. Erfindungsgemäße Assemblierung von 5'-Rn + m ... Rn + 2, Rn + 1, Rn ... Gol ... Rn*, Rn + 1*, Rn + 2 ... Rn + m*-3' flankierten zu assemblierende A-BOX-DNA Sequenzen nach dem erfindungsgemäßen Toggle Verfahren, das die S-BOX mit einbezieht, um alternierende Selektionsbedingungen in jedem Assemblierungszyklus zu schaffen, und damit die Selektionsbedingungen stringent auf das im Zyklus gewünschte Assemblierungskonstrukt zu richten mit den Merkmalen:
(a) Alternierender Austausch der Selektionsmarker für gerade und ungerade Zykluszahlen
(b) Aufteilung der verwendeten Assemblierungsvektoren in DONOR und ACCEPTOR-Vektoren
(c) Zyklus n: ACCEPTOR-Vektor A-BOX-Elemente werden zum Assemblierungsprozess mono-terminal mit A-Rm* und T-R-site restringiert.
(d) Zyklus n: DONOR-Vektor A-BOX-Elemente werden bi-terminal mit jeweils der 5'-D-Rm und 3'- mit der „Toggle” T-R-site restringiert.
(e) Zyklus n: Das restringierte DONOR-Sequenzelement besteht aus dem zu assemblierenden Sequenzteil und der S-BOX mit der Expressionsbox des Selektionsmarkergens.
(f) Das Sequenzelement aus Zyklus n wird in den Zyklus n: ACCEPTOR-Vektor eingesetzt (Ligation, Rekombination)
(g) Der ACCEPTOR-Vektor wird für die weitere Addition des DONOR-Sequenzelements Zyklus n + 1 aus (f) zur Assemblierung vorbereitet, indem mit A-Rn*-3' und T-R-site die Expressionsbox des Selektionsmarkergens herausgeschnitten wird.
(h) Für das DONOR-Sequenzelement im Zyklus n + 1 verfährt man analog wie bei (d, e).

8. Erfindungsgemäße individuelle Sequenzmotive nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 in A-Box-Elementen derart, dass diese zum spezifischen Austausch individueller Sequenzelemente verwendet werden können, wie Expressionsboxen oder einzelne Regulatorelemente, codierende Sequenzen etc.
a natürliche Sequenzmotive
b artifziell konstruierte Sequenzmotive

9. Erfindungsgemäße Applikationskits bestehend aus sinnhaften Kombinationen von konstruktions-, funktions- und spezies-spezifischen Sequenzelementen die die erfindungsgemäßen, beschriebenen Eigenschaften des Systems nach 1–8 umfassen und deren Elemente erfindungsgemäß in sich kompatibel sind.

10. Erfindungsgemäße Verwendung aller erfindungsgemäßen Sequenzelemente nach 1–9, das die Automation von
a Assemblierung,
b Deassemblierung,
c Regenerierung assemblierungsfähiger Sequenzelemente, wie auch dem
d Austausch von Sequenzelementen in analytischen, sowie produktiven Expressionsverfahren
ermöglicht und das Handling von erfindungsgemäß modular aufgebauten DNA-Konstruktionen, wie Genekluster erleichtert und Deassemblierung und/oder die Substitution von Sequenzelementen erlaubt.

Description:
Oberbegriff: DNA-Assemblierung, DeassemblierungAllgemeine Einleitung

Die Struktur von natürlich evolvierten, biochemisch-physiologisch aktiven Molekülen und mit diesen verbundene Funktionsrelationen sind die wohl am häufigsten patentierten Eigenschaften von Molekülen überhaupt. Diese werden meist direkt mit spezifischen molekularen Affinitäten nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip oder dem „induced fit”-Modell für andere, ganz kleine bis hin zu sehr großen Biomolekülen in Verbindung gebracht. Oft werden diese auch gepaart mit katalytischen Aktivitäten oder prozessiven molekularen Vorgängen, wie molekularen Motoren beschrieben. Auch die Sequenz, Struktur und die biologische Funktion von DNA und RNA-Molekülen ist direkt mit verschiedenen Funktionsrelationen, in Verbindung mit spezifischen Interaktionen mit Ihresgleichen, sowie mit anderen Biomolekülen, wie Proteinen und Zuckerverbindungen verknüpft, wobei die RNA neben interaktiven Primär- auch Sekundär- und Tertiärstrukturen ausbilden kann. In der DNA sind Sequenzmotive der Primärsequenz, die sich z. T. überlappen und in einander geschachtelt sein können als CIS-Elemnete ebenfalls funktional und treten meistens in Verbindung mit der strukturell gesteuerten, spezifischen Bindung von Proteinen in der Ausübung einer molekularen Funktion auf. Die Bindung eines Proteins an die DNA kann weitere Bindung von weiteren Molekülen als Multi-Proteinkomplexe nach sich ziehen. DNA-Modifikations-Ligations- und Restriktionsprozesse sind durch die strukturelle Spezifität und den katalytischen Eigenschaften der beteiligten Enzyme in ihrer Funktion sehr zielgerichtet einsetzbar. In der Synthetischen Biologie nutzt man die natürlich evolvierten Funktionen von speziellen Enzymen als Werkzeuge für die künstliche Modulation und Modifikation von DNA-Molekülen zur Schaffung von artifiziellen DNA-Konstrukten mit gewünschten, vorbestimmten Sequenzen und beabsichtigten funktionalen Eigenschaften. Die funktional optimierten individuellen Expressionsboxen und den in diesen funktional verbesserten Genen kann man z. B. zu Enzymensembles von Einheiten höherer struktureller Ordnung (Genkluster) und integrierter Funktion (Pathways) assemblieren. Idealerweise werden die in ihrer Sequenzstruktur und Anordnung funktional definierten Sequenzelemente aus strukturell standardisierten modular aufgebauten DNA-Moleküle in einem Baukastensystem derart zusammen gebaut, so dass deren Einzelnen Komponenten wieder deassembliert werden können und in eine Form gebracht werden, die die Sequenzelemente identisch wieder zu assemblierungs-kompetenten Einheiten regeneriert und ihre Wiederverwendung flexibel in jeder Konfiguration zulässt.

Die bekannten Assemblierungsverfahren lassen allerdings nur den Zusammenbau von doppelsträngiger DNA, d. h. in eine Richtung zu. Sie ermöglichen die Umkehrreaktion nicht, die spezifische Deassemblierung von bereits assemblierten, funktional abgeschlossenen modularen Sequenzelementen.

Dies auch dann nicht, wenn die vorassemblierten Sequenzelemente funktional autark wären und in weiteren Konstrukten in anderer Konfiguration verbaut werden könnten. Eine molekulare Rückbauoption kann demnach Zeit und Kosten für die ansonsten anfallende de novo Synthese des gesamten Konstruktes sparen. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich die molekularen Strukturen einzelner Elemente aus den bereits integrierten Gesamtkonstrukten für neue Kombinationen in weiteren Experimenten wieder zurück zu gewinnen. Im dem Falle kann man bei der Reassemblierung auch neue funktionale Varianten testen. Insbesondere bei der Testung von verschiedenen Varianten einzelner Bauelemente ist eine Rückbauoption und Wiedergewinnung für definierte molekulare Einzelteile mit genau denselben Eigenschaften, wie die, die vorher verbaut wurden, von großem Vorteil.

Insbesondere auch eine Substitutionsreaktion von einzelnen Sequenzbauteilen durch eine bis mehrere Sequenz- und Funktionsvarianten ist für funktionale Optimierungsaufgaben des Gesamtkonstruktes von großem Wert.

Die hier exemplarisch vorgestellte, erfindungsgemäße Struktur und Anordnung von Sequenzelementen, der durch das erfindungsgemäße Assemblierungverfahrens erzeugten Gesamtkonstrukte generiert bei der Assemblierung automatisch eine Struktur, die den gewünschten Rückbau und die Wiedergewinnung einzelner Komponenten mittels der erfindungsgemäßen molekularen Werkzeuge erlaubt.

Insbesondere ist diese auf den spezifischen Zielsequenzstrukturen eines Paares von Restriktionsenzymen basierende Vorgehensweises sehr einfach zu handhaben und geeignet Sequenzelemente wiederverwertbar zu machen, auch wenn die Assemblierung der Sequenzelemente mittels Rekombinationsverfahren oder 3' -> 5' bzw. 5' -> 3' Exonuklease basierten Klonierungs- bzw. Assemblierungsverfahren durchgeführt wurde. Einzige Voraussetzung ist es erfindungsgemäße Sequenzmotive in die Zielsequenzen zu integrieren.

Stand der Technik

Als Stand der Technik wird in diesem Dokument die „Assemblierung” von DNA-Molekülen vorbestimmter Sequenz mit mehreren seriellen bis (semi-)parallelen Klonierungen auf der Basis verschiedener enzymatischer Prozesse ausgeführt.

Gegenstand dieses Dokuments bei der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist einerseits der Aufbau eines Nebenreaktionen ausschließenden Selektionsdrucks auf das gewünschte, richtige Produkt während der Assemblierung. Dies wird erreicht durch die Bündelung verschiedener Maßnahmen, wie unten beschrieben. Ein weiterer maßgeblicher Aspekt liegt aber andererseits auf der Eigenschaft der Deassemblierbarkeit der entsprechenden Assemblate für die sequenzidentische Wiedergewinnung und die Substitution von Sequenzelementen.

Die Assemblierung von DNAs kann durch eine Reihe von meist enzymatischen Prozessen in vitro, wie auch in vivo erreicht werden. Die am längsten bekannten und etablierten Verfahren für die Assemblierung von doppelsträngigen DNA-Molekülen beruhen auf der Verwendung von Restriktion und Ligation (McKnight 2003), Varianten der enzymatischen DNA-Polymerisation (z. B. PCR) und verschiedene Enzyme, die Nebenreaktionen der DNA-Polymerisation, wie die enzymatischen ”proof reading” Aktivitäten – aber auch Verfahren wie die klassische Verwendung von Exonukleaseaktivitäten zur Klonierung in vitro (Hsiao K 1993; Kaluz S 1992). Die Fähigkeit der Exonuklease-III überlappende, einzelsträngige adhäsive 3'-Termini für Klonierung und Assemblierung zu schaffen wurde extensiv genutzt. Andere Enzymaktivitäten wurden verschiedentlich jahrelang in house genutzt, wie die T7Gene6-Aktivität (Bernauer H 2001 pers. Komm.) manche publiziert, und z. T. auch patentiert, wie beispielsweise einfach nur die Verwendung alternativer Enzymaktivitäten, aus z. T. hochgradig homologen genetischen Systemen, wie die T-Phagenreihe (Gibson D et al. 2009). Die erfolgreiche Patentierungen längst bekannter molekularer Prinzipien mit gleichartigen Enzymen ähnlicher Funktion in den letzten Jahren berühren das Thema der Neuheitlichkeit und der erfinderischen Höhe von Erfindungen sehr direkt. Dies wirft Fragen über das Patentsystem auf. Andere Assemblierungsverfahren nutzen spezielle Rekombinationssysteme in vitro, wie auch in vivo (Shao 2009; Yu D et al. 2000). Die Kombination verschiedener, der genannten Verfahren ist ebenso verbreitet (Gibson et al. 2009; Bang D and M Church G 2008; Yehezkel T et al. 2008).

Rekombinationsverfahren basieren oft auf spezifischen Zielsequenzen ganz spezieller Rekombinasen und Transposasen. Andere Verfahren basieren auf Enzymsystemen der generellen Rekombination. Deren Spezifität zur Ziel-DNA richtet sich auf die Homologien flankierender Sequenzen der zu assemblierenden Zielkonstrukte. Dies zielen auf homologe Sequenzelemente, die meist in vivo im Genom oder in episomalen Elementen liegen. Diese Rekombinasen, die beliebige Homologien zwischen Ziel-DNA und der zu addierenden DNA zur Rekombination (Murphy K 1998), nutzen können sehr viel universeller eingesetzt werden.

Eine auf einer zyklischen Ligationsreaktion basierende Variante zur DNA-Assemblierung ist besonders bekannt geworden. Bei dieser wird eine spezielle, gewünschte „unique”-Restriktionsschnittstelle (R-site) in jedem Assemblierungszyklus immer wieder für jeweils eine weitere Assemblierungsreaktion regeneriert. Die wichtigsten Protagonisten dieses Verfahrens stellen ein Reservoir von standardisierten genetischen Elementen „Parts” im Internet zur Verfügung, die „Registry of Standard Biological Parts” (McKnight, 2003).

Das Verfahren beruht im Wesentlichen auf einer benachbarten terminalen Konfiguration kompatibler, uniquer Restriktionsschnittstellen, deren Sequenzhomologie sich auf den bei der Restriktion entstehenden einzelsträngigen Überlappungsbereich beschränkt. Die durch die Restriktion entstehenden identischen, einzelsträngigen, terminalen Überlappungsbereiche sind ligationskompatibel. Werden diese mit den ligationskompatiblen aber sonst nicht sequenzidentischen Erkennungsstellen zusammenligiert, so geht die Erkennungssequenzen für beide Enzymspezifitäten verloren. Verwendet man demnach ein DNA-Molekül mit jeweils einer sequenzidentischen terminalen Schnittstelle und einer, die ligationskompatibel ist, sonst aber nicht sequenzidentisch, dann wird jeweils die vollständig sequenzidentische R-site regeneriert und steht für Folgereaktionen zur Verfügung aber die ligationskompatible und nicht vollständige R-site geht vollständig verloren. In den meisten Fällen ist dieser Verknüpfungspunkt in dem verwendeten Additionsprodukt an dieser Stelle nicht mehr spezifisch trennbar. Das Verfahren ist wegen der großen Redundanz gleicher Spezifitäten und der Entstehung zu kleiner Einzelteile nicht geeignet die einmal ligierten genetischen Elemente wieder sinnvoll zu regenerieren. Ohne Ausübung alternierenden Selektionsdrucks ist die Automatisierbarkeit des Verfahrens schlecht möglich, wenn nicht teilweise unmöglich.

Der Nachteil der oben beschriebenen Assemblierungsverfahren ist die fehlende systemimmanente, molekulare Rückbaumöglichkeit zu molekularen Einheiten hinreichender Größe, die sequenzidentisch mit den Vorläufermolekülen sind, und die demnach wieder in neuen Assemblierungszyklen mit veränderten molekularen Konfigurationen wiederverwendet werden können.

Neben den beschriebenen parallelen Assemblierungsverfahren für Genkonstrukte ist die hier als Toggle-Assemblierung beschriebene Prozedur einerseits als sequenzielle Methode beschrieben. Sie kann allerdings auch semi-parallel betrieben werden. Sie ist ausgelegt auf robuste Reproduzierbarkeit und stringente Selektion auf das richtige Additionsprodukt und kommt deshalb ohne die Aufreingung von Sequenzelementen aus.

BeschreibungAufgabe

Die Bereitstellung synthetischer DNA beispielsweise zum Aufbau von artifiziellen Stoffwechselwegen und Genclustern kodierend für die Komponenten von spezifischen Proteinkomplexen ist ein beträchtlicher Kostenfaktor, der die Möglichkeiten für molekulares Design und dessen Realisierung begrenzt. Mittels der Wiederverwendbarkeit molekularer Bauteile definierter Funktion wären die Möglichkeiten für DNA-Konstruktionen und die Reichweite von Entwicklungsbudgets beträchtlich erweiterbar. Die bislang fehlende flexible Handhabung einzelner genetischer Komponenten von artifiziell in einer gewünschten Logik zusammengesetzten, integrierten Genfunktionen ist deshalb ein Problem. Große DNA-Konstrukte mit kombinatorisch aufgebauten genetischen Elementen müssen unter beträchtlichem Kostenaufwand immer wieder de novo synthetisiert werden, ohne auf Komponenten, die bereits in anderen funktional optimierte Konstrukten verwendet wurden, reproduzierbar zurückgreifen zu können. Die Regenerierbarkeit sequenzidentischer molekularer Einheiten und der Substituierbarkeit von molekularen Bauelementen aus bestehenden Sequenzclustern zur wiederholten Assemblierung ist Gegenstand der Überlegungen hierfür eine Lösung herbeizuführen.

Lösung

Die exemplarische, erfindungsgemäße Struktur und Anordnung von Sequenzelementen, die zur Assemblierung von doppelsträngiger DNA zu höher-molekularen DNA-Assemblaten besonders geeignet sind, beruht auf der Verwendung eines beispielhaften Paares von Restriktionsenzymen mit achtmerigen Erkennungssequenzen mit bislang einzigartiger Eigenschaft. Die Nutzung dieser spezifischen Eigenschaft eignet für eine gezielte artifizielle und reproduzierbare, konstruktive Integration und Desintegration von DNA-Molekülen im Falle die Erkennungssequenzen sind erfindungsgemäß arrangiert.

Bei dem erfindungsgemäßen, natürlichen Paar von Restriktionenzymen besitzen beide eine acht-merige, palindromische Erkennungssequenz (R-site). Deren Erkennungssequenzen und Schnittstellen sind religationskompatibel. Die homologe Ligation derselben R-sites rekonstituiert die 8merigen R-sites AscI (GG|CGCGCC) und MauBI(CG|CGCGCG) Sequenzerkennung jeweils für die individuellen, korrespondierenden Restriktionsendonukleasen. Nach der Kreuzligation der beiden unterschiedlichen heterologen Restriktionstermini aber wird die Symmetrie der acht-merigen R-site gestört GG|CGCGCG.

Der bei beiden Molekülen vorkommende sechs-merige symmetrische Sequenzkern mit der Spezifität für BssHII(G|CGCGC) bildet sich aber wieder aus. In der Gruppe der Restriktionsendonukleasen mit einer acht-merigen Erkennungssequenz ist diese Paarung von Enzymen die einzige kommerziell erhältliche und bekannte mit einer solchen integrierten Spezifität. Die zwei weiteren, in die Vektoren integrierten ligationskompatiblen, achtmerigen Restriktionsenzympaare R-sites des TypsII verdeutlichen dies. Die Toggle-sites AbsI/SgrDI und PacI/AsiSI sind zwar ligations-kompatibel aber sie regenerieren keine nützliche sechs-merige Kernsequenz zur positionsgerechten Deassemblierung. Ebenso die erfindungsgemäßen TypIIS-Enzympaare (s. 1-b), die eine Translationsraster – gerechte Ligation von kodierenden Sequenzen ermöglichen. Sechsmerige Erkennungssequenzen mit einer gemeinsamen, sich regenerierenden vier-merigen Kernsequenz sind wegen der sehr hohen Frequenz ihres statistischen Auftretens und der zumeist kleinen Restriktionsfragmente in der Anwendung nicht praktikabel. Die Ausbildung einer sechs-merigen Kernerkennung aber ist im Vergleich der bekannten und verfügbaren Restriktionsspezifitäten bislang einzigartig und kann als Einzige verwendet werden, eine zuvor erfindungsgemäß assemblierte DNA wieder spezifisch und funktional intakt und reproduzierbar wieder herzustellen. Hierzu ist es jedoch erforderlich, die Sequenzspezifitäten der erfindungsgemäßen Restriktionserkennungssequenzen (R-sites) aus den anderen verwendeten synthetischen Sequenzen der zu (de-)assemblierenden Sequenzelemente herauszurechnen und diese Sequenzen in ihrer Funktion damit im Sinne des Assemblierungsverfahrens vorzubestimmen. Dies benötigt i. d. R. synthetische Gene. Alterniert man die Selektionsmarker bei jedem Additionsschritt der Assemblierungsreaktion, indem man den Selektionsmarker mittels der speziellen erfindungsgemäßen Toggle-site (exemplarisch ist dies bei den A-Elementen AsiSI), in die Assemblierungsreaktion mit einbezieht, dann nennt sich diese erfindungsgemäße Assemblierungsreaktion „Toggle-Assembly”. Diese ist von der Verwendung von speziellen Toggle-Vektoren abhängig, da nur die besondere Konfiguration der funktionalen Elemente die beschriebene zyklische Reaktionsfolge ermöglichen. Die alternierenden Selektionsmarker in Verbindung mit der Inaktivierung der Ori-Funktion bei den DONOR-Molekülen erlaubt es auf das gewünschte Additionsprodukt einen spezifischen Selektionsdruck zu erzeugen, der die Assemblierungsreaktionen ohne Isolierung von Komponenten in die richtige Richtung steuert.

Neben dem exemplarisch dargestellten Ligationsverfahren ist es zudem möglich DNA-Konstrukte die durch Toggle-basierte Rekombinations- oder Exonuklease-vermittelte Assemblierungsverfahren erzeugt wurden positionsgenau wieder aufzulösen, die Sequenzelemente sequenzidentisch zu regenerieren und einer gewünschten, vorbestimmten Wiederverwendung zuzuführen. Dies ist wegen der Kompatibilität der Standardkomponenten möglich.

Solche strukturgebenden, genetischen Elemente lassen sich für viele Applikationsbereiche erweitern und verfeinern, insbesondere in die Richtung eines spezifischen Austausches von einzelnen internen Funktionselementen. Für bestehende komplexe Assemblate mit dem Ziel hoch aktive funktional integrierte genetische Elementen konzertierter molekularer Funktion zu etablieren werden sich immer weitere Verbesserungen finden lassen. Eine strukturelle Formalisierung und Standardisierung der Assemblierung von DNA-Konstrukten ist für die Etablierung von funktional reproduzierbar arbeitenden und funktional autarken aber auch gegenüber anderen genetischen Elementen abgeschlossenen molekularen Einheiten, die in verschiedenen Varianten immer wieder in neuen kombinatorischen Einheiten zusammengebaut werden sollen, von großem Interesse, insbesondere für die Automation dieser Verfahren.

Für zukünftige Entwicklungen in der molekularen Medizin und der Biopharmaindustrie, aber auch der „Weißen Biotechnologie” sind artifizielle, multi-genische Konstrukte mit konzertierter molekularer Funktionalität von großen Wert, da Genfunktionen meist in synergistisch aktiven Genensembles abgerufen werden. Strukturell reproduzierbar aufbauende, wie auch spezifisch abbauende strukturgebende Funktionen, sowie Substitutionsfunktionen, wie auch die Systematisierung in standardisierte autark funktionale Funktionselemente sollten von großem konstruktivem Wert sein und die reproduzierbare Funktionalität von Genklustern gewährleisten. In weiteren erfindungsgemäßen Schritten kann man solche natürlichen Eigenschaften wie die des exemplarischen, erfindungsgemäßen Enzympaares auch mittels z. B. TypIIS-Restritionsendonukleasen, TALENS (Zhang F, et al., 2011; Miller J et al. (2010); Moscou, M and Bogdanove A (2009); CRISPR (Cong L, et al., 2013), Zinkfinger (Isalan M, 2011) oder Krab-Molekülen oder auch TALENS-Molekülen vorherbestimmen und damit logische ON und OFF Kombinationen von Fusions- bzw. Additionsprodukten herstellen, die man für die Konstruktion artifiziellen GenClustern verwenden kann (s. 5). Dies erlaubt es strukturell eindeutige, reproduzierbare und standardisierte Systematisierungen von autark funktionalen Funktionselementen zur freien Bildung von Arrangements besonders auch zum spezifischen Austausch von Komponenten zu nutzen. Dann kann man mit den hier vorgeschlagenen strukturellen Merkmalen deren Zielsequenzen auch zu funktional vorbestimmten Genkonstruktionen von Stoffwechselwegen und dem gezielten Austausch von genetischen Elementen verwenden. Mittels der hier vorgeschlagenen strukturellen Basis ist ein Weg vorgegeben, wie man dies organisieren kann.

DNA und auf ihr codierte genetische Funktionalität kann direkt als Medikament in Gentherapien, artifiziellen Zusatzorganen und auch in Verbindung mit gentechnisch vorteilhaft veränderten Stammzellen in Zelltherapien eingesetzt werden. Dies wird eine der schlagkräftigsten Möglichkeiten des Einsatzes von Synthetischer Biologie in Zukunft werden. Ebenso werden artifizielle Stoffwechselweg zukünftig die biologisch orientierte Chemie zum großen Teil mitbestimmen. Die zur Assemblierung und Deassemblierung vorgeschlagene Struktur ist in 1 dargestellt.

Beispielhaftes und erfindungsgemäßes pBoX-”TOGGLE-ASSEMBLY-VECTOR SYSTEM” bestehend aus:

Vorteile konstruktiv modularer genetischer Shuttle-Vector Systeme, wie die pBoX-Vektoren:

  • • Genetisches Tool-box-System für dokumentierte und verlässliche Funktionalität
  • • Merkmal stringenter, durchgehende, strukturelle Konformität bei allen Konstrukten
  • • Übergreifende Modularität durch Standardisierung der Konstruktion und Funktion
  • • Flexible Handhabbarkeit durch übergreifendes Kompatibilitätskonzept
  • • Flexibilität bei der Realisierung von multi-genischen Applikationen
  • • In Assemblierungsreaktion implementierte parallele Deassemblierungsfunktion
  • • Austausches von Sequenzelementen bei spezifischem Substitutionsklonierungs-Designs
  • • Spart Kosten und Zeit durch Wiederverwendbarkeit der genetischen Elemente
  • • Funktionale Adaptapierbarkeit an viele weitere genetische Systeme
    → In der Summe: Schnellste Realisierungsgeschwindigkeit-time to market-Optimierung

Bei den in 1-a und -b detailliert dargestellten pBoX-Toggle-Assembly-Vektoren handelt es sich um ein konstruktiv standardisiertes Vektorsystem für die Integration von molekular-genetischen Einheiten zu einer artifiziellen Struktur höherer funktionaler Ordnung. Das Vektorsystem stellt die Ausgangssituation für die Bereitstellung der integrierten Struktur und Anordnung dar, die aus einzelnen funktionalen genetischen Elementen mit einer vorbestimmten Position besteht. Diese üben ihre Funktionen auf verschiedenen molekularen Funktionsebenen aus. Einerseits gibt es zusammengesetzte genetische Elemente und andererseits genetische Primärelemente, deren Sequenz zur Aufrechterhaltung der spezifischen Funktion nicht mehr reduziert, bzw. verändert werden darf. Die höchste Ebene sind die verschiedenen Funktionsgruppen BoX-Elemente (A-, S-, T- und M-BOX), deren Positionen genormt und unveränderbar sind. Vier Typen von BoX-Elementen mit verschiedenen Ausprägungen der verschiedenen Elemente sind hinreichend, um alle Funktionen einer höher integrierten molekular-biologischen Funktionalität in verschiedenen genetischen Systemen abzubilden.

Die A-BoX-Elemente bestehen in der jeweiligen, gewünschten Applikation aus einer bis mehreren Expressionskassetten mit vorbestimmter funktionaler und struktureller Sequenzzusammensetzung.

Die strukturellen Eigenschaften der Enzymspezifitäten des inneren, der zwei verschachtelten Restriktionspaares AscI und MauBI wie sie in der A-BoX des Vektors (1-a) dargestellt sind, erlauben es eine DNA, die zwei terminale AscI-sites besitzt, in die zuvor durch spezifische Restriktion geöffnete 5'-AscI-site des Vektors einzuligieren. Dabei wird die AscI-site 5'-strukturell wiederhergestellt und die MauBI-site am 3'-Ende wird zerstört. Es bleibt eine BssHII-site zurück. Im Falle das zu addierende DNA-Konstrukt hat terminale MauBI-sites und die MauBI-site des ACCEPTORS wird geöffnet, so wird die 5'-AscI-site zerstört, es bleibt an dieser Stelle eine BssHII-site zurück und die 3'-MauBI-site wird regeneriert.

In jeden Fall aber wird die sechs-merige BssHII-Kernsequenz beibehalten wenn die heterologen, strukturellen Sequenzvarianten ligiert werden. In welcher Orientierung die internen Elemente im ein-zuligierende Konstrukt einer ExpressionsboX vorliegen soll, wird durch das Design der DONOR-Konstrukte vorbestimmt. Die Orientierung der zwischen den AscI und MauBI befindlichen (i. d. R.) Expressionsboxen kann durch die symmetrische Restriktion der beiden achtmersequenzen eignen sechsmerigen Kernsequenz BssHI umgedreht werden. Dies aber ohne die Integrität der beiden achtmerigen Sequenzen zu verletzen. Diese können dann wie gehabt für die Toggle Reaktion eingesetzt werden. Die Orientierung der internen Sequenzen ist dann vertauscht, wenn dies gewünscht ist.

Wie oben schon erwähnt kann die Effizienz und die Selektivität des Assemblierungsprozesses weiter gesteigert werden, wenn man verschiedene, alternierende Selektionsmarker der S-BoX-Elemente bei den DONOR-Konstrukten zur Selektion abwechselnd einsetzt (zyklischer Toggle-Prozess). Bezieht man nun den Selektor der S-BoX in das Assemblierungsverfahren mit ein, so entfernt man das gesamte S-BoX-Element des vorangegangenen Additionsschritts mittels MauBI und AsiSI aus dem ACCEPTOR-Vektor.

Im folgenden Additionsschritt und setzt man aus dem zu diesem Schritt vorgesehenen DONOR-Konstrukt ein AscI-AsiSI-DNA-Konstrukt mittels Restriktion frei. Dann wird der Selektionsdruck immer auf das Additionsprodukt gelenkt, sofern man die DONOR-Vektoren entsprechend auswählt und vorbehandelt.

Überlappende Enden für erfindungsgemäße Additionreaktionen basierend auf Exonuklease- oder Rekombinationsreaktionen kann man ebenso erzeugen, wenn man die Ausgangsvektoren entsprechend molekular designed hat (s. u.).

Die Erzeugung eines zusätzlichen Selektionsdrucks auf die Entstehung der Additionsprodukte entsteht durch die funktionelle Inaktivierung der DONOR-Oris bei der Assemblierungsreaktion in vivo. Entweder die DONOR-Konstrukte besitzen spezielle pir(+)-abhängige „Origins of Replication” (R6Kgamma) und werden in speziellen pir(+)-Bakterienstämmen propagiert, oder die DONOR-Oris müssen durch Restriktion o. ä. in Verbindung mit einer Dephosphorylierung zerstört werden, damit sich diese sich bei der Religation nicht wieder rekonstituieren können.

In den beispielhaften TogBAC-A3.X.X.-Vektoren ist dies durch R6Kgamma-split-Oris gelöst, die die Insertion eines ColEI-ori (Typ: pXPG) tragen. Der zur Klonierung verwendete ColEI-ori (Typ: pXPG) wird mittels EarI bzw. SapI, TypIIS-Restriktionsendonukleasen heraus gespalten. Die Religation des Vektors alleine ergibt einen R6kgamma-ori. Bei einer möglichen Regeneration des Vektors wird also ein Konstrukt erzeugt, das in pir(–)-E. coli-Zellen auf der ACCEPTOR-Seite nicht repliziert wird. Wird dies aber gewünscht, dann sind diese Konstrukte in pir(+)-Stämmen von E. coli replikations-kompetent.

Alternativ ist es möglich die ApaLI-site des ColEI-Ori der DONOR-Vektoren zu zerstören und die Religation mittels Dephosphorylierung zu verhindern. So wird das gewünschte Additionsprodukt durch zwei unabhängige Mechanismen erzwungen, die alternierende S-BoX-Selektion und die exklusive Replikationskompetenz des ACCEPTOR-Konstrukts.

Man kann auf diese Art die Aufreinigung der DNA-Konstrukte aus dem Gel verzichten und in einer „one tube”-Reaktion die Komponenten mischen ligieren, re-transformieren und einen Selektionsdruck ausschließlich auf das gewünschte Additionsprodukt erzeugen.

Dieses besteht aus dem gewünschten, zu addierenden Sequenzelement und zusätzlich dem alternierenden Selektionsmarker. Mittels Ligation wird dieses in den zur Ligation vorbereiteten ACCEPTOR-Vektor hineingesetzt. Dieses besitzt relativ zu dem vorangegangenen Assemblierungsschritt einen alternativen Selektor, auf den nach der Transformation die dann folgende Selektion hin erfolgt (s. 3). Das so vorgeschlagene Verfahren wurde wegen des zyklischen Umschaltens auf einen alternativen Selektionsmarker in dem S-BoX-Element Toggle-Assembly-Verfahren genannt.

Eine Reihe weiterer molekular-biologische Verfahren sind in den Jahren der molekularbiologischen Historie ausgearbeitet geworden, mit denen man DNA-Moleküle mit vorbestimmten Sequenzen assemblieren kann. Entsprechend der historischen Entdeckung verschiedener für die DNA-Assemblierungserfahren nützlicher enzymatischer Aktivitäten teilen sich diese in Ligationsverfahren (Klassische Verfahren, iGEM-Assembly of Parts, Golden Gate), Polymerase-basierte Verfahren, wie die Exonuklease-Klonierung (5' -> 3': T7Gen6 (Bernauer pers. Comm.), T5- bzw. Lambda Exonuklease (Gibson(200); 3' -> 5': LIC (Aslandis and De Jong, 1990), SLIC) verschiedene Techniken basierend auf der PCR-Reaktion und Rekombinationsverfahren, sowie sinnhafte Kombinationen aus den genannten Verfahren, wie z. B. das kürzlich publizierte Gibson Cloning*.

Die beschriebenen Assemblierungsverfahren lassen nur die Assemblierung in eine Richtung zu. Nach der jeweilig verwendeten Assemblierungsreaktion sind die Sequenzen nicht mehr spezifisch an den jeweiligen Verknüpfungspunkten spaltbar und ermöglichen keine spätere Deassemblierung von bereits assemblierten Sequenzelementen, auch wenn diese als einfache oder aber auch zusammengesetzte genetische Funktion funktional autark sind und wieder zurückgewonnen in weiteren Konstrukten verbaut werden könnten.

Das Toggle Assembly Verfahren ist so konzipiert, dass zwischen den verschachtelten Paaren der R-sites AbsI(XhoI) und AscI am 5'-Ende und 3'- zwischen MauBI und SgrDI(SalI) Sequenzen eingebaut werden können, mit denen einerseits Rekombinationsprozesse über mehrere Assemblierungsstufen hin oder eine Serie von vorbestimmten Exonuklease-Klonierungen vorgenommen werden können. Beide dieser Reaktionstypen können zur Assemblierung von DNA von der Togglereaktion und der erfindungsgemäßen Konfiguration der gewählten Restriktionsenzympaare zur Deasemblierung der DNA-Cluster profitieren.

Eine strukturelle Formalisierung und Standardisierung der Assemblierung von DNAs mit spezifischen Sequenzelementen ist von großem Interesse, insbesondere dort wo für die Etablierung von reproduzierbar funktionierenden molekular-genetischen Einheiten verschiedene Sequenzvarianten immer wieder in neuen Kombinationen zusammengebaut werden sollen.

Die hier vorgestellte Strukturierung von DNA-Assemblaten beruht auf der einzigartigen Eigenschaft eines beispielhaften Paares von Restriktionsenzymen mit einer achtmerigen Erkennungssequenz, die ligationskompatibel sind und nach Ligation der beiden unterschiedlichen Restriktionstermini einen bei beiden Molekülen vorkommenden Sequenzkern mit der Spezifität für BssHII wieder ausbilden, mit dem man nach einer erfolgten Verbindung der Moleküle z. B. mittels Ligation, aber auch Exonuklease- oder Rekombinations-vermittelt die Sequenzelemente wieder regenerieren und einer standardisierten Wiederverwendung zuführen kann.

Mittels der prädiktiven Spezifität von nukleolytischen Molekülen, wie TALEs, CRISPR, Krab oder Zinkfingermolekülen in enger Verbindung mit der gezielten Assemblierung von molekularen Funktionseinheiten sollten sich solche strukturellen Standards für viele Applikationsbereiche erweitern und insbesondere auch verfeinern lassen. Deshalb ist die Erweiterung des hier dargestellten natürlichen Enzympaares auf weitere artifiziel konstruierte Enzymspezifitäten mit künstlich vorbestimmten Zielsequenzen erfindungsgemäß mit dem hier formulierten Patent.

Insbesondere in die Richtung eines spezifischen Austausches von einzelnen Funktionselementen in komplexen Assemblaten mit konzertierten und integrierten molekularen Funktionen sollte sich weitere Verbesserungen finden lassen.

2: Zeigt erfindungsgemäße A-BoX-Expressionskassette, wie sie im erfindungsgemäßen Toggle-(De-Assemblierungsprozess) für die Sequenzelemente AA, AB und AC dargestellt sind:

Toggle-Assembly-Prozess-Beispiel:

Beispielhafte Ausführungsform: Die Kombination der optimierten Expressionskassetten mit den Genen AA, AB, AC für die gleichzeitige-multiple Genexpression auf einem DNA-Konstrukt unter Beibehaltung der Möglichkeit jede der verwendeten Expressionskassetten duch positionsgerechte, parallele Deassemblierung wieder in der ursprünglichen Funktionalität regenerieren zu können. Die zyklisch wiederkehrende Ko-asssemblierung der jeweiligen Expressionskassette erfolgt in Verbindung mit den alternierenden Selektionsmarkern S-A und S-B. Für die Propagation und die Stabilisierung der ACCEPTOR-Vektor-DNA im Wirt der Assemblierungsreaktion wird der ”origin of replication” M2 verwendet, der sich von dem der DONOR-DNA-Konstrukte unterscheiden kann. Die T-BoX-Elemente SR-L,-R werden für die genetische Persistenz im Zielwirtsorganismus benutzt, um die genetischen Funktionen die Ziel-DNA (Genom oder Episom) im Zielorganismus stabil einzubringen und dort zu vermehren. (hier: spezifische Zielrekombinationsstellen SR-L links und SR-R rechts). Sie befinden sich im ACCEPTOR-Vektor.

3 zeigt das Grundprinzip des automatisierbaren Toggle-Processes unter Verwendung alternativer Selektoren, die durch Austausch der gesamten S-Box-Elemente jeweils den Selektionsdruck auf eine andere physiologische Basis stellen und auf die Bildung des jeweiligen Additionsproduktes gerichtet ist.

Toggle-AssemblierungsstrategieBeispiel mit drei Expressionsboxen:

Drei zu assemblierende Expressionsboxen (A-BoX-Elemente) jeweils mi den Genen AA, AB und AC jeweils flankiert von den zugehörigen Kontrollelementen sind in den DONOR Vektoren kloniert und werden mit diesen propagiert. Ein ACCEPTOR-Vektor mit den für den Zielwirt spezifischen T-BoX-Elementen (hier: Tn7-Rekombinationssites SR-L/-R) wird für die Aufnahme eines kombinierten DONOR-Elements aus A- und S-BoX, also z. B. AA und S-A durch die Restriktion mit MauBI und AsiSI vorbereitet, wobei das ACCEPTOR-S-BoX-Element mit dem S-B-Box-Element herausgeschnitten wird. Der so gespaltene ACCEPTOR-Vektor wird auf vollständige Spaltung kontrolliert. Der ACCEPTOR-Vektor ohne Additionsprodukt kann wegen der Inkompatibilität der Restriktionsenden nicht religieren.

Der DONOR-Vektor (mit R6Kgamma-ori aus einem pir(+)-Stamm oder dem ApaLI-zerstörten ColEI-ori) wird mit AscI und AsiSI gespalten. Durch diese Restriktion wird das DONOR-A-BoX-Fragment (hier: entweder AA, AB oder AC) gemeinsam mit dem jeweils alternativen Selektor-S-BoX-Element freigesetzt. Derart präparierte DONOR und ACCEPTOR Spaltprodukte werden nun zu einer Ligationreaktion zusammengebracht und gemischt. Dadurch wird das DONOR-Fragment in das ACCEPTOR-DNA-Molekül, das das S-BoX-Element nicht mehr enthält, weil es mit MauBI und AsiSI herausgeschnitten wurde, einligiert. Der DONOR-Vektor kann im ACCEPTOR pir(–) E. coli Stamm nicht persistieren (alternativ ist der ColEI-Ori des DONORs zerstört). Die Selektion mittels des immer wieder alternierenden Selektionsdruck geht von dem einzuligierenden DONOR-Fragment auf den ACCEPTOR aus. Nur mit dem einzuligierenden Additionsprodukt plus dem alternativem Selektionsmarker, der mit dem DONOR-Konstrukt des jeweiligen Zyklus eingebracht wird kann der ACCEPTOR gegen die Selektion persistieren. Dies lässt die Reaktion in nur eine Richtung zu. Alle weiteren denkbaren Ligationsprodukte sind nicht vital.

In dieser Situation können die zyklischen Additionsreaktion in einem Reaktionsgefäß durch bloses Mischen, ohne vorhergehende Aufreinigung und Isolierung der Komponenten mittels der Ligation des Gemisches und der anschließenden Selektion auf den alternativen, mit dem neuen A-BoX-Element eingebrachten Selektor durchgeführt werden. Der Selektionsdruck ist direkt auf das gewünschte Additionsprodukt gerichtet.

A A-Box-Toggle AssemblierungMonomere A-BoX-DONOR-Sequenzelemente:

  • An
    = A-BoX-Element (0 ... n) mit Genen A, B, C ... N
    Tf
    = Transcriptions Faktoren
    P
    = Promotoren
    T
    = Terminatoren
    S-A, S-B
    alternierende Selektionsmarker n* (DONOR → ACCEPTOR)
    SR-L, SR-R
    = linkes und rechtes Integrationsmotiv in den Zielwirt (T-BoX-Elemente)

Beschreibung des Toggle-Assembly (Assemblierungsschritte S0. S1. S2 und S3):

In diesem Schritt wird das DONOR-DNA-Element A1A, das addiert werden soll aus dem DONOR-Vektor freigesetzt und das S-Box-Element S0 vom ACCEPTOR-Vektor für den folgenden Additionsschritt wird entfernt, um die Addition des DONOR-Fragments pBoX-Donor-A1A in S1 vorzubereiten. Dies wird dann durch eine AscI-An-MauBI-AsiSI-Toggle-Ligation in den ACCEPTOR-Vektor eingebracht.

In diesem Schritt wird das DONOR-DNA-Element A2 das addiert werden soll vom DONOR-Vektor freigesetzt und das S-Box-Element S1 vom ACCEPTOR-Vektor für den nächsten Additionsschritt wird entfernt, um die Addition des DONOR-Fragments A2. vorzubereiten. Dies wird dann durch eine AscI-An-MauBI-AsiSI-Toggle-Ligation in den ACCEPTOR-Vektor eingebracht.

In diesem Schritt wird das DONOR-DNA-Element A1C das addiert werden soll vom DONOR-Vector freigesetzt und das S-BoX-Element S2 vom ACCEPTOR-Vektor für den nächsten Additionsschritt wird entfernt, um die Addition des DONOR-Fragments A1C vorzubereiten. Dies wird dann durch eine AscI-An-MauBI-AsiSI-Toggle-Ligation in den ACCEPTOR-Vektor eingebracht.

Im Ergebnis sind alle drei Gene mit Ihren jeweiligen Expressionsboxen zu einem Cluster assembliert:

Zusammenfassung der Assemblierung der Expressions-A-BoX-Elemente A1A, A1B und A1C:

Das fertig asssemblierte Konstrukt ist ein GenCluster von drei Genen, die jedes für sich mit einem Set der jeweilig beabsichtigten Kontrollelementen für den gewünschten Zielwirt ausgestattet sind. Die Gene sind durch BssHII-Schnittstellen von einander getrennt und sind von Toggle sites flankiert. Mit diesen kann man entweder ganze Cluster miteinander verbinden (AbsI(XhoI) und SgrDI(SalI)) oder weitere A-BoX-Elemente addieren (DONOR:AscI-AsiSI, ACCEPTOR:MauBI-AsiSI).

Das assemblierte A-BoX-GenCluster A1A, A1B A1C ist 5' und 3' von jeweils einer zur Zielsequenz im Zielkonstrukt homologen Rekombinationsequenz SR-L und -R flankiert für die stabile Integration in das Zielkonstrukt (z. B. ein BAC bzw. ein Bacmid etc.) Sie besitzen einen Selektionsmarker S-A oder S-B und ein M-BoX-Element für die Proliferation des Konstruktes in E. coli.

B S-BoX-Toggle Assembly

AsiSI und PacI haben eine ligations-kompatible zwei-merige Kernsequenz, die sich aber nach Ligation nicht zu einem Palindrom ergänzen. Die ursprünglichen Restriktionsschnittstellen existieren nicht mehr. Die Kombination der beiden Enzymschittstellen ist geeignet eine Toggle-Reaktion mit der T-BoX durchzuführen indem man das jeweilige S-BoX-Element mit einbezieht.

Spezifischer Austausch von Funktionselementen:

2 und 4 zeigt die formalisierte Darstellung einer erfindungsgemäßen, beispielhaften molekularen Konfiguration von Sequenzelementen für eine molekulare Substitutionsreaktion unter Verwendung von einzigartigen, natürlichen oder konstruierten (5 und 6) spezifische Affinität und Restriktion vermittelten molekularen Werkzeugen. In einem erfindungsgemäßen „setup” werden spezifische Parameter Restriktionsenzyme verwendet, die aus den Sequenzen einer Applikation errechnet werden zur Verfügung zu stehen. Ein Sequenzsubstitutionskonzept sowohl auf der Ebene der intergenischen Bereiche, zum Austausch der kodierenden Sequenzen oder ganzen Expressionskassetten auf der Basis von natürlich vorkommenden Restriktionsschnittstellen verlangt ein übergreifendes Konzept zur Ermittlung der möglichen Konfigurationen (Oßwald C et al. (2012).

Hat man die Möglichkeit molekulare Zielsequenzen vorzubestimmen wie z. B. kombinatorische auf TALENS-Zielsequenzhalbseiten (5; Miller J et al. (2010); Moscou, M and Bogdanove A (2009) basierten Systeme zur Erzeugung artifizieller erfindungsgemäßer Funktionalität, wie die Generierung von vorbestimmten Restriktionsschnittstellen (s. 5 und 6) so ließen sich weitaus komplexere Fragen im Bereich des Pathwayengineering in vivo lösen. Insbesondere medizinische Applikationsbereiche wie Gentherapeutische Ansaätze wären plötzlich wesentlich leichter machbar.

Die 6 zeigt mindestens zwei funktionale Fusionen von TALENs-Molekülhalbseiten. Diese können in einer Expressionskassette eines repetitiven TALENS-Domänen multiplex Gene-Clusters so organisiert sein, dass sie die Zielsequenzen erkennen.

7 stellt eine formalisierte Genklustersituation dar, die für den spezifischen Austausch von ganzen Expressionskassetten konstruiert wurde. In 7 sind in einem integrierten molekularen Kontext mit X die De-Assemblierungs-sites; A und S: R-sites für die Integration verschiedener Gencluster auf übergeordneter Ebene; E1–E5 sind multiple Expressionskassetten mit vorbestimmten identischen R-sites X für Assembly and De-assembly von allen Expressionsboxen eines DNA-Konstrukts; E1–E5 ein experimenteller Setup hat kalkulierte Paare von R-sites R0-0'-R4-4' sind identische R-sites (e. g. TALENS) für die Substitution individueller Expressionsboxen.

Neben den natürlichen TypII und TypIIS-Enzymspezifitäten eignen sich Zinkfinger, TALENS, CRISPR- und auch Krab-Moleküle für artizizielle Ansätze der Modifikation von Einzelgenen und artifiziellen Stoffwechselwegen in vivo und in vitro.

Beispielhafte erfindungsgemäße Toggle-Vektoren für die (De-)Assemblierung von Genklustern:

Das unten in Sequenz dargestellte Expressionssystem (8 und 9) ist ausgelegt für die simultane Expression von mehreren Genen in mehreren Expressionskassetten auf einem Konstrukt in Insektenzellen. Die Konfiguration der Toggle – Elemente entspricht der des Basis Vektors in 1. Die Vektoren sind ausgestattet mit den A-BoX-Kontrollelementen für die Expression in Insektenzellen mit Baculovirus-Promotoren.

Auf den DONOR-Vektoren liegen die Gene des Interesses (Gol) in Expressionsboxen, welche durch Toggle Assemblierung zu Genklustern einer höheren funktionalen Integration der Gene zusammengefasst werden sollen. Die Restriktionsschnittstellen NdeI (CATATG) und BclI (sind vorgesehen, um die codierenden Sequenzen der interessierenden Gene einzuklonieren. Die fertig assemblierten Genkluster, die am Ende auf dem ACCEPTOR-Vektor vorliegen, werden über eine Phage T7-Transposase, deren Gen in einem E. coli-Stamm auf einem Episom vorliegt und von dort exprimiert wird in eine entsprechend spezifische Transposon-7 (Tn7) Zielsequenz einrekombiniert, die auf einem Bacmid lokalisiert ist. Das Bacmid entspricht einem modifizierten baculoviralen Genom, das als BAC (= bacterial artificial chromosome) mit einem F1-ori vorliegt. Die Integration des Genclusters wird durch ein blau-weiss-Screening unter Nutzung der β-Gal (LacZ), α-Komplementation mittels IPTG und dem X-Gal-Farbstoff detektiert.

Das Bacmid mit dem integrierten GenCluster von Interesse 9 wird in Insektenzellen (z. B. SF9) transfiziert. Dort entwickeln sich infektiöse Viruspartikel, die wiederum andere Insektenzellen infizieren können und sich dort replizieren. Die Vermehrung der Viruspartikel wird verwendet um Kulturüberstände mit großen Virustitern zu erzeugen, die für die Infektion von weiteren Zellen verwendet werden können, z. B. für großangelegte Screeningverfahren etc.. Da Baculoviren auch Säugetierzellen, z. B. humane Zellen infizieren können, dort aber nicht repliziert werden und liegen bleiben, verwendet man sie als Transduktorviren für eine transiente Expression mit großer Transduktionseffizienz.

Vorteile der Erfindung

Diese Erfindung begründet sich auf der Einfachheit einer einheitlichen, modularen, molekularen Struktur eines Paares von Restriktionsenzymen, der Nachahmung ähnlicher aber darüber hinaus funktional erweiterten und auch der molekularen Konstruktion Strukturen mit höherer Selektivität. Insbesondere ermöglicht diese Erfindung, die aus verschiedenen, molekularen Assemblierungsverfahren hervorgegangenen integrierten Sequenzkomponenten sequenzidentisch derart wieder zu regenerieren, so dass diese erneut wieder für Assemblierungsreaktionen eingesetzt werden können. Die mit der beschriebenen Systematik regenerierten Sequenzmodule sind dabei in jedem der möglichen weiteren zur Assemblierung geeigneten Verfahren, wie die Assemblierung mittels Ligation, Rekombination und Exonukleaseklonierung erneut einsetzbar, sofern es für die Assemblierung zuvor konzeptionell so ausgearbeitet wurde. Dieses modulare, molekulare System eignet sich als genereller Standard. Für diese Eigenschaft ist es zweckdienlich, die Regeneration der Sequenzkomponenten in zuvor entsprechend der weiteren Verwendung präparierten erfindungsgemäßen Toggle-Vektoren zu klonieren (s. Beispiel 1 und 8). Die Verwendung konzeptionell einheitlicher modularer Systeme in der molekularen und synthetischen Biologie kann dabei helfen, in der Forschung und Entwicklung viel Geld einzusparen. Die maximale Verfügbarkeit von kompatiblen funktionalen genetischen Elementen kann gewährleistet werden. Es entstehen geringere Kosten weil die leichte Adaptierbarkeit von molekularen Konstruktionen an neue funktionale Anforderungen im Redesign kurze Entwicklungszeiten verursachen. Dabei wird wesentlich weniger Personal im Vergleich mit Einzelanfertigungen benötigt. Es geht einher mit einem geringen Resourcenverbrauch, geringerem Materialeinsatz und vor Allem auch einer dramatischen Reduktion von Ausbildungs- und Trainingseinheiten für die Einarbeitung von Mitarbeitern in das einheitliche System. Die maximale Flexibilität im Austausch von kompatiblen Elementen erlaubt eine flexible molekulare Konstruktion leichte Adaptierbarkeit von Toggle-Vektor basierten molekularen Applikationen mit einer erweiterten Optionen für kombinatorische Konstrukte. Damit einher geht ein hohes Potenzial für eine gesteigerte Produktivität. Alle genannten Eigenschaften verkürzen die Zeit für den Markteintritt („time to market”). Bei der Verwendung von standardisierten Bauteilen definierte Funktion entsteht möglicherweise eine Reduktion von Haftungskosten im Servicebereich.

Weiterbildung der Erfindung

Im Weiteren wird die Erfindung der Nutzung natürlicher, enzymatischer Spezifitäten, wie die Beschriebenen auf artifizielle Spezifitäten mit ähnlichen aber auch neuen Eigenschaften erweitert werden. Diese können neuerdings konstruiert werden. Konstruktive, molekulare Verfahren mit prädeterminierenden Eigenschaften für die Vorherbestimmung der Bindungsspezifität an Ziel-DNAs sind bekannt geworden. Dies trifft insbesondere für TALEN, CRISPR, Krab und Zinkfingerproteine zu. Die hier erfindungsgemäß dargestellte Nutzung vorbestimmter enzymatischer Erkennungssequenzen kann durch Spezifitäten und Funktionen artifiziell hergestellter enzymatischer Entitäten ergänzt werden und deren Wirkungsspektren hinsichtlich eines weithin verbesserten Engineering von multiplen Genkonstrukten, Genklustern im Sinne der Regenerierbarkeit der einzelnen Komponenten, aber auch für den gezielten Austausch von Komponenten aus bestehenden Konstrukten in vitro, wie auch in vivo verwendet werden. Insbesondere für die Realisierung von artifiziellen Stoffwechselwegen mit vorbestimmten Eigenschaften ist die flexible Handhabung molekulare Bauteile von außerordentlichen Wert. Die Automatisierbarkeit der beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und die zur Verfügungstellung der molekularne Werkzeuge zur Realisierung der Verfahren in der Form von spezifischen Kits für eine Vielzahl verschiedener genetischer Systeme, wie z. B. hier exemplarisch dargestellt für das Bakulovirussystem sind die Ausrichtungen, in die diese Erfindung weiter ausgebildet werden kann. Diese Verfahren können bei der Etablierung und Nutzung vieler Anwendungen im Bereich der artifiziellen Stoffwechselwege zur aufbauenden Bereitstellung von Molekülen oder aber auch bei abbauenden Prozessenin Biorafineration dienen. Insbesondere im Bereich der molekularen Medizin bei der genetischen Modulation von Stammzellen, aber auch bei der Entwicklung von zellbasierten Diagnostika sind funktionale, artifizielle Genkluster mit integrierter, konzertierter Funktionalität gut denkbar.

Bezugszeichenliste

  • Gol
    (= Gene of Interest)
    An
    = A-BoX-Element (0 ... n) mit Genen A, B, C ... N (A1A, A1B ... )
    Tf
    = Transkriptionsfaktoren
    P
    = Promotoren
    T
    = Terminatoren
    S-A, S-B
    alternierende Selektionsmarker n* (DONOR → ACCEPTOR)
    SR-L, SR-R
    = linkes und rechtes Integrationsmotiv in den Zielwirt (T-BoX-Elemente)
    T-R
    = Toggle Restriction site

Referenzen:

  • Cong, L et al. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 15; 339(6121): 819–23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3.
  • Oßwald C et al. (2012) Modular Construction of a Functional Artificial Epothilone Polyketide Pathway, ACS Synthetic Biology, DOI: 10.1021/sb300080t http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/sb300080t
  • Zhang F et al. (2011) Programmable Sequence-Specific Transcriptional Regulation of Mammalian Genome Using Designer TAL Effectors Biotechnol. 2011 February; 29(2): 149–153.
  • Isalan, M. (2011) Zinc-finger nucleases: how to play two good hands. Nat Methods 9, 32–34.
  • Miller J et al. (2010) A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol 29, 143–148.
  • Gibson D et al. (2009) Enzymatic Assembly of DNA Molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods 6, 343–345.
  • Zengyi Shao Z (2009) DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research 37, e16
  • Zengyi S et al. (2009) DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways, Nucleic Acids Research 37, e16 doi:10.1093/nar/gkn991.
  • Engler C (2009) Golden Gate Shuffling: A One-Pot DNA Shuffling Method Based on Type IIs Restriction Enzymes, PLoS ONE 4:e5553–e5553, www.plosone.org
  • Moscou, M and Bogdanove A (2009) A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326, 1501.
  • Bang D and Church G (2008) Gene synthesis by circular assembly amplification Nature Methods 5: 37–39.
  • Yehezkel T et al. (2008) De novo DNA synthesis using single molecule PCR, Nucleic Acids Res. 36:e107.
  • Knight T (2003) Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. Boston: MIT Synthetic Biology Working Group
  • Li M and Elledge S (2007) Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods 4: 251–256.
  • Bernauer H. (2001) In house knowledge: use of T7 Gene6 Exonuclease activity for gene assembly for years without patenting)
  • Zhang Y et al. (2000) DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli Nature Biotechnology 18, 1314–1317.
  • Yu D et al. (2000) An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli PNAS 97, 5978–5983.
  • Zhang, Y. Et al. (1998) A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics 20: 123–128.
  • Murphy K. (1998) Use of bacteriophage λ recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J. Bacteriol. 180: 2063–2071.
  • Hsiao K. (1993) Exonuclease III induced ligase-free directional subcloning of PCR products, Nucleic Acids Res. 21: 5528–9.
  • Kaluz S (1992) Directional cloning of PCR products using exonuclease III. Nucleic Acids Res. 20: 4369– 4370.
  • Matsuoka T, et al. (1991) Direct cloning of a long restriction fragment aided with a jumping clone. Gene. Oct 30; 107(1): 27–35.
  • Aslanidis C and de Jong P (1990) Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18: 6069–74.

Patente:

  • EP 09 154 567.3, PCT/EP2010/052892, EP 10 707 041.9, US 13/254,831, CA 2,754,161EP 1047706 A2 (Text aus WO1999047536A2) Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuremolekülen WO 2000034299 A1 Spaltung von chemisch synthetisierten Oligo-/Polynucleotiden an einer vorbestimmten Stelle (15-Jun-2000), applicants: Biochip Technologies GmbH, Klapproth Holger, Bernauer Hubert S.
  • AU 2000016578 A patent Cleavage of chemically synthesized oligonucleotides/polynucleotides in a defined position BIOCHIP TECHNOLOGIES GMBH
    http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2013009525
    http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2012138939
    http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO201213892

Anlage Bezugszeichenliste

  • Gol
    (= Gene of Interest)
    An
    = A-BoX-Element (0 ... n) mit Genen A, B, C ... N (A1A, A1B ... )
    Tf
    = Transkriptionsfaktoren
    P
    = Promotoren
    T
    = Terminatoren
    S-A, S-B
    alternierende Selektionsmarker n* (DONOR → ACCEPTOR)
    SR-L, SR-R
    = linkes und rechtes Integrationsmotiv in den Zielwirt (T-BoX-Elemente)
    T-R
    = Toggle Restriction site

Erklärung zu Figur 1:

1: Ausführung des basalen Assemblierungsvektor-System mit einer erfindungsgemäßen Konfiguration von Restriktionsenzymschnittstellen zur Toggle-(De-)Assemblierung. A Zu assemblierende A-BOX-Elemente sind mit verschachtelten Paaren kompatibler Restriktionsendonuklease-Schnittstellen versehen A: TypII, B: Typ2S, C: A und B gemischt (nicht gezeigt). A: Beide Enzymspezifitäten des inneren Paares (AscI/MauBI) besitzen eine acht-merige Erkennungssequenz, die wiederum jeweils eine identische, sechsstellige BssHII-Kernsequenz besitzt, die nach der Ligation von Enden der unterschiedlichen Spezifitäten wieder regeneriert wird. Die durch die Restriktion der Spezifitäten erzeugte viermerige Überlappungssequenz ist bei allen Spezifitäten kompatibel. Diese Eigenschaft bei den bekannten Restriktionsenzymen mit achtmeriger Erkennungssequenz ist einzigartig und der hat technisch verwertbare Konsequenzen auf die Anwendung von Assemblierungszyklen mittels Ligation oder Rekombination. Das äußere Paar der verschachtelten Restriktionsenzyme besitzt diese Eigenschaft nicht. Die beispielhafte sechsmerige kompatible Kernsequenz von AbsI ist XhoI und die von SgrDI ist SalI. XhoI und SalI haben dieselbe viermerige Überlappung nach Restriktion und sind deshalb ligations-kompatibel. Mit diesem Enzympaar kann man auch zyklisch assemblieren. Als S-BOX-Elemente sind positive, wie auch negative Selektionsmarker vorgesehen. Die S-BOX-Elemente flankierend vorgesehenen beispielhaften Restriktionssites sind SgrDI und AsiSI. AsiSI ist die sogenannte Toggle-site. Die T-BOX ist für die Klonierung von Transferfunktionen vorgesehen, wie Shuttle-oris für Zielorganismen oder aber flankierende und spezifische Rekombination-sites. Die M-BOX-Elemente (beispielhaft flankiert von PacI und AbsI sind vorgesehen für die jeweiligen Wirtsfunktionen zur Vermehrung der Plasmid und Vektor-DNAs der erfindungsgemäßen ACCEPTOREN und DONOREN für die Toggle (De-)Assemblierungsfunktionen. B: pToP-Vektoren: die TypIIS-Paare AarI/BfuAI und SapI/EarI sind jeweils bis auf eine Base sequenzidentisch, dies bei einem identischen Abstand der Restriktionsstelle von der Erkennungsstelle. Diese Variante der Toggle-Assemblyreaktion lässt sich sehr gut auf kodierende Sequenzen anwenden. C: Iteratives Assembly eines multigenen Applikationsvektors mit Zielwirtfunktionen in det T-BoX aus DONOREN in das ACCEPTOR-Konstrukt, wie beschieben. Mischformen aus A und B

Erklärung zu Fig. 2:

2: Erfindungsgemäße A-BoX-Expressionskassette. Aus den individuellen A-BoX-Expressionscassetten A-1 ... An kann man Genecluster mit den Genen A-1: AA, A-2: AB, A-3: AC ... A-n: AN aufbauen (die jweils wieder aus einzelnen Proteindomänen-CDS um eine zentrale ”Central Gene-CDS”) aufgebaut sein können, Jede dieser Expressionskasetten sind für jeweils ein Gen expressionsoptimiert. Fehlen die transkriptionalen Kontrollelemente teilweise und zwischen den CDS finden sich ausschließlich translationale Kontrollelemente, so können die Gencluster spezies-spezifisch auch teilweise bis vollständig bi-, tri- bis oligo-cistronisch als Operone aufgebaut sein. Jede dieser Expressionsboxen ist von der jeweilg anderen durch jeweils eine BssHII site (X, Y) getrennt (mit X und Y sind die ACDC = assembly cloning de-assembly cloning sites markiert), die durch den Assemblierungsprozess mittels der AscI-MauBI vermittelten DONOR/ACCEPTOR basierten Assemblierungsreaktion automatisch entstehen. Intrinsische, ”unique” Zielsequenzen für Restriktionsenzyme werden in die CDS der Gencluster hinein gerechnet, um nach deren Assemblierung neben der generellen De-assemblierungsfunktion auch spezifische, interessierende Sequenzelemente austauschen zu können (SD = substitution cloning). Die Substitution von einer Expressionsbox kann durch ein oder mehrere Varianten einer Variantenbibliothek erfolgen. Erklärung zu Figur 3:

3: Grundprinzip des automatisierbaren Toggle-Processes. A Toggle-multiple-Genassemblierung kann wird durch die Kombination der DONOR-Vektoren pBoX-A- and S- kann aber auch mit kombinierten T- and S-BoXen durchgeführt werden. In jedem der Zyklen wird das S-box SELECTOR Gen ausgetauscht. So wird ein alternierendes Selektionsmuster in jedem der Toggle-Zyklen erzeugt (hier: 0 ... 9). Zu transformierende Bakterien werden auf verschiedenen Selektionsmedien (markiert in hell S-A und dunkel S-B) jeweils spezifisch für das verwendete SELECTOR-Gen. Dies sichert eine spezifische Zwischenselektion für das jeweils korrekt assemblierte Produkt in jedem Additionszyklus. DONOR-Vectoren können mit R6Kg-ORIs ausgestattet sein, die in pir+-Stämmen voneinander E. coli gezogen sind und selectiv für DNAs in pir(–)-minus genetischem Hintergrund. B Mit alternierenden Selektionsmarkeren können iterative Assemblierungsprozesse in vitro etabliert werden. Im Restriktionsmodus mit den Enzympaaren AbsI(XhoI) und SgrDI(SalI) sowie dem die nachfolgende Deassemblierung von zuvor assemblierten Konstrukten ermöglichenden Enympaar AscI(BssHII) und MauBI(BssHII). B Mittels Rekombination sind ähnliche Schemata in vivo möglich. Die Voraussetzung hierfür ist die Insertion rekombinations-spezifischer Sequenzen, die die gewünschte Reihenfolge der Assemblierung vorgeben. Voraussetzung ist ein entsprechende Vorpräparaton der verwendeten Vektoren B Mittels Exonukleasereaktionen sind ähnlich wie in B und C aufgebaute Assemblierungsreaktionen möglich. SLIC beispielsweise mit 3' -> 5'-Exonukleaseaktivität, (z. B. die T4-”proof reading” Aktivität und zusätzlich sind verschiedene 5'-3'-Enzymaktivitäten möglich, wie Lambda Exonuklease sowie T7Gen6, T5 oder T3 etc.).

Erklärung zu Fig. 4:

4: Feinauflösung der A-BoX-Region eines Gene-clusters mit den Genen – A-1, A-2, A-3 ... A-n. C1 ... Cn sind Kontrolregionen. Die 3'-terminale Terminationskontrolle der n-1 Gene wird mit der 5'-Initiationskontrollregion des nachfolgenden Gens n ausgetauscht. Hier sind die CDS internen 5'- and 3'- Restriktionsschnittstellen für den Austausch der Kontrolregionen T = terminator T1 and der transcriptionalen and translationalen Initiationsstellen I2 ... IN and CDS1 ... CDSn R1 and R1', R2 and R2' ... Rn and Rn'.

Erklärung zu Fig. 5:A Kombinatorisches auf TALENS-Zielsequenzhalbseiten basierten Systems zur Erzeugung artifizieller erfindungsgemäßer Funktionalität, wie die Generierung von vorbestimmten Restriktionsschnittstellen:

  • *ein t-Nukleotid wird am 5' Terminus benötigt.

5: Kombinatorische Halbseiten von vorbestimmten Zielsequenzen konstruierter TALENS-Moleküle. Die TALENs Moleküle können vorbestimmt so organisiert werden, dass sich kombinatorische Halbseiten ergeben, die sich nach Bedarf funktional steuern lassen, Zielesequenzen auflösen, neue generieren, sich ergänzen und regenerieren lassen. (A) Beispielhafte kombinatorische Zielsequenz bestehend aus zwei Halbseiten für vorbestimmte Talensmoleküle. Zielsequenzhalbseiten können partial z. B. terminal unterschiedlich sein, wie es bei dem erfindungsgemäßen natürlichen Molekül der Fall ist. Aber auch andere funktional interessante Kombinationen sind erlaubt. (B) können kombiniert werden und sind geeignet für die Substitution von e. g. Expressions-A-BoXen oder diese beinhaltende Teil- bzw. Unterelemente und Sequenzmotive. Bei der Vermeidung von sich wiederholenden Strukturen auf der Zielsequenzeben können (n-k)! mögliche Variationen erzeugt werden.

Erklärung zu Fig. 6:verfügbare RVDs (repeat variable domains)

6: Mindestens zwei funktionale Fusionen von TALENs-Molekülhalbseiten können in einer Expressionskassette eines repetitiven TALENS-Domänen multiplex Gene-Clusters so organisiert sein, dass sie die Zielsequenzen erkennen. Die Kombinatorik sorgt für die Spezifität mit der die einzelnen Kassetten ausgetauscht werden können. Der Austausch kann durch eine oder mehrere Kassetten gleichzeitig erfolgen. Die entsprechenden Zielsequenzhalbseiten können so organisiert werden, dass sie sich zu neuen Entitäten ergänzen, oder sich nach dem erfindungsgemäßen Vorbild es AscI-MauBI Paares so verhalten, dass eine Core-Sequenz sich regeneriert. Insbesonders für Substitutionen von Genen und Geneensembles (GenClusters) sinmit kombinatorischen Eigenschaften der Ziel sequenzen sind TALENs besonders gut geeignet für das Design von künstlicher, molekularer Funktionalität.

zu Fig. 8:

Erfindungsgemäßes Beispiel von Toggle-Vektoren auf denen das Assemblierungs- und De-Assemblierungsystem basiert:

Erklärung zu Fig. 7:

7: X De-Assemblierungs-sites; A und S: R-sites für die Integration verschiedener Gencluster auf übergeordneter Ebene; E1–E5 sind multiple Expressionskassetten mit vorbestimmten identischen R-sites X für Assembly and De-assembly von allen Expressionsboxen eines DNA-Konstrukts; E1–E5 ein experimenteller Setup hat kalkulierte Paare von R-sites R0-0'-R4-4' sind identische R-sites (e. g. TALENS) für die Substitution individueller Expressionsboxen.

Erklärung zu Fig. 8: s. SequenzprotokollErfindungsgemäßes Beispiel eines Toggle-Vektoren basierten Assemblierungs- und De-Assemblierungsystems:

8: Exemplarische Sequenzdarstellungen des erfindungsgemäßen Toggle-(De-)Assembly-Systems für Baculovirus-Transfervektoren: TogBAC-A3.1.1, TogBAC-A3.1.3, TogBAC-A3.2.1 und TogBAC-A3.1.2.

9: Sequenzdarstellungen eines realisierten, erfindungsgemäßen Toggle-(De-)Assembly-Systems für Baculovirus bestehend aus den Genen AA, AB, AC und AD. Die Sequenzen der Gene sind nicht offengelegt, da diese der Geheimhaltung unterliegen. Die Promotoren Polydedrinpromotor (polh) und p10-Promotor (p10) alternieren im Konstrukt: polh-p10-polh-p10. Das Genkluster wurde mit den Transfervektoren TogBAC-A3.1.1(ACCEPTOR), TogBAC-A3.1.2(DONOR), (TogBAC-A3.2.1(ACCEPTOR)) und TogBAC-A3.2.2.(DONOR) aufgebaut.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 09154567 [0067]
  • EP 2010/052892 [0067]
  • EP 10707041 [0067]
  • US 13/254831 [0067]
  • CA 2754161 [0067]
  • EP 1047706 A2 [0067]
  • WO 1999047536 A2 [0067]
  • WO 2000034299 A1 [0067]
  • AU 2000016578 A [0067]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • McKnight 2003 [0009]
  • Hsiao K 1993; Kaluz S 1992 [0009]
  • Bernauer H 2001 pers. Komm. [0009]
  • Gibson D et al. 2009 [0009]
  • Shao 2009; Yu D et al. 2000 [0009]
  • Gibson et al. 2009 [0009]
  • Bang D and M Church G 2008 [0009]
  • Yehezkel T et al. 2008 [0009]
  • Murphy K 1998 [0010]
  • „Registry of Standard Biological Parts” (McKnight, 2003) [0011]
  • Zhang F, et al., 2011 [0021]
  • Miller J et al. (2010) [0021]
  • Moscou, M and Bogdanove A (2009) [0021]
  • Cong L, et al., 2013 [0021]
  • Isalan M, 2011 [0021]
  • Bernauer pers. Comm. [0036]
  • Aslandis and De Jong, 1990 [0036]
  • Oßwald C et al. (2012) [0056]
  • Miller J et al. (2010) [0057]
  • Moscou, M and Bogdanove A (2009) [0057]
  • http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2013009525 [0067]
  • http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO2012138939 [0067]
  • http://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docld=WO201213892 [0067]