Title:
Verfahren zur Isolierung von Rhamnolipiden
Kind Code:
A1
Abstract:

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Rhamnolipiden



Inventors:
Schilling, Martin, Dr. (53115, Bonn, DE)
Rütering, Marius (59872, Meschede, DE)
Dahl, Verena, Dr. (50858, Köln, DE)
Cabirol, Fabien, Dr. (40213, Düsseldorf, DE)
Application Number:
DE102012221519A
Publication Date:
05/28/2014
Filing Date:
11/26/2012
Assignee:
Evonik Industries AG, 45128 (DE)
International Classes:
Foreign References:
WO2012013554A12012-02-02
Other References:
Sarachat et al. (2010)
ISO 4319 (1977)
Claims:
1. Verfahren zur Isolierung von Rhamnolipiden umfassend die Verfahrensschritte
A) Bereitstellen eines mindestens ein Rhamnolipid enthaltenden w?ssrigen Mediums mit einem pH-Wert kleiner 6,
B) in Kontakt Bringen des Mediums mit mindestens einem organischen L?sungsmittel unter Erhalt eines Mehrphasensystems und Abtrennen der w?ssrigen Phase,
C) Erh?hung des pH-Wertes auf einen pH-Wert von 6 oder gr??er unter Erhalt eines mehrphasigen organischen Systems,
D) Abtrennen einer mit Rhamnolipid angereicherten organischen Phase und
E) gegebenenfalls weitere Aufreinigung des Rhamnolipides.

2. Verfahren gem?? Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das gesamte w?ssrige Medium in Verfahrensschritt A) zwischen 10 g/L und 300 g/L, insbesondere zwischen 50 g/L und 150 g/L Rhamnolipide enth?lt.

3. Verfahren gem?? Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das w?ssrige Medium in Verfahrensschritt A) einen pH-Wert von 2 bis 4,5 insbesondere von 3,5 bis 4 aufweist.

4. Verfahren gem?? mindestens einem der vorherigen Anspr?che, dadurch gekennzeichnet, dass das organische L?sungsmittel oder die Mischung der organischen L?sungsmittel des Verfahrensschrittes B) Wasser in einer Menge von 0,1 bis 30 Gew.-%, bevorzugt 0,5 bis 7 Gew.-%, zu l?sen vermag.

5. Verfahren gem?? mindestens einem der vorherigen Anspr?che, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine organische L?sungsmittel des Verfahrensschrittes B) ausgew?hlt ist aus Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isoamylacetat, Butan-1-ol, Butan-2-ol und Diethylether,.

6. Verfahren gem?? mindestens einem der vorherigen Anspr?che, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumenverh?ltnis von w?ssrigem Medium zu organischem L?sungsmittel oder zu Mischung der organischen L?sungsmittel vor in Kontakt Bringen von 0,2:1 bis 5:1, bevorzugt von 2:1 bis 4:1 und besonders bevorzugt von 2,9:1 bis 3,1:1 betr?gt.

7. Verfahren gem?? mindestens einem der vorherigen Anspr?che, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt C) der pH-Wert auf von 6,1 bis 9, bevorzugt auf von 6,5 bis 8, besonders bevorzugt auf von 6,9 bis 7,1, erh?ht wird.

8. Verfahren gem?? mindestens einem der vorherigen Anspr?che, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt C) der pH-Wert durch eine anorganische Base, insbesondre Erdalkali-, Alkalibase, bevorzugt w?ssrige, oder Ammoniak erh?ht wird, wobei NaOH und KOH besonders bevorzugt sind.

9. Verfahren gem?? mindestens einem der vorherigen Anspr?che, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte B), C) und D) in einem Temperaturbereich von 10 bis 50 ?C, bevorzugt 15 bis 30, besonders bevorzugt 18 bis 25 durchgef?hrt werden.

10. Verfahren gem?? mindestens einem der vorherigen Anspr?che, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritte E) organisches L?sungsmittel durch mindestens teilweises Verdampfen von dem Rhamnolipid abgetrennt wird.

Description:
Gebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Rhamnolipiden.

Stand der Technik

Rhamnolipide sind grenzfl?chenaktive Glykolipide und Stoffwechselprodukte bestimmter Mikroorganismen, von denen der bekannteste Produzent wohl Pseudomonas aeruginosa darstellt.

Rhamnolipide verf?gen ?ber besondere tensidische Eigenschaften wie beispielsweise ein starkes Schaumverm?gen und sind f?r verschiedenste technische Anwendungen interessant. Die Tatsache, dass sie unter milden Bedingungen mittels Fermentation basierend auf nachwachsenden Rohstoffen herstellbar sind und damit gut zu den zeitgen?ssischen Megatrends ?Nachhaltigkeit? und ?gr?nen Chemie? passen, hat das Interesse an den Rhamnolipiden in den letzten Jahren stetig zunehmen lassen. Rhamnolipide sind allerdings bisher nur in kleinen Mengen und hohen Preisen auf dem Markt verf?gbar und k?nnen nur in Nischenanwendungen mit den typischerweise in zum Beispiel K?perpflegeprodukten und Haushaltsreinigern angewandten chemisch-synthetischen Tensiden konkurrieren. Ein Grund f?r die hohen Kosten liegt insbesondere in der schwierigen Aufarbeitung des Fermentationsproduktes von den Fermentationsbr?hen, welche eine gro?e Anzahl an verunreinigenden Nebenkomponenten enthalten. Hierzu geh?ren unvollst?ndig umgesetzte, lipophile und amphiphile Substrate (z.B. Tri- und Paritalglyceride sowie Fetts?uren), lipophile und amphiphile Zellbestandteile (z.B. Phospholipide der Zellmembranen), sowie Antischaummittel (z.B. Silikon-, Pflanzen?l- oder Polyether-basiert), die zur Schaumkontrolle w?hrend der Fermentation eingesetzt werden. Insbesondere die Antischaummittel st?ren in der sp?teren Anwendung und sind aufgrund der amphiphilen Natur der Rhamnolipide nur schwer von diesen zu trennen. Neben den schauminhibierenden Komponenten m?ssen in vielen F?llen auch hydrophile Fermentationsnebenprodukte, wie z.B. Proteine und mikrobielle Polysaccharide abgetrennt werden, da diese aus anderen Gr?nden im Endprodukt st?ren k?nnen (mikrobielle Stabilit?t, toxikologische Eigenschaften etc.). Zu guter Letzt ist bei der Aufarbeitung auch eine starke Aufkonzentrierung der w?ssrigen RL L?sung zu erreichen, da Tensidl?sungen auf Marktseite in m?glichst hochkonzentrierter Form gefordert werden. Aus ?kologischen Gr?nden sollen m?glichst geringe Mengen Wasser mit dem Produkt transportiert werden, um einen m?glichst geringen Treibstoffverbrauch pro kg Aktivsubstanz zu gew?hrleisten. Die durch Fermentation erreichbaren Produktkonzentrationen sind relativ niedrig, aus der Literatur sind bisher keine Konzentrationen gr??er 100 g/l bekannt.

Aus der Literatur ist eine Reihe von Methoden bekannt, um Rhamnolipide, die h?ufig eine Mischung verschiedener Formen darstellen (z.B. mono- und di-Rhamnolipide), aufzureinigen und von den vorgenannten Verunreinigungen zu trennen. Verschiedene, verfahrenstechnisch anspruchsvolle Methoden, wie z.B. der Einsatz von Membranfiltration, die Adsorption an Ionenaustauscher sowie die Schaumfraktionierung w?hrend der Fermentation erlauben eine Teilaufreinigung, allerdings k?nnen durch einen einzigen dieser Verfahrensschritte weder die hydrophilen, noch die hydrophobe Verunreinigungen in ausreichendem Ma? abgetrennt werden. Zudem ist ein kosteneffizienter Einsatz in industriellem Ma?stab f?r die Aufreinigung von RLs nicht untersucht und tendenziell zu teuer um bez?glich der Herstellkosten mit den klassisch chemisch-synthetischen Tensiden konkurrenzf?hig zu sein. Dies gilt nat?rlich auch f?r die verf?gbaren chromatographischen Verfahren. Sarachat et al. (2010) beschreiben die saure Extraktion von Fermentationsbr?hen mit einem organischen L?sungsmittel beziehungsweise L?sungsmittelgemisch mittlerer Polarit?t, wie z.B. Ethylacetat, Chloroform-Methanol, Chloroform-Ethanol oder Dichlormethan, bei der zun?chst lipophile Komponenten mit extrahiert werden. Die Rhamnolipide werden in einem zweiten Schritt durch schrittweise Hinzugabe eines unpolareren L?sungsmittels, wie z.B. Hexan oder Chloroform unter K?hlung zur F?llung gebracht und weiter gereinigt. Ein offensichtlicher Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Zugabe von toxikologisch bedenklichen, erd?lbasierten unpolaren L?sungsmitteln wie Hexan oder Chloroform und ein Kristallisationsschritt mit K?hlung erforderlich sind. Neben den ebenfalls h?heren Kosten, den verfahrenstechnischen und sicherheitstechnischen Anforderungen ist ein solches Verfahren auch im Sinne einer nachhaltigen, gr?nen Chemie nicht ideal. Zudem existieren bereits jetzt regulatorische Anforderungen, die die ?ko-Zertifizierung und -vermarktung eines aus einem solchen Prozess stammenden Produktes nicht erlauben.

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren zur Aufreinigung von Rhamnolipiden zur Verf?gung zu stellen, was mindestens einen der Nachteile des Standes der Technik zu ?berwinden vermag.

Beschreibung der Erfindung

?berraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren die der Erfindung gestellte Aufgabe zu l?sen vermag.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Rhamnolipiden wie in den vorliegenden Anspr?chen beansprucht.

Vorteil des erfindungsgem??en Verfahrens ist es, dass wenig L?sungsmittel gebraucht wird. Ein weiterer Vorteil ist es, dass die eingesetzten L?sungsmittel toxikologisch und sicherheitstechnisch unbedenklich sind. Noch ein weiterer Vorteil ist es, dass L?sungsmittel aus nachhaltigen Quellen stammend eingesetzt werden k?nnen. Noch ein Vorteil ist es, dass das erfindungsgem??e Verfahren bei energetisch g?nstigen Temperaturen durchgef?hrt werden kann. Noch ein Vorteil ist es, dass das erfindungsgem??e Verfahren mit einfachen technischen Ger?ten durchgef?hrt werden kann. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgem??en Verfahrens ist es, dass es die Aufreinigung/Aufkonzentrierung gro?er Produktmengen in k?rzester Zeit erm?glicht. Noch ein Vorteil ist es, dass in dem erfindungsgem??en Verfahren das aufkonzentrierte und aufgereinigte Produkt nicht als Feststoff, sondern als fl?ssige Phase erhalten wird, was die verfahrenstechnische Weiterverarbeitung erleichtert. Die anfallende, hochkonzentrierte L?sung stellt das fertige Endprodukt dar. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgem??en Verfahrens ist es, dass es zur Aufarbeitung sowohl von Fermentationsbr?hen als auch von bereits teilaufgereinigten Rhamnolipiden geeignet ist.

Das erfindungsgem??e Verfahren zur Isolierung von Rhamnolipiden umfasst die Verfahrensschritte

  • A) Bereitstellen eines mindestens ein Rhamnolipid enthaltenden w?ssrigen Mediums mit einem pH-Wert kleiner 6, insbesondere kleiner 5,
  • B) in Kontakt Bringen des Mediums mit mindestens einem organischen L?sungsmittel unter Erhalt eines Mehrphasensystems und Abtrennen der w?ssrigen Phase,
  • C) Erh?hung des pH-Wertes auf einen pH-Wert von 6 oder gr??er unter Erhalt eines mehrphasigen organischen Systems,
  • D) Abtrennen einer mit Rhamnolipid angereicherten organischen Phase und
  • E) gegebenenfalls weitere Aufreinigung des Rhamnolipides.

Unter dem Begriff ?Rhamnolipid? im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden insbesondere Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder dessen Salze verstanden, wobei
m = 2, 1 oder 0, insbesondere 1 oder 0,
n = 1 oder 0, insbesondere 1,
R1 und R2 = unabh?ngig voneinander gleicher oder verschiedener organischer Rest mit 2 bis 24, bevorzugt 5 bis 13 Kohlenstoffatomen, insbesondere gegebenenfalls verzweigter, gegebenenfalls substituierter, insbesondere hydroxy-substituierter, gegebenenfalls unges?ttigter, insbesondere gegebenenfalls einfach, zweifach oder dreifach unges?ttigter, Alkylrest, bevorzugt solcher ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus Pentenyl, Heptenyl, Nonenyl, Undekenyl und Tridekenyl und (CH2)o-CH3 mit o = 1 bis 23, bevorzugt 4 bis 12, Der ?pH-Wert? im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist definiert als der Wert, welcher f?r entsprechenden Stoff bei 25 ?C nach f?nf Minuten R?hren mit einer gem?? ISO 4319 (1977) kalibrierten pH-Elektrode gemessen wird. Unter dem Begriff ?w?ssriges Medium? im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung zu verstehen, die mindestens 5 Gew.-% Wasser, bezogen auf die betrachtete Gesamtzusammensetzung enth?lt. Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent.

Es ist erfindungsgem?? bevorzugt, wenn in dem erfindungsgem??en Verfahren das gesamte w?ssrige Medium in Verfahrensschritt A) zwischen 10 g/L und 300 g/L, insbesondere zwischen 50 g/L und 150 g/L Rhamnolipide enth?lt, wobei sich die Literangabe auf das gesamte w?ssrige Medium beziehen. Insbesondere bevorzugt ist in dem erfindungsgem??en Verfahren das w?ssrige Medium in Verfahrensschritt A) eine zellfreie oder zellhaltige Fermentationsbr?he, bevorzugt eine zellfreie.

Insbesondere ist das erfindungsgem??e Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das w?ssrige Medium in Verfahrensschritt A) einen pH-Wert von 2 bis 4,5 insbesondere von 3,5 bis 4 aufweist. Der pH-Wert kann in diesem Zusammenhang vorteilhaft mit einer S?ure, insbesondere einer anorganischen S?ure, die besonders bevorzugt ausgew?hlt aus HCl, H2SO4, Salpeters?ure, Phosphors?ure und Kohlens?ure, insbesondere HCl ist, eingestellt werden.

Es ist vorteilhaft f?r das erfindungsgem??e Verfahren, wenn nach Verfahrensschritt D) in der mit Rhamnolipid angereicherten organischen Phase eine bestimmte Menge Wasser enthalten ist; dies hat den technischen Effekt, dass man durch einfaches Entfernen, beispielsweise Abdestillieren, des organischen L?sungsmittels eine hochkonzentrierte, w?ssrige Rhamnolipidfraktion erhalten kann; deswegen ist ein bevorzugtes erfindungsgem??es Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das organische L?sungsmittel oder die Mischung der organischen L?sungsmittel des Verfahrensschrittes B) Wasser in einer Menge von 0,1 bis 30 Gew.-%, bevorzugt 0,5 bis 7 Gew.-%, zu l?sen vermag, wobei sich die Gewichtsprozente auf die Summe von organischem L?sungsmittel und Wasser beziehen.

Bevorzugte organische L?sungsmittel des Verfahrensschrittes B) sind ausgew?hlt aus Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isoamylacetat, Butan-1-ol, Butan-2-ol und Diethylether, wobei Ethylacetat besonders bevorzugt ist. Es ist erfindungsgem?? bevorzugt, wenn in dem erfindungsgem??en Verfahren das Volumenverh?ltnis bei 20 ?C von w?ssrigem Medium zu organischem L?sungsmittel oder zu der Mischung der organischen L?sungsmittel vor in Kontakt Bringen von 0,2:1 bis 5:1, bevorzugt von 2:1 bis 4:1 und besonders bevorzugt von 2,9:1 bis 3,1:1 betr?gt.

Eine bevorzugte Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt C) der pH-Wert auf von 6,1 bis 9, bevorzugt auf von 6,5 bis 8, besonders bevorzugt auf von 6,9 bis 7,1, erh?ht wird.

Es ist erfindungsgem?? bevorzugt, wenn in dem erfindungsgem??en Verfahren in Verfahrensschritt C) der pH-Wert durch eine anorganische Base, insbesondere Erdalkali-, Alkalibase, bevorzugt w?ssrige, oder Ammoniak erh?ht wird, wobei NaOH und KOH besonders bevorzugt sind.

Ein Vorteil des erfindungsgem??en Verfahrens ist es, dass es zum Gro?teil bei Umgebungstemperatur durchgef?hrt werden kann, somit werden die Verfahrensschritte B), C) und D) bevorzugt in einem Temperaturbereich von 10 bis 50 ?C, bevorzugt 15 bis 30, besonders bevorzugt 18 bis 25 durchgef?hrt.

In Verfahrensschritt E) kann das Rhamnolipid bei Bedarf weiter augereinigt werden. Eine bevorzugte Ausf?hrungsform des erfindungsgem??en Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritte E) vorhandenes organisches L?sungsmittel durch mindestens teilweises Verdampfen von dem Rhamnolipid abgetrennt wird. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass das Verdampfen des organischen L?sungsmittels unter vermindertem Druck und erh?hter Temperatur durchgef?hrt wird. Insbesondere ein Druckbereich von 0,01 bis 1 bar, bevorzugt von 0,15 bis 0,3 bar in Verbindung mit einer Temperatur von 20 bis 80 ?C, bevorzugt von 40 bis 60 ?C, hat sich als vorteilhaft herausgestellt.

Das erfindungsgem??e Verfahren kann einen weiteren Verfahrensschritt F) umfassen, der die R?ckgewinnung von gegebenenfalls enthaltenem Antischaum-Mittel, insbesondere aus den organischen Phasen, beinhaltet. Dieses kann dann vorteilhaft in einer n?chsten Fermentation wiederverwertet werden.

In den nachfolgend aufgef?hrten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Anspr?chen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausf?hrungsformen beschr?nkt sein soll.

Beispiele: Beispiel 1: Abtrennung und Aufkonzentrierung von Rhamnolipiden aus einem Rhamnolipid/Fetts?ure-Gemisch mittels Extraktion und pH induzierter Phasentrennung

Als Ausgangsprodukt f?r die nachfolgend beschriebene Aufreinigung und Aufkonzentrierung wurde ein fermentativ hergestelltes Rhamnolipid Rohprodukt verwendet. Dieses bestand zu etwa 50% aus verschiedenen Rhamnolipiden sowie zu circa 20% aus unterschiedlichen, fetts?ureartiger Verunreinigungen, welche entweder durch das Fermentationssubstrat eingetragen wurden oder auch w?hrend der Fermentation als Nebenprodukt gebildet wurden. Hierbei handelt es sich haupts?chlich um C10 Hydroxyfetts?uren sowie deren Dimere und einfach unges?ttigte C12 Fetts?uren. Zur Detektion der Verunreinigungen in allen Aufbereitungsschritten wurde unter anderem ein speziell hierf?r entwickeltes d?nnschichtchromatographisches Verfahren verwendet. Die Aufreinigung von Rhamnolipiden erfolgte ausgehend von einer w?ssrigen L?sung mit einer RL Konzentration von 50 g/L. Der Anteil der Fetts?uren in der w?ssrigen L?sung betrug 20 g/L. In Fermentationsbr?hen bzw. teilaufgereinigten Rohprodukten befinden sich h?ufig Proteine, die die Phasentrennung nach der Extraktion erschweren und zur Bildung gro?er Interphasen f?hren. Damit ist meist auch ein Produkt- bzw. Ausbeuteverlust verbunden. Um dies zu verhindern, wurden die Proteine zun?chst durch Zugabe 1 Gew. % einer kommerziellen Proteasepr?paration (Alcalase, Novozymes) bei einem pH = 7 und 60 ?C hydrolysiert. Dadurch wurde die anschlie?ende Extraktion stark vereinfacht. Zur Extraktion der Rhamnolipide wurde die w?ssrige L?sung mit Hilfe von konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt. Anschlie?end wurde mit gleichem Volumen Ethylacetat extrahiert. Die Phasentrennung im Scheidetrichter nach erfolgreicher Extraktion erfolgte schnell und zuverl?ssig bei Raumtemperatur (25 ?C).

Hydrophile Verunreinigungen verblieben in diesem Schritt bereits in der w?ssrigen Phase. Die lipophileren Verunreinigungen und nahezu 100% der enthaltenen Rhamnolipide l?sten sich in der organischen Phase. Die rhamnolipidhaltige organische Phase wurde abgetrennt und weiter prozessiert. Durch Zugabe von 50%iger KOH (aq) wurde der pH-Wert der L?sung auf pH 7 eingestellt. Eine pl?tzlich eintretende Tr?bung der L?sung in diesem pH Bereich indizierte das Auftreten einer weiteren organischen Phase; die organischen Phasen wurden wiederum im Scheidetrichter schnell und unkompliziert bei Raumtemperatur (25 ?C) getrennt, wobei sich die Rhamnolipide vornehmlich in der unteren Phase angereichert hatten und die lipophilen Verunreinigungen gr??tenteils in der oberen Phase verblieben. Somit wurde nicht nur eine starke Aufkonzentrierung der Rhamnolipiden, sondern zugleich auch eine effektive Aufreinigung derselbigen erreicht. Nach Abtrennen der unteren, Rhamnolipide enthaltenden Phase wurde das organische L?sungsmittel mittels einfacher Destillation bei 0,2 bar und 60?C abgezogen.

Die erhaltene Rhamnolipid Fraktion wies eine Konzentration von 500 g/L auf. Die Reinheit betrug 80%. Dies entspricht einer 10 fachen Aufkonzentrierung mit einem Aufreinigungfaktor von 1,6 bei insgesamt 95% Ausbeute.

Das fertige Endprodukt wies deutlich bessere anwendungstechnische Eigenschaften auf als die verunreinigte Ausgangl?sung auf. Insbesondere die Schaumeigenschaften wurden hierdurch verbessert. Dies wurde mit einem Schaumtester der Firma SITA (R-2000) ?berpr?ft. Das aufgereinigte Produkt zeigte eine deutlich schnellere Schaumbildungskinetik und das erreichte Schaumvolumen war ebenfalls deutlich h?her.

Beispiel 2: Abtrennung und Aufkonzentrierung von Rhamnolipiden aus einem Rhamnolipide/Antischaum Gemisch mittels Extraktion und pH induzierter Phasentrennung

Zur Abtrennung von Entsch?umer von einer Rhamnolipid L?sung wurde ein kommerziell erh?ltliches Rhamnolipid Gemisch (JBR 505) von Jeneil Biosurfactants verwendet.

Die Aufreinigung von Rhamnolipiden erfolgte ausgehend von einer w?ssrigen L?sung mit einer Konzentration von 50 g/L. Der silikonhaltige DOW Corning 1500 Entsch?umer wurde in einer Endkonzentration von 20 g/L zugesetzt. Zur Extraktion der Rhamnolipide wurde die w?ssrige L?sung mit Hilfe von konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt. Anschlie?end wurde mit gleichem Volumen Ethylacetat extrahiert. Die Phasentrennung im Scheidetrichter nach erfolgreicher Extraktion erfolgte schnell und zuverl?ssig bei Raumtemperatur (25 ?C). Hydrophile Verunreinigungen verblieben in diesem Schritt bereits in der w?ssrigen Phase. Die lipophileren Verunreinigungen und nahezu 100% der enthaltenen Rhamnolipide l?sten sich in der organischen Phase. Die rhamnolipidhaltige organische Phase wurde abgetrennt und weiter prozessiert. Durch Zugabe von 50%iger KOH (aq) wurde der pH-Wert der L?sung auf pH 7 eingestellt. Eine pl?tzlich eintretende Tr?bung der L?sung in diesem pH Bereich indizierte das Auftreten einer weiteren organischen Phase; die organischen Phasen wurden wiederum im Scheidetrichter schnell und unkompliziert bei Raumtemperatur (25 ?C) getrennt, wobei sich die Rhamnolipide vornehmlich in der unteren Phase angereichert hatten und die Mehrheit der lipophilen Verunreinigungen sowie nahezu 100% des Entsch?umers in der oberen Phase verblieben. Somit wurde neben der Aufreinigung und starken Aufkonzentrierung der Rhamnolipiden zugleich auch eine effektive Abtrennung vom Entsch?umer erreicht. Die Abtrennung des Entsch?umers wurde mittels quantitativer 1H-NMR Analytik nachgewiesen. Das f?r den Polydimethylsiloxanentsch?umer typische Signal bei einer chemischen Verschiebung von etwa ? 0.1 ppm konnte in der unteren rhamnolipidhaltigen Phase praktisch nicht mehr detektiert werden, daf?r aber deutlich in der oberen Ethylacetatphase. Nach Abtrennen der unteren, Rhamnolipide enthaltenden Phase wurde das organische L?sungsmittel mittels einfacher Destillation bei 0,2 bar und 60?C abgezogen.

Die erhaltene Rhamnolipid Fraktion wies eine Konzentration von 450 g/L auf. Die Reinheit betrug 75%. Dies entspricht einer 9 fachen Aufkonzentrierung mit einem Aufreinigungsfaktor von 1,5 bei insgesamt 90% Ausbeute.

Das fertige Endprodukt wies deutlich bessere anwendungstechnische Eigenschaften auf als die verunreinigte Ausgangl?sung auf.

Beispiel 3: Abtrennung und Aufkonzentrierung von Rhamnolipiden aus einer Rhamnolipid und Antischaum enthaltenden Fermentationsbr?he

Eine Fermentation mit einem die Rhamnolipid-Biosynthesegene RhlA, RhlB und RhlC enthaltenden Pseudomonas putida Stamm wird durchgef?hrt. Die Vorkultur im Sch?ttelkolben wird wie in WO2012013554A1 beschrieben durchgef?hrt. F?r die Hauptkultur kommt ebenfalls ein Mineralmedium (M9) zum Einsatz. Die Fermentation wird kohlenstofflimitiert ?ber eine Glukosezuf?tterung in einem 2 Liter Fermenter gef?hrt. Die Glukosezuf?tterung erfolgt anhand des Gel?stsauerstoffsignals. Der Gel?stsauerstoff wird bei 20 % S?ttigung ?ber die R?hrerdrehzahl reguliert. Der pH Wert wird ?ber eine pH Elektrode und Zugabe von NH4SO4 auf 7 reguliert. Um das ?bersch?umen der Fermentationsbr?he zu verhindern wird in einem Fall der silikonhaltige Entsch?umer DOW Corning 1500, im anderen Fall ein Sonnenblumen?l zudosiert. Die Fermentation wird ?ber 4 Tage bis zu einer Biotrockenmasse von 15 g/l gef?hrt. Die Rhamnolipidkonzentration wird ?ber HPLC ermittelt und betr?gt 9,8 g/l. Die am Ende der Fermentation erhaltene Br?he zeigt weder im Falle des eingesetzten DOW Corning 1500 Entsch?umers noch im Falle des Sonnenblumen?ls eine starke Neigung zur Schaumbildung. Nach Abtrennen der Zellen mittels Zentrifugation bei 10.000 g und anschlie?ender F?llung der Rhamnolipide durch Ans?uern auf pH = 4 wird die rhamnolipidhaltige Unterphase abgetrennt und mehrmals mit Wasser bei pH = 4 gewaschen. Das erhaltene Produkt wird durch Zugabe von NaOH wieder auf pH = 7 eingestellt, hierbei gehen die ausgef?llten Rhamnolipide wieder in L?sung. Das so erhaltene Produkt weist ung?nstige anwendungstechnische Eigenschaften auf. Die ?ber eine SITA Messungen analysierte Schaumbildungskinetik und das erzielte Gesamtschaumvolumen sind nicht ausreichend. Im Gegensatz dazu, wird ?ber das hier beanspruchte Verfahren ein Produkt mit hervorragenden Anwendungseigenschaften, insbesondere hervorragenden Schaumeigenschaften erhalten. Hierbei wird der Extraktionsschritt und die anschlie?ende Aufkonzentrierung wie in den weiter oben beschriebenen Beispielen durchgef?hrt. Dies kann entweder direkt aus der zellhaltigen Fermentationsbr?he, oder nach Abtrennung der Zellen erfolgen. Wenn die Zellen nicht abgetrennt werden, verl?uft die Phasentrennung deutlich langsamer und es bildet sich eine zell- und produkthaltige Zwischenphase, wodurch die Ausbeute reduziert, die Reinheit und die anwendungstechnischen Eigenschaften aber nicht beeinflusst werden. In dem erhaltenen Produkt ist der DOW Corning 1500 Entsch?umer bzw. das Sonnenblumen?l ?ber 1H-NMR nur noch in Spuren nachweisbar. Der Gro?teil verbleibt in der oberen organischen Phase und kann nach Entfernung des L?sungsmittels optional in einer weiteren Fermentation verwendet werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • WO 2012013554 A1 [0029]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Sarachat et al. (2010) [0004]
  • ISO 4319 (1977) [0010]