Title:
In Beschichtungsmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen für oxidische Oberflächen einsetzbare Peptide
Kind Code:
A1
Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, insbesondere Dodekapeptide enthaltende Beschichtungsmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe für oxidische Oberflächen, einen mehrschichtigen Verbund oder ein beschichtetes Substrat, enthaltend Verbindungen, die vollständig oder zum Teil aus Dodekapeptiden als Haftvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des Verbunds oder zwischen der Beschichtung und dem Substrat aufgebaut sind sowie als Beschichtungsmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe für oxidische Oberflächen einsetzbare Dodekapeptide.



Inventors:
Taden, Andreas, Dr. (40597, Düsseldorf, DE)
Veith, Birgit, Dr. (40235, Düsseldorf, DE)
Breves, Roland, Dr. (40822, Mettmann, DE)
Schmitt, Irmgard (42697, Solingen, DE)
Weber, Thomas, Dr. (41541, Dormagen, DE)
Application Number:
DE102012110664A
Publication Date:
05/08/2014
Filing Date:
11/07/2012
Assignee:
Henkel AG & Co. KGaA, 40589 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE102005045770A1N/A2007-03-29
Foreign References:
WO2003078451A22003-09-25
WO2006056009A12006-06-01
JP2012193155A2012-10-11
WO2004035612A22004-04-29
Other References:
"Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1, S. 267-271 und Band 2, S. 227-229
Attorney, Agent or Firm:
Patentanwaltskanzlei Dr. Reinert, 50670, Köln, DE
Claims:
1. Quantifizierungsverfahren zur Bestimmung der Adh?sionseigenschaften auf oxidischen Oberfl?chen haftender Peptide, insbesondere Dodekapeptide, dadurch gekennzeichnet, da? man
a) eine Peptide enthaltende L?sung auf einen Tr?ger mit oxidischer Oberfl?che aufbringt und trocken l??t,
b) die nicht gebundenen Peptide durch Waschen vom Tr?ger entfernt und diesen trocknen l??t,
c) die auf dem Tr?ger adh?rierten Peptide mit einer F?rbel?sung einf?rbt, die restliche F?rbel?sung abw?scht und den Tr?ger trocknen l??t,
d) die auf dem Tr?ger adh?rierten und gef?rbten Peptide mit einer Extraktionsl?sung vom Tr?ger abl?st und den die gef?rbten Peptide enthaltenden ?berstand einer spektralphotometrischen Messung unterzieht.

2. Quantifizierungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, da? die Einf?rbung in Schritt c) des erfindungsgem??en Verfahrens entweder durch eine einfache unspezifische Anf?rbung der Peptide, beispielsweise durch Coomassie-F?rbel?sung, oder durch eine chemische Umsetzung, beispielsweise mit Ninhydrin, die zu einer spezifischen Bindung f?hrt, erfolgt.

3. Quantifizierungsverfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, da?
? in Schritt a) 2 ? 10 ?l einer Peptidl?sung, die eine Konzentration von 2 mg/ml, gel?st in 1 ? PBS pH 7,4 der Firma Gibco aufweist, auf ein rundes HDG-Stahlpl?ttchen mit einem Durchmesser von 2,3 cm aufgetragen werden, wobei die ersten 10 ?l etwa 15 Minuten getrocknet und die zweiten 10 ?l anschlie?end auf die gleiche Stelle getropft und f?r 30 Minuten getrocknet werden, wonach eine Trocknung bei 30?C im Hybridisierungsofen HB-1000 der Firma UVP Laboratory Products in Gegenwart von 200 ml Wasser erfolgt.
? in Schritt b) die Pl?ttchen zum Waschen in eine Kristallisierschale (Durchmesser 19cm) mit 1 Liter 1 ? PBS pH 7,4 gelegt und f?r 10 Minuten bei Raumtemperatur bei 60 Umdrehungen pro Minute in einem Tischsch?ttler Certomat U der Firma B. Braun leicht gesch?ttelt und anschlie?end bei 30?C getrocknet werden.
? in Schritt c) die Pl?ttchen in eine 6-well Schale ?berf?hrt werden und 150 ?l Coomassie-F?rbel?sung, die 2 g Coomassie brilliant blue R-250, 0,5 g Coomassie brilliant blue G-250, 50 ml Methanol, 425 ml Ethanol, 100 ml Eisessig, ad 1000 ml Aqua dest.enth?lt, auf das Pl?ttchen pipettiert werden, wobei nach 30 Sekunden vorsichtig am Rand der Schale 6ml 1 ? PBS pH 7,4 Puffer zum Absp?len der F?rbel?sung hinzugegeben werden und die Pl?ttchen 2 ? in 6 ml 1 ? PBS pH 7,4 ?berf?hrt werden, um restliche F?rbel?sung zu entfernen, wonach die Pl?ttchen kurz bei 30?C getrocknet werden.
? in Schritt d) 20 ?l DMSO/CH3COOH-Extraktionsl?sung im Volumenverh?ltnis von 9/1 auf die gef?rbten Spots pipettiert werden, die Extraktionsl?sung 5 Minuten bei Raumtemperatur einwirken gelassen wird, die Fl?ssigkeit anschlie?end unter auf- und ab pipettieren aufgesaugt wird, bis der Spot vollst?ndig vom Pl?ttchen entfernt ist und der ?berstand in ein Reaktionsgef?? ?berf?hrt wird, wonach 2 ?l des ?berstandes in einem Nanodrop 1000 Spectrophotometer der Firma PeqLab unter Auswahl des Programmes UV VIS bei 602 nm gemessen werden, um die mit der Adh?sionsst?rke der Peptide an oxidischen Oberfl?chen korrelierende Farbintensit?t zu bestimmen.

4. Peptide, insbesondere Dodekapeptide, die in der Messung in Schritt d) des Quantifizierungsverfahrens nach einem der Anspr?che 1 bis 3 eine Absorption im Bereich von 0,25 bis 1, vorzugsweise 0,4 bis 1, bevorzugterma?en 0,5 bis 1, besonders bevorzugt 0,6 bis 1 und ganz besonders bevorzugt von 0,7 bis 1 aufweisen.

5. Dodekapeptide nach Anspruch 4, deren Aminos?urensequenzen dem in Tabelle 1 gezeigten Sequenzmuster entsprechen.

6. Dodekapeptide nach Anspruch 4 oder 5, deren Aminos?urensequenzen an mindesten 8 der 12 Positionen, bevorzugt an mindesten 10 der 12 Positionen dem in Tabelle 1 gezeigten Sequenzmuster entsprechen.

7. Dodekapeptide nach einem der Anspr?che 4 bis 6, die in Tabelle 1 als Peptide 8 und 9 oder in Tabelle 2 als Peptide 6, 7, 13 und 15 aufgef?hrt sind.

8. Nukleins?uren, die f?r Peptide nach einem der Anspr?che 4 bis 7 kodieren, insbesondere solche, die den in Tabelle 3 aufgef?hrten Nukleins?uresequenzen entsprechen.

9. Vektoren, insbesondere Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren, die f?r Peptide, insbesondere Dodekapeptide kodierende Nukleins?uren nach Anspruch 8 enthalten.

10. Pro- oder eukaryotische Zellen, die mit f?r Peptide, insbesondere Dodekapeptide kodierenden Nukleins?uren nach Anspruch 8 transformiert worden sind.

11. Beschichtungsmittel, Lacke und Anstrichmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe f?r oxidische Oberfl?chen, enthaltend Peptide nach einem der Anspr?che 4 bis 7.

12. Mehrschichtiger Verbund oder beschichtetes Substrat, enthaltend Verbindungen, die vollst?ndig oder zum Teil aus Peptiden nach einem der Anspr?che 4 bis 7 als Haftvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des Verbunds oder zwischen der Beschichtung und dem Substrat aufgebaut sind.

13. Verwendung von Peptiden nach einem der Anspr?che 4 bis 7 als Bestandteil von Beschichtungsmitteln, Lacken und Anstrichmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen f?r oxidische Oberfl?chen sowie von mehrschichtigen Verbunden oder beschichteten Substraten.

Description:

Die Erfindung betrifft Peptide, insbesondere Dodekapeptide enthaltende Beschichtungsmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe f?r oxidische Oberfl?chen, einen mehrschichtigen Verbund oder ein beschichtetes Substrat, enthaltend Verbindungen, die vollst?ndig oder zum Teil aus Dodekapeptiden als Haftvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des Verbunds oder zwischen der Beschichtung und dem Substrat aufgebaut sind sowie als Beschichtungsmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe f?r oxidische Oberfl?chen einsetzbare Dodekapeptide.

Im Bereich der Beschichtung oder Lackierung oxidischer Oberfl?chen sind bekannte Methoden zur Haftvermittlung zum Beispiel bifunktionelle Organosilanverbindungen, die eine chemische Bindung zwischen der Polymermatrix des Lackes und dem anorganischen Substrat herstellen. Ein Nachteil dieser Haftvermittler besteht unter anderem darin, dass eine optimale Haftung nur gew?hrleistet ist, wenn sich auf der Oberfl?che des Substrates Hydroxid-Gruppen befinden, mit denen das Silan wechselwirken kann. In vielen F?llen ist zur Silanisierung von Oberfl?chen daher eine aufwendige Vorbehandlung des Substrates notwendig. Auch die Herstellung von ma?geschneiderten Materialien ist sehr aufwendig und zudem sind nicht f?r alle Substrate ma?geschneiderten Materialien bekannt.

Self-Assembled Monolayers (auch Selbstorganisierende Monoschichten, Abk?rzung: SAM's) wurden schon 1940 untersucht und beschrieben, aber erst 1983 hat man angefangen, diesen Ordnungsprozess technisch zu nutzen. Self-Assembled Monolayers haben im Prinzip zwei unterschiedliche aktive Gruppen, dazwischen ist ein Spacer, z. B. aliphatischer Spacer. Eine Gruppe davon wechselwirkt mit der Oberfl?che und die andere Endgruppe wirkt mit einer speziellen Eigenschaft oder verbindet sich mit einer anderen funktionellen Verbindung. Die SAMs bilden chemische Bindungen aus, die dem Angriff von Wasser widerstehen und gleichzeitig alle elektrochemischen Reaktionen an den Zwischenschichten verhindern k?nnen. Die Selbstorganisation der monomolekularen Schichten auf fester Oberfl?che bietet ein rationelles Verfahren f?r die Herstellung einer Zwischenschicht mit einer definierten Zusammensetzung, Struktur und Dicke. Selektiv selbst-organisierende Haftvermittler haben den Vorteil, die Haftung der Lack- und Klebstoffschichten an metallischen Oberfl?chen f?r lange Lebenszeiten zu gew?hrleisten, wie es zum Beispiel im Automobilbereich f?r eine weitere Verbesserung des Korrosionsschutzes erforderlich ist. Sie erm?glichen weiterhin eine gleichm??ig gute Haftung einer einheitlichen Lackschicht auf den vermehrt zum Einsatz kommenden Kompositwerkstoffen mit unterschiedlichen Oberfl?chen wie Kunststoff-Metallverbundwerkstoffe. Selbstorganisierende Monoschichten werden beispielsweise in der Halbleitertechnologie zur Oberfl?chenstabilisierung und ma?geschneiderten Funktionalisierung von Elektroden eingesetzt. Je nach L?nge der verwendeten Alkylketten wird dabei die Permeabilit?t und die Ladungstransfergeschwindigkeit beeinflu?t. Das Anwendungsgebiet selbstorganisierender Monoschichten ist sehr breit. Unter anderem wird die Technik der selbstorganisierenden Monoschicht beim elektrochemischen Rastertunnelmikroskop, bei Zelluntersuchungen, bei der Sensorik und in der Nanoelektronik verwendet. Allerdings ist die Erzeugung der im Stand der Technik beschriebenen SAMs aufwendig und kostspielig.

Die Kopplung eines anorganischen Substrats mit biologischen Komponenten zur Modifikation der Oberfl?cheneigenschaften ist in der Biomimetik bekannt. Aus einer Phagenbibliothek selektierte, kurze Peptide pr?sentierende Bakteriophagen wurden beispielsweise dazu verwendet, anorganische Materialien zu f?llen bzw. abzuscheiden (WO2003/078451). Auch Hybridmaterialien aus einem anorganischen Substrat und spezifischen Peptid-Liganden werden als potentielle L?sung zur Ver?nderung der Substratoberfl?che verwendet. Die Identifikation des an das Substrat passenden biologischen Liganden (?blicherweise ein Peptid) ist aber zeit- und kostspielig und stand bisher einer konkreten Anwendung im Wege. Das Konzept eines bifunktionellen Liganden zur Bindung von zwei anorganischen Komponenten wird im Stand der Technik angesprochen. Konkret wurde die Bindung von Zellen oder Biomolek?len an einem Polymersubstrat, insbesondere an oxidiertem Chlor-angereicherten Polypyrrol (PPyCl) beziehungsweise Poly(lactatco-glycolat) (PLGA), durch Bakteriophagen mit bifunktionellen Bindungseigenschaften zum Beispiel in WO2004/035612 beschrieben. Die weitere Bindung an einen weiteren Stoff, der wie zum Beispiel ein Beschichtungsmaterial, kein biologischer Bindungspartner des verwendeten Phagen ist, wird nicht weiter beschrieben, wobei diese Bindung ebenfalls selektiv zu erfolgen h?tte und eine genaue Anpassung des Liganden an die weitere Bindungskomponente erfordern w?rde.

Es besteht daher ein erheblicher Bedarf an der Bereitstellung neuer, f?r den Einsatz auf oxidischen Oberfl?chen geeigneter Verbindungen, die die genannten Nachteile des Standes der Technik vermeiden.

?berraschenderweise wurde gefunden, da? bestimmte Dodekapeptide vorteilhaft als Beschichtungsmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe f?r oxidische Oberfl?chen eingesetzt werden k?nnen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Quantifizierungsverfahren zur Bestimmung der Adh?sionseigenschaften auf oxidischen Oberfl?chen haftender Peptide, insbesondere Dodekapeptide, das dadurch gekennzeichnet ist, da? man

  • a) eine Peptide enthaltende L?sung auf einen Tr?ger mit oxidischer Oberfl?che aufbringt und trocken l??t,
  • b) die nicht gebundenen Peptide durch Waschen vom Tr?ger entfernt und diesen trocknen l??t,
  • c) die auf dem Tr?ger adh?rierten Peptide mit einer F?rbel?sung einf?rbt, die restliche F?rbel?sung abw?scht und den Tr?ger trocknen l??t.
  • d) die auf dem Tr?ger adh?rierten und gef?rbten Peptide mit einer Extraktionsl?sung vom Tr?ger abl?st und den die gef?rbten Peptide enthaltenden ?berstand einer spektralphotometrischen Messung unterzieht.

Bevorzugterma?en erfolgt die Einf?rbung in Schritt c) des erfindungsgem??en Verfahrens entweder durch eine einfache unspezifische Anf?rbung der Peptide, beispielsweise durch Coomassie-F?rbel?sung, oder durch eine chemische Umsetzung, beispielsweise mit Ninhydrin, die zu einer spezifischen Bindung f?hrt.

Besonders vorteilhafterweise werden die Schritte a) bis d) des erfindungsgem??en Quantifizierungsverfahrens wie folgt durchgef?hrt:
In Schritt a) werden 2 ? 10 ?l einer Peptidl?sung, die eine Konzentration von 2 mg/ml, gel?st in 1 ? PBS pH 7,4 der Firma Gibco aufweist, auf ein rundes HDG-Stahlpl?ttchen mit einem Durchmesser von 2,3 cm aufgetragen, wobei die ersten 10 ?l etwa 15 Minuten getrocknet und die zweiten 10 ?l anschlie?end auf die gleiche Stelle getropft und f?r 30 Minuten getrocknet werden, wonach eine Trocknung bei 30?C im Hybridisierungsofen HB-1000 der Firma UVP Laboratory Products in Gegenwart von 200 ml Wasser erfolgt.

In Schritt b) werden die Pl?ttchen zum Waschen in eine Kristallisierschale (Durchmesser 19cm) mit 1 Liter 1 ? PBS pH 7,4 gelegt und f?r 10 Minuten bei Raumtemperatur bei 60 Umdrehungen pro Minute in einem Tischsch?ttler Certomat U der Firma B. Braun leicht gesch?ttelt und anschlie?end bei 30?C getrocknet.

In Schritt c) werden die Pl?ttchen in eine 6-well Schale ?berf?hrt und es werden 150 ?l Coomassie-F?rbel?sung, die 2 g Coomassie brilliant blue R-250, 0,5 g Coomassie brilliant blue G-250, 50 ml Methanol, 425 ml Ethanol, 100 ml Eisessig, ad 1000 ml Aqua dest.enth?lt, auf das Pl?ttchen pipettiert, wobei nach 30 Sekunden vorsichtig am Rand der Schale 6ml 1 ? PBS pH 7,4 Puffer zum Absp?len der F?rbel?sung hinzugegeben werden und die Pl?ttchen 2 ? in 6 ml 1 ? PBS pH 7,4 ?berf?hrt werden, um restliche F?rbel?sung zu entfernen, wonach die Pl?ttchen kurz bei 30?C getrocknet werden.

In Schritt d) werden 20 ?l DMSO/CH3COOH-Extraktionsl?sung im Volumenverh?ltnis von 9/1 auf die gef?rbten Spots pipettiert, die Extraktionsl?sung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur einwirken gelassen, die Fl?ssigkeit anschlie?end unter auf- und ab pipettieren aufgesaugt, bis der Spot vollst?ndig vom Pl?ttchen entfernt ist und der ?berstand in ein Reaktionsgef?? ?berf?hrt, wonach 2 ?l des ?berstandes in einem Nanodrop 1000 Spectrophotometer der Firma PeqLab unter Auswahl des Programmes UV VIS bei 602 nm gemessen werden, um die mit der Adh?sionsst?rke der Peptide an oxidischen Oberfl?chen korrelierende Farbintensit?t zu bestimmen.

Erfindungsgem?? geeignete oxidische Oberfl?chen sind beispielsweise Stahl, Glas, Quarz, Metalloxide (z. B. B2O3, Al2O3, SiO2, FexOy), Keramiken, phosphatiertes Eisen, Gestein, Ziegel und Beton, wobei Stahl besonders bevorzugt ist. Auch keratinische Fasern und oxidische Polymere, bzw. entsprechend funktionalisierte Polymere k?nnen erfindungsgem?? geeignete oxidische Oberfl?chen bilden.

Vorteilhafterweise erm?glicht das erfindungsgem??e Quantifizierungsverfahren eine objektive Bestimmung der Adh?sionsst?rke von Peptiden an oxidischen Oberfl?chen, insbesondere von Dodekapeptiden an Stahloberfl?chen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide, insbesondere Dodekapeptide, die in der Messung in Schritt d) des erfindungsgem??en Quantifizierungsverfahrens eine Absorption im Bereich von 0,25 bis 1, vorzugsweise 0,4 bis 1, bevorzugterma?en 0,5 bis 1, besonders bevorzugt 0,6 bis 1 und ganz besonders bevorzugt von 0,7 bis 1 aufweisen.

Mithilfe des erfindungsgem??en Quantifizierungsverfahrens wurden Dodekapeptide identifiziert, deren Aminos?urensequenz dem in Tabelle 1 gezeigten Sequenzmuster entspricht, in dem ?X? f?r eine beliebige Aminos?ure steht, und die einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellen.

Erfindungsgem?? bevorzugte Dodekapeptide sind solche, die an mindesten 8 der 12 Positionen dem in Tabelle 1 gezeigten Sequenzmuster gen?gen. Besonders bevorzugte Dodekapeptide sind solche, die an mindestens 10 der 12 Positionen dem in Tabelle 1 gezeigten Sequenzmuster gen?gen.

Ganz besonders bevorzugte erfindungsgem??e Dodekapeptide sind die in Tabelle 1 aufgef?hrten Peptide 8 und 9 sowie die in Tabelle 2 aufgef?hrten Peptide 6 und 7.

Weitere Gegenst?nde der vorliegenden Erfindung sind die in der Tabelle 2 aufgef?hrten Peptide 10, 13, 15 und 17, insbesondere die Peptide 13 und 15.

Weitere Gegenst?nde der vorliegenden Erfindung sind f?r die erfindungsgem??en Peptide kodierende Nukleins?uren, insbesondere die in der Tabelle 3 aufgef?hrten Nukleins?uresequenzen.

Unter einem Peptid ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den nat?rlichen Aminos?uren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes Polymer zu verstehen, das kleiner ist als ein nat?rliches Protein. In der vorliegenden Anmeldung werden die 19 proteinogenen, nat?rlich vorkommenden L-Aminos?uren mit den international gebr?uchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet.

Die erfindungsgem??en Peptide, insbesondere Dodekapeptide, lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.

Bevorzugt ist es jedoch, die erfindungsgem??en Peptide, insbesondere Dodekapeptide mittels rekombinanter Verfahren herzustellen. Hierunter sind erfindungsgem?? alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, da? die Gene f?r die interessierenden Peptide in einen f?r die Produktion geeigneten Wirtsorganismus eingebracht und von diesem transkribiert und translatiert werden. Geeigneterweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene ?ber Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren; aber auch ?ber solche, die bewirken, da? das interessierende Gen im Wirtsorganismus in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingef?gt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren gegentischen Elementen wird erfindungsgem?? als Expressionskassette bezeichnet. Sie mu? daf?r jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.

Besonders bevorzugterma?en werden die erfindungsgem??en Peptide, insbesondere Dodekapeptide als Multimere hergestellt und nachfolgend in die funktionalen Peptide gespalten. Ganz besonders bevorzugte Multimere weisen 2 bis 10 Dodekapeptide auf, die jeweils durch Spacer von 0 bis 4 Aminos?uren L?nge voneinander getrennt sind. Diese Spacer k?nnen z. B. aus den Aminos?uren Gly, Ala und Ser bestehen.

Einem Fachmann ist es ?ber heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden m?glich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminos?uresequenzen die entsprechenden Nukleins?uren bis hin zu vollst?ndigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus dem ?Lexikon der Biochemie?, Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1, S. 267?271 und Band 2, S. 227?229, bekannt.

Die vorliegende Erfindung umfa?t auch Derivate der erfindungsgem??en Peptide, insbesondere Dodekapeptide. Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Peptide verstanden, deren reine Aminos?urekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen k?nnen beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Biosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierf?r k?nnen molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Sie k?nnen aber auch chemisch durchgef?hrt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminos?ure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Peptid. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Peptide oder Proteine handeln, die beispielsweise ?ber bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgem??e Peptide gebunden werden. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Tr?ger zu verstehen.

Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleins?uren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleins?urebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie verm?gen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie ?ber mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als vom ?brigen Genom unabh?ngig replizierendes, stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewisserma?en auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erf?lllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das hei?t, die Expression des betreffenden Peptids zu erm?glichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.

Die f?r ein erfindungsgem??es Peptid, insbesondere Dodekapeptid oder ein Multimer eines solchen Peptides kodierende Nukleins?ure wird geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Die molekularbiologische Dimension der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen f?r die entsprechenden Peptide. Dazu k?nnen beispielsweise solche geh?ren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder ?berwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen verm?gen Vektoren, sich in den betreffenden Wirtszellen ?ber mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gew?hlt wird, h?ngt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend k?nnen beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verf?gung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren bef?higten Wirtszellen sein.

Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte f?r molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugeh?rigen Peptids und f?r erfindungsgem??e Weiterentwicklungen und letztlich f?r die Amplifikation und Produktion erfindungsgem??er Peptide. Sie stellen weitere Ausf?hrungsformen der vorliegenden Erfindung dar.

Bevorzugte Ausf?hrungsformen der vorliegenden Erfindung sind Klonierungsvektoren. Diese eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens f?r die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa ?ber das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausf?hrungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagerf?hige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte f?r molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion.

Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ?hnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu bef?higen, in den f?r die Produktion von Peptiden optimierten Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen. Bevorzugte Ausf?hrungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflu?t, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den nat?rlichen, urspr?nglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen v?llig anderen Promotor eines anderen Organismus.

Bevorzugte Ausf?hrungsformen sind solche Expressionsvektoren, die ?ber ?nderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind.

Ausf?hrungsformen der vorliegenden Erfindung k?nnen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Peptidbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.

Die In-vivo-Synthese eines erfindungsgem??en Peptids, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugeh?rigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Organismen, das hei?t Prokaryonten, Eukaryonten oder Cyanophyta. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten f?r Fremdpeptide. H?ufig m?ssen aus der F?lle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verf?gung stehenden Systeme die optimalen Expressionssysteme f?r den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes erfindungsgem??e Peptid kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden.

Bevorzugte Ausf?hrungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verf?gung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein k?nnen, in ihrer Aktivit?t regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch ?nderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte k?nnen diese zur Expression angeregt werden. Dies erm?glicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Peptide.

Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegen?ber Eukaryonten in der Regel durch k?rzere Generationszeiten und geringere Anspr?che an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch k?nnen kosteng?nstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgem??er Peptide etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Peptiden in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschlie?enden Membranen. Dies kann f?r spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales, besitzen demgegen?ber keine ?u?ere Membran, so da? sekretierte Peptide sogleich in das die Zellen umgebende N?hrmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausf?hrungsform die exprimierten erfindungsgem??en Peptide direkt aufreinigen lassen.

Eine Variante dieses Versuchsprinzips stellen Expressionssysteme dar, bei denen zus?tzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verf?gung gestellt werden, die Produktion erfindungsgem??er Peptide beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgem??en Peptid gemeinsam aufgereinigt werden sollen.

Aufgrund der weitreichenden Erfahrungen, die man beispielsweise hinsichtlich der molekularbiologischen Methoden und der Kultivierbarkeit mit coliformen Bakterien hat, stellen diese bevorzugte Ausf?hrungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Besonders bevorzugt sind solche der Gattungen Escherichia coli, insbesondere nichtpathogene, f?r die biotechnologische Produktion geeignete St?mme.

Repr?sentative Vertreter dieser Gattungen sind die K12-Derivate und die B-St?mme von Escherichia coli. St?mme, die sich nach an sich bekannten genetischen und/oder mikrobiologischen Methoden von diesen ableiten lassen, und somit als deren Derivate angesehen werden k?nnen, besitzen f?r genetische und mikrobiologische Arbeiten die gr??te Bedeutung und werden vorzugsweise zur Entwicklung erfindungsgem??er Verfahren eingesetzt. Solche Derivate k?nnen beispielsweise ?ber Deletions- oder Insertionsmutagenese hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen ver?ndert sein, andere oder zus?tzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zus?tzliche Peptide exprimieren. Es kann sich insbeosndere um solche Derivate handeln, die zus?tzlich zu dem erfindungsgem?? hergestellten Peptid weitere wirtschaftlich interessante Peptide exprimieren.

Auch solche Mikroorganismen sind bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, da? sie nach Transformation mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten worden sind. Dabei kann es sich beispielsweise um Klonierungsvektoren handeln, die zur Lagerung und/oder Modifikation in einen beliebigen Bakterienstamm eingebracht worden sind. Solche Schritte sind in der Lagerung und in der Weiterentwicklung betreffender genetischer Elemente allgemein verbreitet. Da aus diesen Mikroorganismen die betreffenden genetischen Elemente in zur Expression geeignete gram-negative Bakterien unmittelbar ?bertragen werden k?nnen, handelt es sich auch bei den vorangegenagenen Transformationsprodukten um Verwirklichungen des betreffenden Erfindungsgegenstands.

Auch eukaryontische Zellen k?nnen sich zur Produktion erfindungsgem??er Peptide eignen. Beispiele daf?r sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Peptide im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme erm?glichen. Dazu geh?ren beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccaride.

Die Wirtszellen des erfindungsgem??en Verfahrens werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes N?hrmedium mit den rekombinanten Bakterienst?mmen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Flie?gleichgewichts aus, in dem ?ber einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen telweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.

Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik wohlbekannt und stellen den eigentlichen gro?technischen Produktionsschritt dar; gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgef?hrten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Peptide beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausf?hrungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.

Hierbei m?ssen die f?r die eingesetzten Herstellungsverfahren, f?r die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Peptide jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden St?mme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder R?hrergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden.

Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, da? die Fermentation ?ber eine Zulaufstrategie durchgef?hrt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden, die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugef?ttert; man spricht auch von einer Zuf?tterungsstrategie. Hierdurch k?nnen betr?chtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivit?t des interessierenden Peptids erreicht werden. Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, da? unerw?nschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.

Das hergestellte Peptid kann nachtr?glich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegen?ber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfodert jedoch die Zurverf?gungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme. Ohne Sekretion ist u.U. die Aufreinigung des Peptids aus der Zellmasse erforderlich, auch dazu sind verschiedene Verfahrer bekannt, wie F?llung z.B durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung, wenn erforderlich bis zur Homogenit?t. Die Mehrzahl der beschriebenen technischen Verfahren d?rfte jeoch mit einer angereicherten, stabilisierten Pr?paration auskommen.

Alle bereits oben ausgef?hrten Elemente k?nnen zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgem??e Peptide herzustellen. Es ist dabei f?r jedes erfindungsgem??e Peptid eine Vielzahl von Kombinationsm?glichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren mu? f?r jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.

Weitere Gegenst?nde der vorliegenden Erfindung sind f?r erfindungsgem??e Peptide, insbesondere Dodekapeptide kodierende Nukleins?uren sowie Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren, die f?r erfindungsgem??e Peptide, insbesondere Dodekapeptide kodierende Nukleins?uren enthalten.

Gegenst?nde der vorliegenden Erfindung sind ferner pro- oder eukaryotische Zellen, die mit f?r erfindungsgem??e Peptide, insbesondere Dodekapeptide kodierenden Nukleins?uren transformiert worden sind. Die erfindungsgem??en Peptide, insbesondere Dodekapeptide k?nnen vorteilhafterweise in Beschichtungsmitteln, Lacken und Anstrichmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen f?r oxidische Oberfl?chen eingesetzt werden. Weitere Gegenst?nde der vorliegenden Erfindung sind daher Beschichtungsmittel, Lakke und Anstrichmittel, Haftvermittler oder Klebstoffe f?r oxidische Oberfl?chen, die erfindungsgem??e Peptide, insbesondere Dodekapeptide enthalten, oder aus diesen bestehen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist au?erdem ein mehrschichtiger Verbund oder ein beschichtetes Substrat, enthaltend Verbindungen, die vollst?ndig oder zum Teil aus Peptiden, insbesondere Dodekapeptiden als Haftvermittler zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des Verbunds oder zwischen der Beschichtung und dem Substrat aufgebaut sind.

Mehrschichtige Verbunde werden f?r unterschiedlichste Zwecke, z. B. als Verpackungsmittel (insbesondere Verbundfolien) oder selbstklebende Artikel (mehrschichtiger Verbund aus mindestens Tr?ger und Klebstoffschicht) eingesetzt. Die efindungsgem??en mehrschichtigen Verbunde enthalten mindestens zwei, vorzugsweise zwei bis f?nf Schichten, wobei die einzelnen Schichten eine Dicke von z. B. 0,01 bis 5 mm haben k?nnen. Die einzelnen Schichten weisen oxidische Oberfl?chen auf und enthalten vorzugsweise Metall oder Metalloxide. Bei den Schichten handelt es sich insbesondere um Metallfolien oder metallisierte Polymerfolien. Zwischen mindestens zwei benachbarten Schichten des mehrschichtigen Verbunds werden die oben genannten Peptide als Haftvermittler verwendet. Vorzugsweise handelt es sich bei mindestens einer der benachbarten Schichten um eine Schicht aus einem metallisierten nat?rlichen oder synthetischen Polymer. Als Polymere kommen insbesondere Polykondensate, wie Polyester, Polyaddukte wie Polyurethane, Polyamide, Polycarbonate oder Polyphenylenether oder Polyphenylensulfide oder Polymere, welche durch radikalische oder ionische Polymerisation von ethylenisch unges?ttigten Verbindungen erh?ltlich sind (kurz radikalische Polymere genannt). Derartige radikalische Polymere bestehen vorzugsweise zu mindestens 60 Gew.-%, besonders bevorzugt zu mindestens 80 Gew.-% aus sogenannten Hauptmonomeren, ausgew?hlt aus C1 bis C20 Alkyl(meth)acrylaten, Vinylestern von bis zu 20 C-Atome enthaltenden Carbons?uren, Vinylaromaten mit bis zu 20 C-Atomen, ethylenisch unges?ttigten Nitrilen, Vinylhalogeniden, Vinylethern von 1 bis 10 C Atome enthaltenden Alkoholen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen mit 2 bis 8 C Atomen und ein oder zwei Doppelbindungen, insbesondere Ethylen und Propylen. Die f?r die Haftvermittling ben?tigte Menge des Peptids betr?gt im allgemeinen 0,01 bis 1000 mg (Milligramm/m2 (Quadratmeter), insbesondere 0,01 bis 100 mg/m2 und besonders bevorzugt 0,1 bis 10 mg/m2. Das erfindungsgem??e Peptid, insbesondere Dodekapeptid kann auf eine der benachbarten Schichten aufgetragen werden, alternativ kann das Peptid auch auf beide Schichten aufgetragen werden. Das Peptid liegt vorzugsweise als w?ssrige L?sung vor; der Peptidgehalt der L?sung betr?gt vorzugsweise 0,01 bis 5 Gew.-Teile Peptid auf 100 Gew.-Teile Wasser. F?r die erfindungsgem??en Verwendungen in Beschichtungsmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen f?r oxidische Oberfl?chen wird die L?sung vorzugsweise weiter verd?nnt auf eine Konzentration von 1 bis 10000 ?g/ml Wasser, insbesondere 10 bis 1000 ?g/ml Wasser. Nach dem Auftragen kann daher zun?chst eine Trocknung zur Entfernung des Wassers erfolgen. Danach k?nnen die beiden benachbarten Schichten durch ?bliche Methoden, z. B. durch Kaschierung verbunden werden.

Substrate werden zu unterschiedlichsten Zwecken beschichtet. Genannt seien insbesondere dekorative ?berz?ge oder Schutz?berz?ge (zusammenfassend Lackierungen) oder auch Klebstoffbeschichtungen, wobei der Klebstoff als solcher auf das Substrat aufgebracht werden kann oder z. B. in Form eines selbstklebenden Artikels (Etikett oder Klebeband) aufgeklebt wird. Das Substrat, bzw. die Substratoberfl?che, kann aus einem beliebigen Material bestehen. Ebenso kann die Beschichtung bzw. die substratseitige Oberfl?che der Beschichtung aus einem beliebigen Material bestehen. Vorzugsweise besteht die Substratoberfl?che oder die Beschichtung, bzw. die substratseitige Oberfl?che der Beschichtung aus Metall, insbesondere aus Stahl, oder aus metallisierten nat?rlichen oder synthetischen Polymeren. Als Polymere kommen insbesondere Polykondensate, wie Polyester, Polyaddukte wie Polyurethane, Polyamide, Polycarbonate oder Polyphenylenether oder Polyphenylensulfide oder Polymere, welche durch radikalische oder ionische Polymerisation von ethylenisch unges?ttigten Verbindungen erh?ltlich sind (kurz radikalische Polymere genannt). Zum Aufbau der radikalischen Polymeren und ihren Gehalt an Hauptmonomeren gilt das oben gesagte.

Die f?r die Haftvermittling ben?tigte Menge des Peptids entspricht der oben angegebenen Menge. Das Peptid kann auf die Substratoberfl?che, auf die substratseitige Oberfl?che der Beschichtung oder auf beide aufgetragen werden. Das Peptid liegt vorzugsweise als w?ssrige L?sung vor; der Gehalt der L?sung ist wie oben angegeben. Nach dem Auftragen kann daher zun?chst eine Trocknung zur Entfernung des Wassers erfolgen.

Die Beschichtung kann nach ?blichen Methoden auf das Substrat aufgebracht werden, Folien oder mehrschichtige Verbunde k?nnen z. B. aufkaschiert werden. Insbesondere kann die Beschichtung durch Aufbringen einer Polymerdispersion, Polymerl?sung oder eines l?semittelfreien Polymeren auf die mit dem Haftvermittler versehene subtratseitige Oberfl?che und anschlie?ende Verfilmung und/oder thermische oder photochemische H?rtung hergestellt werden. Insbesondere liegt das Polymer dazu in Form einer w?ssrigen Dispersion oder L?sung vor, besonders bevorzugt handelt es sich um eine w?ssrige Dispersion eines Emulsionspolymerisats, vorzugsweise eines oben aufgef?hrten radikalischen Polymeren. Nach dem Auftragen des Polymeren erfolgt dann gegebenenfalls eine Trocknung.

Die erfindungsgem??en mehrschichtigen Verbunde und beschichteten Substrate haben eine deutlich erh?hte Festigkeit. Die Beschichtung haftet durch die Verwendung der Peptide als Haftvermitteler st?rker auf dem Substrat und die einzelnen Schichten des mehrschichtigen Verbunds haften besser aneinander.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Substrat um ein Metall. Es kann sich hierbei prinzipiell um beliebige Metalle handeln. Beispiele umfassen Eisen, Stahl, Zink, Zinn, Aluminium, Kupfer bzw. Legierungen dieser Metalle untereinander sowie mit anderen Metallen handeln. Es kann sich insbesondere um Stahl, mit Zink-, Zinklegierungen, Aluminium- oder Aluminiumlegierungen beschichteten Stahl oder um Aluminium- bzw. Aluminiumlegierungen handeln. Besonders bevorzugt sind Zink- bzw. Zinklegierungen bzw. damit Substrate wie beispielsweise verzinkter Stahl.

Zn- oder Al-Legierungen sind dem Fachmann bekannt. Je nach dem gew?nschten Anwendungszweck w?hlt der Fachmann Art und Menge von Legierungsbestandteilen aus. Typische Bestandteile von Zink-Legierungen umfassen insbesondere Al, Pb, Si, Mg, Sn, Cu oder Cd. Typische Bestandteile von Aluminium-Legierungen umfassen insbesondere Mg, Mn, Si, Zn, Cr, Zr, Cu oder Ti. Es kann sich auch um Al/Zn-Legierungen handeln, bei denen Al- und Zn in ann?hernd gleicher Menge vorhanden sind. Mit derartigen Legierungen beschichteter Stahl ist kommerziell erh?ltlich.

Die Metalle k?nnen in beliebiger Form vorliegen, bevorzugt sind aber Metallfolien, Metallb?nder oder Metallbleche. Bei dem Metall kann es sich auch um ein Verbundmaterial mit einer metallischen Oberfl?che handeln. Beispielsweise kann es sich um einen Verbund aus einer Polymerfolie und einem Metall handeln. Die oxidischen, vorzugsweise metallischen Oberfl?chen werden mit den erfindungsgem??en Peptiden, als Haftvermittler beschichtet. Dies kann mit w?ssrigen L?sungen der Peptide erfolgen. Einzelheiten zur Beschichtung wurden bereits vorstehend erw?hnt.

Bei der Beschichtung kann es sich insbesondere um typische Lacke bzw. Lacksysteme zur Beschichtung von metallischen Oberfl?chen handeln. Es kann sich hierbei um thermisch, fotochemisch oder nach anderen Mechanismen h?rtende Lacke handeln.

Typische Lacke zur Beschichtung von Metalloberfl?chen umfassen mindestens ein Bindemittel sowie vernetzbare Komponenten. Bei den vernetzbaren Komponenten kann es sich um Vernetzer handeln, welche zus?tzlich zu einem Bindemittel eingesetzt werden oder es kann sich hierbei um vernetzbare Gruppen handeln, welche mit dem Bindemittel verbunden sind. Selbstverst?ndlich kann auch das Bindemittel vernetzbare Gruppen aufweisen und zus?tzlich ein Vernetzer eingesetzt werden. Hierbei sind verschiedene Kombinationsm?glichkeiten denkbar. Beispielsweise k?nnen Bindemittel und Vernetzer getrennt voneinander eingesetzt werden. Das Bindemittel umfasst dann reaktive funktionelle Gruppen, die mit komplement?ren, reaktiven funktionellen Gruppen in den Vernetzern reagieren k?nnen. Alternativ kann es sich auch um selbstvernetzende Bindemittel handeln, die reaktive funktionelle Gruppen umfassen, die mit Gruppen ihrer Art ("mit sich selbst") oder mit komplement?ren, reaktiven funktionellen Gruppen am selben Polymer Vernetzungsreaktionen eingehen k?nnen. M?glich ist auch, dass ausschlie?lich die Vernetzer miteinander reagieren.

Beispiele geeigneter Bindemittel umfassen (Meth)acrylat(co)polymerisate, partiell verseifte Polyvinylester, Polyester, Alkydharze, Polylactone, Polycarbonate, Polyether, Epoxidharz-Amin-Addukte, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyimide oder Polyurethane. Selbstverst?ndlich k?nnen auch Mischungen verschiedener Polymerer eingesetzt werden, vorausgesetzt es treten durch die Mischung keine unerw?nschten Effekte auf. Die vernetzenden Komponenten k?nnen thermisch vernetzende Gruppen oder fotochemisch vernetzende Gruppen aufweisen. Geeignete thermische Vernetzer sind beispielsweise Vernetzer auf Basis von Epoxiden, von Melamin oder von blockierten Isocyanaten. Geeignete Vernetzer zur photochemischen Vernetzung sind insbesondere Verbindungen mit mehreren ethylenisch unges?ttigten Gruppen, insbesondere di- oder polyfunktionelle Acrylate.

Durch die erfindungsgem??en Peptide, insbesondere Dodekapeptide wird die Haftung des Lackes auf dem Substrat vorteilhaft verbessert. Weiterhin wird in Korrosionsschutztests auch eine verbesserte Best?ndigkeit gegen Unterwanderung der Lackschicht erreicht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von erfindungsgem??en Peptiden, insbesondere Dodekapeptiden als Bestandteil von Beschichtungsmitteln, Lacken und Anstrichmitteln, Haftvermittlern oder Klebstoffen f?r oxidische Oberfl?chen sowie von mehrschichtigen Verbunden oder beschichteten Substraten.

Das folgende Beispiele erl?utert die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschr?nken:

Beispiel 1: Quantifizierung von Peptiden auf (Stahl-)Oberfl?chen

Mit der im folgenden beschriebenen Methode wird illustriert, wie eine Quantifizierung von an (Stahl-)Oberfl?chen adh?rierten Peptiden durchgef?hrt werden kann.

Damit ist es m?glich, ?ber die visuelle Bewertung hinaus ein objektiv messbares Ergebnis bez?glich der Adh?sionseigenschaften zu erzeugen. Dies Verfahren ist beispielhaft zu verstehen, weitere chemische Nachweisverfahren k?nnen analog geeignet sein. (z.B. Reaktion mit Ninhydrin).

Mit der beschriebenen Methode k?nnen die in Tabelle 3 genannten Peptide diskriminiert werden, neben guten (P6, P7) und mittelm??igen (P13, P15) k?nnen schlecht bis gar nicht bindende Peptide (10, 17) unterschieden werden, wie der in 1 gezeigten Grafik zu entnehmen ist.

Auftrag der Peptide:

2 ? 10 ?l Peptidl?sung (2 mg/ml gel?st in 1 ? PBS pH 7,4 v. Gibco) werden auf ein HDG-Stahlpl?ttchen (rund, Durchmesser 2,3 cm) aufgetragen. Die ersten 10 ?l werden ca. 15? getrocknet, die zweiten 10 ?l werden anschlie?end auf die gleiche Stelle getropft und f?r 30? getrocknet. Trocknung bei 30?C im Hybridisierungsofen HB-1000 von UVP in Gegenwart von 200 ml Wasser.

Waschen:

Die Pl?ttchen werden zum Waschen in eine Kristallisierschale (Durchmesser 19cm) mit 1 Liter 1 ? PBS pH 7,4 gelegt und f?r 10? bei RT leicht gesch?ttelt (60 rpm, Certomat U v. B. Braun). Anschlie?end werden die Pl?ttchen bei 30?C getrocknet.

F?rben:

Die Pl?ttchen werden in eine 6-well Schale ?berf?hrt. Es werden 150 ?l Coomassie-F?rbel?sung auf das Pl?ttchen pipettiert. Nach 30 sec werden vorsichtig (am Rand) 6ml 1 ? PBS pH 7,4 Puffer zum Absp?len der F?rbel?sung hinzugegeben. Danach wird das Pl?ttchen 2 ? in 6 ml 1 ? PBS pH 7,4 ?berf?hrt, um restliche F?rbel?sung zu entfernen. Anschlie?end wird das Pl?ttchen kurz bei 30?C getrocknet.

(Coomassie-F?rbel?sung.: 2 g Coomassie brilliant blue R-250, 0,5 g Coomassie brilliant blue G-250, 50 ml Methanol, 425 ml Ethanol, 100 ml Eisessig, ad 1000 ml Aqua dest.)

Abl?sen:

Es werden 20 ?l DMSO/CH3COOH-Lsg. (v/v 9/1) auf den gef?rbten Spot pipettiert. Man l?sst die Extraktionsl?sung 5? bei RT einwirken, anschlie?end wird die Fl?ssigkeit unter auf- und ab pipettieren aufgesaugt, bis der Spot vollst?ndig vom Pl?ttchen entfernt ist. Der ?berstand wird in ein Reaktionsgef?? ?berf?hrt.

Messung:

Die Messung der Farbintensit?t erfolgt im Nanodrop 1000 Spectrophotometer. (Program UV VIS). Dazu werden 2 ?l Probe aufgetragen und bei 602 nm gemessen.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgef?hrten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschlie?lich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA ?bernimmt keinerlei Haftung f?r etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • WO 2003/078451 [0004]
  • WO 2004/035612 [0004]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • ?Lexikon der Biochemie?, Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, Band 1, S. 267?271 und Band 2, S. 227?229 [0025]