Title:
EINZELDOMÄNEN-ANTIKÖRPER GEGEN CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOXINE
Kind Code:
A1
Abstract:

Die Erfindung betrifft Antigen-bindende Polypeptide, die die CDR1-, CDR2-, und CDR3-Region einer VHH-Domäne eines Kamelid-Schwereketten-Antikörpers umfassen. Die Polypeptide binden spezifisch im Bereich der Aminosäuren 1-800 eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile. Die Antigen-bindenden Polypeptide eignen sich insbesondere für die therapeutische Behandlung einer Erkrankung, die durch ein Glykosyltransferase-Aktivität aufweisendes Toxin von Clostridium difficile verursacht wird, sowie für die Diagnose einer solchen Erkrankung. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Antigen-bindenden Polypeptide in Verfahren zum Nachweis eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile in einer biologischen Probe. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile, bei denen die Antigenbindenden Polypeptide zur Anwendung kommen, werden ebenfalls bereitgestellt.



Inventors:
Nolte, Friedrich (22767, Hamburg, DE)
Unger, Mandy (22529, Hamburg, DE)
Application Number:
DE102011121238A
Publication Date:
06/20/2013
Filing Date:
12/14/2011
Assignee:
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, 20251 (DE)
International Classes:
Foreign References:
WO2006122825A22006-11-23
WO2010042815A22010-04-15
Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
Uexküll & Stolberg, 22607, Hamburg, DE
Claims:
1. Antigen-bindendes Polypeptid, das die CDR1-, CDR2-, und CDR3-Region einer VHH-Domäne eines Kamelid-Schwereketten-Antikörpers umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminosäuren 1-800 eines Toxins mit Glykosyltransferase-Aktivität von Clostridium difficile bindet.

2. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die CDR-Regionen von einer VHH-Domäne eines Lamas abgeleitet sind

3. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminosäuren 543-800 von Toxin A von Clostridium difficile bindet.

4. Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminosäuren 1-544 von Toxin B von Clostridium difficile bindet.

5. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid:
(a) die in SEQ ID NO: 18-20 dargestellten CDR-Sequenzen;
(b) die in SEQ ID NO: 21-23 dargestellten CDR-Sequenzen;
(c) die in SEQ ID NO: 24-26 dargestellten CDR-Sequenzen;
(d) die in SEQ ID NO: 27-29 dargestellten CDR-Sequenzen;
(e) die in SEQ ID NO: 30-32 dargestellten CDR-Sequenzen;
(f) die in SEQ ID NO: 33-35 dargestellten CDR-Sequenzen;
(g) die in SEQ ID NO: 36-38 dargestellten CDR-Sequenzen;
(h) die in SEQ ID NO: 39-41 dargestellten CDR-Sequenzen;
oder CDR-Sequenzen, die sich von den in (a)–(h) dargestellten CDR-Sequenzen in höchstens einer Aminosäure pro CDR unterscheiden, umfasst.

6. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid:
(a) die in SEQ ID NO: 42-44 dargestellten CDR-Sequenzen;
(b) die in SEQ ID NO: 45-47 dargestellten CDR-Sequenzen;
(c) die in SEQ ID NO: 48-50 dargestellten CDR-Sequenzen;
(d) die in SEQ ID NO: 51-53 dargestellten CDR-Sequenzen;
(e) die in SEQ ID NO: 54-56 dargestellten CDR-Sequenzen;
(f) die in SEQ ID NO: 57-59 dargestellten CDR-Sequenzen;
(g) die in SEQ ID NO: 60-62 dargestellten CDR-Sequenzen;
(h) die in SEQ ID NO: 63-65 dargestellten CDR-Sequenzen;
(i) die in SEQ ID NO: 66-68 dargestellten CDR-Sequenzen;
oder CDR-Sequenzen, die sich von den in (a)–(i) dargestellten CDR-Sequenzen in höchstens einer Aminosäure pro CDR unterscheiden, umfasst.

7. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1-8; und
(b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1-8 aufweist.

8. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 9-17; und
(b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 9-17 aufweist.

9. Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung oder zur Diagnose einer Erkrankung, die durch Clostridium difficile verursacht wird.

10. Nukleinsäuremolekül, das für ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 kodiert.

11. Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10 umfasst.

12. Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 11 umfasst.

13. Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Antigenbindenden Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–8, bei dem man (a) eine Wirtszelle nach Anspruch 12 unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 10 erlauben; und (b) das Antigenbindende Polypeptid aus der Kultur isoliert.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 umfasst.

15. Verfahren zum Nachweis eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile in einer biologischen Probe, bei dem man
(a) ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, die. die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin ermöglichen; und
(b) die Komplexe aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin nachweist.

16. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile, bei dem man
(a) ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin ermöglichen; und
(b) die Komplexe aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin von der Probe abtrennt.

17. Verfahren zur Diagnose einer durch Clostridium difficile vermittelten Erkrankung, bei dem man
(a) ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 mit der biologischen Probe eines Patienten unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin ermöglichen; und
(b) Komplexe aus dem Polypeptid und dem Toxin nachweist; wobei der Nachweis der Komplexe in Schritt (b) darauf hinweist, dass der Patient an einer durch Clostridium difficile verursachten Erkrankung leidet.

18. Verwendung eines Antigen-bindenden Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–8 zur therapeutischen Behandlung oder zur Diagnose einer Erkrankung, die Clostridium difficile verursacht wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Kolitis ist.

20. Kit zum Nachweis von Clostridium difficile, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 umfasst.

Description:

Die Erfindung betrifft Antigen-bindende Polypeptide, die die CDR1-, CDR2-, und CDR3-Region einer VHH-Domäne eines Kamelid-Schwereketten-Antikörpers umfassen. Die Polypeptide binden spezifisch im Bereich der Aminosäuren 1-800 eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile und eignen sich daher insbesondere für die therapeutische und prophylaktische Behandlung einer Erkrankung, die durch ein Glykosyltransferase-Aktivität aufweisendes Toxin von Clostridium difficile verursacht wird, sowie auch für die Diagnose einer solchen Erkrankung. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Antigen-bindenden Polypeptide in Verfahren zum Nachweis eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile in einer biologischen Probe. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile, bei denen die Antigenbindenden Polypeptide zur Anwendung kommen, werden ebenfalls bereitgestellt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Einsatz von Antibiotika hat sich bei der Bekämpfung zahlreicher bakterieller Infektionskrankheiten bewährt und ist auf dem Gebiet der Humanmedizin unverzichtbar geworden. Andererseits trägt die massive Verwendung von Antibiotika auch zur Verbreitung anderer potentiell lebensbedrohlicher Krankheiten bei. So sind beispielsweise durch Clostridium difficile verursachte Erkrankungen eine weitverbreitete Folge von Antibiotikatherapien, die oftmals zu einer beträchtlichen Schädigung der normalen Darmflora führen (Kyne (2010), New Engl. J. Med. 362(3):264–5). C. difficile ist ein anaerobes Grampositives Bakterium, das beim gesunden Menschen Teil der normalen Darmflora ist. Im Rahmen einer Antibiotikatherapie kommt es zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Normalflora, da einzelne Bakterien stärker durch die bakterizide Wirkung des Antibiotikums beeinflusst werden als andere. Auf diese Weise kann es zu einer ungewöhnlich starken Vermehrung von C. difficile kommen, die mit verschiedenen Erkrankungen einhergeht, welche zusammenfassend als ”CDAD” (Clostridium difficile associated diseases) bezeichnet werden. Eine besonders schwerwiegende und potentiell lebensbedrohliche Erkrankung aus der Gruppe der CDAD ist die pseudomembranöse Kolitis.

Durch den in den vergangenen Jahrzehnten stetig zunehmenden Einsatz von Antibiotika hat die Inzidenz von Erkrankungen, die durch C. difficile verursacht werden, stark zugenommen. Schätzungen gehen davon aus, dass die Behandlung dieser Erkrankungen Kosten im Gesundheitswesen verursachen, die sich allein in Europa auf bis zu 3 Mrd. Euro pro Jahr belaufen (Kuijper et al. (2006), Netherlands. Emerg. Infect. Dis. 12:827–30). In jüngster Zeit wurde ein hypervirulenter Stamm von C. difficile nachgewiesen, der als BI/NAP1/027 bezeichnet wird (Goorhuis et al. (2008), Clin Infect Dis. 47(9):1162–70). Einige Isolate dieses Stamms zeigen eine erhöhte Produktion von Virulenzfaktoren sowie eine Resistenz gegen Fluorquinolon-Antibiotika. Die Bekämpfung dieser Stämme hat sich als besonders schwierig erwiesen.

Die Pathogenität von C. difficile wird durch verschiedene enzymatisch wirksame Toxine hervorgerufen. Das Bakterium produziert zwei Exotoxine mit hohem Molekulargewicht, die als Toxin A (ToxA) und Toxin B (ToxB) bezeichnet werden (Just & Gerhard (2004), Rev Physiol Biochem Pharmacol 152: 23–47). Diese Toxine bestehen jeweils aus einer Glykosyltransferase(GT)-Domäne, einer Cysteinprotease(CP)-Domäne, einer Translokationsdomäne, und einer Rezeptorbindungsdomäne (RBD). Der allgemeine Aufbau von ToxA und ToxB ist in Jank & Aktories (2008), Trends Microbiology, 16, 222–229, beschrieben. Die toxische Aktivität dieser Multidomänenproteine ist auf die durch die Glykosyltransferase(GT)-Domäne katalysierte Glykosylierung der humanen Rho-GTPase an der Position Thr-37 zurückzuführen (Koch-Nolte et al. (2001), J. Biotechnol. 92, 81–87). Durch die Glykosylierung kann die Rho-GTPase ihre native Konformation nicht mehr einnehmen, was zur Umverteilung des Aktin-Zytokeletts, zur Desintegration der Zell-Zellkontakte des Darmepithels und damit zum Verlust der Schrankenfunktion führt (Aktories & Barbieri, (2005) Nat Rev Microbiol., 3(5):397–410).

20–35% der Stämme von C. difficile enthalten zusätzlich das binäre Toxin CDT (Perelle et al. (1197), Immun 65(4):1402–1407). Das CDT-Toxin besteht aus zwei separaten Untereinheiten, die CDTa und CDTb genannt werden. CDTb hat ein Molekulargewicht von 99 kDa und bindet an den Zellrezeptor LSR (Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor), der zur Internalisierung von CDTa ins Zytosol führt (Papatheodorou et al. (2011), Proc Natl Acad Sci USA 108(39):16422–27). CDTa weist ein Molekulargewicht von 48 kDa auf und stellt die enzymatisch aktive Untereinheit des Toxins dar. CDTa katalysiert die ADP-Ribosylierung von Aktin im Zytosol, was letztlich zum vollständigen Zusammenbruch des Zytoskeletts der Gewebezelle führt.

Es wurde gezeigt, dass die Verabreichung von monoklonalen Antikörpern gegen ToxA und ToxB ein Rezidiv bezüglich einer Infektion mit C. difficile verhindern kann. So wurde die Rezidivrate durch eine einmalige Infusion der Antikörper um mehr als 70% gesenkt (Lowy et al. (2010), New Engl J Med. 362(3):197–205). Ein Vorteil bei der Verwendung von Antikörpern gegenüber anderen therapeutischen Ansätzen, wie z. B. Verwendung von Impfstoffen, besteht darin, dass ein aktives Immunsystem keine zwingende Voraussetzung für eine erfolgreiche Therapie ist. Daher ermöglicht die Gabe von Antikörpern auch bei Menschen mit geschwächtem Immunsystem einen Therapieerfolg.

Nachteile bei der Verwendung von polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpern auf dem Gebiet der Humanmedizin ergeben sich aus der oftmals unzureichenden Stabilität nach Verabreichung. Außerdem sind die Kosten, die bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern anfallen, sehr hoch. Insbesondere die Herstellung von humanisierten Antikörpern, die eine geringere Immunogenität aufweisen und daher für den Einsatz beim Menschen besonders geeignet sind, ist arbeits- und kostenintensiv. Hinzu kommt, dass vollständige Antikörper aufgrund ihrer Größe eine beschränkte Gewebsdurchgängigkeit aufweisen. Eine deutliche Verbesserung dieser für die Therapie nachteiligen Eigenschaften ist daher für eine effiziente und trotzdem finanziell tragbare Therapie erforderlich.

Im Stand der Technik wurden verschiedene Strategien entwickelt, um die mit der Verabreichung von Antikörpern einhergehenden Probleme zu lösen. So wurden Fragmente von vollständigen IgG-Antikörpern, wie z. B. Fv, Fab, F(ab') und F(ab')2, zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Diese Fragmente weisen jedoch oftmals im Vergleich zum vollständigen Antikörper eine verringerte Spezifität und/oder Affinität in Bezug auf das Antigen auf. Ferner zeigen diese Fragmente oftmals nur eine geringe Löslichkeit in wässrigen Lösungen.

Es ist bekannt, dass Fragmente von bestimmten Kamelid-Antikörpern Eigenschaften aufweisen, die sie in besonderer Weise für die therapeutische Verwendung am Menschen geeignet erscheinen lassen. Neben herkömmlichen Antikörpern, die über jeweils zwei schwere und zwei leichte Ketten verfügen, produzieren die Kameliden auch Antikörper, die ausschließlich aus schweren Ketten bestehen (Hamers-Casterman et al. (1993), Nature 363:446–448; Wesolowski et al. (2009), Med Microbiol Immunol. 198(3):157–74). Bei diesen sogenannten Schwereketten-Antikörpern handelt es sich um Homodimere aus zwei identischen schweren Ketten, die mit dem Antigen über eine einzige variable Domäne interagieren, welche als VHH (variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies) bezeichnet wird. Die VHH-Domäne verfügt über drei komplementaritätsbestimmende Regionen (complementary determining regions, CDRs) und vier Gerüstregionen (framework regions, FR), die mit den CDRs in der Primärsequenz der VHH-Domäne alternieren. Die VHH-Domäne eines Schwereketten-Antikörpers bildet eine kleine Polypeptideinheit mit hohem Antigenbindungsvermögen. Aufgrund einer außergewöhnlich langen CDR3-Region mit einer Länge von etwa 7 bis 25 Aminosäuren kann die VHH-Domäne anders als konventionelle Antikörper in Kavitäten von Protein-Antigenen binden, und so z. B. das aktive Zentrum eines Enzyms blockieren (De Genst et al. (2006), Proc Natl Acad Sci USA 103(12):4586–4591). VHH-Domänen können rekombinant als lösliche Proteine in Bakterien oder Säugerzellen produziert werden. Solche rekombinant hergestellten VHH-Domänen werden auch Einzeldomänenantikörper (single-domain antibodies, sdABs) oder nanobodies® genannt. Derzeit wird ein gegen ein humanes Serumprotein (von Willebrand Faktor) gerichteter nanobody® in einer klinischen Phase II Studie gestestet (von Loon et al. (2011), Thromb Haemost 106(1):165–71, Ulrichts et al. (2011), Blood 118(3):757–65).

VHH-Einzeldomänenantikörper sind nicht nur stabiler sondern auch etwa zehnmal kleiner als herkömmliche Antikörper und weisen neben einer hohen Löslichkeit deutlich bessere Eigenschaften bei der Gewebepenetration auf. Aus diesem Grund sind VHH-Einzeldomänenantikörper für die Behandlung verschiedener Erkrankungen vorgeschlagen worden. In der internationalen Anmeldung WO 2006/122825 werden VHH-Einzeldomänenantikörper gegen von Willebrand-Faktor zur Behandlung von arteriellen Verschlusskrankheiten verwendet. Die internationale Anmeldung WO 2010/042815 offenbart VHH-Einzeldomänenantikörper, die zur Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt werden können.

Die vorliegende Erfindung stellt VHH-Einzeldomänenantikörper bereit, die in der Lage sind, spezifisch an ein Toxin zu binden, das von C. difficile erzeugt wird, und dieses zu neutralisieren. Die Antikörper eignen sich daher in besonderer Weise für eine Verwendung bei der Diagnose und/oder bei der therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die durch die Toxine ToxA und ToxB von C. difficile verursacht werden.

Gegen ToxA und ToxB gerichtete VHH-Einzeldomänenantikörper zur Verwendung bei der Neutralisierung der Toxine wurden im Stand der Technik bereits beschrieben (Hussack et al. (2011), J Biol Chem., 286(11):8961–76). Allerdings richten sich diese Toxine gegen die Rezeptorbindungsdomäne der Toxine, um somit deren Anbindung an die Zielzellen zu unterbinden. Es wurde nunmehr allerdings im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass VHH-Einzeldomänenantikörper, die gegen die Glykosyltransferase-Domäne oder die Cysteinprotease-Domäne von Toxin A oder Toxin B von C. difficile gerichtet sind, besonders vorteilhafte Eigenschaften bei der Neutralisierung der Toxin-vermittelten Gewebeschädigung aufweisen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden zunächst durch Immunisierung von Lamas mit Peptiden aus der Cysteinprotease-Domäne von Toxin A und aus der Glykosyltransferase-Domäne von Toxin B Schwereketten-Antikörper erzeugt. Anschließend wurde aus den peripheren Blutlymphozyten der Lamas RNA isoliert und mittels reverser Transkription in cDNA überführt. Ausgehend von der isolierten RNA wurden die variablen Domänen der Schwereketten-Antikörper mittels PCR amplifiziert. Durch Klonierung der VHH-Fragmente in einen Phagemid-Vektor wurden Phagen-Display-Bibliotheken hergestellt. Diese Bibliotheken wurden unter Verwendung von rekombinantem ToxA bzw. ToxB in einem Panning-Verfahren selektioniert. Die Sequenzen der selektierten Einzeldomänenantikörper wurden anschließend durch Sequenzierung bestimmt und rekombinant in Bakterien-Wirtszellen exprimiert. Auf diese Weise stellt die vorliegende Erfindung VHH-Einzeldomänenantikörper bereit, die sich für eine Verwendung in therapeutischen und/oder diagnostischen Verfahren eignen. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung CDR-Regionen aus VHH-Einzeldomänenantikörpern gegen ToxA bzw. ToxB bereit, die im Rahmen der Konstruktion von rekombinanten, Antigen-bindenden Polypeptiden verwendet werden können.

Die Erfindung stellt folglich in einem ersten Aspekt ein Antigen-bindendes Polypeptid bereit, das die für die Bindung eines VHH-Einzeldomänenantikörpers notwendigen komplementaritätsbestimmenden Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Domäne eines Kamlid-Schwereketten-Antikörpers umfasst, wobei das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminosäuren 1-800 eines Toxins mit Glykosyltransferase-Aktivität von C. difficile bindet. Toxine dieses Erregers, die über eine Glykosyltransferase-Aktivität verfügen, sind die Toxine A und B (ToxA und ToxB), wie in SEQ ID NO: 69 bzw. 70 dargestellt. Das binäre Toxin CDT von C. difficile weist keine Glykosyltransferase-Aktivität auf. Sowohl bei ToxA als auch bei ToxB umfassen die N-terminal lokalisierten 800 Aminosäuren des unprozessierten Toxins die GT- und die CP-Domäne.

Die Erfindung offenbart somit spezifisch an ToxA bindende Polypeptide, welche die für eine Bindung an ToxA erforderlichen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Domäne eines Kamlid-Schwereketten-Antikörpers umfassen. Die Bindung an ToxA erfolgt im Bereich der Aminosäuren 1-800 der nativen, unprozessierten Sequenz von ToxA, d. h. das Epitop für die Bindung des ToxA-bindenden Polypeptids liegt innerhalb der Aminosäuren 1-800 von ToxA. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Epitop im Bereich der Cysteinprotease-Domäne von ToxA. Diese erstreckt sich im unprozessierten ToxA von Aminosäure 547 bis Aminosäure 779.

Des Weiteren offenbart die Erfindung auch Polypeptide, die spezifisch an ToxB binden. Diese Polypeptide umfassen die für eine Bindung an ToxB erforderlichen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Domäne eines Kamlid-Schwereketten-Antikörpers. Die Bindung an ToxB erfolgt im Bereich der Aminosäuren 1-800 der nativen, unprozessierten Sequenz von ToxB, d. h. das Epitop für die Bindung des ToxB-bindenden Polypeptids liegt innerhalb der Aminosäuren 1-800 von ToxB. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Epitop im Bereich der Glykosyltransferase-Domäne von ToxB. Diese erstreckt sich im unprozessierten ToxB von Aminosäure 1 bis Aminosäure 546.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind somit durch CDR-Regionen charakterisiert, die aus Schwereketten-Antikörpern von Kameliden abgeleitet sind. Bei den Schwereketten-Antikörpern handelt es sich um eine besondere Gruppe von Immunglobulinen, die ausschließlich aus schweren Ketten bestehen. Eine schwere Kette eines solchen Antikörpers enthält neben zwei konstanten Domänen eine einzelne variable Domäne, die wiederum aus drei CDR-Regionen und vier FR-Regionen besteht. Die Interaktion mit dem Antigen erfolgt ausschließlich über diese variable Domäne, die auch als VHH-Domäne bezeichnet wird. Durch ausgeprägte Schleifen-Strukturen in der CDR3 ist eine VHH-Domäne in der Lage, auch kryptische Epitope zu erkennen. Schwereketten-Antikörper werden in nur wenigen Spezies produziert, z. B. in Kameliden. Bei der Gruppe der Kameliden handelt es sich um eine Säugetierfamilie aus der Ordnung der Artiodactyla (Paarhufer). Zur Familie der Kameliden zählen Kamele, Dromedare, Lamas, Alpakas und Vikunjas. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Antigen-bindende Polypeptid CDR-Regionen, die von einer VHH-Domäne eines Lamas abgeleitet sind.

Das erfindungsgemäße Polypeptid weist eine spezifische Affinität für die Cysteinprotease(CP)-Domäne oder die Glykosyltransferase(GT)-Domäne von ToxA von C. difficile auf. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Polypeptid auch eine spezifische Affinität für die Cysteinprotease(CP)-Domäne oder die Glykosyltransferase(GT)-Domäne von ToxB von C. difficile aufweisen.

Dies bedeutet, dass ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einer Bindungsaffinität an die entsprechende Domäne von ToxA bzw. ToxB bindet, die signifikant höher ist als die Bindungsaffinität für die Bindung an ein anderes Protein, welches zur Sequenz dieser Toxine nicht homolog ist.

Vorzugsweise ist die Bindungsaffinität des erfindungsgemäßen Polypeptids mindestens 2-fach, 5-fach, 10-fach, 20-fach, 50-fach, 75-fach, 100-fach, 150-fach, 200-fach, 250-fach, 500-fach, 600-fach, 700-fach, 800-fach, 900-fach, 1000-fach, 2000-fach, 5000-fach, oder 10000-fach höher als die Bindungsaffinität für ein nicht zu ToxA oder ToxB homologes Protein. Die Bindungsaffinität liegt vorzugsweise im Bereich von mindestens 10–6 M. Besonders bevorzugte Antigen-bindende Polypeptide der vorliegenden Erfindung weisen eine Bindungsaffinität mit Dissoziationskonstanten (Kd) im Bereich von mindestens 10–6 M, und vorzugsweise im Bereich von mindestens 10–7 M, 10–8 M, 10–9 M, 10–10 M, 10–11 M, oder 10–12 M auf. Verfahren zur Messung der Bindungsaffinitäten von Antikörpern sind im Stand der Technik hinlänglich bekannt und umfassen z. B. die Bestimmung der Kd-Werte mittels Durchflußzytometrie.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Antigen-bindende Polypeptid die CDR-Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Domäne eines Kamelid-Schwereketten-Antikörpers, wobei diese CDR-Regionen:

  • (a) die in SEQ ID NO: 18-20 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (b) die in SEQ ID NO: 21-23 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (c) die in SEQ ID NO: 24-26 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (d) die in SEQ ID NO: 27-29 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (e) die in SEQ ID NO: 30-32 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (f) die in SEQ ID NO: 33-35 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (g) die in SEQ ID NO: 36-38 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (h) die in SEQ ID NO: 39-41 dargestellten CDR-Sequenzen;
    aufweisen.

In einer weiteren, ebenfalls besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Antigen-bindende Polypeptid die CDR-Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Domäne eines Kamelid-Schwereketten-Antikörpers, wobei diese CDR-Regionen:

  • (a) die in SEQ ID NO: 42-44 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (b) die in SEQ ID NO: 45-47 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (c) die in SEQ ID NO: 48-50 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (d) die in SEQ ID NO: 51-53 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (e) die in SEQ ID NO: 54-56 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (f) die in SEQ ID NO: 57-59 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (g) die in SEQ ID NO: 60-62 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (h) die in SEQ ID NO: 63-65 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (i) die in SEQ ID NO: 66-68 dargestellten CDR-Sequenzen;
    aufweisen.

Dem Fachmann ist ersichtlich, dass innerhalb der vorliegend offenbarten CDRs eine gewisse Modifikation der Aminosäuresequenz möglich ist, ohne die Bindungsfähigkeit des VHH-Einzeldomänenantikörpers zu beeinträchtigen. So kann es beispielsweise möglich sein, eine CDR des Einzeldomänenantikörpers durch den Austausch von 1, 2 oder 3 Aminosäuren zu verändern. Im Allgemeinen kann jeder der Aminosäure-Reste innerhalb der in den SEQ ID NO: 18-68 dargestellten CDRs durch einen anderen Rest ersetzt werden, solange das resultierende CDR noch in der Lage ist (gemeinsam mit den anderen beiden CDRs) spezifisch an das entsprechende Toxin (d. h. ToxA oder ToxB) zu binden. Ferner können auch 1, 2 oder 3 Aminosäuren innerhalb einer der in SEQ ID NO: 18-68 dargestellten Sequenzen deletiert oder mittels Addition zugefügt worden sein, solange die Bindungsfähigkeit an das entsprechende Toxin (d. h. ToxA oder ToxB) nicht vollständig beseitigt wird.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind somit Antigenbindende Polypeptide, die CDRs aufweisen, welche sich von den in SEQ ID NO: 18-68 dargestellten Sequenzen in einzelnen Aminosäurepositionen unterscheiden. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Antigen-bindende Polypeptide mit CDR-Sequenzen, die sich von den in SEQ ID NO: 18-68 dargestellten CDR-Sequenzen in höchstens einer Aminosäure pro CDR unterscheiden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Antigen-bindende Polypeptid eine vollständige VHH-Domäne eines Kamlid-Schwereketten-Antikörpers. Eine solche VHH-Domäne ist bei alleiniger Verwendung in der Lage, an das entsprechende Antigen zu binden und wird vorliegend daher auch als ”VHH-Einzeldomänen-Antikörper” bezeichnet. Die VHH-Domäne umfasst neben den drei für die Antigenbindung verantwortlichen CDR-Regionen auch die vier Gerüstregionen FR1–FR4, die zwischen den CDR-Regionen angeordnet sind. Die Gerüstregionen können in der erfindungsgemäßen VHH-Domäne vollständig erhalten sein, oder sie können in Form von Fragmenten der ursprünglichen Gerüstsequenzen vorliegen. So können z. B. die Gerüstsequenzen, welche die VHH-Domäne C-terminal und N-terminal begrenzen, um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt vorliegen. Solche modifizierten VHH-Domänen sind ausdrücklich von der Erfindung umfasst. Wie vorliegend verwendet bezeichnet ”VHH-Einzeldomänen-Antikörper” ein Antigen-bindendes Polypeptid, dem im Vergleich zu einem vollständigen Schwereketten-Antikörper die konstanten Domänen CH2 oder CH3 fehlen.

Bevorzugte Antigen-bindende Polypeptide, die eine VHH-Domäne eines Kamlid-Schwereketten-Antikörpers umfassen und spezifisch an ToxA von C. difficile binden, sind in SEQ ID NO: 1-8 dargestellt. Bevorzugte Antigen-bindende Polypeptide, die eine VHH-Domäne eines Kamlid-Schwereketten-Antikörpers umfassen und spezifisch an ToxB von C. difficile binden, sind in SEQ ID NO: 9-17 dargestellt. Die Erfindung erstreckt sich darüber hinaus auch auf Varianten der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide, die zu den in den SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptiden homolog sind und ebenfalls die Fähigkeit zur Bindung der des entsprechenden Toxins von C. difficile aufweisen. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff ”Variante” eine Aminosäuresequenz, die durch Deletion, Substitution oder Addition von Aminosäuren so modifiziert wurde, dass sie mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu einer der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Sequenzen aufweist, wenn diese Sequenzen optimal angeordnet sind, z. B. mit den Programmen GAP oder BESTFIT unter Verwendung des default gap Verfahrens. Computerprogramme zur Bestimmung der Aminosäuresequenzidentität sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.

So können Varianten insbesondere in den Gerüstregionen (FR1–FR4) von den in SEQ ID NO: 1-17 dargestellten VHH-Regionen abweichen, ohne die Bindungsaffinität der Polypeptide nachteilig zu beeinflussen. Vorzugsweise unterscheiden sich die Varianten von den in den SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptiden lediglich durch den Austausch von wenigen Aminosäuren. Besonders bevorzugt ist es, dass sich Varianten der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide von diesen in weniger als 20, in weniger als 15, in weniger als 10, in weniger als 5, z. B. in 4, 3, 2 oder in 1 Aminosäureposition(en), unterscheiden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung somit ein Antigen-bindendes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • (a) den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1-8; und
  • (b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1-8 aufweist.

Die Erfindung betrifft ferner ein Antigen-bindendes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • (a) den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 9-17; und
  • (b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 9-17 aufweist.

Vorzugsweise sind die Substitutionen, durch die sich die Varianten von den in SEQ ID NO: 1-17 dargestellten VHH-Regionen unterscheiden, konservative Substitutionen, d. h. Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäure-Resten durch eine Aminosäure mit ähnlichen Polarität, die als funktionales Äquivalent agiert. Vorzugsweise ist der als Austausch dienende Aminosäure-Rest aus der gleichen Gruppe von Aminosäuren ausgewählt wie der zu ersetzende Aminosäure-Rest. Beispielsweise kann ein hydrophober Rest durch einen anderen hydrophoben Rest ersetzt werden oder ein polarer Rest mit einem anderen polaren Rest, der die gleiche Ladung hat. Funktional homologe Aminasäuren, welche für die konservative Substitution verwendet werden können, umfassen z. B. nicht-polare Aminosäuren wie z. B. Glycin, Valin, Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, und Tryptophan. Beispiele von ungeladenen polaren Aminosäuren umfassen Serin, Threonin, Glutamin, Asparagin, Tyrosin, und Cystein. Beispiele von geladenen polaren (sauren) Aminosäuren umfassen Histidin, Arginin und Lysin. Beispiele von geladenen polaren (basischen) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure.

Als Varianten der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Sequenzen gelten ferner auch solche Polypeptide, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in die Aminosäuresequenz eines der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide eingefügt wurden. Solche Insertionen können prinzipiell an jeder Position der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide erfolgen, solange die resultierende Variante des Polypeptids ihre immunologische Aktivität (d. h. die Fähigkeit zur Bindung und Hemmung von ToxA oder ToxB) beibehält. Ferner gelten vorliegend auch solche Proteine als Varianten eines der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren innerhalb der Sequenz im Vergleich zum Referenzpolypeptid fehlen. Solche Deletionen können beliebige Aminosäure-Positionen innerhalb der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Sequenzen betreffen. Es kann sich bei den Deletionen insbesondere um solche handeln, die zwei oder mehrere (z. B. 3, 4 oder 5) aufeinanderfolgende Aminosäuren aus einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 1-17 umfassen.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind immunologisch aktive Fragmente der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide (oder deren Varianten). Unter immunologisch aktiven Fragmenten werden vorliegend solche Sequenzen verstanden, die sich von den in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Aminosäuresequenzen oder von deren Varianten durch das Fehlen einer oder mehrerer Aminosäuren am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Proteins unterscheiden, und die weiterhin zur spezifischen Bindung von ToxA bzw. ToxB in der Lage sind. So können beispielsweise immunologisch aktive Fragmente der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz Fragmente sein, bei denen die ersten beiden N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren des in SEQ ID NO: 1 gezeigten Polypeptids fehlen. Der Fachmann wird problemlos in der Lage sein, die Fähigkeit von Fragmenten zur Bindung an ToxA bzw. ToxB zu bestimmen, z. B. durch kompetitive Antikörper-Assays.

Die in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide und deren Varianten oder Fragmente können ferner an einer oder mehreren Positionen der Aminosäuresequenz strukturell modifiziert werden, wie beispielsweise durch Einführen einer modifizierten Aminosäure. Bei diesen modifizierten Aminosäuren kann es sich erfindungsgemäß um Aminosäuren handeln, die durch Biotinylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Acetylierung, Verzweigung und/oder Zyklisierung verändert wurden.

Es ist bevorzugt, dass die Varianten oder Fragmente der erfindungsgemäßen Antigen-bindenden Polypeptide mehr als 50% der ursprünglichen Bindungsaffinität für ToxA bzw. ToxB von C. difficile beibehalten. Noch stärker bevorzugt ist es, dass die Varianten oder Fragmente mehr als 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der ursprünglichen Bindungsaffinität der erfindungsgemäßen Antigen-bindenden Polypeptide, z. B. der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide, beibehalten. Die Bindungsaffinität für ToxA bzw. ToxB von C. difficile kann mit Hilfe von in vitro-Assays routinemäßig gemessen werden.

Das Antigen-bindende Polypeptid wird vorzugsweise eine Größe aufweisen, die zu physikochemischen Eigenschaften führt, welche für therapeutische und/oder diagnostische Applikationen besonders geeignet sind, z. B. eine gute Löslichkeit und Gewebepenetration, thermische Stabilität und ähnlichen Eigenschaften. Vorzugsweise wird das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Größe von 80-250 Aminosäuren aufweisen, wobei eine Größe von 90-200, 90-180, 90-150, 100-140, 100-130, 100-120 besonders bevorzugt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform führt die Bindung des Antigen-bindenden Polypeptids an ToxA bzw. ToxB zur Hemmung oder Reduktion der Enzymaktivität des Toxins. Die Enzymaktivität, insbesondere die Glykosyltransferase-Aktivität wird z. B. auf ungefähr 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% oder weniger der Aktivität des ungebundenen Enzyms reduziert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Enzymaktivität der gebundenen Domäne und/oder des gesamten Toxins durch Bindung des erfindungsgemäßen Polypeptids vollständig neutralisiert.

VHH-Einzeldomänen-Antikörper zeichnen sich gegenüber herkömmlichen Antikörpern von Säugetieren insbesondere dadurch aus, dass lediglich drei CDRs für die Bindung des Antigens erforderlich sind. Die Erfindung betrifft daher auch solche Antigen-bindenden Polypeptide, die lediglich die zur Bindung des Toxins erforderlichen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 eines der in SEQ ID NO: 1-17 exemplarisch dargestellten Polypeptide umfassen, wobei die zwischen den CDR-Regionen lokalisierten Regionen nur geringfügige oder sogar im Wesentlichen keine Ähnlichkeit zu den entsprechenden Regionen eines der in SEQ ID NO: 1-17 dargestellten Polypeptide zeigen. Die jeweiligen Sequenzen der CDR-Regionen der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Einzeldomänenantikörper sind in 2 und in SEQ ID NO: 18-68 gezeigt.

Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Nukleinsäuremolekül bereit, das für ein wie oben definiertes Antigenbindendes Polypeptid kodiert. Bei dem Nukleinsäuremolekül kann es sich um DNA oder RNA handeln. Vorzugsweise handelt es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, wie beispielsweise genomische DNA oder cDNA. Vorzugsweise kodiert das Polynukleotid für ein Polypeptid, welches eine der in SEQ ID NO: 1–17 gezeigten Aminosäuresequenzen umfasst.

Die Erfindung umfasst ferner einen Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches für ein Antigen-bindendes Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert. Expressionsvektoren sind üblicherweise DNA-Konstrukte, die über einen Replikationsursprung verfügen, der es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der Wirtszelle zu replizieren. Expressionsvektoren umfassen darüber hinaus regulatorische Kontrollelemente, die in funktioneller Verknüpfung mit den zu exprimierenden Nukleotidsequenzen stehen und deren Transkription und/oder Translation steuern. Geeignete Kontrollelemente können prokaryontische Promotoren (konstitutiv oder regulierbar, wie z. B. lac-, trp-, T3-, T7- oder gpt-Promotor), eukaryontische Promotoren (konstitutiv oder regulierbar, wie z. B. Thymidinkinase-Promotor, SV40-Promotor oder CMV-Promotor), Operatoren, Transkriptions- bzw. Translationsenhancer, Transkriptions- bzw. Translationsterminatoren, Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Selektionsmarker, Silencer und Repressorsequenzen umfassen. Dem Fachmann sind zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Expressionsvektoren bekannt, die sich für die Ausführung der vorliegenden Erfindung eignen. Beispiele sind die prokaryontischen Vektoren pHEN2, pGEM, pBluescript und pUC, die regelmäßig für die heterologe Expression in E. coli verwendet werden. Beispiele für eukaryontische Expressionsvektoren umfassen pcDNA3.1, pOG44, pSV2CAT Rc/CMV, Rc/RSV, GEM1 und ähnliche.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches für ein Antigen-bindendes Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, oder einen Expressionsvektor, der ein solches Nukleinsäuremolekül umfasst. Es kann sich insbesondere um eine prokaryontische oder eine eukaryontische Wirtszelle handeln. Beispiele von Wirtszellen, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, umfassen prokaryontische Wirtszellen, wie beispielsweise bakterielle Stämme von Escherichia coli, Bacillus subtilis und Ähnlichem. Geeignete eukaryontische Zellen umfassen Hefezellen, Insektenzellen, Säugetierzellen, Pflanzenzellen und Ähnliches. Das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in bakteriellen Zellen exprimiert, z. B. in E. coli. Das Verfahren zur Transformation oder Transfektion der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, welches für das Antigen-bindende Polypeptid kodiert, wird von dem Typ des Expressionsvektors und der verwendeten Wirtszelle abhängen. Dem Fachmann wird es problemlos möglich sein, geeignete Vektoren und Wirtszellen für die rekombinante Expression auszuwählen.

Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Antigen-bindenden Polypeptids bereit, bei dem man (a) eine wie oben beschriebene Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die die Expression eines Nukleinsäuremoleküls erlauben, welches für ein Antigen-bindendes Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert; und (b) das Antigenbindende Polypeptid aus der Kultur isoliert.

Die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung einer Erkrankung, die durch ToxA bzw. ToxB von C. difficile verursacht wird. Eine solche therapeutische Behandlung schließt sowohl die Behandlung eines akuten Krankheitszustands als auch die prophylaktische Behandlung zur Vermeidung einer Erkrankung ein.

Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung eignen sich ferner auch zur Diagnose einer Erkrankung, die durch ToxA bzw. ToxB von C. difficile verursacht wird. Erkrankungen die durch diese Toxine verursacht werden, umfassen Diarrhöe, insbesondere eine Antibiotika-assoziierte Diarrhöe (ADD), eine Kolitis, insbesondere eine pseudomembranöse Kolitis, eine Enterokolitis oder ein toxisches Megakolon. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur therapeutischen Behandlung der pseudomembranösen Kolitis eingesetzt. Die Behandlung umfasst die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Polypeptids an einen Patienten, bei dem eine Infektion mit einem ToxA- und/oder ToxB-exprimierenden Stamm von C. difficile nachgewiesen wurde, der in Verdacht steht, mit dem Erreger infiziert zu sein, oder der einem Risiko ausgesetzt ist, sich mit dem bakteriellen Erreger zu infizieren.

Die Erfindung stellt demgemäß auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Antigen-bindende Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen. Das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird dabei in einer therapeutisch wirksamen Menge an den Patienten verabreicht, d. h. in einer Menge, die ausreicht, um das Toxin, gegen das sich das Antigenbindende Polypeptid richtet, zu einem erheblichen Teil zu hemmen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Verabreichung des Antigen-bindenden Polypeptids in einer Menge, die zu einer im Wesentlichen vollständigen Inaktivierung des Toxins führt. Die Inaktivierung des Toxins kann anhand der Verbesserung eines oder mehrerer Symptome der Erkrankung verfolgt werden.

Die genaue Menge an Polypeptid, die verabreicht werden muss, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen, hängt von mehreren Parametern ab. Faktoren, die relevant für die Menge des zu verabreichenden Polypeptids sind, umfassen z. B. die Art der Verabreichung des Polypeptids, die Größe des jeweiligen Polypeptids, der Art und Schwere der Erkrankung, die Krankheitsgeschichte des zu behandelnden Patienten sowie Alter, Gewicht, Größe und Gesundheitszustand des zu behandelnden Patienten. Eine therapeutisch wirksame Menge des Antigen-bindenden Polypeptids kann von einem Fachmann ohne weiteres anhand des allgemeinen Fachwissens und der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden.

Das Polypeptid wird vorzugsweise in einer Menge an ein Subjekt verabreicht, die ausreicht, um eine Plasmakonzentration von etwa 0,05 μg/ml bis etwa 150 μg/ml zu erreichen, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 50 μg/ml, stärker bevorzugt von etwa 1 μg/ml bis etwa 20 μg/ml und normalerweise von etwa 1 μg/ml bis etwa 10 μg/ml, z. B. 5 μg/ml. Die wöchentliche Dosis kann dabei von etwa 1 mg bis etwa 500 mg Polypeptid pro m2 Körperoberfläche des Patienten betragen. Die wöchentliche Dosis des Polypeptids kann von etwa 10–300 mg/m2 reichen, vorzugsweise von etwa 100–200 mg/m2, wie beispielsweise 150 mg/m2. Abhängig von der Größe des Polypeptids kann die zu verabreichende Menge des Polypeptids angepasst werden.

Das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann für verschiedene Arten der Verabreichung formuliert werden, z. B. für die orale Verabreichung als Tablette, Kapsel, Puder, Flüssigkeit oder Ähnliches. Es ist jedoch bevorzugt, dass das Antigen-bindende Polypeptid parental mittels intravenöser Injektion oder intravenöser Infusion verabreicht wird. Die Verabreichung kann beispielsweise mittels intravenöser Infusion, z. B. innerhalb von 60 Minuten, innerhalb von 30 Minuten, oder innerhalb von 15 Minuten erfolgen. Zusammensetzungen, die für die Verabreichung mittels Injektion und/oder Infusion geeignet sind, umfassen in der Regel Lösungen und Dispersionen sowie Pulver, aus denen entsprechende Lösungen und Dispersionen hergestellt werden können. Derartige Zusammensetzungen werden das immunologisch aktive Polypeptid und mindestens einen geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger für die intravenöse Verabreichung umfassen bakteriostatisches Wasser, Ringer-Lösung, physiologische Salzlösung, Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) und Cremophor ELTM. Sterile Zusammensetzungen für die Injektion und/oder Infusion können hergestellt werden, indem das Polypeptid in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Träger eingebracht und anschließend mittels eines Filters sterilfiltriert wird. Zusammensetzungen für die Verabreichung mittels Injektion oder Infusion sollten nach ihrer Herstellung unter Lagerungsbedingungen über einen längeren Zeitraum stabil bleiben. Die Zusammensetzungen können zu diesem Zweck ein Konservierungsmittel enthalten. Geeignete Konservierungsmittel umfassen Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure und Thiomersal.

In einer Ausführungsform wird das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit Trägern formuliert, die das Polypeptid vor einer zu schnellen Ausscheidung aus dem Körper schützen (Retardformulierungen). Solche Formulierungen können biokompatible Polymere, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäuren, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäuren enthalten. Verfahren zur Herstellung von Retardformulierungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Retardformulierungen können als semipermeable Filme aus festem, hydrophobem Polymer vorliegen, z. B. in Form von Mikrokapseln. Die Herstellung von entsprechenden Darreichungsformen sowie geeignete Hilfsstoffe sind beispielsweise in ”Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Lippincott Williams & Wilkins; 21. Auflage (2005) beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich ferner für den Nachweis von ToxA und/oder ToxB in biologischen Proben, insbesondere in Proben, die von einem Individuum erhalten wurden, bei dem das Vorliegen einer Infektion mit einem Stamm von C. difficile nachgewiesen werden soll, der ToxA und/oder ToxB produziert, wie z. B. Stuhlproben, Gewebeproben, usw. Es können allerdings auch andere Proben, wie z. B. Wasserproben auf eine Belastung mit Toxin untersucht werden.

Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Toxin A und/oder Toxin B von C. difficile in einer biologischen Probe, bei dem man

  • (a) ein wie oben beschriebenes und in den Ansprüchen definiertes Antigen-bindendes Polypeptid mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin ermöglichen; und
  • (b) Komplexe aus dem Polypeptid und dem Toxin nachweist.

Das Verfahren umfasst zunächst einen Schritt, bei dem das erfindungsgemäße Antigen-bindende Polypeptid mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird. Dieser Schritt wird unter Bedingungen ausgeführt, die für die Bildung von Bindungskomplexen, die aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem nachzuweisenden Toxin bestehen, geeignet sind. Bedingungen, die die Bildung von Bindungskomplexen aus Antigen-bindenden Polypeptiden (insbesondere Antikörpern) und Toxin erlauben, sind im Stand der Technik bekannt. Solche Bedingungen können eine Temperatur im Bereich von 4–37°C, einen pH-Wert im Bereich von 6–8 und eine Inkubationszeit im Bereich von mehreren Minuten bis zu mehreren Stunden einschließen. Dem Fachmann wird ersichtlich sein, dass geeignete Bindungsbedingungen für ein bestimmtes Paar aus Antigen-bindendem Polypeptid und Toxin von verschiedenen Faktoren abhängen, wie z. B. der Konzentration des Antigen-bindenden Polypeptids, der voraussichtlichen Konzentration des Toxins in der Probe und Ähnlichem. Der Fachmann wird in der Lage sein, geeignete Bedingungen für eine Bindung zwischen Polypeptid und Toxin anhand von Routineversuchen zu ermitteln, um die Bildung der Bindungskomplexe zu optimieren.

Nachdem man dem Antigen-bindenden Polypeptid ausreichend Gelegenheit gegeben hat, an das Toxin (ToxA oder ToxB) zu binden, werden die aus Toxin und dem spezifisch daran gebundenen Polypeptid bestehenden Immunkomplexe nachgewiesen. Dabei können im Stand der Technik übliche Verfahren eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Antigen-bindende Polypeptid kann beispielsweise vor dem Inkontaktbringen mit der Probe, von der vermutet wird, dass sie ToxA und/oder ToxB enthält, mit einer nachweisbaren Markierung versehen werden. Bei der Markierung kann es sich z. B. um eine floureszente, chemilumineszente oder radioaktive Markierung handeln. Eine Markierung mit Enzymen, wie z. B. mit Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase, ist ebenfalls möglich. Eine weitere Methode, die einen Nachweis der Komplexe ermöglicht, besteht in der rekombinanten Expression der Antigen-bindenden Polypeptide als Fusionsproteine, die über ein oder mehrere Peptidepitope verfügen, die sich mittels markierter Antikörper sichtbar machen lassen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder zur Aufkonzentrierung von ToxA oder ToxB von C. difficile, bei dem man

  • (a) ein wie oben beschriebenes und in den Ansprüchen definiertes Antigen-bindendes Polypeptid mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin ermöglichen; und
  • (b) die Komplexe aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin von der Probe abtrennt.

Die Aufreinigung und/oder Konzentrierung des Toxins wird vorzugsweise mit Antigen-bindenden Polypeptiden durchgeführt, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wie z. B. auf einem Material, das für die Verwendung in chromatographischen Trennverfahren geeignet ist. Geeignete Säulenmaterialien umfassen Sepharose (z. B. Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, SP-Sepharose) und Ähnliches. Die Toxin-bindenden Polypeptide können darüber hinaus auf Beads immobilisiert werden, z. B. auf Agarose- oder Glas-Beads. Vorzugsweise sind die Beads magnetisierbar, wodurch die Trennung der Bindungskomplexe, die an den Beads nach Inkubation in Toxin-haltigen Proben anhaften, erleichtert wird. Verfahren zur Kopplung von Polypeptiden an einen festen Träger sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Ein für die Kopplung geeignetes Verfahren kann beispielsweise eine Immobilisierung von Polypeptiden, die mit Biotin oder Derivaten von Biotin gekoppelt wurden, an ein Trägermaterial, das zuvor mit Streptavidin oder Derivaten davon beschichtet wurde, vorsehen. Solche Verbindungen sind kommerziell von verschiedenen Anbietern erhältlich. Alternativ dazu kann das Protein mittels chemischer Reaktion direkt an den Träger gebunden werden. Die Probe, in der das Toxin enthalten ist, wird durch die entsprechend vorbereitete Säule geleitet, so dass das Toxin durch die immobilisierten Antigen-bindenden Polypeptide spezifisch adsorbiert wird. Durch Verwendung eines geeigneten Waschpuffers werden alle unspezifisch gebundenen Moleküle von der Säule gewaschen, während das Toxin in der Säule zurückgehalten wird. In einem abschließenden Schritt kann das Toxin mit einem geeigneten Elutionspuffer (z. B. einem Puffer mit hohem Salzgehalt) von der Säule eluiert werden, um somit das gereinigte und/oder aufkonzentrierte Toxin zu erhalten. Alternativ kann das an die Matrix bzw. Säule gebundene Toxin durch ein immunologisches Nachweisverfahren nachgewiesen werden.

In Ausführungsformen, bei denen die Antigen-bindenden Polypeptide nicht an einen Träger gekoppelt werden, kann die Trennung aus der Probe unter Verwendung von Fusionspolypeptiden erfolgen, die neben einem erfindungsgemäßen Antigen-bindenden Polypeptid einen Affinitätstag besitzen. Solche Fusionspolypeptide lassen sich mit Hilfe eines Materials, welches eine besonders hohe Affinität zu dem verwendeten Affinitätstag besitzt, effizient aufreinigen. Beispielsweise kann der Affinitätstag 6–12 Histidin-Reste aufweisen, die spezifisch mit einer chelatierenden Nickelionen-Matrix interagieren. Alternativ dazu kann der Affinitätstag auch aus einer Glutathion-S-Transferase bestehen, die sich unter Verwendung einer Glutathion-Matrix aufreinigen lässt. Im Stand der Technik sind zahlreiche weitere Affinitätstags bekannt, die in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Antigen-bindenden Polypeptiden verwendet werden können. Beispiele für Paare aus Affinitätstag und Affinitätsligand umfassen Maltose-bindendes Protein (MBP) und Maltose; Avidin und Biotin; Streptag und Streptavin oder Neutravidin.

Affinitätstags können z. B. mittels Ligation einer DNA, die für ein erfindungsgemäßes Antigen-bindendes Polypeptid kodiert, mit einer für den Affinitätstag kodierenden Sequenz hergestellt werden. In Fallen, bei denen der Affinitätstag kein Peptid ist, kann der Affinitätstag mittels chemischer Kopplungsreaktionen an das Antigen-bindende Polypeptid konjugiert werden. Beispielsweise kann das Antigen-bindende Polypeptid chemisch mit Biotin gekoppelt werden. Eine Markierung mit Biotin kann auch erreicht werden, indem man an dem Antigenbindenden Polypeptid ein Peptid anbringt, welches von einer Biotin-Protein-Ligase (EC 6.3.4.15) erkannt wird, wie z. B. von BirA aus E. coli (siehe beispielsweise Smith et al. (1998) Nucleic Acids Research 26:1414–1420; Recket et al. (1999) Protein Science 8:921–929). Geeignete Peptide sind beispielsweise die 13 Aminosäuren lange, minimale Biotinylierungssequenz des Biotin Carboxy Carrier Proteins (BCCP) (Beckett et al. (1999), Protein Sci., 8, 921–929), die 15 Aminosäuren lange Variante hiervon, die AviTagTM genannt wird (Tirat et al. (2006), Int. J. Biol. Macromol., 39(1–3):66–76), und die 76 Aminosäuren lange BioEaseTM Sequenz (Tirat et al. (2006), s. o.), die alle durch die Biotin-Protein-Ligase BirA an einem zentralen Lysinrest biotinyliert werden. Ebenfalls geeignet sind Strep-tags, wie Streptag II (SA-WSHPQFEK) und One-STrEP-tag (SA-WSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK) (IBA BioTAGnology, IBA GmbH, Germany).

Darüber hinaus können die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch mit Enzymen (wie z. B. alkalischer Phosphatase) oder mit Erkennungssequenzen für Enzyme (wie z. B. den obigen BirA Biotinylierungssequenzen) gekoppelt werden. Auch eine Kopplung von verschiedenen Antigen-bindenden Polypeptiden, wie z. B. VHHs, die sich gegen verschiedene Epitope desselben Zielantigens (ToxA oder ToxB) richten, ist möglich, um auf diese Weise die Effizienz der Bindung an das Zielantigen zu verstärken. Zu diesem Zweck können beispielsweise zwei oder mehr der oben beschriebenen VHH-Einzeldomänenantikörper über eine BirA-Erkennungssequenz mit Biotin gekoppelt werden und anschließend über die hochaffine Bindung von Biotin an Avidin oder Streptavidin, oder an modifiziertes Streptavidin, wie Neutravidin oder Strep-Tactin, gebunden werden. Avidin und Streptavidin sind tetramere Moleküle, die vier Moleküle von D-Biotin binden können. Derartig multimerisierte, tetravalente VHH-Einzeldomänenantikörper haben eine erhöhte Affinität für die Toxine. Zur Multimerisierung können mit Streptavidinüberzogene Beads, z. B. magnetische oder Sepharose-Beads, verwendet werden. Geeignete Beads sind z. B. Strep-Tactin Magnetic Nanobeads (IBA BioTAGnology, IBA GmbH, Germany). Darüber hinaus ist auch eine Kopplung von gegen ToxA oder ToxB gerichteten VHH-Domänen an VHH-Domänen, die gegen Albumin oder gegen einen Transzytose-Rezeptor gerichtet sind, nützlich. Die VHH-Einzeldomänenantikörper der vorliegenden Erfindung können selbstverständlich auch an Immunglobuline gekoppelt werden, z. B. an die Fc-Region eines Immunglobulins.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die durch ToxA und/oder ToxB von Clostridium difficile verursacht wird, bereitgestellt, bei dem man

  • (a) ein wie oben beschriebenes und in den Ansprüchen definiertes Antigen-bindendes Polypeptid mit der biologischen Probe eines Patienten unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin ermöglichen; und
  • (b) Komplexe aus dem Polypeptid und dem Toxin nachweist; wobei der Nachweis der Komplexe in Schritt (b) darauf hinweist, dass der Patient an einer durch C. difficile vermittelten Erkrankung leidet.

Bei der Erkrankung kann es sich um eine Diarrhöe, insbesondere eine Antibiotika-assoziierte Diarrhöe (ADD), eine Kolitis, insbesondere eine pseudomembranöse Kolitis, eine Enterokolitis oder um ein toxisches Megakolon handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur therapeutischen Behandlung der pseudomembranösen Kolitis eingesetzt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die durch C. difficile verursachte Erkrankung pseudomembranöse Kolitis. Durch die Verwendung von, wie oben beschriebenen, magnetischen, mit Streptavidin-Biotin-VHH Komplexen überzogenen Beads ist eine besonders effektive Anreicherung von Toxinen aus biologischen Proben möglich.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines wie oben beschriebenen und in den Ansprüchen definierten Antigenbindenden Polypeptids zur therapeutischen Behandlung oder zur Diagnose einer Erkrankung, die durch Clostridium difficile verursacht wird.

Schließlich stellt die vorliegende Erfindung auch ein Kit für den Nachweis von C. difficile bereit, wobei das Kit ein wie oben beschriebenes Antigen-bindendes Polypeptid umfasst. Das Kit kann darüber hinaus weitere Reagenzien und Mittel umfassen, die für den Nachweis erforderlich sind, z. B. Reagenzien für die Visualisierung einer Markierung.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1 zeigt die schematische Darstellung der Klonierungsstrategie für das VHH-Repertoire im Phagen-Display-Vektor pHEN2. L: Signalpeptid (Leader); VHH: variable Region des Schwereketten-Antikörpers; h: Hinge-Region; CH2: konstante Region 2 des Schwereketten-Antikörpers; CH3: konstante Region 3 des Schwereketten-Antikörpers; amber stop: Stopcodon UAG; H6x: His-tag; g3p: Phagenprotein g3p.

2 zeigt die Aminosäuresequenzen der mittels ToxA-CP und ToxB-GT selektionierten VHHs. Die drei CDR Regionen sind hervorgehoben (CDR1: einfach unterstrichen, CDR2: doppelt unterstrichen, und CDR3: fett unterstrichen). Alle Unterstreichungen gelten auch für die Aminosäurepositionen in den anderen Sequenzen desselben Blocks. In Fettschrift markiert sind in den VHHs vorkommende Cystein-Reste.

3A zeigt die Spezifität der selektierten VHHs in einer ELISA-Analyse in bivalentem Format gegen die CP-Domäne von ToxA (ToxA-CPD), ToxA 1-809, ToxA-Holotoxin, ToxB 1-807, ToxB-Holotoxin, die katalytische Domäne des CDT (CDTa) und Milchpulver (MPBS). 3B zeigt die Spezifität der selektionierten VHHs in einer ELISA-Analyse in bivalentem Format gegen ToxB-GT, ToxB 1-807, ToxA 1-809, die katalytische Domän e des CDT (CDTa) und Milchpulver (MPBS). coVHH: Kontroll-VHH.

4A zeigt die Dosis-abhängige Bindung der selektionierten anti-ToxA VHHs in einer ELISA-Analyse im monovalenten Format gegen ToxA 1-809. 4B zeigt die Dosis-abhängige Bindung der selektionierten anti-ToxB VHHs in einer ELISA-Analyse im monovalenten Format gegen ToxB-GT. 4C zeigt die Dosisabhängige Bindung der selektionierten VHH S + 12 in einer ELISA-Analyse im monovalenten Format gegen ToxA 1-809 und ToxB 1-507. coVHH: Kontroll-VHH.

5 zeigt das Ergebnis der in vitro-Spaltungsanalyse. Die gegen Toxin A gerichteten VHHs L-10 und L-11 inhibieren dosisabhängig die Cysteinprotease-Aktivität, d. h. die autokatalytische Spaltung von ToxA.

BEISPIELEBeispiel 1: Induktion von ToxA- und ToxB-spezifischen Schwereketten-Antikörpern durch Immunisierung

Für die Induktion von Schwereketten-Antikörpern, die gegen ToxA und ToxB gerichtet sind, wurden drei Lamas (die als Lamas Nr. 5, Nr. 5026 und 5037 bezeichnet wurden) mit Polypeptiden immunisiert, die von den Toxinen ToxA, ToxE und CDT von C. difficile abgeleitet sind. Lama Nr. 5 erhielt ein von ToxA abgeleitetes Polypeptid, Lama Nr. 5026 erhielt ein von ToxB abgeleitetes Polypeptid, und Lama Nr. 5037 erhielt jeweils ein von ToxA, ToxB und CDT abgeleitetes Polypeptid. Für die Immunisierung mit ToxA wurde die Cysteinprotease-Domäne von ToxA (SEQ ID NO: 71 = Aminosäuren 547-779 von SEQ ID NO: 69, 25 kDa) und für die Immunisierung mit ToxB die Glykosyltransferase-Domäne von ToxB (SEQ ID NO: 72 = Aminosäuren 1-546 von SEQ ID NO: 70, 60 kDa) verwendet. Für die Grundimmunisierung wurden jeweils 400 μg der ToxA bzw. ToxB Fragmente bzw. 50 μg der CDT Untereinheit CDTa verwendet.

Die Toxinfragmente wurden in 400 μl PBS zu 500 μl des Specol Adjuvans (Cedi Diagnostics, Lelystad, The Netherlands) gegeben und bei 4°C dreimal kurz mit Ultraschall behandelt. Die Injektionen erfolgten subkutan in den Hals der Lamas. Die Immunisierung der Lamas wurde durch mehrere aufeinander folgende Injektionen der Antigene verstärkt. Den Lamas Nr. 5 und Nr. 5026 wurden weitere zwei Male, dem Lama Nr. 5037 weitere drei Male die betreffenden Antigene injiziert. Schließlich wurde Lamas Nr. 5 und 5026 elf Tage nach der 3. Injektion, dem Lama Nr. 5037 zehn Tage nach der 4. Injektion 20–100 ml Blut für die Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek abgenommen (vergleiche Beispiel 2).

Die erfolgreiche Induktion der humoralen Immunantwort wurde mittels eines Serum-Titer-ELISAs bestätigt. Über Nacht wurden die Vertiefungen einer ELISA-Platte bei 4°C mit 100 ng Antigen pro Vertiefung beschichtet und anschließend 2 h bei Raumtemperatur (RT) mit 5% Milchpulver in PBS blockiert. Als Antigene wurden die Fragmente verwendet, die bereits für die Immunisierung eingesetzt wurden. Die Seren wurde in einer Verdünnung von 1:1000 in PBS verwendet. Zur Detektion der gebundenen Antikörper wurde ein polyklonales Kaninchen-Anti-Lama-IgG-Serum verwendet (1:1000). Als sekundärer Antikörper wurde ein Schaf-Anti-Kaninchen-Peroxidase (PO) Konjugat (1:5000) verwendet. Die Detektion erfolgte mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) und wurde durch die Zugabe von 0.5 M Schwefelsäure gestoppt. Am ELISA-Reader wurde bei 450 nm der Substratumsatz quantifiziert. Verglichen wurden die Präimmunseren mit den Immunseren der Lamas nach der dritten (Lamas Nr. 5, 5026) bzw. vierten Injektion (Lama Nr. 5037). Die Präimmunseren zeigten keine Reaktivität gegen die getesteten Antigene. Das Immunserum des Lamas 5026 zeigte nach den Immunisierungen keine starke Reaktivität gegen ToxB. Das Lama, welches mit drei Antigenen immunisiert wurde, zeigte eine hohe Reaktivität für alle Toxinantigene.

Beispiel 2: Selektion und Sequenzanalyse von ToxA- und ToxB-spezifischen VHHs aus Phagen-Display-Bibliotheken der immunisierten Lamas

Zur Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek wurde aus den peripheren Blutlymphozyten der Lamas nach der 3. bzw. 4. Injektion zunächst RNA isoliert und mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben. Für die reverse Transkription wurden Random-Hexamere (RH6) verwendet, die an unterschiedlichen Positionen an die RNA binden. Aus dieser cDNA wurde die für die VHHs der Schwereketten-Antikörper kodierende Region mittels PCR mit den spezifischen und teilweise degenerierten Oligonukleotiden SHFmu/SHRmu und LHFmu/LHRmu amplifiziert: (r, m, s und w bezeichnen Positionen mit variablen Nukleotiden: r = a oder g; m = a oder c; s = c oder g; w = a oder t.)

Die amplifizierten VHH-Fragmente wurden nach Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SfiI und NotI in den Phagemid-Vektor pHEN2 kloniert (1). Die Ligationsprodukte wurden in E. coli transformiert, so dass eine VHH-Fragment exprimierende Phagen-Bibliothek entstand.

Spezifische Einzeldomänen-Antikörper wurden aus den Phagen-Display Bibliotheken mittels Panning selektiert, wobei die Einzeldomänen-Antikörper über ihre VHHs an die immobilisierten Antigene (ToxA, ToxB) banden, die zuvor in den Vertiefungen einer ELISA-Platte immobilisiert worden waren. Für ein Biotin-Panning wurden die oben beschriebenen ToxA bzw. ToxB Fragmente mit dem EZ-Link-Sulfo-NHS-Biotinylation Kit Thermo Scientific (Fisher Scientific, Schwerte Germany) biotinyliert. Das Biotin ist in der Lage, an Streptavidin-Agarose zu binden. 20 μl Streptavidin-Agarose wurden mit 2 μg der biotinylierten Antigene inkubiert und im Anschluss mit 10 μl der Phagenbibliothek inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Phagen kompetitiv mit 2 μg des unkonjugierten Antigens eluiert, und der Überstand wurde für eine Reinfektion von E. coli mit den Phagen verwendet. Die Bibliotheken wurden 2 bis 3 derartigen Selektionszyklen unterzogen. Nach jeder Runde wurden 12 Klone sequenziert, um den Erfolg der Selektion zu überprüfen. Die Sequenz der final selektierten Klone ist in 2 aufgeführt.

DNA-Sequenz-Analysen aus den zufällig gewählten Klonen bestätigten die erfolgreiche Klonierung eines breiten VHH-Repertoires der Bibliotheken. Die Sequenzierungen zeigten ferner, dass die CDR3 der VHHs eine Länge von 6-21 Aminosäuren aufweist. Alle Klone verfügen über das kanonische Cysteinpaar, das sich zwischen der FR1 und der FR3 ausbildet (siehe 2). Einige der sequenzierten Klone wiesen außerdem ein zusätzliches Cysteinpaar zwischen CDR2 und CDR3 auf.

Beispiel 3: Rekombinante Herstellung von VHH-Einzeldomänen-Antikörpern in E. coli

Die wie oben beschrieben identifizierten VHHs wurden rekombinant in E. coli produziert. Lösliche Einzeldomänen-Antikärger wurden durch Transformation des Vektorkonstrukts von Beispiel 2 in E. coli HB2151 (Genotyp: K12 D(lac-pro), ara, nalr, thi/F' [proAB, lacIq, lacZDM15]) erzeugt. Dieser Stamm ist in der Lage, das Stopcodon zwischen der für VHH kodierenden Sequenz und der für das g3-Kapsidprotein des M13-Phagen kodierenden Sequenz zu erkennen. Die transformierten Zellen von E. coli wurden in 100 ml 2 × YT (BD Difco, Heidelberg, 16 g/l Trypton, 5 g/l NaCl, 10 g/l Hefeextrakt) mit 100 μg/ml Carbenicillin bis zu einer optischen Dichte von 0.5 kultiviert. Die Proteinexpression wurde durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und nach drei Stunden durch Zentrifugation beendet. Mittels osmotischem Schock wurde die äußere Zellwand aufgebrochen. Die VHHs wurden über ihren Histidin-Tag durch Metallionen-Affinitätschromatographie mit einer Ausbeute zwischen 0.5 mg/l bis 1 mg/l aufgereinigt. Die VHHs wurden anschließend gegen PBS dialysiert und nach Bestimmung der Proteinkonzentration bei 4°C gelagert. Der Erfolg der Produktion und Aufreinigung wurde mittels SDS-PAGE Analyse bestätigt.

Beispiel 4: Affinitätsanalyse der selektierten VHHs

Die Bindung der in Beispiel 3 rekombinant hergestellten VHHs an ToxA und ToxB wurde mittels ELISA getestet (3). Einzeldomänen-Antikörper wurden dabei durch Peroxidasekonjugierte Antikörper gegen ihren C-terminalen myc-Tag nachgewiesen. Als Antigene wurden 500 ng ToxA-CPD (die Cysteinprotease-Domäne von ToxA), ToxB-GT (die Glucosyltransferase-Domäne von ToxB), ToxA 1-809 (ein Fragment von Toxin A, das die Glucosyltransferase-Domäne und die Cysteinprotease-Domäne von ToxA umfasst), ToxB 1-807 (ein Fragment von Toxin B, das die Glucosyltransferase-Domäne und die Cysteinprotease-Domäne von ToxB umfasst), CDTa (der katalytischen Domäne von CDT) oder Milchpulver (MPBS) über Nacht bei 4°C in den Vertiefungen einer Mikrotiter/ELISA-Platte immobilisiert. Nach Blockierung der freien Bindungsstellen mit 5% Milchpulver/PBS für 2 h bei Raumtemperatur wurden VHH-Anti-Myc-Antikörper-Komplexe (vergleiche Beispiel 3) für 1 Stunde in den Vertiefungen inkubiert. Dazu wurden die VHHs (100 ng) zunächst mit einem Maus-Anti-c-Myc Antikörper (700 ng) für 10 min bei RT vorinkubiert, so dass VHH-Anti-Myc-Komplexe mit bivalenten Eigenschaften entstanden, und anschließend in die ELISA Platte gegeben. Als tertiärer Antikörper wurde ein Schaf-Anti-Maus-Peroxidase-Konjugat (1:5000) verwendet. Die Detektion erfolgte mit 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) und wurde durch die Zugabe von 0.5 M Schwefelsäure gestoppt. Am ELISA-Reader wurde bei 450 nm der Substratumsatz quantifiziert. Als Kontrollen wurden Milchpulver (MPBS), CDTa und der CDTa-spezifische VHH-Einzeldomänenantikörper (1 + 8) verwendet. Die VHHs L-10a (#2150, SEQ ID NO: 1), L-11a (#2147, SEQ ID NO: 6), und L-14 (#2145, SEQ ID NO: 8) zeigten spezifische Reaktionen mit ToxA-CPD und mit ToxA 1-809 (3A). Die VHHs L-7.II (#2971, SEQ ID NO: 15), S + 12 (#2967, SEQ ID NO: 16), L-14 (#2966, SEQ ID NO: 17) und L-7c.I (#2954, SEQ ID NO: 11) zeigen eine spezifische Bindung an ToxB-GT und an ToxB 1-807 (3B). Die VHH 5 + 12 kreuzreagierte mit ToxA 1-809, nicht aber mit CDTa oder MBPS (3B).

Die konzentrationsabhängige Bindung der VHHs an ToxA 1–809 (300 ng/Napf) und an ToxB 1-546 (230 ng/Napf) wurde analog mit monovalenten VHHs getestet (4). Dazu wurde oben beschriebener ELISA durchgeführt, wobei die VHHs nicht mit Anti-Myc-Antikärpern vorinkubiert wurden. Die VHHs (1 μg bis 3 ng) wurden in 1:3,3 Verdünnungsschritten für eine Stunde in den Vertiefungen der ELISA Platte inkubiert. Die Näpfe wurden 2 mal gewaschen. Zur Detektion der gebundenen VHHs wurde ein Maus-Anti-c-Myc Antikörper verwendet (700 ng/Napf). Als teritärer Antikörper wurde ein Schaf-Anti-MausIgG-Peroxidase (PO)-Konjugat (1:5000) verwendet. Die Detektion erfolgte wie oben beschrieben. Die VHHs L-10a (#2150, SEQ ID NO: 1), L-11a (#2147, SEQ ID NO: 6), und L-14 (#2145, SEQ ID NO: 8) banden konzentrationsabhängig an ToxA 1-809 (4A). Die VHHs L-7.II (#2971, SEQ ID NO: 15), S + 12 (#2967, SEQ ID NO: 16), L-14 (#2966, SEQ ID NO: 17) und L-7c.I (#2954, SEQ ID NO: 11) banden konzentrationsabhängig an ToxB-GT (4B). Darüber hinaus banden die VHHs L-7.II und S + 12 konzentrationsabhängig auch an ToxA-1-800 (4C). Im bivalenten ELISA Testformat, wie in 3B gezeigt, reagierte S + 12 deutlich stärker mit ToxA 1-809 als im monovalenten Testformat.

Beispiel 5: Hemmung der Cysteinprotease-Aktivität durch ToxA-spezifische VHHs

Die Immunisierung der Lamas wurde mit der Cysteinprotease-Domäne (CPD) von ToxA durchgeführt. Die CPD von ToxA wird durch Inositol-Hexakisphosphat (InsP6) aktiviert. InsP6 ist ausschließlich in Eukaryonten vorhanden, so dass ToxA erst bei Kontakt mit Eukaryonten gespalten wird. In der Anwesenheit von InsP6, das nur in der Wirtszelle vorkommt, wird eine autokatalytische Prozessierung des Toxins eingeleitet. Durch die CPD wird der enzymatisch aktive N-Terminus vom C-terminalen Teil abgespalten und ins Zytosol entlassen (Reineke et al. (2007), Nature, 446(7134):415–419).

Die Toxine ToxA 1-809 oder ToxB 1-807 (1 μg) wurden mit den anti-ToxA-spezifischen VHHs (von 0,08 μg bis 1,25 μg) für 1 h bei RT vorinkubiert. Die autoproteolytische Prozessierung der Toxine wurde durch Zugabe von 100 μM InsP6 induziert und der Ansatz in der Ab- bzw. Anwesenheit der VHHs für 1 h bei 37°C induziert. Die Proteaseaktivität wurde anschließend mittels SDS-PAGE visualisiert (5). Bei der Kontrolle ohne Zugabe von InsP6 (”–”) kam es zu keiner autokatalytischen Spaltung, bei Zugabe von InsP6 sind zwei Fragmente im Gel zu erkennen (”+”).

Die Anti-ToxA-VHHs L-10a und L-11a blockierten Dosis-abhängig die autokatalytische Spaltung von ToxA. Kontroll VHHs (coVHH) zeigten selbst in hoher Dosis keine Hemmung der autokatlytischen Spaltung von ToxA. Keine der anti-ToxA VHHs blockierte die autokatalytische Spaltung von ToxB.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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