Title:
EINZELDOMÄNEN-ANTIKÖRPER GEGEN CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOXINE
Kind Code:
A1
Abstract:

Die Erfindung betrifft Antigen-bindende Polypeptide, die die CDR1-, CDR2-, und CDR3-Region einer VHH-Domäne eines Kamelid-Schwereketten-Antikörpers umfassen. Die Polypeptide binden spezifisch im Bereich der Aminosäuren 1-800 eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile. Die Antigen-bindenden Polypeptide eignen sich insbesondere für die therapeutische Behandlung einer Erkrankung, die durch ein Glykosyltransferase-Aktivität aufweisendes Toxin von Clostridium difficile verursacht wird, sowie für die Diagnose einer solchen Erkrankung. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Antigen-bindenden Polypeptide in Verfahren zum Nachweis eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile in einer biologischen Probe. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eines Glykosyltransferase-Aktivität aufweisenden Toxins von Clostridium difficile, bei denen die Antigenbindenden Polypeptide zur Anwendung kommen, werden ebenfalls bereitgestellt.



Inventors:
Nolte, Friedrich (22767, Hamburg, DE)
Unger, Mandy (22529, Hamburg, DE)
Application Number:
DE102011121238A
Publication Date:
06/20/2013
Filing Date:
12/14/2011
Assignee:
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, 20251 (DE)
International Classes:
Foreign References:
WO2006122825A22006-11-23
WO2010042815A22010-04-15
Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
Uexküll & Stolberg, 22607, Hamburg, DE
Claims:
1. Antigen-bindendes Polypeptid, das die CDR1-, CDR2-, und CDR3-Region einer VHH-Dom?ne eines Kamelid-Schwereketten-Antik?rpers umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminos?uren 1-800 eines Toxins mit Glykosyltransferase-Aktivit?t von Clostridium difficile bindet.

2. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die CDR-Regionen von einer VHH-Dom?ne eines Lamas abgeleitet sind

3. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminos?uren 543-800 von Toxin A von Clostridium difficile bindet.

4. Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminos?uren 1-544 von Toxin B von Clostridium difficile bindet.

5. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid:
(a) die in SEQ ID NO: 18-20 dargestellten CDR-Sequenzen;
(b) die in SEQ ID NO: 21-23 dargestellten CDR-Sequenzen;
(c) die in SEQ ID NO: 24-26 dargestellten CDR-Sequenzen;
(d) die in SEQ ID NO: 27-29 dargestellten CDR-Sequenzen;
(e) die in SEQ ID NO: 30-32 dargestellten CDR-Sequenzen;
(f) die in SEQ ID NO: 33-35 dargestellten CDR-Sequenzen;
(g) die in SEQ ID NO: 36-38 dargestellten CDR-Sequenzen;
(h) die in SEQ ID NO: 39-41 dargestellten CDR-Sequenzen;
oder CDR-Sequenzen, die sich von den in (a)?(h) dargestellten CDR-Sequenzen in h?chstens einer Aminos?ure pro CDR unterscheiden, umfasst.

6. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid:
(a) die in SEQ ID NO: 42-44 dargestellten CDR-Sequenzen;
(b) die in SEQ ID NO: 45-47 dargestellten CDR-Sequenzen;
(c) die in SEQ ID NO: 48-50 dargestellten CDR-Sequenzen;
(d) die in SEQ ID NO: 51-53 dargestellten CDR-Sequenzen;
(e) die in SEQ ID NO: 54-56 dargestellten CDR-Sequenzen;
(f) die in SEQ ID NO: 57-59 dargestellten CDR-Sequenzen;
(g) die in SEQ ID NO: 60-62 dargestellten CDR-Sequenzen;
(h) die in SEQ ID NO: 63-65 dargestellten CDR-Sequenzen;
(i) die in SEQ ID NO: 66-68 dargestellten CDR-Sequenzen;
oder CDR-Sequenzen, die sich von den in (a)?(i) dargestellten CDR-Sequenzen in h?chstens einer Aminos?ure pro CDR unterscheiden, umfasst.

7. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine Aminos?uresequenz umfasst, die ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) den Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 1-8; und
(b) einer Aminos?uresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentit?t zu einer der Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 1-8 aufweist.

8. Antigen-bindendes Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine Aminos?uresequenz umfasst, die ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) den Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 9-17; und
(b) einer Aminos?uresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentit?t zu einer der Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 9-17 aufweist.

9. Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1?8 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung oder zur Diagnose einer Erkrankung, die durch Clostridium difficile verursacht wird.

10. Nukleins?uremolek?l, das f?r ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1?8 kodiert.

11. Expressionsvektor, der ein Nukleins?uremolek?l nach Anspruch 10 umfasst.

12. Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle ein Nukleins?uremolek?l nach Anspruch 10 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 11 umfasst.

13. Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Antigenbindenden Polypeptids nach einem der Anspr?che 1?8, bei dem man (a) eine Wirtszelle nach Anspruch 12 unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression eines Nukleins?uremolek?ls nach Anspruch 10 erlauben; und (b) das Antigenbindende Polypeptid aus der Kultur isoliert.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1?8 umfasst.

15. Verfahren zum Nachweis eines Glykosyltransferase-Aktivit?t aufweisenden Toxins von Clostridium difficile in einer biologischen Probe, bei dem man
(a) ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1?8 mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, die. die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin erm?glichen; und
(b) die Komplexe aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin nachweist.

16. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eines Glykosyltransferase-Aktivit?t aufweisenden Toxins von Clostridium difficile, bei dem man
(a) ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1?8 mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin erm?glichen; und
(b) die Komplexe aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin von der Probe abtrennt.

17. Verfahren zur Diagnose einer durch Clostridium difficile vermittelten Erkrankung, bei dem man
(a) ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1?8 mit der biologischen Probe eines Patienten unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin erm?glichen; und
(b) Komplexe aus dem Polypeptid und dem Toxin nachweist; wobei der Nachweis der Komplexe in Schritt (b) darauf hinweist, dass der Patient an einer durch Clostridium difficile verursachten Erkrankung leidet.

18. Verwendung eines Antigen-bindenden Polypeptids nach einem der Anspr?che 1?8 zur therapeutischen Behandlung oder zur Diagnose einer Erkrankung, die Clostridium difficile verursacht wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Kolitis ist.

20. Kit zum Nachweis von Clostridium difficile, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit ein Antigen-bindendes Polypeptid nach einem der Anspr?che 1?8 umfasst.

Description:

Die Erfindung betrifft Antigen-bindende Polypeptide, die die CDR1-, CDR2-, und CDR3-Region einer VHH-Dom?ne eines Kamelid-Schwereketten-Antik?rpers umfassen. Die Polypeptide binden spezifisch im Bereich der Aminos?uren 1-800 eines Glykosyltransferase-Aktivit?t aufweisenden Toxins von Clostridium difficile und eignen sich daher insbesondere f?r die therapeutische und prophylaktische Behandlung einer Erkrankung, die durch ein Glykosyltransferase-Aktivit?t aufweisendes Toxin von Clostridium difficile verursacht wird, sowie auch f?r die Diagnose einer solchen Erkrankung. Dar?ber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Antigen-bindenden Polypeptide in Verfahren zum Nachweis eines Glykosyltransferase-Aktivit?t aufweisenden Toxins von Clostridium difficile in einer biologischen Probe. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eines Glykosyltransferase-Aktivit?t aufweisenden Toxins von Clostridium difficile, bei denen die Antigenbindenden Polypeptide zur Anwendung kommen, werden ebenfalls bereitgestellt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Einsatz von Antibiotika hat sich bei der Bek?mpfung zahlreicher bakterieller Infektionskrankheiten bew?hrt und ist auf dem Gebiet der Humanmedizin unverzichtbar geworden. Andererseits tr?gt die massive Verwendung von Antibiotika auch zur Verbreitung anderer potentiell lebensbedrohlicher Krankheiten bei. So sind beispielsweise durch Clostridium difficile verursachte Erkrankungen eine weitverbreitete Folge von Antibiotikatherapien, die oftmals zu einer betr?chtlichen Sch?digung der normalen Darmflora f?hren (Kyne (2010), New Engl. J. Med. 362(3):264?5). C. difficile ist ein anaerobes Grampositives Bakterium, das beim gesunden Menschen Teil der normalen Darmflora ist. Im Rahmen einer Antibiotikatherapie kommt es zu Ver?nderungen in der Zusammensetzung der Normalflora, da einzelne Bakterien st?rker durch die bakterizide Wirkung des Antibiotikums beeinflusst werden als andere. Auf diese Weise kann es zu einer ungew?hnlich starken Vermehrung von C. difficile kommen, die mit verschiedenen Erkrankungen einhergeht, welche zusammenfassend als ?CDAD? (Clostridium difficile associated diseases) bezeichnet werden. Eine besonders schwerwiegende und potentiell lebensbedrohliche Erkrankung aus der Gruppe der CDAD ist die pseudomembran?se Kolitis.

Durch den in den vergangenen Jahrzehnten stetig zunehmenden Einsatz von Antibiotika hat die Inzidenz von Erkrankungen, die durch C. difficile verursacht werden, stark zugenommen. Sch?tzungen gehen davon aus, dass die Behandlung dieser Erkrankungen Kosten im Gesundheitswesen verursachen, die sich allein in Europa auf bis zu 3 Mrd. Euro pro Jahr belaufen (Kuijper et al. (2006), Netherlands. Emerg. Infect. Dis. 12:827?30). In j?ngster Zeit wurde ein hypervirulenter Stamm von C. difficile nachgewiesen, der als BI/NAP1/027 bezeichnet wird (Goorhuis et al. (2008), Clin Infect Dis. 47(9):1162?70). Einige Isolate dieses Stamms zeigen eine erh?hte Produktion von Virulenzfaktoren sowie eine Resistenz gegen Fluorquinolon-Antibiotika. Die Bek?mpfung dieser St?mme hat sich als besonders schwierig erwiesen.

Die Pathogenit?t von C. difficile wird durch verschiedene enzymatisch wirksame Toxine hervorgerufen. Das Bakterium produziert zwei Exotoxine mit hohem Molekulargewicht, die als Toxin A (ToxA) und Toxin B (ToxB) bezeichnet werden (Just & Gerhard (2004), Rev Physiol Biochem Pharmacol 152: 23?47). Diese Toxine bestehen jeweils aus einer Glykosyltransferase(GT)-Dom?ne, einer Cysteinprotease(CP)-Dom?ne, einer Translokationsdom?ne, und einer Rezeptorbindungsdom?ne (RBD). Der allgemeine Aufbau von ToxA und ToxB ist in Jank & Aktories (2008), Trends Microbiology, 16, 222?229, beschrieben. Die toxische Aktivit?t dieser Multidom?nenproteine ist auf die durch die Glykosyltransferase(GT)-Dom?ne katalysierte Glykosylierung der humanen Rho-GTPase an der Position Thr-37 zur?ckzuf?hren (Koch-Nolte et al. (2001), J. Biotechnol. 92, 81?87). Durch die Glykosylierung kann die Rho-GTPase ihre native Konformation nicht mehr einnehmen, was zur Umverteilung des Aktin-Zytokeletts, zur Desintegration der Zell-Zellkontakte des Darmepithels und damit zum Verlust der Schrankenfunktion f?hrt (Aktories & Barbieri, (2005) Nat Rev Microbiol., 3(5):397?410).

20?35% der St?mme von C. difficile enthalten zus?tzlich das bin?re Toxin CDT (Perelle et al. (1197), Immun 65(4):1402?1407). Das CDT-Toxin besteht aus zwei separaten Untereinheiten, die CDTa und CDTb genannt werden. CDTb hat ein Molekulargewicht von 99 kDa und bindet an den Zellrezeptor LSR (Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor), der zur Internalisierung von CDTa ins Zytosol f?hrt (Papatheodorou et al. (2011), Proc Natl Acad Sci USA 108(39):16422?27). CDTa weist ein Molekulargewicht von 48 kDa auf und stellt die enzymatisch aktive Untereinheit des Toxins dar. CDTa katalysiert die ADP-Ribosylierung von Aktin im Zytosol, was letztlich zum vollst?ndigen Zusammenbruch des Zytoskeletts der Gewebezelle f?hrt.

Es wurde gezeigt, dass die Verabreichung von monoklonalen Antik?rpern gegen ToxA und ToxB ein Rezidiv bez?glich einer Infektion mit C. difficile verhindern kann. So wurde die Rezidivrate durch eine einmalige Infusion der Antik?rper um mehr als 70% gesenkt (Lowy et al. (2010), New Engl J Med. 362(3):197?205). Ein Vorteil bei der Verwendung von Antik?rpern gegen?ber anderen therapeutischen Ans?tzen, wie z. B. Verwendung von Impfstoffen, besteht darin, dass ein aktives Immunsystem keine zwingende Voraussetzung f?r eine erfolgreiche Therapie ist. Daher erm?glicht die Gabe von Antik?rpern auch bei Menschen mit geschw?chtem Immunsystem einen Therapieerfolg.

Nachteile bei der Verwendung von polyklonalen und/oder monoklonalen Antik?rpern auf dem Gebiet der Humanmedizin ergeben sich aus der oftmals unzureichenden Stabilit?t nach Verabreichung. Au?erdem sind die Kosten, die bei der Herstellung von monoklonalen Antik?rpern anfallen, sehr hoch. Insbesondere die Herstellung von humanisierten Antik?rpern, die eine geringere Immunogenit?t aufweisen und daher f?r den Einsatz beim Menschen besonders geeignet sind, ist arbeits- und kostenintensiv. Hinzu kommt, dass vollst?ndige Antik?rper aufgrund ihrer Gr??e eine beschr?nkte Gewebsdurchg?ngigkeit aufweisen. Eine deutliche Verbesserung dieser f?r die Therapie nachteiligen Eigenschaften ist daher f?r eine effiziente und trotzdem finanziell tragbare Therapie erforderlich.

Im Stand der Technik wurden verschiedene Strategien entwickelt, um die mit der Verabreichung von Antik?rpern einhergehenden Probleme zu l?sen. So wurden Fragmente von vollst?ndigen IgG-Antik?rpern, wie z. B. Fv, Fab, F(ab') und F(ab')2, zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Diese Fragmente weisen jedoch oftmals im Vergleich zum vollst?ndigen Antik?rper eine verringerte Spezifit?t und/oder Affinit?t in Bezug auf das Antigen auf. Ferner zeigen diese Fragmente oftmals nur eine geringe L?slichkeit in w?ssrigen L?sungen.

Es ist bekannt, dass Fragmente von bestimmten Kamelid-Antik?rpern Eigenschaften aufweisen, die sie in besonderer Weise f?r die therapeutische Verwendung am Menschen geeignet erscheinen lassen. Neben herk?mmlichen Antik?rpern, die ?ber jeweils zwei schwere und zwei leichte Ketten verf?gen, produzieren die Kameliden auch Antik?rper, die ausschlie?lich aus schweren Ketten bestehen (Hamers-Casterman et al. (1993), Nature 363:446?448; Wesolowski et al. (2009), Med Microbiol Immunol. 198(3):157?74). Bei diesen sogenannten Schwereketten-Antik?rpern handelt es sich um Homodimere aus zwei identischen schweren Ketten, die mit dem Antigen ?ber eine einzige variable Dom?ne interagieren, welche als VHH (variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies) bezeichnet wird. Die VHH-Dom?ne verf?gt ?ber drei komplementarit?tsbestimmende Regionen (complementary determining regions, CDRs) und vier Ger?stregionen (framework regions, FR), die mit den CDRs in der Prim?rsequenz der VHH-Dom?ne alternieren. Die VHH-Dom?ne eines Schwereketten-Antik?rpers bildet eine kleine Polypeptideinheit mit hohem Antigenbindungsverm?gen. Aufgrund einer au?ergew?hnlich langen CDR3-Region mit einer L?nge von etwa 7 bis 25 Aminos?uren kann die VHH-Dom?ne anders als konventionelle Antik?rper in Kavit?ten von Protein-Antigenen binden, und so z. B. das aktive Zentrum eines Enzyms blockieren (De Genst et al. (2006), Proc Natl Acad Sci USA 103(12):4586?4591). VHH-Dom?nen k?nnen rekombinant als l?sliche Proteine in Bakterien oder S?ugerzellen produziert werden. Solche rekombinant hergestellten VHH-Dom?nen werden auch Einzeldom?nenantik?rper (single-domain antibodies, sdABs) oder nanobodies? genannt. Derzeit wird ein gegen ein humanes Serumprotein (von Willebrand Faktor) gerichteter nanobody? in einer klinischen Phase II Studie gestestet (von Loon et al. (2011), Thromb Haemost 106(1):165?71, Ulrichts et al. (2011), Blood 118(3):757?65).

VHH-Einzeldom?nenantik?rper sind nicht nur stabiler sondern auch etwa zehnmal kleiner als herk?mmliche Antik?rper und weisen neben einer hohen L?slichkeit deutlich bessere Eigenschaften bei der Gewebepenetration auf. Aus diesem Grund sind VHH-Einzeldom?nenantik?rper f?r die Behandlung verschiedener Erkrankungen vorgeschlagen worden. In der internationalen Anmeldung WO 2006/122825 werden VHH-Einzeldom?nenantik?rper gegen von Willebrand-Faktor zur Behandlung von arteriellen Verschlusskrankheiten verwendet. Die internationale Anmeldung WO 2010/042815 offenbart VHH-Einzeldom?nenantik?rper, die zur Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt werden k?nnen.

Die vorliegende Erfindung stellt VHH-Einzeldom?nenantik?rper bereit, die in der Lage sind, spezifisch an ein Toxin zu binden, das von C. difficile erzeugt wird, und dieses zu neutralisieren. Die Antik?rper eignen sich daher in besonderer Weise f?r eine Verwendung bei der Diagnose und/oder bei der therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die durch die Toxine ToxA und ToxB von C. difficile verursacht werden.

Gegen ToxA und ToxB gerichtete VHH-Einzeldom?nenantik?rper zur Verwendung bei der Neutralisierung der Toxine wurden im Stand der Technik bereits beschrieben (Hussack et al. (2011), J Biol Chem., 286(11):8961?76). Allerdings richten sich diese Toxine gegen die Rezeptorbindungsdom?ne der Toxine, um somit deren Anbindung an die Zielzellen zu unterbinden. Es wurde nunmehr allerdings im Rahmen der vorliegenden Erfindung ?berraschenderweise festgestellt, dass VHH-Einzeldom?nenantik?rper, die gegen die Glykosyltransferase-Dom?ne oder die Cysteinprotease-Dom?ne von Toxin A oder Toxin B von C. difficile gerichtet sind, besonders vorteilhafte Eigenschaften bei der Neutralisierung der Toxin-vermittelten Gewebesch?digung aufweisen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden zun?chst durch Immunisierung von Lamas mit Peptiden aus der Cysteinprotease-Dom?ne von Toxin A und aus der Glykosyltransferase-Dom?ne von Toxin B Schwereketten-Antik?rper erzeugt. Anschlie?end wurde aus den peripheren Blutlymphozyten der Lamas RNA isoliert und mittels reverser Transkription in cDNA ?berf?hrt. Ausgehend von der isolierten RNA wurden die variablen Dom?nen der Schwereketten-Antik?rper mittels PCR amplifiziert. Durch Klonierung der VHH-Fragmente in einen Phagemid-Vektor wurden Phagen-Display-Bibliotheken hergestellt. Diese Bibliotheken wurden unter Verwendung von rekombinantem ToxA bzw. ToxB in einem Panning-Verfahren selektioniert. Die Sequenzen der selektierten Einzeldom?nenantik?rper wurden anschlie?end durch Sequenzierung bestimmt und rekombinant in Bakterien-Wirtszellen exprimiert. Auf diese Weise stellt die vorliegende Erfindung VHH-Einzeldom?nenantik?rper bereit, die sich f?r eine Verwendung in therapeutischen und/oder diagnostischen Verfahren eignen. Dar?ber hinaus stellt die vorliegende Erfindung CDR-Regionen aus VHH-Einzeldom?nenantik?rpern gegen ToxA bzw. ToxB bereit, die im Rahmen der Konstruktion von rekombinanten, Antigen-bindenden Polypeptiden verwendet werden k?nnen.

Die Erfindung stellt folglich in einem ersten Aspekt ein Antigen-bindendes Polypeptid bereit, das die f?r die Bindung eines VHH-Einzeldom?nenantik?rpers notwendigen komplementarit?tsbestimmenden Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Dom?ne eines Kamlid-Schwereketten-Antik?rpers umfasst, wobei das Polypeptid spezifisch im Bereich der Aminos?uren 1-800 eines Toxins mit Glykosyltransferase-Aktivit?t von C. difficile bindet. Toxine dieses Erregers, die ?ber eine Glykosyltransferase-Aktivit?t verf?gen, sind die Toxine A und B (ToxA und ToxB), wie in SEQ ID NO: 69 bzw. 70 dargestellt. Das bin?re Toxin CDT von C. difficile weist keine Glykosyltransferase-Aktivit?t auf. Sowohl bei ToxA als auch bei ToxB umfassen die N-terminal lokalisierten 800 Aminos?uren des unprozessierten Toxins die GT- und die CP-Dom?ne.

Die Erfindung offenbart somit spezifisch an ToxA bindende Polypeptide, welche die f?r eine Bindung an ToxA erforderlichen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Dom?ne eines Kamlid-Schwereketten-Antik?rpers umfassen. Die Bindung an ToxA erfolgt im Bereich der Aminos?uren 1-800 der nativen, unprozessierten Sequenz von ToxA, d. h. das Epitop f?r die Bindung des ToxA-bindenden Polypeptids liegt innerhalb der Aminos?uren 1-800 von ToxA. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform liegt das Epitop im Bereich der Cysteinprotease-Dom?ne von ToxA. Diese erstreckt sich im unprozessierten ToxA von Aminos?ure 547 bis Aminos?ure 779.

Des Weiteren offenbart die Erfindung auch Polypeptide, die spezifisch an ToxB binden. Diese Polypeptide umfassen die f?r eine Bindung an ToxB erforderlichen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Dom?ne eines Kamlid-Schwereketten-Antik?rpers. Die Bindung an ToxB erfolgt im Bereich der Aminos?uren 1-800 der nativen, unprozessierten Sequenz von ToxB, d. h. das Epitop f?r die Bindung des ToxB-bindenden Polypeptids liegt innerhalb der Aminos?uren 1-800 von ToxB. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform liegt das Epitop im Bereich der Glykosyltransferase-Dom?ne von ToxB. Diese erstreckt sich im unprozessierten ToxB von Aminos?ure 1 bis Aminos?ure 546.

Die erfindungsgem??en Polypeptide sind somit durch CDR-Regionen charakterisiert, die aus Schwereketten-Antik?rpern von Kameliden abgeleitet sind. Bei den Schwereketten-Antik?rpern handelt es sich um eine besondere Gruppe von Immunglobulinen, die ausschlie?lich aus schweren Ketten bestehen. Eine schwere Kette eines solchen Antik?rpers enth?lt neben zwei konstanten Dom?nen eine einzelne variable Dom?ne, die wiederum aus drei CDR-Regionen und vier FR-Regionen besteht. Die Interaktion mit dem Antigen erfolgt ausschlie?lich ?ber diese variable Dom?ne, die auch als VHH-Dom?ne bezeichnet wird. Durch ausgepr?gte Schleifen-Strukturen in der CDR3 ist eine VHH-Dom?ne in der Lage, auch kryptische Epitope zu erkennen. Schwereketten-Antik?rper werden in nur wenigen Spezies produziert, z. B. in Kameliden. Bei der Gruppe der Kameliden handelt es sich um eine S?ugetierfamilie aus der Ordnung der Artiodactyla (Paarhufer). Zur Familie der Kameliden z?hlen Kamele, Dromedare, Lamas, Alpakas und Vikunjas. In einer besonders bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung umfasst das Antigen-bindende Polypeptid CDR-Regionen, die von einer VHH-Dom?ne eines Lamas abgeleitet sind.

Das erfindungsgem??e Polypeptid weist eine spezifische Affinit?t f?r die Cysteinprotease(CP)-Dom?ne oder die Glykosyltransferase(GT)-Dom?ne von ToxA von C. difficile auf. Dar?ber hinaus kann das erfindungsgem??e Polypeptid auch eine spezifische Affinit?t f?r die Cysteinprotease(CP)-Dom?ne oder die Glykosyltransferase(GT)-Dom?ne von ToxB von C. difficile aufweisen.

Dies bedeutet, dass ein erfindungsgem??es Polypeptid mit einer Bindungsaffinit?t an die entsprechende Dom?ne von ToxA bzw. ToxB bindet, die signifikant h?her ist als die Bindungsaffinit?t f?r die Bindung an ein anderes Protein, welches zur Sequenz dieser Toxine nicht homolog ist.

Vorzugsweise ist die Bindungsaffinit?t des erfindungsgem??en Polypeptids mindestens 2-fach, 5-fach, 10-fach, 20-fach, 50-fach, 75-fach, 100-fach, 150-fach, 200-fach, 250-fach, 500-fach, 600-fach, 700-fach, 800-fach, 900-fach, 1000-fach, 2000-fach, 5000-fach, oder 10000-fach h?her als die Bindungsaffinit?t f?r ein nicht zu ToxA oder ToxB homologes Protein. Die Bindungsaffinit?t liegt vorzugsweise im Bereich von mindestens 10?6 M. Besonders bevorzugte Antigen-bindende Polypeptide der vorliegenden Erfindung weisen eine Bindungsaffinit?t mit Dissoziationskonstanten (Kd) im Bereich von mindestens 10?6 M, und vorzugsweise im Bereich von mindestens 10?7 M, 10?8 M, 10?9 M, 10?10 M, 10?11 M, oder 10?12 M auf. Verfahren zur Messung der Bindungsaffinit?ten von Antik?rpern sind im Stand der Technik hinl?nglich bekannt und umfassen z. B. die Bestimmung der Kd-Werte mittels Durchflu?zytometrie.

In einer besonders bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung umfasst das Antigen-bindende Polypeptid die CDR-Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Dom?ne eines Kamelid-Schwereketten-Antik?rpers, wobei diese CDR-Regionen:

  • (a) die in SEQ ID NO: 18-20 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (b) die in SEQ ID NO: 21-23 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (c) die in SEQ ID NO: 24-26 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (d) die in SEQ ID NO: 27-29 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (e) die in SEQ ID NO: 30-32 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (f) die in SEQ ID NO: 33-35 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (g) die in SEQ ID NO: 36-38 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (h) die in SEQ ID NO: 39-41 dargestellten CDR-Sequenzen;
    aufweisen.

In einer weiteren, ebenfalls besonders bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung umfasst das Antigen-bindende Polypeptid die CDR-Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 einer VHH-Dom?ne eines Kamelid-Schwereketten-Antik?rpers, wobei diese CDR-Regionen:

  • (a) die in SEQ ID NO: 42-44 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (b) die in SEQ ID NO: 45-47 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (c) die in SEQ ID NO: 48-50 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (d) die in SEQ ID NO: 51-53 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (e) die in SEQ ID NO: 54-56 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (f) die in SEQ ID NO: 57-59 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (g) die in SEQ ID NO: 60-62 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (h) die in SEQ ID NO: 63-65 dargestellten CDR-Sequenzen;
  • (i) die in SEQ ID NO: 66-68 dargestellten CDR-Sequenzen;
    aufweisen.

Dem Fachmann ist ersichtlich, dass innerhalb der vorliegend offenbarten CDRs eine gewisse Modifikation der Aminos?uresequenz m?glich ist, ohne die Bindungsf?higkeit des VHH-Einzeldom?nenantik?rpers zu beeintr?chtigen. So kann es beispielsweise m?glich sein, eine CDR des Einzeldom?nenantik?rpers durch den Austausch von 1, 2 oder 3 Aminos?uren zu ver?ndern. Im Allgemeinen kann jeder der Aminos?ure-Reste innerhalb der in den SEQ ID NO: 18-68 dargestellten CDRs durch einen anderen Rest ersetzt werden, solange das resultierende CDR noch in der Lage ist (gemeinsam mit den anderen beiden CDRs) spezifisch an das entsprechende Toxin (d. h. ToxA oder ToxB) zu binden. Ferner k?nnen auch 1, 2 oder 3 Aminos?uren innerhalb einer der in SEQ ID NO: 18-68 dargestellten Sequenzen deletiert oder mittels Addition zugef?gt worden sein, solange die Bindungsf?higkeit an das entsprechende Toxin (d. h. ToxA oder ToxB) nicht vollst?ndig beseitigt wird.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind somit Antigenbindende Polypeptide, die CDRs aufweisen, welche sich von den in SEQ ID NO: 18-68 dargestellten Sequenzen in einzelnen Aminos?urepositionen unterscheiden. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Antigen-bindende Polypeptide mit CDR-Sequenzen, die sich von den in SEQ ID NO: 18-68 dargestellten CDR-Sequenzen in h?chstens einer Aminos?ure pro CDR unterscheiden.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform umfasst das erfindungsgem??e Antigen-bindende Polypeptid eine vollst?ndige VHH-Dom?ne eines Kamlid-Schwereketten-Antik?rpers. Eine solche VHH-Dom?ne ist bei alleiniger Verwendung in der Lage, an das entsprechende Antigen zu binden und wird vorliegend daher auch als ?VHH-Einzeldom?nen-Antik?rper? bezeichnet. Die VHH-Dom?ne umfasst neben den drei f?r die Antigenbindung verantwortlichen CDR-Regionen auch die vier Ger?stregionen FR1?FR4, die zwischen den CDR-Regionen angeordnet sind. Die Ger?stregionen k?nnen in der erfindungsgem??en VHH-Dom?ne vollst?ndig erhalten sein, oder sie k?nnen in Form von Fragmenten der urspr?nglichen Ger?stsequenzen vorliegen. So k?nnen z. B. die Ger?stsequenzen, welche die VHH-Dom?ne C-terminal und N-terminal begrenzen, um eine oder mehrere Aminos?uren verk?rzt vorliegen. Solche modifizierten VHH-Dom?nen sind ausdr?cklich von der Erfindung umfasst. Wie vorliegend verwendet bezeichnet ?VHH-Einzeldom?nen-Antik?rper? ein Antigen-bindendes Polypeptid, dem im Vergleich zu einem vollst?ndigen Schwereketten-Antik?rper die konstanten Dom?nen CH2 oder CH3 fehlen.

Bevorzugte Antigen-bindende Polypeptide, die eine VHH-Dom?ne eines Kamlid-Schwereketten-Antik?rpers umfassen und spezifisch an ToxA von C. difficile binden, sind in SEQ ID NO: 1-8 dargestellt. Bevorzugte Antigen-bindende Polypeptide, die eine VHH-Dom?ne eines Kamlid-Schwereketten-Antik?rpers umfassen und spezifisch an ToxB von C. difficile binden, sind in SEQ ID NO: 9-17 dargestellt. Die Erfindung erstreckt sich dar?ber hinaus auch auf Varianten der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide, die zu den in den SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptiden homolog sind und ebenfalls die F?higkeit zur Bindung der des entsprechenden Toxins von C. difficile aufweisen. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff ?Variante? eine Aminos?uresequenz, die durch Deletion, Substitution oder Addition von Aminos?uren so modifiziert wurde, dass sie mindestens 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentit?t zu einer der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Sequenzen aufweist, wenn diese Sequenzen optimal angeordnet sind, z. B. mit den Programmen GAP oder BESTFIT unter Verwendung des default gap Verfahrens. Computerprogramme zur Bestimmung der Aminos?uresequenzidentit?t sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.

So k?nnen Varianten insbesondere in den Ger?stregionen (FR1?FR4) von den in SEQ ID NO: 1-17 dargestellten VHH-Regionen abweichen, ohne die Bindungsaffinit?t der Polypeptide nachteilig zu beeinflussen. Vorzugsweise unterscheiden sich die Varianten von den in den SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptiden lediglich durch den Austausch von wenigen Aminos?uren. Besonders bevorzugt ist es, dass sich Varianten der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide von diesen in weniger als 20, in weniger als 15, in weniger als 10, in weniger als 5, z. B. in 4, 3, 2 oder in 1 Aminos?ureposition(en), unterscheiden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung somit ein Antigen-bindendes Polypeptid, das eine Aminos?uresequenz umfasst, die ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • (a) den Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 1-8; und
  • (b) einer Aminos?uresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentit?t zu einer der Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 1-8 aufweist.

Die Erfindung betrifft ferner ein Antigen-bindendes Polypeptid, das eine Aminos?uresequenz umfasst, die ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • (a) den Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 9-17; und
  • (b) einer Aminos?uresequenz, die mindestens 80% oder mehr Sequenzidentit?t zu einer der Aminos?uresequenzen von SEQ ID NO: 9-17 aufweist.

Vorzugsweise sind die Substitutionen, durch die sich die Varianten von den in SEQ ID NO: 1-17 dargestellten VHH-Regionen unterscheiden, konservative Substitutionen, d. h. Substitutionen von einer oder mehreren Aminos?ure-Resten durch eine Aminos?ure mit ?hnlichen Polarit?t, die als funktionales ?quivalent agiert. Vorzugsweise ist der als Austausch dienende Aminos?ure-Rest aus der gleichen Gruppe von Aminos?uren ausgew?hlt wie der zu ersetzende Aminos?ure-Rest. Beispielsweise kann ein hydrophober Rest durch einen anderen hydrophoben Rest ersetzt werden oder ein polarer Rest mit einem anderen polaren Rest, der die gleiche Ladung hat. Funktional homologe Aminas?uren, welche f?r die konservative Substitution verwendet werden k?nnen, umfassen z. B. nicht-polare Aminos?uren wie z. B. Glycin, Valin, Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, und Tryptophan. Beispiele von ungeladenen polaren Aminos?uren umfassen Serin, Threonin, Glutamin, Asparagin, Tyrosin, und Cystein. Beispiele von geladenen polaren (sauren) Aminos?uren umfassen Histidin, Arginin und Lysin. Beispiele von geladenen polaren (basischen) Aminos?uren umfassen Asparagins?ure und Glutamins?ure.

Als Varianten der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Sequenzen gelten ferner auch solche Polypeptide, bei denen eine oder mehrere Aminos?uren in die Aminos?uresequenz eines der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide eingef?gt wurden. Solche Insertionen k?nnen prinzipiell an jeder Position der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide erfolgen, solange die resultierende Variante des Polypeptids ihre immunologische Aktivit?t (d. h. die F?higkeit zur Bindung und Hemmung von ToxA oder ToxB) beibeh?lt. Ferner gelten vorliegend auch solche Proteine als Varianten eines der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide, bei denen eine oder mehrere Aminos?uren innerhalb der Sequenz im Vergleich zum Referenzpolypeptid fehlen. Solche Deletionen k?nnen beliebige Aminos?ure-Positionen innerhalb der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Sequenzen betreffen. Es kann sich bei den Deletionen insbesondere um solche handeln, die zwei oder mehrere (z. B. 3, 4 oder 5) aufeinanderfolgende Aminos?uren aus einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 1-17 umfassen.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind immunologisch aktive Fragmente der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide (oder deren Varianten). Unter immunologisch aktiven Fragmenten werden vorliegend solche Sequenzen verstanden, die sich von den in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Aminos?uresequenzen oder von deren Varianten durch das Fehlen einer oder mehrerer Aminos?uren am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Proteins unterscheiden, und die weiterhin zur spezifischen Bindung von ToxA bzw. ToxB in der Lage sind. So k?nnen beispielsweise immunologisch aktive Fragmente der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz Fragmente sein, bei denen die ersten beiden N-terminalen und/oder C-terminalen Aminos?uren des in SEQ ID NO: 1 gezeigten Polypeptids fehlen. Der Fachmann wird problemlos in der Lage sein, die F?higkeit von Fragmenten zur Bindung an ToxA bzw. ToxB zu bestimmen, z. B. durch kompetitive Antik?rper-Assays.

Die in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide und deren Varianten oder Fragmente k?nnen ferner an einer oder mehreren Positionen der Aminos?uresequenz strukturell modifiziert werden, wie beispielsweise durch Einf?hren einer modifizierten Aminos?ure. Bei diesen modifizierten Aminos?uren kann es sich erfindungsgem?? um Aminos?uren handeln, die durch Biotinylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Acetylierung, Verzweigung und/oder Zyklisierung ver?ndert wurden.

Es ist bevorzugt, dass die Varianten oder Fragmente der erfindungsgem??en Antigen-bindenden Polypeptide mehr als 50% der urspr?nglichen Bindungsaffinit?t f?r ToxA bzw. ToxB von C. difficile beibehalten. Noch st?rker bevorzugt ist es, dass die Varianten oder Fragmente mehr als 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der urspr?nglichen Bindungsaffinit?t der erfindungsgem??en Antigen-bindenden Polypeptide, z. B. der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Polypeptide, beibehalten. Die Bindungsaffinit?t f?r ToxA bzw. ToxB von C. difficile kann mit Hilfe von in vitro-Assays routinem??ig gemessen werden.

Das Antigen-bindende Polypeptid wird vorzugsweise eine Gr??e aufweisen, die zu physikochemischen Eigenschaften f?hrt, welche f?r therapeutische und/oder diagnostische Applikationen besonders geeignet sind, z. B. eine gute L?slichkeit und Gewebepenetration, thermische Stabilit?t und ?hnlichen Eigenschaften. Vorzugsweise wird das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Gr??e von 80-250 Aminos?uren aufweisen, wobei eine Gr??e von 90-200, 90-180, 90-150, 100-140, 100-130, 100-120 besonders bevorzugt wird.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform f?hrt die Bindung des Antigen-bindenden Polypeptids an ToxA bzw. ToxB zur Hemmung oder Reduktion der Enzymaktivit?t des Toxins. Die Enzymaktivit?t, insbesondere die Glykosyltransferase-Aktivit?t wird z. B. auf ungef?hr 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% oder weniger der Aktivit?t des ungebundenen Enzyms reduziert. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform wird die Enzymaktivit?t der gebundenen Dom?ne und/oder des gesamten Toxins durch Bindung des erfindungsgem??en Polypeptids vollst?ndig neutralisiert.

VHH-Einzeldom?nen-Antik?rper zeichnen sich gegen?ber herk?mmlichen Antik?rpern von S?ugetieren insbesondere dadurch aus, dass lediglich drei CDRs f?r die Bindung des Antigens erforderlich sind. Die Erfindung betrifft daher auch solche Antigen-bindenden Polypeptide, die lediglich die zur Bindung des Toxins erforderlichen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 eines der in SEQ ID NO: 1-17 exemplarisch dargestellten Polypeptide umfassen, wobei die zwischen den CDR-Regionen lokalisierten Regionen nur geringf?gige oder sogar im Wesentlichen keine ?hnlichkeit zu den entsprechenden Regionen eines der in SEQ ID NO: 1-17 dargestellten Polypeptide zeigen. Die jeweiligen Sequenzen der CDR-Regionen der in SEQ ID NO: 1-17 gezeigten Einzeldom?nenantik?rper sind in 2 und in SEQ ID NO: 18-68 gezeigt.

Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Nukleins?uremolek?l bereit, das f?r ein wie oben definiertes Antigenbindendes Polypeptid kodiert. Bei dem Nukleins?uremolek?l kann es sich um DNA oder RNA handeln. Vorzugsweise handelt es sich um einzelstr?ngige oder doppelstr?ngige DNA, wie beispielsweise genomische DNA oder cDNA. Vorzugsweise kodiert das Polynukleotid f?r ein Polypeptid, welches eine der in SEQ ID NO: 1?17 gezeigten Aminos?uresequenzen umfasst.

Die Erfindung umfasst ferner einen Expressionsvektor, der ein Nukleins?uremolek?l umfasst, welches f?r ein Antigen-bindendes Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert. Expressionsvektoren sind ?blicherweise DNA-Konstrukte, die ?ber einen Replikationsursprung verf?gen, der es dem Vektor erm?glicht, sich unabh?ngig von der Wirtszelle zu replizieren. Expressionsvektoren umfassen dar?ber hinaus regulatorische Kontrollelemente, die in funktioneller Verkn?pfung mit den zu exprimierenden Nukleotidsequenzen stehen und deren Transkription und/oder Translation steuern. Geeignete Kontrollelemente k?nnen prokaryontische Promotoren (konstitutiv oder regulierbar, wie z. B. lac-, trp-, T3-, T7- oder gpt-Promotor), eukaryontische Promotoren (konstitutiv oder regulierbar, wie z. B. Thymidinkinase-Promotor, SV40-Promotor oder CMV-Promotor), Operatoren, Transkriptions- bzw. Translationsenhancer, Transkriptions- bzw. Translationsterminatoren, Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Selektionsmarker, Silencer und Repressorsequenzen umfassen. Dem Fachmann sind zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Expressionsvektoren bekannt, die sich f?r die Ausf?hrung der vorliegenden Erfindung eignen. Beispiele sind die prokaryontischen Vektoren pHEN2, pGEM, pBluescript und pUC, die regelm??ig f?r die heterologe Expression in E. coli verwendet werden. Beispiele f?r eukaryontische Expressionsvektoren umfassen pcDNA3.1, pOG44, pSV2CAT Rc/CMV, Rc/RSV, GEM1 und ?hnliche.

Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die ein Nukleins?uremolek?l umfasst, welches f?r ein Antigen-bindendes Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, oder einen Expressionsvektor, der ein solches Nukleins?uremolek?l umfasst. Es kann sich insbesondere um eine prokaryontische oder eine eukaryontische Wirtszelle handeln. Beispiele von Wirtszellen, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden k?nnen, umfassen prokaryontische Wirtszellen, wie beispielsweise bakterielle St?mme von Escherichia coli, Bacillus subtilis und ?hnlichem. Geeignete eukaryontische Zellen umfassen Hefezellen, Insektenzellen, S?ugetierzellen, Pflanzenzellen und ?hnliches. Das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in bakteriellen Zellen exprimiert, z. B. in E. coli. Das Verfahren zur Transformation oder Transfektion der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Nukleins?uremolek?l umfasst, welches f?r das Antigen-bindende Polypeptid kodiert, wird von dem Typ des Expressionsvektors und der verwendeten Wirtszelle abh?ngen. Dem Fachmann wird es problemlos m?glich sein, geeignete Vektoren und Wirtszellen f?r die rekombinante Expression auszuw?hlen.

Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Antigen-bindenden Polypeptids bereit, bei dem man (a) eine wie oben beschriebene Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die die Expression eines Nukleins?uremolek?ls erlauben, welches f?r ein Antigen-bindendes Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert; und (b) das Antigenbindende Polypeptid aus der Kultur isoliert.

Die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung einer Erkrankung, die durch ToxA bzw. ToxB von C. difficile verursacht wird. Eine solche therapeutische Behandlung schlie?t sowohl die Behandlung eines akuten Krankheitszustands als auch die prophylaktische Behandlung zur Vermeidung einer Erkrankung ein.

Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung eignen sich ferner auch zur Diagnose einer Erkrankung, die durch ToxA bzw. ToxB von C. difficile verursacht wird. Erkrankungen die durch diese Toxine verursacht werden, umfassen Diarrh?e, insbesondere eine Antibiotika-assoziierte Diarrh?e (ADD), eine Kolitis, insbesondere eine pseudomembran?se Kolitis, eine Enterokolitis oder ein toxisches Megakolon. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform werden die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur therapeutischen Behandlung der pseudomembran?sen Kolitis eingesetzt. Die Behandlung umfasst die Verabreichung eines erfindungsgem??en Polypeptids an einen Patienten, bei dem eine Infektion mit einem ToxA- und/oder ToxB-exprimierenden Stamm von C. difficile nachgewiesen wurde, der in Verdacht steht, mit dem Erreger infiziert zu sein, oder der einem Risiko ausgesetzt ist, sich mit dem bakteriellen Erreger zu infizieren.

Die Erfindung stellt demgem?? auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Antigen-bindende Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen. Das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird dabei in einer therapeutisch wirksamen Menge an den Patienten verabreicht, d. h. in einer Menge, die ausreicht, um das Toxin, gegen das sich das Antigenbindende Polypeptid richtet, zu einem erheblichen Teil zu hemmen. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung erfolgt die Verabreichung des Antigen-bindenden Polypeptids in einer Menge, die zu einer im Wesentlichen vollst?ndigen Inaktivierung des Toxins f?hrt. Die Inaktivierung des Toxins kann anhand der Verbesserung eines oder mehrerer Symptome der Erkrankung verfolgt werden.

Die genaue Menge an Polypeptid, die verabreicht werden muss, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen, h?ngt von mehreren Parametern ab. Faktoren, die relevant f?r die Menge des zu verabreichenden Polypeptids sind, umfassen z. B. die Art der Verabreichung des Polypeptids, die Gr??e des jeweiligen Polypeptids, der Art und Schwere der Erkrankung, die Krankheitsgeschichte des zu behandelnden Patienten sowie Alter, Gewicht, Gr??e und Gesundheitszustand des zu behandelnden Patienten. Eine therapeutisch wirksame Menge des Antigen-bindenden Polypeptids kann von einem Fachmann ohne weiteres anhand des allgemeinen Fachwissens und der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden.

Das Polypeptid wird vorzugsweise in einer Menge an ein Subjekt verabreicht, die ausreicht, um eine Plasmakonzentration von etwa 0,05 ?g/ml bis etwa 150 ?g/ml zu erreichen, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 50 ?g/ml, st?rker bevorzugt von etwa 1 ?g/ml bis etwa 20 ?g/ml und normalerweise von etwa 1 ?g/ml bis etwa 10 ?g/ml, z. B. 5 ?g/ml. Die w?chentliche Dosis kann dabei von etwa 1 mg bis etwa 500 mg Polypeptid pro m2 K?rperoberfl?che des Patienten betragen. Die w?chentliche Dosis des Polypeptids kann von etwa 10?300 mg/m2 reichen, vorzugsweise von etwa 100?200 mg/m2, wie beispielsweise 150 mg/m2. Abh?ngig von der Gr??e des Polypeptids kann die zu verabreichende Menge des Polypeptids angepasst werden.

Das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann f?r verschiedene Arten der Verabreichung formuliert werden, z. B. f?r die orale Verabreichung als Tablette, Kapsel, Puder, Fl?ssigkeit oder ?hnliches. Es ist jedoch bevorzugt, dass das Antigen-bindende Polypeptid parental mittels intraven?ser Injektion oder intraven?ser Infusion verabreicht wird. Die Verabreichung kann beispielsweise mittels intraven?ser Infusion, z. B. innerhalb von 60 Minuten, innerhalb von 30 Minuten, oder innerhalb von 15 Minuten erfolgen. Zusammensetzungen, die f?r die Verabreichung mittels Injektion und/oder Infusion geeignet sind, umfassen in der Regel L?sungen und Dispersionen sowie Pulver, aus denen entsprechende L?sungen und Dispersionen hergestellt werden k?nnen. Derartige Zusammensetzungen werden das immunologisch aktive Polypeptid und mindestens einen geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Tr?ger enthalten. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Tr?ger f?r die intraven?se Verabreichung umfassen bakteriostatisches Wasser, Ringer-L?sung, physiologische Salzl?sung, Phosphat-gepufferte Salzl?sung (PBS) und Cremophor ELTM. Sterile Zusammensetzungen f?r die Injektion und/oder Infusion k?nnen hergestellt werden, indem das Polypeptid in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Tr?ger eingebracht und anschlie?end mittels eines Filters sterilfiltriert wird. Zusammensetzungen f?r die Verabreichung mittels Injektion oder Infusion sollten nach ihrer Herstellung unter Lagerungsbedingungen ?ber einen l?ngeren Zeitraum stabil bleiben. Die Zusammensetzungen k?nnen zu diesem Zweck ein Konservierungsmittel enthalten. Geeignete Konservierungsmittel umfassen Chlorbutanol, Phenol, Ascorbins?ure und Thiomersal.

In einer Ausf?hrungsform wird das Antigen-bindende Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit Tr?gern formuliert, die das Polypeptid vor einer zu schnellen Ausscheidung aus dem K?rper sch?tzen (Retardformulierungen). Solche Formulierungen k?nnen biokompatible Polymere, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycols?uren, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchs?uren enthalten. Verfahren zur Herstellung von Retardformulierungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Retardformulierungen k?nnen als semipermeable Filme aus festem, hydrophobem Polymer vorliegen, z. B. in Form von Mikrokapseln. Die Herstellung von entsprechenden Darreichungsformen sowie geeignete Hilfsstoffe sind beispielsweise in ?Remington: The Science and Practice of Pharmacy?, Lippincott Williams & Wilkins; 21. Auflage (2005) beschrieben.

Die erfindungsgem??en Polypeptide eignen sich ferner f?r den Nachweis von ToxA und/oder ToxB in biologischen Proben, insbesondere in Proben, die von einem Individuum erhalten wurden, bei dem das Vorliegen einer Infektion mit einem Stamm von C. difficile nachgewiesen werden soll, der ToxA und/oder ToxB produziert, wie z. B. Stuhlproben, Gewebeproben, usw. Es k?nnen allerdings auch andere Proben, wie z. B. Wasserproben auf eine Belastung mit Toxin untersucht werden.

Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Toxin A und/oder Toxin B von C. difficile in einer biologischen Probe, bei dem man

  • (a) ein wie oben beschriebenes und in den Anspr?chen definiertes Antigen-bindendes Polypeptid mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin erm?glichen; und
  • (b) Komplexe aus dem Polypeptid und dem Toxin nachweist.

Das Verfahren umfasst zun?chst einen Schritt, bei dem das erfindungsgem??e Antigen-bindende Polypeptid mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird. Dieser Schritt wird unter Bedingungen ausgef?hrt, die f?r die Bildung von Bindungskomplexen, die aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem nachzuweisenden Toxin bestehen, geeignet sind. Bedingungen, die die Bildung von Bindungskomplexen aus Antigen-bindenden Polypeptiden (insbesondere Antik?rpern) und Toxin erlauben, sind im Stand der Technik bekannt. Solche Bedingungen k?nnen eine Temperatur im Bereich von 4?37?C, einen pH-Wert im Bereich von 6?8 und eine Inkubationszeit im Bereich von mehreren Minuten bis zu mehreren Stunden einschlie?en. Dem Fachmann wird ersichtlich sein, dass geeignete Bindungsbedingungen f?r ein bestimmtes Paar aus Antigen-bindendem Polypeptid und Toxin von verschiedenen Faktoren abh?ngen, wie z. B. der Konzentration des Antigen-bindenden Polypeptids, der voraussichtlichen Konzentration des Toxins in der Probe und ?hnlichem. Der Fachmann wird in der Lage sein, geeignete Bedingungen f?r eine Bindung zwischen Polypeptid und Toxin anhand von Routineversuchen zu ermitteln, um die Bildung der Bindungskomplexe zu optimieren.

Nachdem man dem Antigen-bindenden Polypeptid ausreichend Gelegenheit gegeben hat, an das Toxin (ToxA oder ToxB) zu binden, werden die aus Toxin und dem spezifisch daran gebundenen Polypeptid bestehenden Immunkomplexe nachgewiesen. Dabei k?nnen im Stand der Technik ?bliche Verfahren eingesetzt werden. Das erfindungsgem??e Antigen-bindende Polypeptid kann beispielsweise vor dem Inkontaktbringen mit der Probe, von der vermutet wird, dass sie ToxA und/oder ToxB enth?lt, mit einer nachweisbaren Markierung versehen werden. Bei der Markierung kann es sich z. B. um eine floureszente, chemilumineszente oder radioaktive Markierung handeln. Eine Markierung mit Enzymen, wie z. B. mit Meerrettichperoxidase oder alkalischer Phosphatase, ist ebenfalls m?glich. Eine weitere Methode, die einen Nachweis der Komplexe erm?glicht, besteht in der rekombinanten Expression der Antigen-bindenden Polypeptide als Fusionsproteine, die ?ber ein oder mehrere Peptidepitope verf?gen, die sich mittels markierter Antik?rper sichtbar machen lassen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder zur Aufkonzentrierung von ToxA oder ToxB von C. difficile, bei dem man

  • (a) ein wie oben beschriebenes und in den Anspr?chen definiertes Antigen-bindendes Polypeptid mit der biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin erm?glichen; und
  • (b) die Komplexe aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin von der Probe abtrennt.

Die Aufreinigung und/oder Konzentrierung des Toxins wird vorzugsweise mit Antigen-bindenden Polypeptiden durchgef?hrt, die auf einem festen Tr?ger immobilisiert sind, wie z. B. auf einem Material, das f?r die Verwendung in chromatographischen Trennverfahren geeignet ist. Geeignete S?ulenmaterialien umfassen Sepharose (z. B. Q-Sepharose, DEAE-Sepharose, SP-Sepharose) und ?hnliches. Die Toxin-bindenden Polypeptide k?nnen dar?ber hinaus auf Beads immobilisiert werden, z. B. auf Agarose- oder Glas-Beads. Vorzugsweise sind die Beads magnetisierbar, wodurch die Trennung der Bindungskomplexe, die an den Beads nach Inkubation in Toxin-haltigen Proben anhaften, erleichtert wird. Verfahren zur Kopplung von Polypeptiden an einen festen Tr?ger sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Ein f?r die Kopplung geeignetes Verfahren kann beispielsweise eine Immobilisierung von Polypeptiden, die mit Biotin oder Derivaten von Biotin gekoppelt wurden, an ein Tr?germaterial, das zuvor mit Streptavidin oder Derivaten davon beschichtet wurde, vorsehen. Solche Verbindungen sind kommerziell von verschiedenen Anbietern erh?ltlich. Alternativ dazu kann das Protein mittels chemischer Reaktion direkt an den Tr?ger gebunden werden. Die Probe, in der das Toxin enthalten ist, wird durch die entsprechend vorbereitete S?ule geleitet, so dass das Toxin durch die immobilisierten Antigen-bindenden Polypeptide spezifisch adsorbiert wird. Durch Verwendung eines geeigneten Waschpuffers werden alle unspezifisch gebundenen Molek?le von der S?ule gewaschen, w?hrend das Toxin in der S?ule zur?ckgehalten wird. In einem abschlie?enden Schritt kann das Toxin mit einem geeigneten Elutionspuffer (z. B. einem Puffer mit hohem Salzgehalt) von der S?ule eluiert werden, um somit das gereinigte und/oder aufkonzentrierte Toxin zu erhalten. Alternativ kann das an die Matrix bzw. S?ule gebundene Toxin durch ein immunologisches Nachweisverfahren nachgewiesen werden.

In Ausf?hrungsformen, bei denen die Antigen-bindenden Polypeptide nicht an einen Tr?ger gekoppelt werden, kann die Trennung aus der Probe unter Verwendung von Fusionspolypeptiden erfolgen, die neben einem erfindungsgem??en Antigen-bindenden Polypeptid einen Affinit?tstag besitzen. Solche Fusionspolypeptide lassen sich mit Hilfe eines Materials, welches eine besonders hohe Affinit?t zu dem verwendeten Affinit?tstag besitzt, effizient aufreinigen. Beispielsweise kann der Affinit?tstag 6?12 Histidin-Reste aufweisen, die spezifisch mit einer chelatierenden Nickelionen-Matrix interagieren. Alternativ dazu kann der Affinit?tstag auch aus einer Glutathion-S-Transferase bestehen, die sich unter Verwendung einer Glutathion-Matrix aufreinigen l?sst. Im Stand der Technik sind zahlreiche weitere Affinit?tstags bekannt, die in Verbindung mit den erfindungsgem??en Antigen-bindenden Polypeptiden verwendet werden k?nnen. Beispiele f?r Paare aus Affinit?tstag und Affinit?tsligand umfassen Maltose-bindendes Protein (MBP) und Maltose; Avidin und Biotin; Streptag und Streptavin oder Neutravidin.

Affinit?tstags k?nnen z. B. mittels Ligation einer DNA, die f?r ein erfindungsgem??es Antigen-bindendes Polypeptid kodiert, mit einer f?r den Affinit?tstag kodierenden Sequenz hergestellt werden. In Fallen, bei denen der Affinit?tstag kein Peptid ist, kann der Affinit?tstag mittels chemischer Kopplungsreaktionen an das Antigen-bindende Polypeptid konjugiert werden. Beispielsweise kann das Antigen-bindende Polypeptid chemisch mit Biotin gekoppelt werden. Eine Markierung mit Biotin kann auch erreicht werden, indem man an dem Antigenbindenden Polypeptid ein Peptid anbringt, welches von einer Biotin-Protein-Ligase (EC 6.3.4.15) erkannt wird, wie z. B. von BirA aus E. coli (siehe beispielsweise Smith et al. (1998) Nucleic Acids Research 26:1414?1420; Recket et al. (1999) Protein Science 8:921?929). Geeignete Peptide sind beispielsweise die 13 Aminos?uren lange, minimale Biotinylierungssequenz des Biotin Carboxy Carrier Proteins (BCCP) (Beckett et al. (1999), Protein Sci., 8, 921?929), die 15 Aminos?uren lange Variante hiervon, die AviTagTM genannt wird (Tirat et al. (2006), Int. J. Biol. Macromol., 39(1?3):66?76), und die 76 Aminos?uren lange BioEaseTM Sequenz (Tirat et al. (2006), s. o.), die alle durch die Biotin-Protein-Ligase BirA an einem zentralen Lysinrest biotinyliert werden. Ebenfalls geeignet sind Strep-tags, wie Streptag II (SA-WSHPQFEK) und One-STrEP-tag (SA-WSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK) (IBA BioTAGnology, IBA GmbH, Germany).

Dar?ber hinaus k?nnen die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch mit Enzymen (wie z. B. alkalischer Phosphatase) oder mit Erkennungssequenzen f?r Enzyme (wie z. B. den obigen BirA Biotinylierungssequenzen) gekoppelt werden. Auch eine Kopplung von verschiedenen Antigen-bindenden Polypeptiden, wie z. B. VHHs, die sich gegen verschiedene Epitope desselben Zielantigens (ToxA oder ToxB) richten, ist m?glich, um auf diese Weise die Effizienz der Bindung an das Zielantigen zu verst?rken. Zu diesem Zweck k?nnen beispielsweise zwei oder mehr der oben beschriebenen VHH-Einzeldom?nenantik?rper ?ber eine BirA-Erkennungssequenz mit Biotin gekoppelt werden und anschlie?end ?ber die hochaffine Bindung von Biotin an Avidin oder Streptavidin, oder an modifiziertes Streptavidin, wie Neutravidin oder Strep-Tactin, gebunden werden. Avidin und Streptavidin sind tetramere Molek?le, die vier Molek?le von D-Biotin binden k?nnen. Derartig multimerisierte, tetravalente VHH-Einzeldom?nenantik?rper haben eine erh?hte Affinit?t f?r die Toxine. Zur Multimerisierung k?nnen mit Streptavidin?berzogene Beads, z. B. magnetische oder Sepharose-Beads, verwendet werden. Geeignete Beads sind z. B. Strep-Tactin Magnetic Nanobeads (IBA BioTAGnology, IBA GmbH, Germany). Dar?ber hinaus ist auch eine Kopplung von gegen ToxA oder ToxB gerichteten VHH-Dom?nen an VHH-Dom?nen, die gegen Albumin oder gegen einen Transzytose-Rezeptor gerichtet sind, n?tzlich. Die VHH-Einzeldom?nenantik?rper der vorliegenden Erfindung k?nnen selbstverst?ndlich auch an Immunglobuline gekoppelt werden, z. B. an die Fc-Region eines Immunglobulins.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, die durch ToxA und/oder ToxB von Clostridium difficile verursacht wird, bereitgestellt, bei dem man

  • (a) ein wie oben beschriebenes und in den Anspr?chen definiertes Antigen-bindendes Polypeptid mit der biologischen Probe eines Patienten unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Bildung von Komplexen aus dem Antigen-bindenden Polypeptid und dem Toxin erm?glichen; und
  • (b) Komplexe aus dem Polypeptid und dem Toxin nachweist; wobei der Nachweis der Komplexe in Schritt (b) darauf hinweist, dass der Patient an einer durch C. difficile vermittelten Erkrankung leidet.

Bei der Erkrankung kann es sich um eine Diarrh?e, insbesondere eine Antibiotika-assoziierte Diarrh?e (ADD), eine Kolitis, insbesondere eine pseudomembran?se Kolitis, eine Enterokolitis oder um ein toxisches Megakolon handeln. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform werden die Antigen-bindenden Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur therapeutischen Behandlung der pseudomembran?sen Kolitis eingesetzt.

In einer besonders bevorzugten Ausf?hrungsform ist die durch C. difficile verursachte Erkrankung pseudomembran?se Kolitis. Durch die Verwendung von, wie oben beschriebenen, magnetischen, mit Streptavidin-Biotin-VHH Komplexen ?berzogenen Beads ist eine besonders effektive Anreicherung von Toxinen aus biologischen Proben m?glich.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines wie oben beschriebenen und in den Anspr?chen definierten Antigenbindenden Polypeptids zur therapeutischen Behandlung oder zur Diagnose einer Erkrankung, die durch Clostridium difficile verursacht wird.

Schlie?lich stellt die vorliegende Erfindung auch ein Kit f?r den Nachweis von C. difficile bereit, wobei das Kit ein wie oben beschriebenes Antigen-bindendes Polypeptid umfasst. Das Kit kann dar?ber hinaus weitere Reagenzien und Mittel umfassen, die f?r den Nachweis erforderlich sind, z. B. Reagenzien f?r die Visualisierung einer Markierung.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1 zeigt die schematische Darstellung der Klonierungsstrategie f?r das VHH-Repertoire im Phagen-Display-Vektor pHEN2. L: Signalpeptid (Leader); VHH: variable Region des Schwereketten-Antik?rpers; h: Hinge-Region; CH2: konstante Region 2 des Schwereketten-Antik?rpers; CH3: konstante Region 3 des Schwereketten-Antik?rpers; amber stop: Stopcodon UAG; H6x: His-tag; g3p: Phagenprotein g3p.

2 zeigt die Aminos?uresequenzen der mittels ToxA-CP und ToxB-GT selektionierten VHHs. Die drei CDR Regionen sind hervorgehoben (CDR1: einfach unterstrichen, CDR2: doppelt unterstrichen, und CDR3: fett unterstrichen). Alle Unterstreichungen gelten auch f?r die Aminos?urepositionen in den anderen Sequenzen desselben Blocks. In Fettschrift markiert sind in den VHHs vorkommende Cystein-Reste.

3A zeigt die Spezifit?t der selektierten VHHs in einer ELISA-Analyse in bivalentem Format gegen die CP-Dom?ne von ToxA (ToxA-CPD), ToxA 1-809, ToxA-Holotoxin, ToxB 1-807, ToxB-Holotoxin, die katalytische Dom?ne des CDT (CDTa) und Milchpulver (MPBS). 3B zeigt die Spezifit?t der selektionierten VHHs in einer ELISA-Analyse in bivalentem Format gegen ToxB-GT, ToxB 1-807, ToxA 1-809, die katalytische Dom?n e des CDT (CDTa) und Milchpulver (MPBS). coVHH: Kontroll-VHH.

4A zeigt die Dosis-abh?ngige Bindung der selektionierten anti-ToxA VHHs in einer ELISA-Analyse im monovalenten Format gegen ToxA 1-809. 4B zeigt die Dosis-abh?ngige Bindung der selektionierten anti-ToxB VHHs in einer ELISA-Analyse im monovalenten Format gegen ToxB-GT. 4C zeigt die Dosisabh?ngige Bindung der selektionierten VHH S + 12 in einer ELISA-Analyse im monovalenten Format gegen ToxA 1-809 und ToxB 1-507. coVHH: Kontroll-VHH.

5 zeigt das Ergebnis der in vitro-Spaltungsanalyse. Die gegen Toxin A gerichteten VHHs L-10 und L-11 inhibieren dosisabh?ngig die Cysteinprotease-Aktivit?t, d. h. die autokatalytische Spaltung von ToxA.

BEISPIELEBeispiel 1: Induktion von ToxA- und ToxB-spezifischen Schwereketten-Antik?rpern durch Immunisierung

F?r die Induktion von Schwereketten-Antik?rpern, die gegen ToxA und ToxB gerichtet sind, wurden drei Lamas (die als Lamas Nr. 5, Nr. 5026 und 5037 bezeichnet wurden) mit Polypeptiden immunisiert, die von den Toxinen ToxA, ToxE und CDT von C. difficile abgeleitet sind. Lama Nr. 5 erhielt ein von ToxA abgeleitetes Polypeptid, Lama Nr. 5026 erhielt ein von ToxB abgeleitetes Polypeptid, und Lama Nr. 5037 erhielt jeweils ein von ToxA, ToxB und CDT abgeleitetes Polypeptid. F?r die Immunisierung mit ToxA wurde die Cysteinprotease-Dom?ne von ToxA (SEQ ID NO: 71 = Aminos?uren 547-779 von SEQ ID NO: 69, 25 kDa) und f?r die Immunisierung mit ToxB die Glykosyltransferase-Dom?ne von ToxB (SEQ ID NO: 72 = Aminos?uren 1-546 von SEQ ID NO: 70, 60 kDa) verwendet. F?r die Grundimmunisierung wurden jeweils 400 ?g der ToxA bzw. ToxB Fragmente bzw. 50 ?g der CDT Untereinheit CDTa verwendet.

Die Toxinfragmente wurden in 400 ?l PBS zu 500 ?l des Specol Adjuvans (Cedi Diagnostics, Lelystad, The Netherlands) gegeben und bei 4?C dreimal kurz mit Ultraschall behandelt. Die Injektionen erfolgten subkutan in den Hals der Lamas. Die Immunisierung der Lamas wurde durch mehrere aufeinander folgende Injektionen der Antigene verst?rkt. Den Lamas Nr. 5 und Nr. 5026 wurden weitere zwei Male, dem Lama Nr. 5037 weitere drei Male die betreffenden Antigene injiziert. Schlie?lich wurde Lamas Nr. 5 und 5026 elf Tage nach der 3. Injektion, dem Lama Nr. 5037 zehn Tage nach der 4. Injektion 20?100 ml Blut f?r die Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek abgenommen (vergleiche Beispiel 2).

Die erfolgreiche Induktion der humoralen Immunantwort wurde mittels eines Serum-Titer-ELISAs best?tigt. ?ber Nacht wurden die Vertiefungen einer ELISA-Platte bei 4?C mit 100 ng Antigen pro Vertiefung beschichtet und anschlie?end 2 h bei Raumtemperatur (RT) mit 5% Milchpulver in PBS blockiert. Als Antigene wurden die Fragmente verwendet, die bereits f?r die Immunisierung eingesetzt wurden. Die Seren wurde in einer Verd?nnung von 1:1000 in PBS verwendet. Zur Detektion der gebundenen Antik?rper wurde ein polyklonales Kaninchen-Anti-Lama-IgG-Serum verwendet (1:1000). Als sekund?rer Antik?rper wurde ein Schaf-Anti-Kaninchen-Peroxidase (PO) Konjugat (1:5000) verwendet. Die Detektion erfolgte mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) und wurde durch die Zugabe von 0.5 M Schwefels?ure gestoppt. Am ELISA-Reader wurde bei 450 nm der Substratumsatz quantifiziert. Verglichen wurden die Pr?immunseren mit den Immunseren der Lamas nach der dritten (Lamas Nr. 5, 5026) bzw. vierten Injektion (Lama Nr. 5037). Die Pr?immunseren zeigten keine Reaktivit?t gegen die getesteten Antigene. Das Immunserum des Lamas 5026 zeigte nach den Immunisierungen keine starke Reaktivit?t gegen ToxB. Das Lama, welches mit drei Antigenen immunisiert wurde, zeigte eine hohe Reaktivit?t f?r alle Toxinantigene.

Beispiel 2: Selektion und Sequenzanalyse von ToxA- und ToxB-spezifischen VHHs aus Phagen-Display-Bibliotheken der immunisierten Lamas

Zur Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek wurde aus den peripheren Blutlymphozyten der Lamas nach der 3. bzw. 4. Injektion zun?chst RNA isoliert und mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben. F?r die reverse Transkription wurden Random-Hexamere (RH6) verwendet, die an unterschiedlichen Positionen an die RNA binden. Aus dieser cDNA wurde die f?r die VHHs der Schwereketten-Antik?rper kodierende Region mittels PCR mit den spezifischen und teilweise degenerierten Oligonukleotiden SHFmu/SHRmu und LHFmu/LHRmu amplifiziert: (r, m, s und w bezeichnen Positionen mit variablen Nukleotiden: r = a oder g; m = a oder c; s = c oder g; w = a oder t.)

Die amplifizierten VHH-Fragmente wurden nach Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SfiI und NotI in den Phagemid-Vektor pHEN2 kloniert (1). Die Ligationsprodukte wurden in E. coli transformiert, so dass eine VHH-Fragment exprimierende Phagen-Bibliothek entstand.

Spezifische Einzeldom?nen-Antik?rper wurden aus den Phagen-Display Bibliotheken mittels Panning selektiert, wobei die Einzeldom?nen-Antik?rper ?ber ihre VHHs an die immobilisierten Antigene (ToxA, ToxB) banden, die zuvor in den Vertiefungen einer ELISA-Platte immobilisiert worden waren. F?r ein Biotin-Panning wurden die oben beschriebenen ToxA bzw. ToxB Fragmente mit dem EZ-Link-Sulfo-NHS-Biotinylation Kit Thermo Scientific (Fisher Scientific, Schwerte Germany) biotinyliert. Das Biotin ist in der Lage, an Streptavidin-Agarose zu binden. 20 ?l Streptavidin-Agarose wurden mit 2 ?g der biotinylierten Antigene inkubiert und im Anschluss mit 10 ?l der Phagenbibliothek inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Phagen kompetitiv mit 2 ?g des unkonjugierten Antigens eluiert, und der ?berstand wurde f?r eine Reinfektion von E. coli mit den Phagen verwendet. Die Bibliotheken wurden 2 bis 3 derartigen Selektionszyklen unterzogen. Nach jeder Runde wurden 12 Klone sequenziert, um den Erfolg der Selektion zu ?berpr?fen. Die Sequenz der final selektierten Klone ist in 2 aufgef?hrt.

DNA-Sequenz-Analysen aus den zuf?llig gew?hlten Klonen best?tigten die erfolgreiche Klonierung eines breiten VHH-Repertoires der Bibliotheken. Die Sequenzierungen zeigten ferner, dass die CDR3 der VHHs eine L?nge von 6-21 Aminos?uren aufweist. Alle Klone verf?gen ?ber das kanonische Cysteinpaar, das sich zwischen der FR1 und der FR3 ausbildet (siehe 2). Einige der sequenzierten Klone wiesen au?erdem ein zus?tzliches Cysteinpaar zwischen CDR2 und CDR3 auf.

Beispiel 3: Rekombinante Herstellung von VHH-Einzeldom?nen-Antik?rpern in E. coli

Die wie oben beschrieben identifizierten VHHs wurden rekombinant in E. coli produziert. L?sliche Einzeldom?nen-Antik?rger wurden durch Transformation des Vektorkonstrukts von Beispiel 2 in E. coli HB2151 (Genotyp: K12 D(lac-pro), ara, nalr, thi/F' [proAB, lacIq, lacZDM15]) erzeugt. Dieser Stamm ist in der Lage, das Stopcodon zwischen der f?r VHH kodierenden Sequenz und der f?r das g3-Kapsidprotein des M13-Phagen kodierenden Sequenz zu erkennen. Die transformierten Zellen von E. coli wurden in 100 ml 2 ? YT (BD Difco, Heidelberg, 16 g/l Trypton, 5 g/l NaCl, 10 g/l Hefeextrakt) mit 100 ?g/ml Carbenicillin bis zu einer optischen Dichte von 0.5 kultiviert. Die Proteinexpression wurde durch Isopropyl-?-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und nach drei Stunden durch Zentrifugation beendet. Mittels osmotischem Schock wurde die ?u?ere Zellwand aufgebrochen. Die VHHs wurden ?ber ihren Histidin-Tag durch Metallionen-Affinit?tschromatographie mit einer Ausbeute zwischen 0.5 mg/l bis 1 mg/l aufgereinigt. Die VHHs wurden anschlie?end gegen PBS dialysiert und nach Bestimmung der Proteinkonzentration bei 4?C gelagert. Der Erfolg der Produktion und Aufreinigung wurde mittels SDS-PAGE Analyse best?tigt.

Beispiel 4: Affinit?tsanalyse der selektierten VHHs

Die Bindung der in Beispiel 3 rekombinant hergestellten VHHs an ToxA und ToxB wurde mittels ELISA getestet (3). Einzeldom?nen-Antik?rper wurden dabei durch Peroxidasekonjugierte Antik?rper gegen ihren C-terminalen myc-Tag nachgewiesen. Als Antigene wurden 500 ng ToxA-CPD (die Cysteinprotease-Dom?ne von ToxA), ToxB-GT (die Glucosyltransferase-Dom?ne von ToxB), ToxA 1-809 (ein Fragment von Toxin A, das die Glucosyltransferase-Dom?ne und die Cysteinprotease-Dom?ne von ToxA umfasst), ToxB 1-807 (ein Fragment von Toxin B, das die Glucosyltransferase-Dom?ne und die Cysteinprotease-Dom?ne von ToxB umfasst), CDTa (der katalytischen Dom?ne von CDT) oder Milchpulver (MPBS) ?ber Nacht bei 4?C in den Vertiefungen einer Mikrotiter/ELISA-Platte immobilisiert. Nach Blockierung der freien Bindungsstellen mit 5% Milchpulver/PBS f?r 2 h bei Raumtemperatur wurden VHH-Anti-Myc-Antik?rper-Komplexe (vergleiche Beispiel 3) f?r 1 Stunde in den Vertiefungen inkubiert. Dazu wurden die VHHs (100 ng) zun?chst mit einem Maus-Anti-c-Myc Antik?rper (700 ng) f?r 10 min bei RT vorinkubiert, so dass VHH-Anti-Myc-Komplexe mit bivalenten Eigenschaften entstanden, und anschlie?end in die ELISA Platte gegeben. Als terti?rer Antik?rper wurde ein Schaf-Anti-Maus-Peroxidase-Konjugat (1:5000) verwendet. Die Detektion erfolgte mit 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) und wurde durch die Zugabe von 0.5 M Schwefels?ure gestoppt. Am ELISA-Reader wurde bei 450 nm der Substratumsatz quantifiziert. Als Kontrollen wurden Milchpulver (MPBS), CDTa und der CDTa-spezifische VHH-Einzeldom?nenantik?rper (1 + 8) verwendet. Die VHHs L-10a (#2150, SEQ ID NO: 1), L-11a (#2147, SEQ ID NO: 6), und L-14 (#2145, SEQ ID NO: 8) zeigten spezifische Reaktionen mit ToxA-CPD und mit ToxA 1-809 (3A). Die VHHs L-7.II (#2971, SEQ ID NO: 15), S + 12 (#2967, SEQ ID NO: 16), L-14 (#2966, SEQ ID NO: 17) und L-7c.I (#2954, SEQ ID NO: 11) zeigen eine spezifische Bindung an ToxB-GT und an ToxB 1-807 (3B). Die VHH 5 + 12 kreuzreagierte mit ToxA 1-809, nicht aber mit CDTa oder MBPS (3B).

Die konzentrationsabh?ngige Bindung der VHHs an ToxA 1?809 (300 ng/Napf) und an ToxB 1-546 (230 ng/Napf) wurde analog mit monovalenten VHHs getestet (4). Dazu wurde oben beschriebener ELISA durchgef?hrt, wobei die VHHs nicht mit Anti-Myc-Antik?rpern vorinkubiert wurden. Die VHHs (1 ?g bis 3 ng) wurden in 1:3,3 Verd?nnungsschritten f?r eine Stunde in den Vertiefungen der ELISA Platte inkubiert. Die N?pfe wurden 2 mal gewaschen. Zur Detektion der gebundenen VHHs wurde ein Maus-Anti-c-Myc Antik?rper verwendet (700 ng/Napf). Als terit?rer Antik?rper wurde ein Schaf-Anti-MausIgG-Peroxidase (PO)-Konjugat (1:5000) verwendet. Die Detektion erfolgte wie oben beschrieben. Die VHHs L-10a (#2150, SEQ ID NO: 1), L-11a (#2147, SEQ ID NO: 6), und L-14 (#2145, SEQ ID NO: 8) banden konzentrationsabh?ngig an ToxA 1-809 (4A). Die VHHs L-7.II (#2971, SEQ ID NO: 15), S + 12 (#2967, SEQ ID NO: 16), L-14 (#2966, SEQ ID NO: 17) und L-7c.I (#2954, SEQ ID NO: 11) banden konzentrationsabh?ngig an ToxB-GT (4B). Dar?ber hinaus banden die VHHs L-7.II und S + 12 konzentrationsabh?ngig auch an ToxA-1-800 (4C). Im bivalenten ELISA Testformat, wie in 3B gezeigt, reagierte S + 12 deutlich st?rker mit ToxA 1-809 als im monovalenten Testformat.

Beispiel 5: Hemmung der Cysteinprotease-Aktivit?t durch ToxA-spezifische VHHs

Die Immunisierung der Lamas wurde mit der Cysteinprotease-Dom?ne (CPD) von ToxA durchgef?hrt. Die CPD von ToxA wird durch Inositol-Hexakisphosphat (InsP6) aktiviert. InsP6 ist ausschlie?lich in Eukaryonten vorhanden, so dass ToxA erst bei Kontakt mit Eukaryonten gespalten wird. In der Anwesenheit von InsP6, das nur in der Wirtszelle vorkommt, wird eine autokatalytische Prozessierung des Toxins eingeleitet. Durch die CPD wird der enzymatisch aktive N-Terminus vom C-terminalen Teil abgespalten und ins Zytosol entlassen (Reineke et al. (2007), Nature, 446(7134):415?419).

Die Toxine ToxA 1-809 oder ToxB 1-807 (1 ?g) wurden mit den anti-ToxA-spezifischen VHHs (von 0,08 ?g bis 1,25 ?g) f?r 1 h bei RT vorinkubiert. Die autoproteolytische Prozessierung der Toxine wurde durch Zugabe von 100 ?M InsP6 induziert und der Ansatz in der Ab- bzw. Anwesenheit der VHHs f?r 1 h bei 37?C induziert. Die Proteaseaktivit?t wurde anschlie?end mittels SDS-PAGE visualisiert (5). Bei der Kontrolle ohne Zugabe von InsP6 (???) kam es zu keiner autokatalytischen Spaltung, bei Zugabe von InsP6 sind zwei Fragmente im Gel zu erkennen (?+?).

Die Anti-ToxA-VHHs L-10a und L-11a blockierten Dosis-abh?ngig die autokatalytische Spaltung von ToxA. Kontroll VHHs (coVHH) zeigten selbst in hoher Dosis keine Hemmung der autokatlytischen Spaltung von ToxA. Keine der anti-ToxA VHHs blockierte die autokatalytische Spaltung von ToxB.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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