Title:
Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
Kind Code:
B4
Abstract:

Verfahren zum spezifischen Detektieren einer Adenovirus-Targetnukleinsäure in einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Kontaktieren einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens eine Adenovirus-Nukleinsäure enthält, mit mindestens zwei Amplifikationsoligomeren zur Erzeugung eines Amplikons, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine Länge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie speziell mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus Nukleotiden 83 bis 175 der Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47),
(b) Bereitstellen von Bedingungen, die ausreichen, um ein Amplikon aus einer Adenovirus-Targetnukleinsäure, die in der Probe vorhanden ist, unter Verwendung der Amplifikationsoligomere aus Schritt (a) zu erzeugen, und
(c) Bereitstellen von Bedingungen zum Detektieren des Amplikons und zum Feststellen, ob eine Adenovirus-Targetnukleinsäure in der Probe vorhanden ist.



Inventors:
Ziegler, Emily L., Wis. (Milwaukee, US)
Townsend, Jessica A., Wis. (Milwaukee, US)
Application Number:
DE102011120550A
Publication Date:
06/06/2013
Filing Date:
12/05/2011
Assignee:
Gen-Probe Prodesse, Inc. (Wis., Waukesha, US)
International Classes:
Foreign References:
WO2005100611A22005-10-27
Other References:
DAMEN, M. [u.a.]: Real-time PCR with an internal control for detection of all known human adenovirus serotypes. J. Clin. Microbiol. (2008) 46 (12) 3997-4003
Datenbank GenBank, Eintragungsnummer AB330090.1 vom 14. Juni 2008
WASHINGTON, C. [u.a.]: Multiplexed Luminex xMAP assay for detection and identification of five adenovirus serotypes associated with epidemics of respiratory disease in adults. J. Clin. Microbiol. (Juni 2010) 48 (6) 2217-22 (elektronisch veröffentlicht 21.04.2010)
Attorney, Agent or Firm:
Patent- und Rechtsanwälte Kraus & Weisert, 80539, München, DE
Claims:
1. Verfahren zum spezifischen Detektieren einer Adenovirus-Targetnukleins?ure in einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Kontaktieren einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens eine Adenovirus-Nukleins?ure enth?lt, mit mindestens zwei Amplifikationsoligomeren zur Erzeugung eines Amplikons, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie speziell mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die ausgew?hlt werden aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus Nukleotiden 83 bis 175 der Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47),
(b) Bereitstellen von Bedingungen, die ausreichen, um ein Amplikon aus einer Adenovirus-Targetnukleins?ure, die in der Probe vorhanden ist, unter Verwendung der Amplifikationsoligomere aus Schritt (a) zu erzeugen, und
(c) Bereitstellen von Bedingungen zum Detektieren des Amplikons und zum Feststellen, ob eine Adenovirus-Targetnukleins?ure in der Probe vorhanden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 9, 11 bis 16, 25 bis 28, 31 bis 35, 38 und 42 bis 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1, 5, 11, 12, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspr?che, wobei mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 42, 43, 44, 45 oder 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspr?che, wobei ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer SEQ ID NR: 2 und/oder SEQ ID NR: 3 umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

6. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, wobei ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus SEQ ID NRn: 6 bis 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

7. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, in SEQ ID NR: 11 und/oder 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus SEQ ID NRn: 13 bis 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

8. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 31 bis 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

9. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

10. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, wobei mindestens zwei erste Amplifikationsoligomere jeweils eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder 26 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen und mindestens zwei zweite Amplifikationsoligomere jeweils eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei die Kombination von Amplifikationsoligomeren SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nr. 25, 26 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 oder SEQ ID Nrn. 26 und 28 ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspr?che, wobei der Detektionsschritt Kontaktieren des Amplifikationsprodukts mit mindestens einer Detektionssonde, die gestaltet ist, um mit einem Teil des Amplifikationsprodukts zu hybridisieren, umfasst.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Detektionssonde eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

14. Verfahren nach einem der Anspr?che 9 bis 13, wobei die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

15. Verfahren zum Detektieren einer Adenovirus-Nukleins?ure umfassend die Schritte:
(a) Kontaktieren einer Probe, die Nukleins?ure umfasst, mit mindestens einer Hybridisierungsassyssonde, die die Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.
(b) Bestimmen, ob sich eine Sonde:Target-Duplex unter stringenten Hybridisierungsbedingungen in der Probe gebildet hat,
wobei das Vorhandensein der Sonde:Target-Duplex ein Hinweis auf des Vorhandensein von Adenovirus-Nukleins?ure in der Probe ist.

16. Zusammensetzung zur Verwendung in einem Adenovirus-Targetnukleins?ure-Amplifikationsassay, der mindestens zwei Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, mit Adenovirus-Targetnukleins?ure stabil zu hybridisieren, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus zu hybridisieren, die aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 von Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47) ausgew?hlt sind.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht und wobei mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR. 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei die ersten und zweiten Amplifikationsoligomere aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nr. 25, 26 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 oder SEQ ID Nrn. 26 und 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlt werden.

19. Zusammensetzung nach einem der Anspr?che 16 bis 18, weiterhin umfassend eine Detektionssonde.

20. Zusammensetzung nach einem der Anspr?che 16 bis 19, wobei die Detektionssonde eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

21. Zusammensetzung nach einem der Anspr?che 17 bis 20, wobei die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht.

22. Kit, das die Zusammensetzung nach einem der Anspr?che 16 bis 21 und wahlweise Anweisungen zum Ausf?hren desselben umfasst.

Description:
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion von Infektionserregern, insbesondere die Detektion von Adenovirus. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits f?r die Detektion von Adenovirus unter Verwendung von Techniken zur In vitro-Amplifikation von Nukleins?uren werden beschrieben.

EINF?HRUNG

Adenovirus kann Infektionen in einer Reihe von verschiedenen Organen verursachen, einschlie?lich des Gastrointestinaltrakts, der oberen Atemwege und der Augen. Bei Personen mit einem gut funktionierenden Immunsystem sind Adenovirus-Infektionen in der Regel nicht mit lebensbedrohlicher Erkrankung verbunden. Allerdings kann Adenovirus zu schwerer Infektion bei immungeschw?chten Patienten f?hren ? wie beispielsweise bei HIV-positiven Personen und bei Patienten, die Knochenmarktransplantationen erhalten. Es wurden mehr als 50 verschiedene menschliche Adenovirus-Serotypen identifiziert. Auf der Grundlage verschiedener Eigenschaften von Adenovirus wurden sie in sechs wesentliche Untergruppen (Untergattungen oder Arten A?F) unterteilt, wobei die aktuellere Literatur in Richtung des Vorhandenseins eines siebten Serotyps deutet.

In fr?hen Ans?tzen zum Detektieren von Adenovirus st?tzte sich die Detektion im Wesentlichen auf serologische Tests und Zellkultur. Bei immunsupprimierten Patienten ist jedoch die Verwendung von serologischen Tests durch die gest?rte Immunreaktion begrenzt, und die Auswertung von positiven Kulturen ist ein verh?ltnism??ig langsames Verfahren. Die Einf?hrung von PCR-basierten Assays hat neue Methoden f?r die schnelle, spezifische und empfindliche Detektion von Adenovirus bereitgestellt. Viele dieser diagnostischen Ans?tze decken jedoch nicht wirksam alle Adenovirus-Serotypen ab oder verwenden Bedingungen niedriger Stringenz, um die Detektion der genetisch sehr unterschiedlichen Adenoviren zu erm?glichen.

Die Homologie von DNA-Sequenzen von Adenovirus zwischen verschiedenen Arten ist gering. Selbst konservierte Bereiche innerhalb des Adenovirus-Genoms zeigen nur eine begrenzte Homologie zwischen verschiedenen Arten von Adenoviren. In vielen F?llen bestehen erhebliche Unterschiede in der DNA-Sequenz sogar zwischen Serotypen, die derselben Art angeh?ren. Diese Fakten unterstreichen die Schwierigkeit, molekulare Tests zu entwickeln, die ein zuverl?ssiges Screening auf Adenovirus-Infektionen mit der erforderlichen breiten Spezifit?t erleichtern.

Ein Assay auf molekularer Basis ist erforderlich, um die empfindliche und spezifische Detektion von mehreren Serotypen zu erm?glichen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren, Zusammensetzungen und Kits bereitzustellen, die eingesetzt werden k?nnen, um gezielt mit hoher Empfindlichkeit Adenovirus-Nukleins?uren zu detektieren. Die Verfahren, Zusammensetzungen und Kits k?nnen vorteilhaft eingesetzt werden, um gezielt mit hoher Empfindlichkeit viele (z. B. 5 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 30 oder mehr, 40 oder mehr oder 50 oder mehr) oder alle bekannten Serotypen von Adenovirus zu detektieren.

In einem Aspekt wird ein Verfahren zum spezifischen Detektieren einer Adenovirus-Targetnukleins?ure in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens eine Adenovirus-Nukleins?ure enth?lt, mit mindestens zwei Amplifikationsoligomeren zur Erzeugung eines Amplikons, wobei jedes der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die ausgew?hlt sind aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 der Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47), (b) Bereitstellen von Bedingungen, die ausreichen, um ein Amplikon aus einer Adenovirus-Targetnukleins?ure, die in der Probe vorhanden ist, unter Verwendung der Amplifikationsoligomere aus Schritt (a) zu erzeugen, und (c) Bereitstellen von Bedingungen zum Detektieren des Amplikons und zum Feststellen, ob eine Adenovirus-Targetnukleins?ure in der Probe vorhanden ist.

In einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens eines der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 9, 11 bis 16, 25 bis 28, 31 bis 35, 38 und 42 bis 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1, 5, 11, 12, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 42, 43, 44, 45 oder 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst SEQ ID NR: 2 und/oder SEQ ID NR: 3, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 6 bis 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 und/oder 12 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 13 bis 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 31 bis 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder 26 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus, und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder 28 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfassen mindestens zwei erste Amplifikationsoligomere jeweils eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und 26 dargelegte Sequenz, bestehen daraus oder bestehen im Wesentlichen daraus, und mindestens zwei zweite Amplifikationsoligomere umfassen eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und 28 dargelegte Sequenz, bestehen daraus oder bestehen im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform ist die Kombination der Amplifikationsoligomere SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28 oder SEQ ID Nrn. 25 und 27 oder SEQ ID Nrn. 25 und 28 oder SEQ ID Nrn. 26 und 27 oder SEQ ID Nrn. 26 und 28.

In einer Ausf?hrungsform umfasst der Detektionsschritt Kontaktieren des Amplifikationsprodukts mit mindestens einer Detektionssonde, die gestaltet ist, um mit einem Teil des Amplifikationsprodukts zu hybridisieren.

In einer Ausf?hrungsform umfasst die Detektionssonde eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Detektieren einer Adenovirus-Nukleins?ure bereitgestellt, umfassend die Schritte: (a) Kontaktieren einer Testprobe, die Nukleins?ure enth?lt, mit mindestens einer Hybridisierungsassaysonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, und (b) ermitteln, ob sich eine Sonde:Target-Duplex unter stringenten Hybridisierungsbedingungen in der Probe gebildet hat, wobei das Vorhandensein der Sonde:Target-Duplex ein Hinweis auf das Vorhandensein von Adenovirus-Nukleins?ure in der Probe ist.

In einem weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Adenovirus-Targetnukleins?ure-Amplifikationsassay bereitgestellt, der mindestens zwei Amplifikationsoligomere umfasst, die in der Lage sind, mit Adenovirus-Targetnukleins?ure stabil zu hybridisieren, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotide aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils so gestaltet sind, dass sie spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, die aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 von Akzessionsnummer AB330090.1 (SEQ ID Nr. 47) ausgew?hlt werden.

Mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus und mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer umfasst eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform werden die ersten und zweiten Amplifikationsoligomere ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28; SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28; SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28; SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27; SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28; SEQ ID Nrn. 25 und 27; SEQ ID Nrn. 25 und 28; SEQ ID Nrn. 26 und 27 und SEQ ID Nrn. 26 und 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon.

In einer Ausf?hrungsform umfasst die Zusammensetzung ferner eine Detektionssonde.

In einer Ausf?hrungsform umfasst die Detektionssonde eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 10, 17 bis 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einer Ausf?hrungsform umfasst die Detektionssonde eine wie in SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

In einem weiteren Aspekt wird ein Kit bereitgestellt, umfassend die erfindungsgem??e Zusammensetzung und optionale Anweisungen zum Ausf?hren desselben.

In einem weiteren Aspekt wird eine isolierte DNA-Sequenz bereitgestellt, die im Wesentlichen der Sequenz, wie in einer der SEQ ID Nrn. 1 bis 46 dargelegten oder der entsprechenden isolierter RNA-Sequenz entspricht.

In einer Ausf?hrungsform ist die Sequenz das Komplement oder das reverse Komplement davon.

In einem weiteren Aspekt wird die Verwendung der isolierten DNA-Sequenz zum Amplifizieren und/oder zum Detektieren von Adenovirus-Nukleins?ure bereitgestellt.

AUSF?HRLICHE BESCHREIBUNG

Es werden Nukleins?ureoligomersequenzen offenbart, die als Primer und/oder Detektionssonden zur Amplifikation und/oder Detektion von Adenovirus-Nukleins?uren dienen k?nnen. Die Adenovirus-Nukleins?uren k?nnen in einer Probe detektiert werden, indem Verfahren der In-vitro-Nukleins?ure-Amplifikation eingesetzt werden, wie beispielsweise PCR (z. B. TaqMan-PCR) ? oder transkriptionsvermittelte Amplifikation ? wie beispielsweise TMA oder NASBA. Sonden f?r die Detektion der amplifizierten Nukleins?uresequenzen werden ebenfalls beschrieben. Detektionssonden hybridisieren spezifisch mit mindestens einem Teil der amplifizierten Sequenz, entweder nach Abschluss oder w?hrend des Amplifikationsprozesses. Einige Ausf?hrungsformen detektieren die Amplifikationsprodukte durch Verwendung eines homogenen Detektionsverfahrens, das in einer Mischung eine markierte Sonde detektiert, die spezifisch an eine amplifizierte Sequenz gebunden ist (z. B. siehe Arnold et al., 1989, Clin. Chem. 35: 1588?1594; US-Patent Nr. US 5 658 737 A, Nelson et al. und US-Patente Nrn. US 5 118 801 A und US 5 312 728 A, Lizardi et al.). Die Verfahren k?nnen Oligonukleotidsequenzen einsetzen, die als F?ngersonden zum Bearbeiten einer Probe dienen, um die Adenovirus-Targetnukleins?ure zu fangen und sie von anderen Bestandteilen der Probe abzutrennen (z. B. siehe US-Patente Nrn. US 6 110 678 A, US 6 280 952 B1 und US 6 534 273 B2).

Die hier offenbarten Verfahren k?nnen eingesetzt werden, um Adenovirus-Nukleins?uren in Proben, die von Tieren und Menschen stammen oder von diesen abgeleitet wurden, zu detektieren.

Die hier offenbarten Zusammensetzungen umfassen Amplifikationsoligomere, die eingesetzt werden k?nnen, um ausgew?hlte Nukleins?uresequenzen, die in genomischen Adenovirus-Sequenzen vorhanden sind, spezifisch zu amplifizieren, und wahlweise Nukleins?uresonden zum Detektieren der amplifizierten Sequenzen.

Die offenbarten Nukleins?uresequenzen und Verfahren sind zum Amplifizieren und Detektieren von Adenovirus-Nukleins?uren, die aus Viruspartikeln stammen oder davon abgeleitet wurden, die in einer Probe vorhanden sind, in einer relativ kurzen Zeit brauchbar, so dass die Diagnose schnell erstellt werden kann und so eine wirksame Behandlung eingeleitet und die Ausbreitung des Virus begrenzt werden kann. Die Verfahren sind f?r das Screening nach Personen, die Adenovirus-Infektionen haben, allerdings keine definitive Symptome zeigen, brauchbar und sind besonders f?r das Screening von Patienten, die ein erh?htes Risiko f?r Tod oder f?r schwere Komplikationen von Adenovirus-Infektionen haben, z. B. junge, ?ltere oder immungeschw?chte Personen, brauchbar. Die Verfahren sind auch f?r ein schnelles Screening einer gro?en Anzahl von Proben brauchbar. Die Verfahren sind brauchbar, weil sie das Risiko der Exposition von Laborpersonal gegen?ber infekti?sen Adenovirus-Agentien minimieren, wodurch der Gefahr einer Infektion und Ausbreitung des Virus Einhalt geboten wird. Somit gehen die hier offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen auf das Bed?rfnis nach einer schnellen, empfindlichen und spezifischen Pr?fung von klinischen Proben, die Adenovirus enthalten k?nnen, ein.

Die offenbarten Sondensequenzen k?nnen als Primer eingesetzt werden, und die offenbarten Primer k?nnen als Sonden eingesetzt werden. Das gleiche gilt f?r die offenbarten Sondendom?nen und Primerdom?nen. Somit k?nnen die hier offenbarten Sondendom?nen als Primerdom?nen eingesetzt werden. Ebenso k?nnen die hier offenbarten Primerdom?nen als Sondendom?nen eingesetzt werden.

Die hier offenbarten Amplifikationsoligomere sind weiter als Komponenten von Multiplex-Amplifikationsreaktionen denkbar, wobei mehrere Amplikonarten, die aus einer Mischung (z. B. zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, f?nf oder mehr, sechs oder mehr oder sogar zehn oder mehr) von targetspezifischen Primern hergestellt werden k?nnen. Zum Beispiel ist es denkbar, dass mehr als eines der hier offenbarten Amplifikationsysteme kombiniert werden k?nnen, um einen Multiplex-Assay zu ergeben, der sowohl robust als auch breit gef?chert in seiner F?higkeit zur Detektion des Targets ist ? wie beispielsweise die F?higkeit, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 30 oder mehr, 40 oder mehr oder 50 oder mehr oder alle bekannten Serotypen des Adenovirus zu detektieren.

Als Beitrag zu einem besseren Verst?ndnis der Aspekte der Offenbarung werden einige der hier verwendeten Begriffe n?her erl?utert. Alle anderen hier verwendeten wissenschaftlichen und technischen Begriffe haben die gleiche Bedeutung, wie sie von den Fachleuten auf dem betreffenden Gebiet verstanden und wie sie beispielsweise im Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. Auf. (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY), The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY), und darin zitierten Literaturstellen gegeben wird. Falls nicht anders angegeben sind die hier angewandten oder in Betracht gezogenen Techniken Standardverfahren, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohl bekannt sind.

Man beachte, dass der Begriff ?eine? Einheit sich auf eine oder mehrere dieser Einheit beziehet, zum Beispiel steht ?eine Nukleins?ure? f?r eine oder mehrere Nukleins?uren. Daher k?nnen die Begriffe ?ein?, ?ein oder mehrere? und ?mindestens ein? hier synonym eingesetzt werden.

Probe. Eine ?Probe? oder ein ?Pr?fk?rper?, darunter ?biologische? oder ?klinische? Proben, k?nnen Adenovirus oder Bestandteile davon enthalten oder im Verdacht stehen, diese zu enthalten, wie beispielsweise Nukleins?uren oder Fragmente von Nukleins?uren. Eine Probe kann eine komplexe Mischung von Bestandteilen sein. Proben umfassen ?biologische Proben?, die Gewebe oder Material, das von einem lebenden oder toten S?uger oder Organismus abgeleitet wurde, enthalten, einschlie?lich beispielsweise Blut, Plasma, Serum, Blutzellen, Speichel, Schleim und Liquor. Die Proben k?nnen auch Proben von In-vitro-Zellkulturbestandteilen enthalten, wie beispielsweise konditionierte Medien, die sich aus dem Wachstum von Zellen und Geweben in Kulturmedium ergeben. Die Probe kann behandelt werden, um physisch oder mechanisch Gewebe oder Zellstruktur zu spalten, um intrazellul?re Nukleins?uren in eine L?sung, die Enzyme, Puffer, Salze, Tenside und dergleichen enthalten kann, freizusetzen, um die Probe f?r die Analyse vorzubereiten. In einem Schritt der hier beschriebenen Verfahren ist eine Probe vorgesehen, von der vermutet wird, mindestens eine Adenovirus-Targetnukleins?ure zu enthaften. Dementsprechend vermeidet dieser Schritt den physischen Schritt des Gewinnens der Probe von einem Probanden.

Nukleins?ure. Dies bezeichnet eine multimere Verbindung, die zwei oder mehr kovalent gebundene Nukleoside oder Nukleosidanaloga umfasst, die stickstoffhaltige heterocyclische Basen oder Basenanaloga aufweisen, in der die Nukleoside mit Phosphodiesterbindungen oder anderen Verkn?pfungen verbunden sind, um ein Polynukleotid zu bilden. Zu Nukleins?uren z?hlen RNA, DNA oder chim?re DNA-RNA-Polymere oder Oligonukleotide und deren Analoga. Ein ?R?ckgrat? einer Nukleins?ure kann aus einer Vielzahl von Verkn?pfungen hergestellt werden, einschlie?lich einer oder mehrerer Zucker-Phosphodiester-Verkn?pfungen, Peptid-Nukleinsaure-Bindungen (in ?Peptid-Nukleins?uren? oder PNA, siehe PCT Nr. WO 95/32305 A1), Phosphorothioat-Verkn?pfungen, Methylphosphonat-Verkn?pfungen oder Kombinationen davon. Die Zuckerreste der Nukleins?ure k?nnen entweder Ribose oder Desoxyribose oder ?hnliche Verbindungen mit bekannten Substitutionen sein, z. B. 2'-Methoxy-Substitutionen und 2'-Halogen-Substitutionen (z. B. 2'-F). Die stickstoffhaltigen Basen k?nnen die herk?mmlichen Basen (A, G, C, T, U), Analoga davon (z. B. Inosin, 5-Methylisocytosin, Isoguanin, The Biochemistry of the Nucleic Acids 5?36, Adams et al., Hrsg., 11. Auflage, 1992, Abraham et al., 2007, BioTechniques 43: 617?24), die Derivate von Purin- oder Pyrimidin-Basen umfassen (z. B. N4-Methyldeoxyguanosin, Deaza- oder Aza-Purine, Deaza- oder Aza-Pyrimidine, Pyrimidin-Basen mit Substituentengruppen an der 5- oder 6-Position, Purin-Basen mit ver?nderten oder Ersatzsubstituenten an der 2, 6 und/oder 8-Position wie beispielsweise 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thiopyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4-Dimethylhydrazinpyrimidine und O4-Alkylpyrimidine und Pyrazol-Verbindungen, wie beispielsweise unsubstituiertes oder 3-substituiertes Pyrazol[3,4-d]pyrimidin, US-Patente Nrn. US 5 378 825 A, US 6 949 367 B1 und PCT Nr. WO 93/13121 A1). Nukleins?uren k?nnen ?abasische? Reste enthalten, bei denen das R?ckgrat keine stickstoffhaltige Base an einem oder mehreren Resten aufweist (US-Patent Nr. US 5 585 481 A). Eine Nukleins?ure kann nur herk?mmliche Zucker, Basen und Verkn?pfungen umfassen, wie sie in RNA und DNA vorkommen, oder kann herk?mmliche Bestandteile und Substitutionen (z. B. herk?mmliche Basen, die ?ber ein 2'-Methoxy-R?ckgrat verkn?pft sind, oder eine Nukleins?ure bestehend aus einer Mischung aus herk?mmlichen Basen zusammen mit einem oder mehreren Basenanaloga) enthalten. Nukleins?uren k?nnen ?verschlossene Nukleins?uren? (Locked Nucleic Acids, LNA) sein, bei denen ein oder mehrere Nukleotidmonomere eine bicyclische Furanose-Einheit in einer verschlossenen, RNA-imitierenden Zuckerkonformation aufweisen, die die Hybridisierungsaffinit?t gegen?ber komplement?ren Sequenzen in einzelstr?ngiger RNA (ssRNA), einzelstr?ngiger DNA (ssDNA) oder doppelstr?ngiger DNA (dsDNA) verbessern (Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42): 13233?41). Nukleins?uren k?nnen modifizierte Basen beinhalten, um die Funktion oder das Verhalten der Nukleins?ure zu ?ndern, beispielsweise die Addition eines 3'-terminalen Didesoxynukleotids, um zu verhindern, dass zus?tzliche Nukleotide an die Nukleins?ure addiert werden. Synthetische Verfahren zur Herstellung von Nukleins?uren in vitro sind im Stand der Technik wohl bekannt, wenngleich Nukleins?uren aus nat?rlichen Quellen unter Verwendung von Routinetechniken aufgereinigt werden k?nnen.

Polynukleotid. Der Begriff bezeichnet eine Nukleins?urekette. In dieser Anmeldung werden Nukleins?uren vom 5'-Ende hin zu dem 3'-Terminus bezeichnet. Normale Nukleins?uren, beispielsweise DNA und RNA, werden in der Regel ?3'-nach-5'? hergestellt, d. h. durch die Addition von Nukleotiden an das 5'-Ende einer wachsenden Nukleins?ure.

Nukleotid. Dies ist eine Untereinheit einer Nukleins?ure, bestehend aus einer Phosphatgruppe, einem 5-Kohlenstoff-Zucker und einer stickstoffhaltigen Base. Der in RNA vorkommende 5-Kohlenstoff-Zucker ist die Ribose. In DNA ist der 5-Kohlenstoff-Zucker die 2'-Desoxyribose. Der Begriff umfasst auch Analoga dieser Untereinheiten, wie beispielsweise eine Methoxygruppe an der 2'-Position der Ribose (2'-O-Me oder 2'-Methoxy). Wie hier verwendet enthalten Methoxy-Oligonukleotide mit ?T?-Resten eine Methoxygruppe an der 2'-Position der Ribose-Einheit und ein Uracil an der Position der Base des Nukleotids.

Nicht-Nukleotid-Einheit. Dies ist eine Einheit, die nicht wesentlich an der Hybridisierung eines Polymers beteiligt ist. Derartige Einheiten d?rfen zum Beispiel nicht in nennenswertem Ausma? an Wasserstoffbr?cken mit einem Nukleotid beteiligt sein und w?rde Einheiten ausschlie?en, die eine der f?nf Nukleotidbasen oder Analoga davon als Bestandteil aufweisen.

Targetnukleins?ure. Dies ist eine Nukleins?ure, die eine ?Targetsequenz? enth?lt, die amplifiziert werden soll. Targetnukleins?uren k?nnen DNA oder RNA sein und k?nnen entweder einzel- oder doppelstr?ngig sein. In einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung ist die Targetnukleins?ure DNA. Die Targetnukleins?uren k?nnen neben der Targetsequenz auch andere Sequenzen umfassen, die amplifiziert werden k?nnen. Typische Targetnukleins?uren stammen aus dem Adenovirus-Genom oder sind davon abgeleitet.

Targetsequenz. Dieser Begriff bezieht sich auf die konkrete Nukleotidsequenz der Targetnukleins?ure, die amplifiziert werden soll. Wenn die Targetnukleins?ure urspr?nglich einzelstr?ngig ist, bezieht sich der Begriff ?Targetsequenz? auch auf die komplement?re Sequenz der Targetsequenz, die in der Targetnukleins?ure vorhanden ist. Wenn die Targetnukleins?ure urspr?nglich doppelstr?ngig ist, bezieht sich der Begriff ?Targetsequenz? sowohl auf die Sense-(+) als auch die Antisense-(?)-Str?nge. Bei der Wahl einer Targetsequenz ist dem Fachmann offensichtlich, dass eine Sequenz derart gew?hlt werden sollte, um zwischen nicht verwandten oder eng verwandten Targetnukleins?uren zu unterscheiden. Die Begriffe ?zielt auf eine Sequenz ab? oder ?zielt auf eine Targetnukleins?ure ab?, wie hier in Bezug auf einen Nukleins?urebereich von Adenovirus verwendet, bezieht sich auf einen Prozess, wobei ein Oligonukleotid stabil mit der Targetsequenz in einer Weise hybridisiert, wodurch die Amplifikation und/oder die Detektion wie hier beschrieben erm?glicht wird. In einer Ausf?hrungsform ist das Oligonukleotid komplement?r zur abgezielten Adenovirus-Nukleins?uresequenz und enth?lt keine Fehlpaarungen. In einer weiteren Ausf?hrungsform ist das Oligonukleotid komplement?r, enth?lt jedoch 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder mehr Fehlpaarungen hinsichtlich der abgezielten Adenovirus-Nukleins?uresequenz. Vorzugsweise enth?lt das Oligonukleotid, das stabil mit der Adenovirus-Nukleins?uresequenz hybridisiert, mindestens 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 zusammenh?ngende Nukleotide, die komplement?r zu der Targetsequenz sind. Es ist selbstverst?ndlich, dass mindestens 10 und bis zu 50 ein inklusiver Bereich ist, so dass 10, 50 und jede ganze Zahl dazwischen, enthalten sind. Der Begriff ?gestaltet, um auf eine Sequenz abzuzielen? bedeutet hier, dass der hybridisierende Targetbereich eines Amplifikationsoligonukleotids gestaltet ist, eine Polynukleotidsequenz aufzuweisen, die auf eine Sequenz des bezuggenommenen Adenovirus-Bereichs abzielen k?nnte. Ein solches Amplifikationsoligonukleotid ist nicht auf das Abzielen auf diese Sequenz beschr?nkt, sondern eignet sich als eine Zusammensetzung, in einem Kit oder in einem Verfahren f?r das Abzielen auf eine Adenovirus-Targetnukleins?ure wie hier beschrieben. Der Begriff ?gestaltet um zu? bezeichnet eine tats?chliche Anordnung der Polynukleotidsequenzkonfiguration der das Target hybridisierenden Sequenz des Amplifikationsoligonukleotids.

Isoliert. Dies bedeutet, dass eine Nukleins?ure aus ihrer nat?rlichen Umgebung entfernt wird, die Bedeutung des Begriffs umfasst jedoch keine Aufreinigung irgendwelcher Art.

Fragment. Wie hier in Bezug auf die abgezielte Adenovirus-Nukleins?uresequenz eingesetzt bezieht sich dieser Begriff auf ein St?ck zusammenh?ngende Nukleins?ure. In bestimmten Ausf?hrungsformen umfasst das Fragment zusammenh?ngende Nukleotide aus der Adenovirus-Targetnukleins?ure, wobei die Anzahl der zusammenh?ngenden Nukleotide in dem Fragment geringer ist als diejenige des gesamten Adenovirus-Genoms oder eines Gens davon.

Bereich. Dieser Begriff bezieht sich auf einen Teil einer Nukleins?ure, wobei dieser Abschnitt kleiner als die gesamte Nukleins?ure ist. Wenn beispielsweise die besagte Nukleins?uresequenz ein Oligonukleotidpromotor-Provider ist, kann der Begriff ?Bereich? verwendet werden, um sich auf den kleineren Promotor-Abschnitt des gesamten Oligonukleotids zu beziehen. Ebenso und ebenfalls nur beispielhaft kann, wenn die Nukleins?ure eine Targetnukleins?ure ist, der Begriff ?Bereich? eingesetzt werden, um sich auf einen kleineren Bereich der Nukleins?ure zu beziehen.

Oligonukleotid. Dieser Begriff kann synonym mit ?Oligomer? und ?Oligo? eingesetzt werden und bezeichnet eine Nukleins?ure, die in der Regel weniger als 1.000 Nukleotid(nt)-Reste aufweist, einschlie?lich Polymere im Bereich von etwa 5 nt-Resten bis etwa 900 nt-Resten, von etwa 10 nt-Resten bis etwa 800 nt-Resten mit einer Untergrenze von etwa 12 bis 15 nt und einer Obergrenze von etwa 40 bis 600 nt, und andere Ausf?hrungsformen liegen in einem Bereich mit einer Untergrenze von etwa 15 bis 20 nt und einer Obergrenze von etwa 22 bis 100 nt. Es ist selbstverst?ndlich, dass diese Bereiche nur beispielhafter Natur sind, und dass ein Oligonukleotid jede ganze Zahl in dem Bereich enthalten kann. Oligonukleotide k?nnen aus nat?rlich vorkommenden Quellen aufgereinigt werden, k?nnen aber auch unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten enzymatischen oder chemischen Verfahren synthetisiert werden. Der Begriff Oligonukleotid bezieht keine bestimmte Funktion des Reagenzes ein, sondern er bezieht sich allgemein auf s?mtliche derartige Reagenzien, die hier beschrieben werden. Ein Oligonukleotid kann verschiedene Funktionen aus?ben. Zum Beispiel kann es als Primer dienen, wenn es spezifisch f?r einen komplement?ren Strang ist und in der Lage ist, mit diesem zu hybridisieren, und weiterhin in Gegenwart einer Nukleins?ure-Polymerase verl?ngert werden kann, es kann einen Promotor bereitstellen, wenn es eine Sequenz enth?lt, die von einer RNA-Polymerase erkannt wird und die Transkription (z. B. Bereitstellen von T7) erm?glicht, und es kann dazu dienen, die Hybridisierung zu verhindern oder die Primerextension zu behindern, wenn es entsprechend angeordnet und/oder modifiziert wird.

Wie hier eingesetzt bedeutet ein Oligonukleotid mit einer Nukleins?uresequenz, die eine aus einer Gruppe von konkreten Oligonukleotidsequenzen ausgew?hlte Sequenz ?umfasst? oder ?daraus besteht? oder ?im Wesentlichen daraus besteht?, dass das Oligonukleotid als grundlegende und neuartige Eigenschaft in der Lage ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stabil mit einer Nukleins?ure zu hybridisieren, die das genaue Komplement einer der aufgef?hrten Nukleins?uresequenzen der Gruppe aufweist. Ein genaues Komplement umfasst die entsprechende DNA- oder RNA-Sequenz.

Entspricht. Wie hier eingesetzt ?entspricht? eine Nukleins?ure einer konkreten Nukleins?ure, wenn die Nukleins?ure 100% identisch oder komplement?r zu der konkreten Nukleins?ure ist.

Im Wesentlichen entsprechend. Wie hier eingesetzt bedeutet eine Nukleins?ure ?entspricht im Wesentlichen? einer konkreten Nukleins?uresequenz, dass das betreffende Oligonukleotid der Referenznukleins?uresequenz ausreichend ?hnlich ist, so dass das Oligonukleotide ?hnliche Hybridisierungseigenschaften wie die Referenznukleins?uresequenz aufweist, so dass es unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der gleichen Targetnukleins?uresequenz hybridisieren w?rde. Im Wesentlichen entsprechende Nukleins?uren unterscheiden sich durch mindestens ein Nukleotid von der konkreten Nukleins?ure. Diese ?nderung kann in Bezug auf einen prozentualen Anteil Identit?t oder Komplementarit?t zwischen der Nukleins?ure und der konkreten Nukleins?ure angegeben werden. Somit entspricht eine Nukleins?ure im Wesentlichen einer Referenznukleins?uresequenz, falls diese prozentualen Anteile an Basenidentit?t oder -komplementarit?t von weniger als 100% bis etwa 80% betragen. In bevorzugten Ausf?hrungsformen betr?gt dieser prozentuale Anteil mindestens 85%. In besonders bevorzugten Ausf?hrungsformen betr?gt dieser prozentuale Anteil mindestens etwa 90%, in anderen bevorzugten Ausf?hrungsformen betr?gt dieser prozentuale Anteil mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%. F?r den Fachmann ist offensichtlich, dass die genannten Bereiche alle ganzen und rationalen Zahlen in dem Bereich umfassen (z. B. 92% oder 92,377%).

Helferoligonukleotid. Ein ?Helferoligonukleotid? oder ?Helfer? bezeichnet ein Oligonukleotid, das entworfen wurde, um eine Targetnukleins?ure zu binden, und dem Target eine andere Sekund?r- und/oder Terti?rstruktur aufzuerlegen, um die Geschwindigkeit und das Ausma? der Hybridisierung einer Detektionssonde oder eines anderen Oligonukleotids mit der abgezielten Nukleins?ure zu erh?hen, beispielsweise wie in US-Patent Nr. US 5 030 557 A beschrieben. Helfer k?nnen ebenfalls eingesetzt werden, um die Hybridisierung mit Targetnukleins?uresequenzen und die Funktion als Primer, Targetf?nger und andere Oligonukleotide zu unterst?tzen. Helferoligonukleotide k?nnen in den hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden und k?nnen einen Teil der hier beschriebenen Zusammensetzungen und Kits bilden.

Blockierungseinheit. Wie hier verwendet ist eine Blockierungseinheit eine Substanz, die eingesetzt wird, um das 3'-Ende eines Oligonukleotids oder einer anderen Nukleins?ure zu ?blockieren?, so dass es durch eine Nukleins?ure-Polymerase nicht mehr wirksam verl?ngert werden kann.

Amplifikationsoligomer. Ein ?Amplifikationsoligomer?, das auch als ein ?Amplifikationsoligonukleotid? bezeichnet werden kann, ist ein Oligomer, bei dem mindestens das 3'-Ende komplement?r zu einer Targetnukleins?ure (?mit dem Target hybridisierende Sequenz?) ist, und das mit einer Targetnukleins?ure oder seinem Komplement hybridisiert und sich an einer Nukleins?ureamplifikationsreaktion beteiligt. Ein Beispiel f?r ein Amplifikationsoligomer ist ein ?Primer?, der mit einer Targetnukleins?ure hybridisiert und ein 3'-OH-Ende enth?lt, das durch eine Polymerase in einem Amplifikationsprozess verl?ngert wird. Ein weiteres Beispiel f?r ein Amplifikationsoligomer ist ein ?Promotor-basiertes Amplifikationsoligomer?, das eine hybridisierende Targetsequenz und eine Promotorsequenz f?r die Transkriptionsinitiation durch eine entsprechende Polymerase umfasst. Promotor-basierte Amplifikationsoligomere k?nnen durch eine Polymerase gegebenenfalls in einer Primer-basierten Extension verl?ngert werden, je nachdem, ob das 3'-Ende der hybridisierenden Targetsequenz modifiziert wurde, um Primer-basierte Extension zu verhindern (z. B. ein 3'-blockiertes Ende) oder nicht. Ein Promotor-basiertes Amplifikationsoligonukleotid, das einen hybridisierenden Targetbereich umfasst, der nicht modifiziert wurde, um eine Primer-basierte Extension zu verhindern, wird als ?Promotor-Primer? bezeichnet. Ein Promotor-basiertes Amplifikationsoligonukleotid, das einen hybridisierenden Targetbereich umfasst, der modifiziert wurde, um eine Primer-basierte Extension zu verhindern, wird als ?Promotor-Provider? bezeichnet. Zu den Gr??enbereichen f?r Amplifikationsoligonukleotide geh?ren diejenigen, die hybridisierende Targetbereiche umfassen, die etwa 10 bis etwa 70 nt lang sind ? wie beispielsweise etwa 10 bis 60 nt lang, etwa 10 bis etwa 50 nt lang, etwa 10 bis etwa 40 nt lang, etwa 10 bis etwa 30 nt lang oder etwa 10 bis etwa 25 nt lang oder etwa 15 bis 25 nt lang. Zu bevorzugten Gr??en von Amplifikationsoligomeren geh?ren diejenigen, die hybridisierende Targetbereiche umfassen, die etwa 18, 19, 20, 21, 22 oder 23 nt lang sind. Ein Amplifikationsoligomer kann wahlweise modifizierte Nukleotide oder Analoga enthalten, die nicht komplement?r zu einer Targetnukleins?ure im strengen Sinne A:T/U, G:C sind. Solche modifizierten Nukleotide oder Analoga werden hier als Fehlpaarung mit ihren entsprechenden Targetsequenzen betrachtet.

Oligomere, die nicht f?r Primer-basierte Extension durch eine Nukleins?urepolymerase vorgesehen sind, k?nnen eine Blockierungsgruppe enthalten, die die 3'-OH-Gruppe ersetzt, um die enzymvermittelte Verl?ngerung des Oligomers in einer Amplifikationsreaktion zu verhindern. Zum Beispiel k?nnen blockierte Amplifikationsoligomere und/oder Detektionssonden, die w?hrend der Amplifikation vorhanden sind, keine funktionalen 3'-OH aufweisen und stattdessen eine oder mehrere Blockierungsgruppen an oder nahe dem 3'-Ende enthalten. In einigen Ausf?hrungsformen kann die Blockierungsgruppe in der N?he des 3'-Endes innerhalb von f?nf Resten des 3'-Endes sein und ist gro? genug, um die Bindung der Polymerase an das Oligomer einzuschr?nken. In anderen Ausf?hrungsformen ist eine Blockierungsgruppe kovalent an dem 3'-Ende angebracht. Viele verschiedene chemische Gruppen k?nnen eingesetzt werden, um das 3'-Ende zu blockieren, beispielsweise Alkylgruppen, Nicht-Nukleotid-Linker, Alkandioldidesoxynukleotid-Reste und Cordycepin.

Promotor. Dies bezeichnet eine konkrete Nukleins?uresequenz, die von einer DNA-abh?ngigen RNA-Polymerase (?Transkriptase?) als elf Signal erkannt wird, die Nukleins?ure zu binden und die Transkription von RNA an einer konkreten Stelle zu beginnen.

Promotor-Provider. Wie hier eingesetzt bezeichnet ein ?Promotor-Provider? oder ?Provider? ein Oligonukleotid bestehend aus ersten und zweiten Bereichen, und das modifiziert wurde, um die Einleitung der DNA-Synthese von seinem 3'-Terminus zu verhindern. Der ?erste Bereich? eines Promotor-Provider-Oligonukleotids umfasst eine Basensequenz, die mit einem DNA-Templat hybridisiert, wobei die hybridisierende Sequenz 3' liegt, aber nicht notwendigerweise angrenzend an einen Promotorbereich. Der mit dem Target hybridisierende Teil eines Promotoroligonukleotids weist typischerweise eine L?nge von mindestens 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 oder 45 Nukleotiden auf und kann bis zu 50 oder mehr Nukleotide lang sein. Der ?zweite Bereich? umfasst eine Promotorsequenz f?r eine RNA-Polymerase. Ein Promotor-Provider-Oligonukleotid ist so gestaltet, dass es nicht bef?higt ist, von einer RNA- oder DNA-abh?ngigen DNA-Polymerase (z. B. reverse Transkriptase) verl?ngert werden zu k?nnen, vorzugsweise durch das Vorhandensein einer Blockierungseinheit an seinem 3'-Ende, wie oben beschrieben. Diese Modifikation unterscheidet Promotor-Provider von Promotor-Primern. Vorzugsweise ist der Promotorteil eines Promotor-Primers oder Providers ein Promotor f?r eine DNA-abh?ngige RNA-Polymerase aus E. coli und Bakteriophagen T7, T3 und SP6, wenngleich andere Promotoren oder modifizierte Version davon auch eingesetzt werden k?nnen.

Abbruchsoligonukleotid. Wie hier verwendet ist ein ?Abbruchsoligonukleotid? oder ?Blockeroligonukleotid? eine Oligonukleotidsequenz, die eine Basensequenz enth?lt, die zu einem Bereich der Targetnukleins?ure in der N?he des 5'-Endes der Targetnukleins?ure komplement?r ist, um so die Primerextension einer naszierenden Nukleins?ure, die ein als Primer dienendes Oligonukleotid enth?lt, ?abzubrechen?, wodurch ein definiertes 3'-Ende des neu entstehenden Nukleins?urestranges erhalten wird.

Amplifikation. Dies bezieht sich auf alle bekannten Vorschriften zum Erzeugen von mehreren Kopien einer Targetnukleins?uresequenz oder von Fragmenten davon. Die mehrfachen Kopien k?nnen als Amplikone oder Amplifikationsprodukte bezeichnet werden. Die Amplifikation von ?Fragmenten? bezieht sich auf die Herstellung einer amplifizierten Nukleins?ure, die weniger als die komplette Targetnukleins?ure oder ihr Komplement enth?lt, z. B. hergestellt unter Verwendung eines Amplifikationsoligonukleotids, das mit einer internen Stelle der Targetnukleins?ure hybridisiert und von dort aus eine Polymerisation initiiert. Bekannte Amplifikationsverfahren umfassen sowohl thermische als auch isotherme Amplifikationsverfahren. F?r einige Ausf?hrungsformen sind isotherme Amplifikationsverfahren bevorzugt. Replikasevermittelte Amplifikation, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangverschiebungsamplifikation (SDA) und transkriptionsvermittelte oder transkriptionsassoziierte Amplifikation sind nicht einschr?nkende Beispiele f?r Nukleins?ureamplifikationsverfahren. Replikasevermittelte Amplifikation verwendet selbstreplizierende RNA-Molek?le und eine Replikase, wie beispielsweise QB-Replikase (z. B. US-Patent Nr. US 4 786 600 A). PCR-Amplifikation verwendet DNA-Polymerase, Primerpaare und Temperaturzyklen, um mehrere Kopien von zwei komplement?ren Str?nge von dsDNA oder von einer cDNA zu synthetisieren (z. B. US-Patente Nrn. US 4 683 195 A, US 4 683 202 A und US 4 800 159 A). LCR-Amplifikation verwendet vier oder mehr verschiedene Oligonukleotide, um ein Target und seinen komplement?ren Strang unter Verwendung mehrerer Zyklen der Hybridisierung, Ligation und Denaturierung zu amplifizieren (z. B. US-Patente Nrn. US 5 427 930 A und US 5 516 663 A). SDA verwendet einen Primer, der eine Erkennungsstelle f?r eine Restriktionsendonuklease enth?lt und eine Endonuklease, die einen Strang einer halbmodifizierten DNA-Duplex schneidet (?nicked?), der die Targetsequenz enth?lt, wobei Amplifikation in einer Reihe von Primerextensions- und Strangverschiebungsschritten erfolgt (z. B. US-Patente Nrn. US 5 422 252 A, US 5 547 861 A und US 5 648 211 A).

Transkriptionsassoziierte Amplifikation. Dieses Verfahren der Amplifikation, hier auch als ?transkriptionsvermittelte Amplifikation? (TMA) bezeichnet, bezeichnet eine Nukleins?ureamplifikation, bei der RNA-Polymerase eingesetzt wird, um mehrere RNA-Transkripte von einem Nukleins?uretemplat herzustellen. Diese Verfahren nutzen in der Regel eine RNA-Polymerase, eine DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate und ein templatkomplement?res Oligonukleotid, das eine Promotorsequenz enth?lt und wahlweise ein oder mehrere andere Oligonukleotide enthalten kann. TMA-Verfahren sind Ausf?hrungsformen von Amplifikationsverfahren, die zum Amplifizieren und Detektieren von Adenovirus-Targetsequenzen wie hier beschrieben eingesetzt werden. Variationen von transkriptionsassoziierter Amplifikation sind im Stand der Technik wohl bekannt, wie bereits im Detail offenbart wurde (z. B. US-Patente Nrn. US 4 868 105 A, US 5 124 246 A, US 5 130 238 A, US 5 399 491 A, US 5 437 990 A, US 5 554 516 A, und US 7 374 885 B2 und PCT Pub.-Nrn. WO 88/01302 A1, WO 88/10315 A1 und WO 95/03430 A1). Dem Fachrnann auf dem Gebiet ist offensichtlich, dass die offenbarten Zusammensetzungen, die in Amplifikationsverfahren, die auf Extension von Oligomersequenzen durch eine Polymerase basieren, eingesetzt werden k?nnen.

Echtzeitamplifikation. Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff ?Echtzeitamplifikation? die Amplifikation von Targetnukleins?ure, die mit Echtzeitdetektionsmitteln verfolgt wird.

Amplikon. Dieser Begriff, der synonym mit ?Amplifikationsprodukt? verwendet wird, bezieht sich auf das Nukleins?uremolek?l, das im Rahmen einer Amplifikationsvorschrift erzeugt wird, das komplement?r oder homolog zu einer Sequenz ist, die innerhalb der Targetsequenz enthalten ist. Diese Begriffe k?nnen in Bezug auf ein einzelstr?ngiges Amplifikationsprodukt, ein doppelstr?ngiges Amplifikationsprodukt oder einen der Str?nge eines doppelstr?ngigen Amplifikationsprodukts eingesetzt werden.

Sonde. Eine Sonde, auch als ?Detektionssonde? oder ?Detektionsoligonukleotid? bekannt, umfasst Begriffe, die sich auf ein Nukleins?ureoligomer beziehen, das spezifisch mit einer Targetsequenz in einer Nukleins?ure oder in einer amplifizierten Nukleins?ure hybridisiert und zwar unter Bedingungen, die die Hybridisierung f?rdern, um die Detektion der Targetsequenz oder der amplifizierten Nukleins?ure zu erm?glichen. Detektion kann entweder direkt erfolgen (z. B. eine Sonde, die direkt mit ihrer Targetsequenz hybridisiert ist) oder indirekt (z. B. eine Sonde, die mit ihrem Target ?ber eine molekulare Zwischenstruktur verkn?pft ist). Sonden k?nnen DNA, RNA, Analoga davon oder Kombinationen davon sein, und sie k?nnen markiert oder nicht markiert sein. Die ?Targetsequenz? einer Sonde bezeichnet in der Regel eine kleinere Nukleins?uresequenz in einer gr??eren Nukleins?uresequenz, die spezifisch mit zumindest einem Teil eines Sondenoligomers durch normale Basenpaarung hybridisiert. Eine Sonde kann zielspezifische Sequenzen und andere Sequenzen, die zur dreidimensionalen Konformation der Sonde beitragen, enthalten (z. B. US-Patente Nrn. US 5 118 801 A, US 5 312 728 A, US 6 849 412 B2, US 6 835 542 B2, US 6 534 274 B2 und US 6 361 945 B1 und US-Pub. Nr. US 2006/0068417 A1). In einer bevorzugten Ausf?hrungsform umfasst die Detektionssonde ein 2'-Methoxy-R?ckgrat, was bewirken kann, dass ein gr??eres Signal erhalten wird. In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform umfasst die Sonde ein Fluorophor, das kovalent am 5'-Ende der Sonde angebracht ist, sowie einen Quencher am 3'-Ende. Solche Sonden sind als TaqMan-Sonden bekannt.

Stabil. Mit ?stabil? oder ?stabil f?r die Detektion? ist gemeint, dass die Temperatur einer Reaktionsmischung mindestens 2 Grad C unterhalb der Schmelztemperatur einer Nukleins?ureduplex liegt.

Markierung. Wie hier verwendet bezeichnet eine ?Markierung? eine Einheit oder Verbindung, die direkt oder indirekt mit einer Sonde verbunden ist, die detektiert wird oder die zu einem detektierbaren Signal f?hrt. Direktes Markieren kann durch Bindungen oder Wechselwirkungen erfolgen, die die Markierung mit der Sonde verkn?pfen, einschlie?lich kovalenten Bindungen oder nicht-kovalenten Wechselwirkungen, beispielsweise Wasserstoffbr?cken, hydrophobe und ionische Wechselwirkungen oder die Bildung von Chelat- oder Koordinationskomplexen. Indirekte Markierung kann durch den Einsatz einer verbr?ckenden Einheit oder eines ?Linkers? erfolgen, wie beispielsweise eines Bindungspaarglieds, eines Antik?rpers oder eines zus?tzlichen Oligomers, das bzw. der entweder direkt oder indirekt markiert ist, und das bzw. der m?glicherweise das detektierbare Signal verst?rkt. Markierungen umfassen jede detektierbare Einheit, wie beispielsweise ein Radionuklid, einen Liganden (z. B. Biotin, Avidin), ein Enzym oder ein Enzymsubstrat, eine reaktive Gruppe oder ein Chromophor (z. B. einen Farbstoff, ein Teilchen, ein K?gelchen, der bzw. das detektierbare Farbe verleiht), eine lumineszierende Verbindung (z. B. biolumineszierende, phosphoreszierende oder chemilumineszierende Markierungen) oder ein Fluorophor. Markierungen k?nnen in einem homogenen Assay detektierbar sein, wobei eine gebundene markierte Sonde in einem Gemisch eine detektierbare Ver?nderung aufweist, die sich von der einer ungebundenen markierten Sonde unterscheidet, wie beispielsweise Instabilit?t oder differentielle Zersetzungseigenschaften. Eine ?homogen detektierbare Markierung? ist ohne physisches Entfernen von gebundenen von ungebundenen Formen der Markierung detektierbar (z. B. US-Patente Nrn. US 5 283 174 A, US 5 656 207 A und US 5 658 737 A). Markierungen umfassen chemilumineszierende Verbindungen, wie beispielsweise Acridiniumester(?AE?)-Verbindungen die normales AE und Derivate beinhalten (z. B. US-Patente Nrn. US 5 656 207 A, US 5 658 737 A und US 5 639 604 A). Die Synthese und Verfahren zum Anbringen der Markierungen an Nukleins?uren sind wohl bekannt (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10, US-Patente Nrn. US 5 658 737 A, US 5 656 207 A, US 5 547 842 A, US 5 283 174 A und US 4 581 333 A). Auf einer konkreten Sonde k?nnen mehr als eine Markierung und mehr als eine Art von Markierung vorhanden sein, wobei die Detektion eine Mischung von Sonden verwenden kann, in der jede Sonde mit einer Verbindung markiert ist, die ein anders detektierbares Signal erzeugt (z. B. US-Patente Nrn. US 6 180 340 B1 und US 6 350 579 B1).

Molekulare Fackeln. Wie hier verwendet sind Strukturen, die als ?molekulare Fackeln? bezeichnet werden, konzipiert, bestimmte Bereiche von Selbstkomplementarit?t aufzuweisen (?die Schlie?dom?ne?), die von einem Verbindungsbereich (?die das Target bindende Dom?ne?) verbunden werden und die unter vorgegebenen Hybridisierungsassaybedingungen miteinander hybridisieren. Alle oder ein Teil der Nukleotidsequenzen, die das Target schlie?ende Dom?nen umfassen, k?nnen auch als das Target bindende Dom?nen fungieren. Somit k?nnen die das Target schlie?enden Sequenzen das Target bindende Sequenzen, das Target nicht bindende Sequenzen und Kombinationen davon umfassen.

F?ngeroligonukleotid. Wie hier verwendet bezeichnet ein ?F?ngeroligonukleotid?, ?Targetf?nger-oligonukleotid? oder ?F?ngersonde? ein Nukleins?ureoligomer, das spezifisch mit einer Targetsequenz in einer Targetnukleins?ure durch normale Basenpaarung hybridisiert, und sich mit einem Bindungspartner auf einer immobilisierten Sonde verbindet, um die Targetnukleins?ure an einem Tr?ger zu fangen. Ein Beispiel f?r ein F?ngeroligomer umfasst ein Oligonukleotid mit zwei bindenden Bereichen: einem mit der das Target hybridisierenden Sequenz und einem mit dem die immobilisierte Sonde bindenden Bereich. In einer Variation dieses Beispiel k?nnen die beiden Bereiche auf zwei verschiedenen Oligomeren, die durch einen oder mehrere Linker verbunden sind, vorhanden sein. In einer weiteren Ausf?hrungsform eines F?ngeroligomers ist die das Target hybridisierende Sequenz eine Sequenz, die zuf?llige oder nicht zuf?llige Poly-GU, Poly-GT oder Poly U-Sequenzen enth?lt, um unspezifisch an eine Targetnukleins?ure zu binden und diese mit einer immobilisierten Sonde auf einem Tr?ger zu verkn?pfen. (PCT Pub.-Nr. WO 2008/016988 A1). Der die immobilisierte Sonde bindende Bereich kann eine Nukleins?uresequenz sein, die als Schwanz bezeichnet wird. Schw?nze umfassen einen im Wesentlichen homopolymeren Schwanz von etwa 10 bis 40 Nukleotiden (z. B. A10 bis A40) oder von etwa 14 bis 33 nt (z. B. T3A14 bis T3A30), der an eine komplement?re immobilisierte Sequenz bindet, die an dem Tr?gerteilchen oder an der Tr?germatrix angebracht ist. Somit kann ein nicht einschr?nkendes Beispiel von bevorzugten Nukleins?ureschw?nzen in einigen Ausf?hrungsformen T0-4A10-36-Sequenzen umfassen. Ein weiteres Beispiel f?r ein F?ngeroligomer enth?lt zwei Bereiche, eine mit dem Target hybridisierende Sequenz und ein Bindungspaarteil, das keine Nukleins?uresequenz ist.

Immobilisiertes Oligonukleotid. Wie hier verwendet bezeichnet ein ?immobilisiertes Oligonukleotid?, eine ?immobilisierte Sonde? oder eine ?immobilisierte Nukleins?ure? einen Nukleins?urebindungspartner, der ein F?ngeroligomer direkt oder indirekt mit einem Tr?ger verbindet. Eine immobilisierte Sonde, die mit einem Tr?ger verbunden ist, erleichtert die Trennung eines an die F?ngersonde gebundenen Targets von ungebundenem Material in einer Probe. Eine Ausf?hrungsform einer immobilisierten Sonde ist ein Oligomer, des mit einem Tr?ger verbunden, das die Trennung von gebundener Targetsequenz von ungebundenem Material in einer Probe erleichtert. Tr?ger k?nnen bekannte Materialien umfassen, wie beispielsweise Matrizen und Teilchen, die frei in L?sung sind, die aus Nitrocellulose, Nylon, Glas, Polyacrylat, Mischpolymerisaten, Polystyrol, Silan, Polypropylen, Metall oder anderen Zusammensetzungen hergestellt sein k?nnen, von denen eine Ausf?hrungsform magnetisch anziehbare Teilchen umfasst. Tr?ger k?nnen monodisperse magnetische Kugeln sein (z. B. einheitliche Gr??e von ?5%), mit denen eine immobilisierte Sonde direkt (?ber kovalente Verkn?pfung, Chelatisierung oder ionische Wechselwirkung) oder indirekt (?ber einen oder mehrere Linker) verbunden ist, wobei die Verkn?pfung oder Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Tr?ger unter den Hybridisierungsbedingungen stabil ist.

Komplement?r. Unter ?komplement?r? wird verstanden, dass die Nukleotidsequenzen von ?hnlichen Bereichen von zwei einzelstr?ngigen Nukleins?uren oder an unterschiedlichen Bereichen derselben einzelstr?ngigen Nukleins?ure eine Nukleotidbasenkomposition aufweisen, die es den einzelstr?ngigen Bereichen erm?glicht, unter stringenten Hybridisierungs- oder Amplifikationsbedingungen in einem stabilen, doppelstr?ngigen, ?ber Wasserstoffbr?cken gebundenen Bereich zu hybridisieren. Sequenzen, die miteinander hybridisieren, k?nnen gem?? normaler Nukleins?urebasenpaarung (z. B. G:C-, A:T- oder A:U-Paarung) vollst?ndig komplement?r oder teilweise komplement?r zu der Targetsequenz sein. Unter ?ausreichend komplement?r? wird eine zusammenh?ngende Sequenz verstanden, die in der Lage ist, mit einer anderen Sequenz ?ber Wasserstoffbr?cken zwischen einer Reihe von komplement?ren Basen zu hybridisieren, die an jeder Position in der Sequenz gem?? normaler Basenpaarung komplement?r sein k?nnen oder die einen oder mehrere Reste enthalten k?nnen, der bzw. die gem?? normaler A:T- und G:G-Paarung nicht komplement?r sind, oder die modifizierte Nukleotide, wie beispielsweise abasische Reste, modifizierte Nukleotide oder Nukleotidanaloga, sind. In der Regel sind ausreichend komplement?re zusammenh?ngende Sequenzen mindestens 80% oder mindestens 90% zu einer Sequenz komplement?r, mit der ein Oligomer spezifisch hybridisieren soll (ein in Prozent angegebener Komplementarit?tsbereich umfasst alle ganzen und rationalen Zahlen des Bereichs). Sequenzen, die ?ausreichend komplement?r? sind erm?glichen stabile Hybridisierung eines Nukleins?ureoligomers mit seiner Targetsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen, auch wenn die Sequenzen nicht vollst?ndig komplement?r sind. Wenn eine zusammenh?ngende Sequenz von Nukleotiden eines einzelstr?ngigen Bereichs in der Lage ist, eine Reihe von ?kanonischen? ?ber Wasserstoffbr?cken gebundene Basenpaare mit einer analogen Sequenz von Nukleotiden des anderen einzelstr?ngigen Bereichs zu bilden, so dass A mit U oder T gepaart ist oder C mit G gepaart ist, sind die Nukleotidsequenzen ?vollst?ndig? komplement?r.

Bevorzugt hybridisieren. Unter ?bevorzugt hybridisieren? wird verstanden, dass unter stringenten Hybridisierungsassaybedingungen ein Oligonukleotid mit seiner Targetsequenz oder Replikaten davon unter Bildung eines stabilen Oligonukleotid:Targetsequenz-Hybrids hybridisiert, w?hrend gleichzeitig die Bildung eines stabilen Oligonukleotid:Targetsequenz-Hybrids minimiert wird. Beispielsweise hybridisiert ein Sondenoligonukleotid bevorzugt mit einer Targetsequenz oder Replikat davon in einem ausreichend gr??eren Ausma? als mit einer Nicht-Targetsequenz, um einem Fachmann zu erm?glichen, die RNA-Replikate oder die komplement?re DNA (cDNA) der Targetsequenz, die w?hrend der Amplifikation gebildet werden, genau zu detektieren. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind im Stand der Technik f?r Sonden-, Amplifikations-, Targetf?nger-, Blockierungs- und andere Oligonukleotide wohl bekannt, k?nnen aufgrund der Sequenzkomposition vorhergesagt werden oder k?nnen durch routinem??ige Testverfahren bestimmt werden (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in ?? 1.90?1.91, 7.37?7.57, 9.47?9.51 und 11.47?11.57, insbesondere ?? 9.50?9.51, 11.12?11.13, 11.45?11.47 und 11.55?11.57).

Nukleins?urehybrid. Unter ?Nukleins?urehybrid? oder ?Hybrid? oder ?Duplex? wird eine Nukleins?ure verstanden, die einen doppelstr?ngigen, ?ber Wasserstoffbr?cken gebunden Bereich enth?lt, wobei jeder Strang zu dem anderen komplement?r ist, und wobei der Bereich unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stabil ist, um durch Mittel detektiert zu werden, einschlie?lich, aber nicht beschr?nkt auf, Detektion mit chemilumineszierendem oder fluoreszierendem Licht, Autoradiographie oder Gelelektrophorese. Solche Hybride k?nnen RNA:RNA-, RNA:DNA- oder DNA:DNA-Duplexmolek?le umfassen.

Probenvorbereitung. Dies bezieht sich auf Schritte oder Verfahren, in denen oder womit eine Probe f?r sp?tere Amplifikation und/oder Detektion von Adenovirus-Nukleins?uren, die in der Probe vorhanden sind, behandelt wird. Die Targetnukleins?ure kann eine Minderheitskomponente in der Probe sein. Die Probenvorbereitung kann jedes bekannte Verfahren zum Isolieren und Konzentrieren von Bestandteilen, wie beispielsweise Viren oder Nukleins?uren, unter Verwendung von normalen Verfahren der Molekularbiologie beinhalten.

Die Probenvorbereitung kann physisches Spalten und/oder chemische Lyse von zellul?ren Bestandteilen zur Freisetzung intrazellul?rer Bestandteile in eine im Wesentlichen w?ssrige oder organische Phase und Entfernung von Tr?mmermaterialien, wie beispielsweise unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation oder Adsorption beinhalten. Die Probenvorbereitung kann die Verwendung eines Nukleins?ureoligonukleotids, das selektiv oder unspezifisch eine Targetnukleins?ure f?ngt und sie von anderen Bestandteilen der Probe trennt, beinhalten (z. B. wie in US-Patent Nr. US 6 110 678 A und PCT Pub.-Nr. WO 2008/016988 A1 beschrieben).

Trennen, Reinigen. Diese Begriffe bedeuten, dass eine oder mehrere Bestandteile einer Probe von anderen Bestandteilen der Probe entfernt oder getrennt werden. Beispielbestandteile umfassen Targetnukleins?uren, normalerweise in einer in der Regel w?ssrigen Phase, und k?nnen auch Zellfragmente, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und andere Nukleins?uren beinhalten. Trennen oder Reinigen entfernt mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 95% der Targetnukleins?ure von anderen Bestandteilen der Probe. Bereiche der in Prozent angegebenen Reinheit enthalten alle ganzen und rationalen Zahlen des Bereichs.

DNA-abh?ngige DNA-Polymerase. Wie hier verwendet ist eine ?DNA-abh?ngige DNA-Polymerase? ein Enzym, das eine komplement?re DNA-Kopie von einem DNA-Templat synthetisiert. Beispiele daf?r sind DNA-Polymerase I aus E. coli, Bakteriophage T7 DNA-Polymerase oder DNA-Polymerase aus Bakteriophagen T4, Phi-29, M2 oder T5. DNA-abh?ngige DNA-Polymerasen k?nnen die nat?rlich vorkommenden Enzyme, die aus Bakterien oder Bakteriophagen isoliert werden, oder die rekombinant exprimiert werden, sein oder k?nnen modifizierte oder ?entwickelte? Formen sein, die gestaltet wurden, um bestimmte w?nschenswerte Eigenschaften aufzuweisen, wie beispielsweise Thermostabilit?t oder die F?higkeit, einen DNA-Strang aus verschiedenen modifizierten Templaten zu erkennen oder zu synthetisieren. Alle bekannten DNA-abh?ngigen DNA-Polymerasen erfordern einen komplement?ren Primer, um die Synthese einzuleiten. Es ist bekannt, dass unter geeigneten Bedingungen eine DNA-abh?ngige DNA-Polymerase eine komplement?re DNA-Kopie aus einem RNA-Templat synthetisieren kann. RNA-abh?ngige DNA-Polymerasen besitzen typischerweise auch DNA-abh?ngige DNA-Polymeraseaktivit?t.

DNA-abh?ngige RNA-Polymerase. Wie hier verwendet ist eine ?DNA-abh?ngige RNA-Polymerase? oder ?Transkriptase? ein Enzym, das mehrere RNA-Kopien von einem doppelstr?ngigen oder teilweise doppelstr?ngigen DNA-Molek?l mit einer Promotorsequenz, die in der Regel doppelstr?ngig ist, synthetisiert. Die RNA-Molek?le (?Transkripte?) werden in der 5'-nach-3'-Richtung beginnend an einer bestimmten Position, die dem Promotor nachgelagert ist, synthetisiert. Beispiele von Transkriptasen sind die DNA-abh?ngige RNA-Polymerase aus E. coli und Bakteriophagen T7, T3 und SP6.

RNA-abh?ngige DNA-Polymerase. Wie hier verwendet ist eine ?RNA-abh?ngige DNA-Polymerase? oder ?reverse Transkriptase? (?RT?) ein Enzym, das eine komplement?re DNA-Kopie von einem RNA-Templat synthetisiert. Alle bekannten reversen Transkriptasen haben auch die F?higkeit eine komplement?re eine DNA-Kopie von einem DNA-Templat zu machen, somit sind sie sowohl RNA- als auch DNA-abh?ngige DNA-Polymerasen. RT k?nnen auch eine RNAse H Aktivit?t besitzen. Zum Einleiten der Synthese ist sowohl f?r RNA- als auch DNA-Template ein Primer erforderlich.

Selektive RNAse. Wie hier verwendet ist eine ?selektive RNAse? ein Enzym, das den RNA-Bereich einer RNA:DNA-Duplex, aber nicht einer einzelstr?ngigen RNA, doppelstr?ngigen RNA oder DNA abbaut. Eine beispielhafte selektive RNAse ist RNAse H. Enzyme, die die gleiche oder ?hnliche Aktivit?t wie RNAse H besitzen, k?nnen ebenfalls eingesetzt werden. Selektive RNAsen k?nnen Endonukleasen oder Exonukleasen sein. Die meisten reverse-Transkriptase-Enzyme enthalten eine RNAse H-Aktivit?t zus?tzlich zu ihren Polymeraseaktivit?ten. Andere Quellen der RNAse H ohne verbundene Polymeraseaktivit?t stehen zur Verf?gung. Der Abbau kann zur Trennung von RNA aus einem RNA:DNA-Komplex f?hren. Alternativ kann eine selektive RNAse einfach die RNA an verschiedenen Stellen schneiden, so dass diese Teile der RNA wegschmelzen oder es Enzymen erm?glichen, Teile der RNA abzuwickeln. Andere Enzyme, die selektiv RNA-Targetsequenzen oder erfindungsgem??e RNA-Produkte abbauen, sind einem Fachmann ohne Weiteres offensichtlich.

Spezifit?t. Der Begriff ?Spezifit?t? im Rahmen eines Amplifikationssystems wird hier verwendet, um die Charakteristik eines Amplifikationssystems zu bezeichnen, die dessen F?higkeit, zwischen Target- und Nicht-Targetsequenzen abh?ngig von Sequenz und Assaybedingungen zu unterscheiden, beschreibt. In Bezug auf die Nukleins?ureamplifikation bezieht sich Spezifit?t auf das Verh?ltnis der Anzahl der konkreten Amplikone, die erzeugt wurden, zur Anzahl der Nebenprodukte (z. B. das Signal-Rausch-Verh?ltnis).

Empfindlichkeit. Der Begriff ?Empfindlichkeit? wird hier verwendet, um die Genauigkeit, mit der eine Nukleins?ureamplifikationsreaktion detektiert oder quantifiziert werden kann, zu bezeichnen. Die Empfindlichkeit einer Amplifikationsreaktion ist in der Regel ein Ma? f?r die kleinste Kopienanzahl der Targetnukleins?ure, die zuverl?ssig in dem Amplifikationssystem detektiert werden kann, und h?ngt beispielsweise davon ab, welcher Detektionsassay verwendet wird, sowie von der Spezifit?t der Amplifikationsreaktion, beispielsweise das Verh?ltnis der konkreten Amplikone zu Nebenprodukten.

Relative Fluoreszenzeinheit. Wie hier eingesetzt ist der Begriff ?relative Fluoreszenzeinheit? (?RFE?) eine willk?rliche Ma?einheit der Fluoreszenzintensit?t. RFE variiert mit den Eigenschaften des f?r die Messung verwendeten Detektionsmittels.

Oligonukleotide f?r die Amplifikation von Adenovirus

Oligonukleotide zum Amplifizieren eines Adenovirus-Targets umfassen typischerweise mindestens zwei Amplifikationsoligomere. Einige Ausf?hrungsformen der Erfindung nutzen m?glicherweise drei, vier, f?nf oder sechs oder zehn oder noch mehr Amplifikationsoligomere in beispielsweise Multiplex-Amplifikations-Assays. Somit k?nnen beispielsweise Oligonukleotide zur Amplifikation des Adenovirus-Targets einen, zwei, drei, vier oder f?nf oder mehr Vorw?rtsprimer f?r die Amplifikation umfassen und ein, zwei, drei, vier oder f?nf oder mehr R?ckw?rtsprimer f?r die Amplifikation umfassen. In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer weiteren Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer Ausf?hrungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jedes der mindestens Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus zu hybridisieren, der ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden von 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 und aus den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47, um ein Amplikon zu erzeugen, das anschlie?end detektiert werden kann. Zweckm??igerweise ist das Amplikon mit einer Detektionssonde detektierbar.

Zweckm??igerweise weist das Amplikon mindestens eine L?nge von 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70 oder 80 Nukleotiden auf.

In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer weiteren Ausf?hrungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jedes der mindestens Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, dass sie spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, der ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und aus den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47, um ein Amplikon zu erzeugen, das anschlie?end detektiert werden kann.

In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder von 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, dass es spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisiert, der den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht. In einer weiteren Ausf?hrungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jedes der mindestens Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, dass sie spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus hybridisieren, der ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder von 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und aus den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47, um ein Amplikon zu erzeugen, das anschlie?end detektiert werden kann.

Oligonukleotide zum Amplifizieren und/oder Detektieren des Adenovirus-Targets umfassen Oligonukleotidsequenzen ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 46. Wenngleich diese Sequenzen als DNA-Sequenzen dargestellt werden, umfassen die Sequenzen ihre entsprechenden RNA-Sequenzen und ihre komplement?ren (z. B. vollst?ndig komplement?ren) DNA- oder RNA-Sequenzen einschlie?lich des reversen Komplements davon.

Targetf?ngeroligomere k?nnen eine targetspezifische Sequenz, die spezifisch die Adenvirus-Targetnukleins?ure bindet, und eine kovalent verkn?pfte ?Schwanz?-Sequenz (z. B. T0-4A10-36), die verwendet wird, um den Hybridisierungskomplex, der die Targetnukleins?ure enth?lt, an einer immobilisierten Sequenz auf einem festen Tr?ger zu fangen, enthalten. F?ngeroligomere k?nnen mindestens eine 2'-Methoxy-Verkn?pfung enthalten. F?ngeroligomere k?nnen die targetspezifische Sequenz enthalten, die Adenovirus-Nukleins?ure bindet, die an einer anderen bindenden Einheit angebracht ist, beispielsweise eine biotinylierte Sequenz, die spezifisch an immobilisiertes Avidin oder Streptavidin bindet. Die Schwanzsequenz oder Bindungseinheit bindet an eine immobilisierte Sonde (z. B. komplement?re Sequenz oder Avidin), um das hybridisierte Target zu fangen und von anderen Bestandteilen der Probe durch Abtrennen des festen Tr?gers von dem Gemisch abzutrennen.

Primersequenzen, einschlie?lich Promotor-Primersequenzen, binden spezifisch an die Targetnukleins?ure oder an ihre komplement?re Sequenz oder k?nnen zus?tzliche Sequenzen enthalten, die nicht targetspezifisch sind, beispielsweise die Promotorsequenz in einem Promotor-Primer. Eine zielspezifische Sequenz mit oder ohne einer angebrachten Promotorsequenz kann als Amplifikationsoligomer in einer Vielzahl von In-vitro-Amplifikationsprozessen dienen. Ausf?hrungsbeispiele der Adenovirus-Assays k?nnen Amplifikationsverfahren einsetzen, die mehrere zyklische Reaktionstemperaturen erfordern, wie beispielsweise PCR (US-Patente Nrn. US 4 683 195 A, US 4 683 202 A und US 4 800 159 A), oder die im Wesentlichen isotherm sind, wie bei beispielsweise transkriptionsassoziierten Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise TMA oder NASBA (z. B. US-Patente Nrn. US 5 399 491 A, US 5 480 784 A, US 5 824 518 A, US 5 888 779 A, US 5 786 183 A, US 5 437 990 A, US 5 130 238 A, US 4 868 105 A, US 5 124 246 A und PCT Nrn. WO 88/01302 A1 und WO 88/10315 A1). Die Adenovirus-Assays k?nnen Amplifikationssysteme einsetzen, die w?hrend des Amplifikationsprozesses detektiert werden (z. B. Echtzeitdetektion), indem Sonden einbezogen werden, die unterscheidbare fluoreszierende Signale aussenden, wenn die Sonde an die vorgesehene Targetsequenz gebunden ist, die w?hrend des Amplifikationsprozesses hergestellt wurde. Zu den Sonden f?r Echtzeitdetektion z?hlen diejenigen, die als ?molekularer Beacon?- oder ?molekulare Schalter?-Sonden bezeichnet werden (z. B. US-Patente Nrn. US 5 118 801 A und US 5 312 728 A, Lizardi et al., US-Patente Nrn. US 5 925 517 A und US 6 150 097 A, Tyagi et al., Giesendorf et al., 1998, Clin. Chem. 44(3): 482?6) und ?molekulare Fackel?-Sonden (z. B. US-Patente Nrn. US 6 835 542 B2 und US 6 849 412 B2, Becker et al.). Im Allgemeinen umfassen derartige Sonden einen Reporterfarbstoff, der an einem Ende des Sondenoligomers angebracht ist (z. B. FAMTM, TETTM, JOETM, VICTM) und eine Quencher-Verbindung (z. B. TAMRATM, BHQ1 oder einen nicht-fluoreszierenden Quencher), die am anderen Ende des Sondenoligomers angebracht ist, wobei die Signalerzeugung davon abh?ngt, ob die beiden Enden mit ihren angebrachten Verbindungen in unmittelbarer N?he zueinander oder entfernt voneinander vorliegen.

Der Assay zum Detektieren von Adenovirus in einer Probe umfasst die Schritte des Amplifizierens eines Targetbereichs in der Adenvirus-Targetnukleins?ure, die in einer Probe enthalten ist, unter Verwendung von Amplifikationsoligomeren oder Primern, die spezifisch f?r den vorgesehenen Targetbereich sind, und Detektieren der amplifizierten Nukleins?ure, indem diese mit einer Sondensequenz hybridisiert. Bevorzugte Assays verwenden eine PCR- oder transkriptionsassoziierte Amplifikationsreaktion, wobei die Detektion am Ende der Amplifikationsreaktion erfolgt. Zur Detektion kann die amplifizierte Nukleins?ure markiert sein und an eine unmarkierte Sonde gebunden werden, bevorzugte Ausf?hrungsformen allerdings binden eine markierte Sonde an die amplifizierte Nukleins?ure. F?r Echtzeitdetektion kann eine markierte Sonde eingesetzt werden, die in einem homogenen System detektiert werden kann.

Ausf?hrungsformen von Amplifikationsoligomeren, die spezifisch f?r Adenovirus-Nukleins?ure sind, beinhalten die Amplifikationsoligomere, die eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1 bis 9, 11 bis 16, 25 bis 28, 31 bis 35, 38 und 42 bis 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen. Gem?? einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens ein Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 1, 5, 11, 12, 25, 26, 31, 32, 33, 34, 35 oder 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlten Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus. Gem?? einer Ausf?hrungsform umfasst mindestens ein zweites Amplifikationsoligomer eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRn: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 42, 43, 44, 45 oder 46 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz, besteht daraus oder besteht im Wesentlichen daraus.

Kombinationen von Amplifikationsoligomeren, die spezifisch f?r Adenovirus-Nukleins?ure sind, sind daher denkbar.

Gem?? einer Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 und/oder SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15 und SEQ ID NR: 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifkationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer Ausf?hrungsform werden mindestens zwei erste Amplifikationsoligomere, die eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen, in Kombination mit mindestens zwei zweiten Amplifikationsoligomeren, die eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfassen, daraus bestehen oder im Wesentlichen daraus bestehen, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplfikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 32 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 6 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 7 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 8 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 9 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 13 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 14 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 15 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ 10 NR: 35 oder SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon ausgew?hlte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Die Verfahren zum Detektieren von Adenovirus-Nukleins?ure enthalten wahlweise einen Detektionsschritt, in dem mindestens eine Sonde eingesetzt wird, die spezifisch an das amplifizierte Adenovirus-Produkt (RNA- oder DNA-Amplikon, vorzugsweise DNA-Amplikon) bindet. Vorzugsweise ist die Sonde markiert und erzeugt ein Signal, das in einem homogenen System detektiert wird, d. h. ohne Trennung von gebundener Sonde und nicht gebundener Sonde. Andere Beispiele von Sonden k?nnen mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert sein, die nur dann ein detektierbares Signal emittieren, wenn die Sonde an ihr Target gebunden ist, beispielsweise molekulare Schalter-, Beacon-, Taqman- oder Fackel-Sonden, wie weiterhin beschrieben wird.

Sonden umfassen Polynukleotide oder Polynukleotidanaloga und k?nnen wahlweise eine detektierbare Markierung tragen, die daran kovalent gebunden ist. Nukleoside oder Nukleosidanaloga der Sonde k?nnen stickstoffhaltige heterocyclische Basen oder Basenanaloga, in denen die Nukleoside beispielsweise durch Phosphodiesterbindungen unter Bildung eines Polynukleotids miteinander verkn?pft sind, umfassen. Dementsprechend kann eine Sonde herk?mmliche Ribonukleins?ure (RNA) und/oder Desoxyribonukleins?ure (DNA) umfassen, sie kann aber auch chemische Analoga dieser Molek?le umfassen. Das ?R?ckgrat? einer Sonde kann aus einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verkn?pfungen aufgebaut sein, einschlie?lich einer oder mehrere Zucker-Phosphodiesterverkn?pfungen, Peptid-Nukleins?ure-Bindungen (manchmal auch als ?Peptid-Nukleins?uren? bezeichnet, wie von Hyldig-Nielsen et al. beschrieben, PCT Internationale Pub. Nr. WO 95/32305 A1), Phosphorothioatverkn?pfungen, Methylphosphonatverkn?pfungen oder Kombinationen davon. Zuckerreste der Sonde k?nnen entweder Ribose oder Desoxyribose oder ?hnliche Verbindungen mit bekannten Substitutionen, wie beispielsweise 2'-O-Methylribose und 2'-Halogensubstitutionen (z. B. 2'-F) sein. Die stickstoffhaltigen Basen k?nnen herk?mmliche Basen (A, G, C, T, U), bekannte Analoga davon (z. B. Inosin oder ?I?, siehe The Biochemistry of the Nucleic Acids 5?36, Adams et al., Hrsg., 11. Auflage, 1992), bekannte Derivate von Purin- oder Pyrimidinbasen (z. B. N4-Methyldeoxyguanasin, Deaza- oder Azapurine und Deaza- oder Azapyrimidine, Pyrimidinbasen mit Substituentengruppen an der 5- oder 6-Position, Purinbasen mit einem ge?nderten oder Ersatzsubstituenten an den 2-, 6- oder 8-Positionen, 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thiopyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4-Dimethylhydrazinpyrimidine und O4-Alkylpyrimidine (siehe Cook, PCT Internationale Pub. Nr. WO 93/13121 A1) und ?abasische? Reste, an denen das R?ckgrat keine stickstoffhaltige Base an einem oder mehreren Resten des Polymers enth?lt (siehe Arnold et al., US-Patent Nr. US 5 585 481 A) sein. Eine Sonde kann nur herk?mmliche Zucker, Basen und Verkn?pfungen, die in RNA und DNA vorkommen, enthalten, oder kann sowohl herk?mmliche Bestandteile als auch Substitutionen (z. B. herk?mmliche Basen, die ?ber ein Methoxy-R?ckgrat verbunden sind, oder eine Nukleins?ure, herk?mmliche Basen und ein oder mehrere Basenanaloga enth?lt) enthalten. Wenngleich Oligonukleotidsonden unterschiedlicher L?ngen und Hasenkomposition zum Detektieren von Adenovirus-Nukleins?uren eingesetzt werden k?nnen, weisen bevorzugte erfindungsgem??e Sonden L?ngen von bis zu 100 Nukleotiden auf, und mehr bevorzugt weisen sie L?ngen bis zu 60 Nukleotiden auf. Bevorzugte L?ngenbereiche der erfindungsgem??en Oligonukleotide liegen im Bereich von L?ngen von 10 bis 100 Basen, mehr bevorzugt sind L?ngen zwischen 15 und 50 Basen, noch mehr bevorzugt sind L?ngen zwischen 15 und 40 Basen oder noch mehr bevorzugt sind L?ngen zwischen 15 und 30 Basen. Allerdings kann die konkrete Sondensequenz, die hier beschrieben wird, auch in einem Nukleins?ureklonierungsvektor oder -transkript oder einer anderen l?ngeren Nukleins?ure bereitgestellt werden und kann dennoch zum Detektieren von Adenovirus-Nukleins?uren eingesetzt werden.

In einer Ausf?hrungsform werden eine oder mehrere Detektionssonden gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 74 bis 139 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 56 bis 103 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 18 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 23 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 23 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 23 bis 83 der SEQ ID NR: 47 und/oder den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht, zu detektieren.

In einer weiteren Ausf?hrungsform werden eine oder mehrere Detektionssonden gestaltet, um auf eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 76 bis 99 und/oder den Nukleotiden 65 bis 87 und/oder den Nukleotiden 53 bis 76 und/oder den Nukleotiden 53 und/oder 74 oder Nukleotiden 53 und/oder 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71 entspricht, abzuzielen.

Sonden f?r die spezifische Detektion von Adenovirus-Sequenzen umfassen Oligomere ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon.

Wenngleich auch diese Sequenzen als DNA-Sequenzen gezeigt werden, umfassen die Sequenzen auch ihre entsprechenden RNA-Sequenzen und ihre komplement?ren (z. B. vollst?ndig komplement?ren) DNA- oder RNA-Sequenzen einschlie?lich der reversen Komplemente davon.

Assays f?r die Detektion von Adenovirus-Nukleins?ure k?nnen in den gleichen Reaktionsmischungen, die zur Amplifikation und Detektion der Adenovirus-Nukleins?ure eingesetzt werden, eine Nukleins?ure als interne Kontrolle (IC) enthalten, die durch Verwendung von IC-spezifischen Primern und Sonden amplifiziert und detektiert wird. Amplifikation und Detektion der IC-spezifischen Sequenz dient zum Nachweis, dass die Assay-Reagenzien und -Bedingungen in Ordnung waren, selbst wenn kein Adenovirus-spezifisches Signal f?r eine untersuchte Probe detektiert wird (d. h. negative Proben). Die IC kann als interner Kalibrator f?r den Assay, der ein quantitatives Ergebnis liefert, eingesetzt werden. Die IC kann eine randomisierte Sequenz sein, die aus einer nat?rlich vorkommenden Quelle, die nicht Adenovirus ist, gewonnen wird.

Kombinationen und Zusammensetzungen von Oligonukleotiden f?r die Amplifikation und die Detektion von Adenovirus

Es werden auch Kombinationen von Oligomeren und Sonden, die f?r die Amplifikation und die Detektion von Adenovirus eingesetzt werden k?nnen, offenbart.

Oligonukleotide zum Amplifizieren und Detektieren des Adenovirus-Targets umfassen in der Regel mindestens zwei Amplifikationsoligomere und mindestens eine Sonde. Einige erfindungsgem??e Ausf?hrungsformen k?nnen drei, vier, f?nf oder sechs oder mehr Amplifikationsoligomere und zwei, drei, vier, f?nf oder sechs oder mehr Sonden nutzen. Somit k?nnen beispielsweise Oligonukleotide zum Amplifizieren und Detektieren des Adenovirus-Targets einen, zwei oder drei oder mehr Vorw?rtsamplifikationsprimer zusammen mit einem, zwei oder drei oder mehr R?ckw?rtsamplifikationsprimern zusammen mit einem, zwei, drei, vier, f?nf oder selbst sechs oder mehr Sonden umfassen.

In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht, zu detektieren.

In einer weiteren Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht, zu detektieren.

In einer Ausf?hrungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 99 der SEQ ID Nr. 47 und den Nukleotiden 83 bis 175 der SEQ ID Nr. 47 zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR ist 47 entspricht, zu detektieren.

In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht ? wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.

In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht ? wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.

In einer weiteren Ausf?hrungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 99 und/oder 40 bis 87 und/oder 1 bis 23 und/oder 7 bis 23 und/oder 7 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht ? wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.

In einer Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht ? wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.

In einer weiteren Ausf?hrungsform ist mindestens eines der Amplifikationsoligomere gestaltet, um spezifisch mit einem Bereich innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus, die den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 entspricht, zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht ? wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.

In einer weiteren Ausf?hrungsform werden mindestens zwei Amplifikationsoligomere eingesetzt, wobei jeder der mindestens zwei Amplifikationsoligomere eine L?nge von 10 bis etwa 50 Nukleotiden aufweist, und wobei die Amplifikationsoligomere jeweils gestaltet sind, um spezifisch mit Bereichen innerhalb einer Targetsequenz von Adenovirus ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 52 bis 74 und/oder 76 bis 99 und/oder 40 bis 56 und/oder 65 bis 87 und/oder 1 bis 18 und/oder 7 bis 23 und/oder 28 bis 45 und/oder 27 bis 45 und/oder 26 bis 45 der SEQ ID Nr. 47 und den Nukleotiden 139 bis 155 und/oder 103 bis 123 und/oder 159 bis 175 und/oder 83 bis 99 und/oder 83 bis 98 der SEQ ID Nr. 47 zu hybridisieren, und eine Sonde ist gestaltet, um eine Sequenz in einem Bereich, der den Nukleotiden 52 bis 99 der SEQ ID NR: 47 entspricht ? wie beispielsweise den Nukleotiden 76 bis 99 oder den Nukleotiden 65 bis 87 oder den Nukleotiden 53 bis 76 oder den Nukleotiden 53 bis 74 oder den Nukleotiden 53 bis 72 oder den Nukleotiden 52 bis 71, zu detektieren.

Gem?? einer Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 und/oder SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 6 und/oder SEQ ID NR: 7 und/oder SEQ ID NR: 8 und/oder SEQ ID NR: 9 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 10, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 und/oder SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 13 und/oder SEQ ID NR: 14 und/oder SEQ ID NR: 15 und/oder SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 und/oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nrn. 29 und/oder 30, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird mindestens ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31 und/oder SEQ ID NR: 32 und/oder SEQ ID NR: 33 und/oder SEQ ID NR: 34 und/oder SEQ ID NR: 35 und/oder SEQ ID NR: 38 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 und/oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 1 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 10, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 29 und 30 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 29 und 30 oder einer Kombination davon, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 31 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifkationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 and 40 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 32 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 33 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ 10 NR: 15, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 2 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 3 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 6 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 7 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 8 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 9 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon, vorzugsweise SEQ ID Nr. 4, umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 13 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 14 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 15 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 17 bis 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die SEQ ID Nr. 29 oder 30 oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Gem?? einer weiteren Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 38 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, zusammen mit einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 29, 30, 36, 37, 39 und 40 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, vorzugsweise eine Sonde, die SEQ ID Nr. 29 oder 30 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

Bevorzugte Kombinationen und Zusammensetzungen f?r die Amplifikation und/oder Detektion von Adenovirus

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 5 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird eine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die die in SEQ ID Nr. 10 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 11 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird eine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die die in SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 20 dargelegte Sequenz oder eine Kombination umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15, SEQ ID NR: 16 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird irgendeine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die die in SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 20 dargelegte Sequenz oder eine Kombination umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 12 dargelegte Sequenz umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 15 oder SEQ ID NR: 16 dargelegte Sequenz oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird eine dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21 oder SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon (z. B. SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27) umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform kann irgendeine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23, SEQ ID Nr. 24, SEQ ID Nr. 29 und SEQ ID Nr. 30 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 31 und SEQ ID NR: 26 oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder einer Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform kann eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 24 oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34 und SEQ ID NR: 35 oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon (z. B. SEQ ID Nrn. 33 und 35 oder 34 und 35) umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform kann eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine Sequenz ausgew?hlt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 24 oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform wird ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz oder einer Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder eine Kombination davon (z. B. SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 und SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 28) umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform kann eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde, die eine wie in SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 37 dargelegte Sequenz oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, eingesetzt werden. Somit ist beispielweise eine bevorzugte Kombination eine der SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und 27 und SEQ ID Nr. 26 und 28 in Kombination mit SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37.

Probenvorbereitung

Die Vorbereitung von Proben f?r die Amplifikation und die Detektion von Adenovirus-Sequenzen k?nnen Verfahren zur Abtrennung und/oder zur Konzentration von Viren, die in einer Probe enthalten sind, von anderen Bestandteilen der Probe beinhalten. Die Probenvorbereitung kann Routineverfahren zum Spalten oder zum Durchf?hren einer Lyse der Probe, um den intrazellul?ren Inhalt freizusetzen, einschlie?lich Adenovirus-Nukleins?ure oder genetische Sequenzen, die Adenovirus-Nukleins?ure umfassen, beinhalten. Die Probenvorbereitung vor der Amplifikation kann den optionalen Schritt des Target-Einfangens (Target Capture) beinhalten, um die Target-Nukleins?uren spezifisch oder unspezifisch von anderen Bestandteilen der Probe abzutrennen. Verfahren zum unspezifischen Target-Einfangen k?nnen die selektive F?llung von Nukleins?uren aus einer im Wesentlichen w?ssrigen Mischung, Anhaftung von Nukleins?uren an einen Tr?ger, der gewaschen wird, um andere Bestandteile der Probe zu entfernen, andere Verfahren zum physischen Abtrennen von Nukleins?uren aus einer Mischung, die Adenovirus-Nukleins?ure und andere Probenbestandteile enth?lt, beinhalten.

Amplifikation des Targetbereichs von Adenovirus

Das Amplifizieren des Targetbereichs von Adenovirus unter Verwendung von zwei oder mehr Primern kann unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten Nukleins?ure-Amplifikationsverfahren erfolgen. Beispielsweise kann Amplifikation unter Verwendung von PCR-Amplifikation erreicht werden (US-Patente Nrn. US 4 683 195 A, US 4 683 202 A und US 4 800 159 A, Mullis et al.), wobei mehrere DNA-Str?nge hergestellt werden, indem Thermocycling-Reaktionen eingesetzt werden, die dsDNA und Primer, die spezifisch f?r Teile der getrennten Str?nge sind, trennen, um zus?tzliche dsDNA-Molek?le unter Verwendung einer DNA-Polymerase herzustellen. Wohl bekannte Variationen des grundlegenden PCR-Verfahrens k?nnen auch eingesetzt werden, beispielsweise PCR in Verbindung mit Echtzeitdetektion ? wie beispielsweise Taqman-PCR. Ein Nachteil der PCR ist die Notwendigkeit eines Thermocyclers zum Erw?rmen und K?hlen der Amplifikationsmischung, um die DNA zu denaturieren. Wie PCR wurde eine Vielzahl von anderen Techniken zur Detektion und Amplifikation von spezifischen Sequenzen entwickelt. Ein Beispiel ist die Ligasekettenreaktion (LCR). Zus?tzlich zu den herk?mmlichen Verfahren der DNA-Amplifikation, die auf der thermischen Denaturierung des Targets w?hrend der Amplifikationsreaktion beruhen, wurde eine Reihe von Verfahren beschrieben, die keine Denaturierung des Templats w?hrend der Amplifikationsreaktion erfordern, und die daher als isotherme Amplifikationstechnologien bezeichnet werden. Beispiele f?r isotherme Amplifikation sind Strangverschiebungsamplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) und nukleins?uresequenzbasierte Amplifikation (NASBA), bei denen eine RNA-Polymerase eingesetzt wird, um RNA-Sequenzen, aber nicht die entsprechende genomische DNA zu kopieren. Weitere DNA-basierte isotherme Techniken umfassen Rolling-Circle-Amplifikation (RCA), Ramifikationsamplifikation (RAM) und Helicase-abh?ngige isotherme DNA-Amplifikation (HDA).

In einer Ausf?hrungsform ist das Amplifikationsverfahren TMA. Ein TMA-basierter Assay stellt viele RNA-Transkripte (Amplikone) von einer einzigen Kopie der Targetnukleins?ure her und die Amplikone werden detektiert, um auf das Vorhandensein des Adenovirus-Targets in der Probe hinzuweisen. Kurz gesagt hybridisiert in TMA-basierten Assays ein Promotor-Primer spezifisch mit der Targetsequenz und reverse Transkriptase (RT), die eine RNase H-Aktivit?t aufweist, erzeugt einen ersten Strang cDNA durch Extension ausgehend vom 3'-Ende des Promotor-Primers und verdaut den Templatstrang. Die cDNA wird dann von einem zweiten Primer gebunden, und es wird ein neuer DNA-Strang ausgehend vom Ende des zweiten Primers unter Verwendung von RT synthetisiert, um eine doppelstr?ngige DNA (dsDNA), die eine funktionelle Promotorsequenz enth?lt, zu erzeugen. RNA-Polymerase, die spezifisch f?r diesen Promotor ist, bindet an die Promotorsequenz und es werden mehrere RNA-Transkripte hergestellt, die jeweils als Templat f?r weitere Sequenzreplikation unter Verwendung der gleichen Schritte, die f?r das erste Templat verwendet wurden, dienen k?nnen. Somit werden gro?e Mengen einzelstr?ngiger amplifizierter Produkte unter Verwendung im Wesentlichen isothermer Reaktionsbedingungen hergestellt.

Amplifikationsverfahren, die TMA-Amplifikation einsetzen, k?nnen folgende Schritte beinhalten. Kurz gesagt wird eine Targetnukleins?ure bereitgestellt, die die zu amplifizierende Targetsequenz enth?lt. Ein erstes Amplifikationsoligomer wird mit dieser Targetnukleins?ure in Kontakt gebracht, indem es mit der Targetsequenz hybridisiert. Das erste Amplifikationsoligomer kann ein Primer oder ein Promotor-Primer sein. Eine geeignete Nukleins?urepolymerase erzeugt dann ein Nukleins?urestrangamplifikationsprodukt, das komplement?r zu der Targetnukleins?uretargetsequenz ist. Wenn zun?chst ein Primer als das erste Amplifikationsoligomer eingesetzt wird, dann ist das zweite Amplifikationsoligomer ein Promotor-Primer oder Promotor-Provider. Eine geeignete Nukleins?urepolymerase verwendet das neu erzeugte Amplifikationsprodukt, mit dem das Promotor-basierte Oligomer hybridisiert ist, als Primer zur Herstellung eines komplement?ren Strangs der nicht hybridisierten Promotorsequenz. Wenn das zweite Amplifikationsoligomer ein Promotor-Primer ist, dann wird auch eine komplement?re Kopie des Amplifikationsprodukts, das mit dem zweiten Amplifikationsoligomer hybridisiert ist, erzeugt. Die nun doppelstr?ngige Promotorsequenz der promotorbasierten Amplifikation wird von einer geeigneten RNA-Polymerase verwendet, um die Transkription einzuleiten und RNA-Transkript-Amplifikationsprodukte herzustellen. Der erste Amplifikationsoligomer-Primer kann dann mit den transkribierten Amplifikationsprodukten hybridisieren, und die Schritte k?nnen sich wiederholen. Wenn die Targetnukleins?ure DNA ist, dann ist das erste Amplifikationsoligomer ein Promotor-Primer und das zweite Amplifikationsoligomer ist ein Primer. Die Amplifikation erfolgt in der Regel wie oben beschrieben und wie im Stand der Technik beschrieben. Siehe beispielsweise US-Patente Nrn. US 4 868 105 A, US 5 124 246 A, US 5 130 238 A, US 5 399 491 A, US 5 437 990 A, US 5 554 516 A und US 7 374 885 B2 und PCT Pub.-Nr. WO 88/01302 A1, WO 88/10315 A1 und WO 95/03430 A1, die TMA und andere Variationen der transkriptionsassoziierten Amplifikation beschreiben. Die amplifizierten Produkte k?nnen in Echtzeit w?hrend der Amplifikation oder am Ende der Amplifikationsreaktion detektiert werden. Die Detektion kann durch eine Reihe von Verfahren erfolgen. Sondenbasierte Detektionsverfahren verwenden eine Oligonukleotidsonde, die eine mit dem Target hybridisierende Sequenz enth?lt, die spezifisch an eine Targetsequenz, die in den Amplifikationsprodukten enthalten ist, bindet. Die Detektion eines Signals, das aufgrund der gebundenen Sonden erhalten wird, weist auf das Vorhandensein der Targetnukleins?ure in der Probe hin.

Nukleins?uredetektion

Die Detektion der Nukleins?uren kann durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden. In den Detektionsverfahren k?nnen Nukleins?uresonden, die eine mit dem Target hybridisierende Sequenz enthalten, die komplement?r zu einem Teil des amplifizierten Produkts ist, und Detektieren des Vorhandenseins des Sonde:Produkt-Komplexes eingesetzt werden, oder durch Verwenden eines Komplexes von Sonden, der das detektierbare Signal, das mit den amplifizierten Produkten verbunden ist, verst?rken kann (z. B. US-Patente Nrn. US 5 424 413 A, US 5 451 503 A und US 5 849 481 A). Direkt oder indirekt markierte Sonden, die spezifisch mit dem amplifizierten Produkt assoziieren, liefern ein detektierbares Signal, das auf das Vorhandensein der Targetnukleins?ure in der Probe hinweist. Wenn beispielsweise die Targetnukleins?ure Adenovirus-DNA ist, enth?lt das amplifizierte Produkt eine Sequenz in einer Adenovirus-Targetsequenz oder eine, die komplement?r dazu ist. Eine Sonde wird gestaltet, um direkt oder indirekt an einen Teil des Amplifikationsprodukts zu binden, um auf das Vorhandensein von Adenovirus in der untersuchten Probe hinzuweisen.

Amplifizierte Produkte k?nnen in Echtzeit w?hrend der Amplifikation oder am Ende der Amplifikationsreaktion detektiert werden. Die Detektion kann mit einer Reihe von Verfahren durchgef?hrt werden. Sondenbasierte Detektionsverfahren verwenden eine Oligonukleotidsonde, die eine mit dem Target hybridisierende Sequenz umfasst, die spezifisch an eine Targetsequenz bindet, die in den Amplifikationsprodukten enthalten ist. Die Detektion eines Signals, das aufgrund der gebundenen Sonden erhalten wird, weist auf das Vorhandensein der Targetnukleins?ure in der Probe hin.

Im Wesentlichen kann jedes Markierungs- und Detektionssystem, das zur Verfolgung konkreter Nukleins?urehybridisierung eingesetzt werden kann, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zu der Palette n?tzlicher Markierungen z?hlen Radiomarkierungen, Enzyme, Haptene, verkn?pfte Oligonukleotide, chemilumineszierende Molek?le, fluoreszierende Einheiten (entweder allein oder in Kombination mit ?Quencher?-Einheiten) und redoxaktive Einheiten, die elektronischen Detektionsverfahren zug?nglich sind. Bevorzugte chemilumineszierende Molek?le umfassen Acridiniumester der Art, wie sie von Arnold et al. in US-Patent Nr. US 5 283 174 A f?r den Einsatz in Verbindung mit homogenen Protektions-Assays offenbart wurden und der Art, wie sie von Woodhead et al. in US-Patent Nr. US 5 656 207 A f?r den Einsatz in Verbindung mit Assays, die mehrere Targets in einer einzigen Reaktion quantifizieren, offenbart wurden. Ans?tze mit elektronischer Markierung und Detektion werden in US-Patenten Nrn. US 5 591 578 A und US 5 770 369 A und der ver?ffentlichten Patentanmeldung WO 98/57158 A1 offenbart.

Redoxaktive Einheiten, die als Markierungen brauchbar sind, umfassen ?bergangsmetalle wie beispielsweise Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe und Ru. Besonders bevorzugte detektierbare Markierungen f?r Sonden in ?bereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind in homogenen Assaysystemen detektierbar (d. h. wenn in einer Mischung eine gebundene markierte Sonde eine detektierbare Ver?nderung im Vergleich zu einer ungebundenen markierten Sonde aufweist, wie beispielsweise Stabilit?t oder differenziellen Abbau). W?hrend andere homogen detektierbare Markierungen, wie beispielsweise fluoreszierende Markierungen und elektronisch detektierbare Markierungen, f?r den praktischen Einsatz der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, ist eine bevorzugte Markierung f?r den Einsatz in homogenen Assays eine chemilumineszierende Verbindung (z. B. wie von Woodhead et al. in US-Patent Nr. US 5 656 207 A; von Nelson et al. in US-Patent Nr. US 5 658 737 A oder von Arnold et al. in US-Patent Nr. US 5 639 604 A beschrieben). Chemilumineszierende Markierungen k?nnen Acridiniumester(?AE?)-Verbindungen umfassen, wie beispielsweise normaler AE oder Derivate davon, wie beispielsweise Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE und 2-Methyl-AE.

Ein weiteres Beispiel einer Hybridisierungsassaysonde, die in Verbindung mit der Erfindung eingesetzt werden kann, ist eine Struktur, die gemeinhin als ?Molekularer Beacon? bezeichnet wird. Molekulare Beacons umfassen Nukleins?uremolek?le mit einer komplement?ren Targetsequenz, ein Affinit?tspaar (oder Nukleins?urearme), die in Abwesenheit einer Targetnukleins?uresequenz die Sonde in einer geschlossenen Konformation halten und ein Markierungspaar, das wechselwirkt, wenn die Sonde in einer geschlossenen Konformation vorliegt. Die Hybridisierung der Targetnukleins?uresequenz und der komplement?ren Targetsequenz trennt die Teile des Affinit?tspaares, wobei die Sonde in eine offene Konformation gebracht wird. Das Bringen in die offene Konformation ist aufgrund der verminderten Wechselwirkung des Markierungspaares, das beispielsweise ein Fluorophor und ein Quencher sein kann (z. B. DABCYL und EDANS), detektierbar. Molekulare Beacons werden ausf?hrlich in US-Patent Nr. US 5 925 517 A beschrieben. Molekulare Beacons, die brauchbar zum Detektieren von Adenovirus-spezifischen Nukleins?uresequenzen sind, k?nnen erzeugt werden, indem ein erster Nukleins?urearm, der ein Fluorophor umfasst, und ein zweiter Nukleins?urearm, der eine Quencher-Einheit umfasst, an eines der Enden der hier offenbarten Sondensequenzen angeh?ngt wird. In dieser Konfiguration dient die hier offenbarte Adenovirus-spezifische Sondensequenz als der targetkomplement?re ?Schleifen?-Teil des erhaltenen molekularen Beacons.

Vorzugsweise werden molekulare Beacons mit einem wechselwirkenden Paar von detektierbaren Markierungen markiert. Beispiele f?r detektierbare Markierungen, die als Teile eines wechselwirkenden Markierungspaares bevorzugt sind, wechselwirken miteinander durch FRET- oder Nicht-FRET-Energietransfermechanismen. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) beinhaltet die strahlungslose ?bertragung von Energiequanten vom Absorptionsort zum Ort der Nutzung in dem Molek?l oder in dem Molek?lsystem durch Resonanzwechselwirkung zwischen Chromophoren ?ber Entfernungen hinweg, die erheblich gr??er sind als Atomabst?nde, ohne Umwandlung in thermische Energie und ohne dass Donor und Akzeptor kinetisch kollidieren. Der ?Donor? ist die Einheit, die urspr?nglich die Energie absorbiert, und der ?Akzeptor? ist die Einheit, auf die die Energie anschlie?end ?bertragen wird. Au?er FRET gibt es mindestens drei weitere ?Nicht-FRET?-Energietransferprozesse, durch die Anregungsenergie von einem Donor- auf ein Akzeptormolek?l ?bertragen werden kann.

Wenn zwei Markierungen ausreichend nahe beieinander gehalten werden, so dass die Energie, die von einer Markierung emittiert wird, von der zweiten Markierung empfangen oder absorbiert werden kann, ob durch einen FRET- oder Nicht-FRET-Mechanismus, dann sagt man, dass die beiden Markierungen in einer ?Energietransferbeziehung? zueinander stehen. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn ein molekularer Beacon durch die Bildung einer Stammduplex in einem geschlossenen Zustand gehalten wird und die Fluoreszenzemission von einem Fluorophor, das an einem Arm der Sonde angebracht ist, von einer Quencher-Einheit am anderen Arm gequencht wird.

Besonders bevorzugte Markierungseinheiten f?r die molekularen Beacons umfassen ein Fluorophor und eine zweite Einheit mit fluoreszenzquenchenden Eigenschaften (d. h. ein ?Quencher?). In dieser Ausf?hrungsform ist das charakteristische Signal wahrscheinlich eine Fluoreszenz einer bestimmten Wellenl?nge, k?nnte aber alternativ auch ein Lichtsignal im sichtbaren Bereich sein. Im Falle, dass eine Fluoreszenz beteiligt ist, erfolgen ?nderungen in der Emission vorzugsweise durch FRET oder Strahlungsenergietransfer oder Nicht-FRET-Modi. Wenn ein molekularer Beacon mit einem Paar von wechselwirkenden Markierungen im geschlossenen Zustand durch eine geeignete Lichtfrequenz angeregt wird, wird ein Fluoreszenzsignal auf einem ersten Niveau erzeugt, das sehr niedrig sein kann. Wenn dieselbe Sonde im offenen Zustand vorliegt und von einer geeigneten Lichtfrequenz angeregt wird, sind das Fluorophor und die Quenchereinheiten ausreichend voneinander getrennt, so dass ein Energietransfer zwischen ihnen im Wesentlichen ausgeschlossen ist. Unter dieser Bedingung ist die Quenchereinheit nicht in der Lage, die Fluoreszenz von der Fluorophoreinheit zu quenchen. Wenn das Fluorophor durch Lichtenergie einer geeigneten Wellenl?nge angeregt wird, wird ein Fluoreszenzsignal auf einem zweiten Niveau, das h?her liegt als das erste Niveau, erzeugt. Der Unterschied zwischen den beiden Fluoreszenzniveaus ist detektierbar und messbar. Bei Verwendung von Fluorophor- und Quenchereinheiten in dieser Weise ist der molekulare Beacon nur in der ?offenen? Konformation ?an? und weist durch das Ausstrahlen eines in einfacher Weise detektierbaren Signals an, dass die Sonde an das Target gebunden ist. Der konformationelle Zustand der Sonde ?ndert das von der Sonde erzeugte Signal durch die Regelung der Wechselwirkung zwischen den Markierungseinheiten. Beispiele f?r Donor/Akzeptor-Markierungspaare, die im Zusammenhang mit der Erfindung eingesetzt werden k?nnen, umfassen Fluoreszein/Tetramethylrhodamin, IAEDANS/Fluoreszein, EDANS/D ABCYL, Cumarin/D ABCYL, Fluoreszein/Fluoreszein, BODIPY FL/BODIPY FL, Fluoreszein/D ABCYL, Luzifer-Gelb/D ABCYL, BODIPY/D ABCYL, Eosin/D ABCYL, Erythrosin/D ABCYL, Tetramethylrhodamin/D ABCYL, Texas-Rot/DABCYL, CY5/BH1, CY5/BH2, CY3/BH1, CY3/BH2, Fluoreszein/QSY7, FAM/BHQ1 und Quasar/BHQ1. Einem Fachmann auf diesem Gebiet ist offensichtlich, dass, wenn Donor- und Akzeptorfarbstoffe verschieden sind, ein Energietransfer durch das Erscheinen einer sensibilisierten Fluoreszenz des Akzeptors oder durch Quenchen der Donorfluoreszenz detektiert werden kann. Wenn die Donor- und Akzeptorspezies gleich sind, kann Energie durch die erhaltene Fluoreszenzdepolarisation detektiert werden. Nicht-fluoreszierende Akzeptoren wie beispielsweise DABCYL und die QSY 7-Farbstoffe eliminieren in vorteilhafter Weise das potentielle Problem der Hintergrundfluoreszenz aus der direkten (d. h. nicht-sensibilisierten) Akzeptoranregung. Bevorzugte Fluorophoreinheiten, die als ein Teil eines Donor-Akzeptor-Paares eingesetzt werden k?nnen, umfassen Fluoreszein, ROX und die CY-Farbstoffe (z. B. Cy5).

Synthesetechniken und -verfahren zum Anbringen von Markierungen an Nukleins?uren und zum Detektieren von Markierungen sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10, Nelson et al., US-Patent Nr. US 5 658 737 A, Woodhead et al., US-Patent Nr. US 5 656 207 A, Hogan et al., US-Patent Nr. US 5 547 842 A, Arnold et al., US-Patent Nr. US 5 283 174 A; Kourilsky et al., US-Patent Nr. US 4 581 333 A) und Becker et al., europ?ische Patentanmeldung Nr. EP 0 747 706 A1.

Sonden, die mit amplifizierten Sequenzen hybridisieren, umfassen Haarnadeloligonukleotide, wie beispielsweise molekulare Fackeln und lineare Oligonukleotide, die im Wesentlichen keine durch intramolekulare Bindungen zusammengehaltenen Konformationen bilden. Vorzugsweise enthalten die Sonden Markierungen. Ausf?hrungsformen einer linearen Sonde k?nnen eine chemilumineszierende Verbindung als Markierung enthalten, beispielsweise eine chemilumineszierende AE-Verbindung, die an der Sondensequenz ?ber einen Linker angebracht ist (im Wesentlichen wie in US-Patenten Nrn. 5,585,481 und 5,639,604 insbesondere in Spalte 10, Zeile 6 bis Spalte 11, Zeile 3 und in Beispiel 8 darin beschrieben). Beispiele f?r die Positionen von Markierungen sind der zentrale Bereich des Sondenoligomers und in der N?he eines Bereichs mit A:T-Basenpaarung am 3'- oder 5'-Ende des Oligomers und an oder nahe einer Fehlpaarungsstelle mit einer bekannten Sequenz, die nicht die gew?nschte Targetsequenz ist. Haarnadel- oder lineare Sonden k?nnen mit jeder einer Vielzahl von verschiedenen Arten von wechselwirkenden Markierungen markiert werden, wobei ein wechselwirkender Teil in der Regel am 5'-Ende der Sonde angebracht wird und der andere wechselwirkende Teil am 3'-Ende der Sonde angebracht wird. Mit Farbstoff markierte Sonden, einschlie?lich dual markierten Sonden, einzelmarkierten Sonden, AE-markierten Sonden und dergleichen sind allgemein bekannt. Dual markierte Sonden k?nnen an einem Ende mit einer Fluoreszenzmarkierung (?F?), die Licht einer bestimmten Wellenl?nge oder eines bestimmten Bereichs absorbiert und Licht einer anderen Emissionswellenl?nge oder eines anderen Bereichs emittiert und am anderen Ende mit einem Quencher (?Q?), der teilweise oder vollst?ndig das Signal abschw?cht, das von dem angeregten F emittiert wird, wenn Q in der N?he des Fluorophors ist, markiert werden. Eine derartige Sonde kann als mit einem fluoreszierenden/Quencher(F/Q)-Paar markiert bezeichnet werden. Eine Ausf?hrungsform einer Haarnadelsonde ist eine ?molekulare Fackel?, die ein amplifiziertes Produkt detektiert, um anzudeuten, ob eine Targetsequenz nach dem Amplifikationsschritt in der Probe vorhanden ist. Eine molekulare Fackelsonde enth?lt eine Targetbindungsdom?ne und eine schlie?ende Dom?ne wie oben beschrieben. Diese Dom?nen erm?glichen es der molekularen Fackel in offenen und geschlossenen Konformationen zu existieren, je nachdem, ob die Fackel an ein Target gebunden ist. (Siehe auch US-Patente Nrn. US 6 849 412 B2, US 6 835 542 B2, US 6 534 274 B2 und US 6 361 945 B1). Eine weitere Ausf?hrungsform der Haarnadelsonde ist ein ?molekularer Beacon?, der allgemein in Tyagi et al., 1998, Nature Biotechnol. 16: 49?53 und in US-Patenten Nrn. US 5 118 801 A und US 5 312 728 A beschrieben wird. Verfahren f?r den Einsatz solcher Haarnadelsonden zum Detektieren des Vorhandenseins einer Targetsequenz sind im Stand der Technik wohl bekannt.

Die Verfahren zum Amplifizieren einer Targetnukleins?uresequenz, die in der Nukleins?ure von Adenovirus vorhanden ist, kann daher einen optionalen weiteren Schritt des Detektierens von Amplikonen beinhalten. Diese Vorschrift beinhaltet vorzugsweise einen Schritt des Kontaktierens einer Testprobe mit einer Hybridisierungsassaysonde, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen bevorzugt mit der Targetnukleins?uresequenz oder dem Komplement davon hybridisiert, wodurch eine Sonde:Target-Duplex gebildet wird, die f?r die Detektion stabil ist. Als n?chstes folgt ein Schritt zum Feststellen, ob das Hybrid in der Testprobe vorhanden ist, was auf das Vorhandensein oder Fehlen von Adenovirus-Nukleins?uren in der Probe hinweist. Dies kann Detektieren der Sonde:Target-Duplex umfassen und umfasst vorzugsweise homogene Assaysysteme.

Hybridisierungsassaysonden, die zum Detektieren von Adenovirus-Nukleins?uresequenzen brauchbar sind, umfassen eine Basensequenz, die im Wesentlichen komplement?r zu einer Adenvirus-Targetnukleins?uresequenz ist. Somit hybridisieren erfindungsgem??e Sonden mit einem Strang einer Adenovirus-Targetnukleins?uresequenz oder dem Komplement davon. Diese Sonden k?nnen wahlweise zus?tzliche Basen au?erhalb des Targetnukleins?urebereichs aufweisen, die gegebenenfalls komplement?r zu Adenovirus-Nukleins?ure sind.

Bevorzugte Sonden sind ausreichend homolog zu der Targetnukleins?ure, um unter stringenten Hybridisierungsbedingungen entsprechend etwa 42?C, oder mehr bevorzugt etwa 60?C, bei einer Salzkonzentration im Bereich von 0,6 bis 0,9 M zu hybridisieren. Bevorzugte Salze umfassen Lithiumchlorid, allerdings k?nnen auch andere Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid und Natriumcitrat, ebenfalls in der Hybridisierungsl?sung eingesetzt werden. Beispielhafte Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz werden durch etwa 42?C, oder mehr bevorzugt etwa 60?C, und 0,48 M Natriumphosphatpuffer, 0,1% Natriumdodecylsulfat und jeweils 1 mM EDTA und EGTA, oder durch 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60 mM Lithiumsuccinat und jeweils 10 mM EDTA und EGTA bereitgestellt. Erfindungsgem??e Sonden weisen Sequenzen auf, die komplement?r zu verschiedenen Dom?nen des Adenovirus-Genoms sind oder diesen entsprechen. Bestimmte Sonden, die zum Detektieren von Adenovirus-Nukleins?uresequenzen bevorzugt sind, weisen eine Sondensequenz im L?ngenbereich von 10?100 Nukleotiden auf, die die zum Target komplement?re Basensequenz enth?lt zusammen mit etwaigen Basensequenzen, die nicht komplement?r zu der zu detektierenden Nukleins?ure sind. Sonden zum Detektieren von Adenovirus-Nukleins?uresequenzen weisen zum Target komplement?re Sequenzen in einem L?ngenbereich von 15?30, von 16?24, 18?22 oder von 18?20 Nukleotiden auf. Nat?rlich k?nnen diese zum Target komplement?ren Sequenzen lineare Sequenzen sein oder k?nnen in der Struktur eines molekularen Beacons oder eines anderen Konstrukts enthalten sein, der bzw. das ein oder mehrere optionale Nukleins?uresequenzen aufweist, die nicht komplement?r zu der zu detektierenden Adenovirus-Targetsequenz sind. Wie oben angegeben k?nnen Sonden aus DNA, RNA, einer Kombination von DNA und RNA, einem Nukleins?ureanalog bestehen oder ein oder mehrere modifizierte Nukleoside enthalten (z. B. ein Ribonukleosid mit einer 2'-O-Methyl-Substitution an der Ribofuranosyl-Einheit).

Kits

Die Oligomere f?r die Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren sind f?r die Herstellung von Kits geeignet. Ein derartiges Kit kann Beh?ltnisse umfassen, die jeweils ein oder mehrere der verschiedenen Oligomeren wahlweise zusammen mit einem oder mehreren der Reagenzien (z. B. Enzyme), die erforderlich sind, um die hier beschriebenen Verfahren durchzuf?hren, enthalten. Die Bestandteile des Kits k?nnen in konzentrierter Form bereitgestellt werden. In der Regel sind auch Anweisungen f?r die Verwendung der Bestandteile des Kits enthalten. Wenn das Kit Kombinationen von Oligomeren enth?lt, dann k?nnen die einzelnen Oligomere einzeln mit entsprechenden Anweisungen zum Mischen derselben oder als Kombinationen davon, die bereits gebrauchsfertig gemischt sind, bereitgestellt werden.

In einem Aspekt wird ein Kit bereitgestellt, das die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und wahlweise eine Reihe von Anweisungen zur Durchf?hrung desselben umfasst. In einer Ausf?hrungsform umfasst diese Zusammensetzung ein erstes Amplifikationsoligomer, das eine mit dem Target hybridisierende, wie in SEQ ID NR: 25 oder SEQ ID NR: 26 dargelegte Sequenz oder eine Kombination von zwei oder mehreren davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, in Kombination mit mindestens einem zweiten Amplifikationsoligomer, das SEQ ID NR: 27 oder SEQ ID NR: 28 oder eine Kombination davon umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht. Dementsprechend kann die Zusammensetzung SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27, SEQ ID Nrn. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und Nr. 27 und SEQ ID Nrn. 26 und 28 umfassen. Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform kann die Zusammensetzung eine oder mehrere dieser Kombinationen zusammen mit mindestens einer Sonde mit einer wie in SEQ ID Nr. 36 oder SEQ ID Nr. 37 dargelegten Sequenz oder einer Kombination davon umfassen. So ist beispielsweise eine besonders bevorzugte Kombination eine der SEQ ID Nrn. 25, 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 26, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 28, SEQ ID Nrn. 25, 26 und 27; SEQ ID Nr. 25, 27 und 28, SEQ ID Nrn. 25 und 27, SEQ ID Nrn. 25 und 28, SEQ ID Nrn. 26 und 27 und SEQ ID Nrn. 26 und 28 in Kombination mit SEQ ID Nr. 36 und/oder SEQ ID Nr. 37.

Korrelation der Detektion einer Targetsequenz mit der Diagnose

Die Detektion von amplifizierten Targetsequenzen, die charakteristisch f?r Adenovirus sind, in einer biologischen Probe einer Person ist ein Hinweis auf eine Infektion mit Adenovirus.

BEISPIELEBeispiel 1: Analyse von Amplifikationsprimern und -sondenMaterialien und Methoden

In einer ersten Amplifikationsreaktion wurde folgendes eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? bis 2 ? Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 100 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 5) und 100 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8) und 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 10).

Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden durchgef?hrt, indem eine Reaktion wie oben beschrieben angesetzt wurde, allerdings keine Templat-Nukleins?ure zugegeben wurde. Die Amplifikationszyklen f?r beide S?tze von Amplifikationsreaktionen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 1: Adenovirus-Amplifikation und Detektion mit Primer- und Sonden-Sets

SEQ ID Nrn. 5, 6 und 10SEQ ID Nrn. 5, 8 und 10CTRFECTRFETarget/Probe26,951926,4383

Die Ergebnisse werden als CT/RFE(Zyklusschwellenwert/relative Fluoreszenz-Einheit)-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 12 Versuchen unter Verwendung verschiedener Adenovirus-Serotypen dar. Amplifikation konnte in keiner der Kontrollreaktionen festgestellt werden.

Schlussfolgerung

Die verwendeten Primer und Sonden schienen empfindlich und spezifisch f?r Adenovirus-Nukleins?ure zu sein.

Beispiel 2: Analyse weiterer Amplifikationsprimer und -sondenMaterialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? bis 2 ? Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 200 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 11 oder SEQ ID Nr. 12) und 200 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 13 oder SEQ ID Nr. 15) und 200 nM Sonde (SEQ ID Nr. 17 oder SEQ ID Nr. 19).

Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden durchgef?hrt, indem eine Reaktion wie oben beschrieben angesetzt wurde, allerdings keine Templat-Nukleins?ure zugegeben wurde. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 2: Adenovirus-Amplifikation und Detektion mit Primer- und Sonden-Sets

SEQ ID Nrn. 11, 13 und 17SEQ ID Nrn. 11, 13 und 19CTRFECTRFETarget/Probe8,729,832460SEQ ID Nrn. 11, 15 und 17SEQ ID Nrn. 11, 15 und 19CTRFECTRFETarget/Probe13,329,532,3406,4SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19SEQ ID Nrn. 12, 15 und 17CTRFECTRFETarget/Probe29,662012,632.8SEQ ID Nrn. 12, 13 und 19SEQ ID Nrn. 12, 13 und 17CTRFECTRFETarget/Probe29,65048,318,9

Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 8 Versuchen unter Verwendung verschiedener Adenovirus-Serotypen dar. Amplifikation konnte in keiner der Kontrollreaktionen festgestellt werden.

Schlussfolgerung

Kombinationen der SEQ ID Nrn. 11, 13 und 19, SEQ ID Nrn. 11, 15 und 19, SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19 oder SEQ ID Nrn. 12, 13 und 19 waren empfindlich und spezifisch f?r Adenovirus-Nukleins?ure. Die Kombinationen, die den Vorw?rtsprimer SEQ ID Nr. 12 umfassen, scheinen eine bessere Empfindlichkeit zu haben als die Kombination, die den Vorw?rtsprimer SEQ ID Nr. 11 enth?lt. Die Kombination, die SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19 enth?lt, schien die empfindlichste in diesen Versuchen zu sein.

Beispiel 3: Analyse von Adenovirus-Serotypen mit SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19Materialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq DNA-Polymerase (Roche), 400 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 12) und 400 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 15) wurde zusammen mit 400 nM Sonde (SEQ ID Nr. 19) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden angesetzt, allerdings wurde keine Templat-Nukleins?ure zugegeben. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 3. Adenovirus-Serotyp-Analyse

SerotypCTRFE2-12612034-1316666-1299267-1326059-126113710-128125211-12863012-126111913-126110014-13068215-126107816-12972317-123110018-13438719-127114620-12399621-13156822-125104423-123110924-125122125-13283626-124110727-125107028-12698929-127111630-122116631-121112733-12894134-12865435-12954236-12499737-124112538-126103339-123114340-127111441-12599442-123112543-122114944-122114145-127107146-127104747-122114448-125117449-126106850-12567251-12610991-1299563-1325405-1297917A-1266328-13455332-224974

Die Serotyp-Spalte gibt ?Serotyp-Nummer-1 ? 10x Anzahl TCID50/ml? an. Alle CT-Werte wurden abgerundet. Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben.

Schlussfolgerung

Die Kombination der SEQ ID Nrn. 12, 15 und 19 waren in der Lage, alle untersuchten Adenovirus-Serotypen zu detektieren.

Beispiel 4: Analyse weiterer Sonden-Kombinationen zusammen mit Primern der SEQ ID Nrn. 12 und 15Materialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 100 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 12) und 100 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 15) wurde eingesetzt zusammen mit entweder: 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21) und 50 nM Sonde (SEQ ID Nr. 24), 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21) und 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 24), 50 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21) und 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 24). Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Kontrollreaktionen wurden angesetzt, allerdings wurde keine Templat-Nukleins?ure zugegeben. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 4: Amplifikation und Detektion mit verschiedenen Konzentrationen von Sonden-Kombinationen

150 nM SEQ ID Nr. 21 und 50 nM SEQ ID Nr. 24;100 nM SEQ ID Nr. 21 und 100 nM SEQ ID Nr. 24;CTRFECTRFETarget34,829126,931850 nM SEQ ID Nr. 21 und 150 nM SEQ ID Nr. 24CTRFETarget26,8339

Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 6 Versuchen unter Verwendung verschiedener Adenovirus-Serotypen dar.

Schlussfolgerung

Sonden der SEQ ID Nr. 21 und ID Nr. 24 in Kombination mit SEQ ID Nr. 12 und 15 waren in der Lage, Adenovirus bei den verschiedenen untersuchten Konzentrationen empfindlich und spezifisch zu detektieren.

Beispiel 5: Analyse weiterer Sonden- und Primer-Kombinationen zur Detektion von AdenovirusMaterialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 2 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und entweder: (1) 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (ii) 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (iii) 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (iv) 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (v) 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (vi) 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimers (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonde (SEQ ID Nr. 23), oder (vii) 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25), 50 mM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 26), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27), 50 mM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 28) und 100 nM Sonden (SEQ ID Nr. 21).

Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommene Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Zwei verschiedene Konzentrationen wurden untersucht

Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabellen 5a?5d. Amplifikation und Detektion mit verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen von Primern und Sonden. Tabelle 5a.

SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 28, 21 und 23SEQ ID Nrn. 26, 27, 28, 21 und 23CTRFECTRFETarget (101)38,524039,2143Target (103)29,837330,8227
Tabelle 5b.SEQ ID Nrn. 25, 27, 28, 21 und 23SEQ ID Nrn. 25, 26, 28, 21 und 23CTRFECTRFETarget (101)37,821241,599Target (103)30,227532258
Tabelle 5c.SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 21 und 23SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 28 und 23CTRFECTRFETarget (101)41,89637,7254Target (103)31,832030360
Tabelle 5d.SEQ ID Nrn. 25, 26, 27, 28 und 21CTRFETarget (101)7,121Target (103)03

Die Ergebnisse werden als RFE-Werte angegeben und stellen den Mittelwert von 6 Versuchen f?r jede Konzentration dar.

Schlussfolgerung

Das Weglassen von einem der Primer oder eine der Sonden aus dem Assay machte gr??tenteils kaum einen Unterschied. Weglassen der Sonde SEQ ID Nr. 23 f?hrte zu geringerer Detektion in diesem konkreten Versuch.

Beispiel 6: Analyse von Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von Adenovirus 18Materialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien werden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 150 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25 und SEQ ID Nr. 26) und 150 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 300 nM Sonde (SEQ ID Nr. 29) eingesetzt.

Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus 18 entnommener Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 6. Amplifikation und Detektion von Adenovirus 18.

SerotypCTRFE18-617124018-52097518-424124218-330102318-23394218-13574718-0311215

Die Serotyp-Spalte gibt ?Serotyp-Nummer-1 ? 10x Anzahl TCID50/ml? an. CT-Werte wurden abgerundet. Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben.

Schlussfolgerung

Diese Kombination von Primer und Sonden detektiert erfolgreich Adenovirus 18.

Beispiel 7: Analyse von weiteren Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von AdenovirusMaterialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche), 150 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 31 und SEQ ID Nr. 26) und 150 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus Adenovirus entnommener Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 7. Primer und Sonden-Kombinationen zum Detektieren von Adenovirus-Serotypen.

FAMCy5SerotypCTRFECTRFE138,74035,9172337,45935,5208402237,2185732,2711322091124,284332,21901428,873731,91961623,887932,12122131,967131,42192532,839931,72173429,364531,72053529,677130,72205024,678630,9210

Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben. Die Fam-Spalte zeigt Detektionsergebnisse f?r die Templat-Nukleins?uren. Die Cy5-Spalte zeigt Detektionsergebnisse f?r eine interne Kontrollnukleins?ure.

Schlussfolgerung

Mit Ausnahme von Serotyp 4 detektierte diese Kombination von Primer und Sonden erfolgreich alle untersuchten Serotypen.

Beispiel 8: Analyse von weiteren Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von AdenovirusMaterialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und entweder: (i) 150 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 33 und 34) und 150 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23), (ii) 150 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 33 und 35) und 150 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23) eingesetzt, oder (iii) 150 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 34 und 35) und 150 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 23) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus verschiedenen Adenovirus-Serotypen entnommener Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabellen 8a bis 8c. Amplifikation und Detektion von verschiedenen Adenovirus-Serotypen mit Kombinationen von Primern und Sonden. Tabelle 8a.

SEQ ID Nrn. 33, 34, 27, 28, 21 und 23FAMCy5SerotypCTRFECTRFE135,631835,9243337,38735,8210436,915035,62321938,19535,22173135,724734,62574136,724435,92851429,786831,5250
Tabelle 8b.SEQ ID Nrn. 33, 35, 27, 28, 21 und 23FAMCy5SerotypCTRFECTRFE101235,7248336,415935,1231436,817135,62491936,715135,31813135,817034,61974139,350362431429,2106231,5256
Tabelle 8cSEQ ID Nrn. 34, 35, 27, 28, 21 und 23FAMCy5SerotypCTRFECTRFE137,519835,519930535,5213401536,11581901235,12243135,636934,62404136,628435,72631433,194232,1203

Die Ergebnisse werden als CT- und RFE-Werte angegeben. Die Fam-Spalte zeigt Detektionsergebnisse f?r die Templat-Nukleins?uren. Die Cy5-Spalte zeigt Detektionsergebnisse f?r eine interne Kontrollnukleins?ure.

Schlussfolgerung

Tabelle 8a der Primer und Sonden detektierte erfolgreich alle untersuchten Serotypen. Tabellen 8b und 8c detektierten die meisten der untersuchten Serotypen.

Beispiel 9: Analyse von weiteren Primer- und Sondenkombinationen zum Detektieren von AdenovirusMaterialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Buffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und 150 nM Vorw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 25 und 26) und 150 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 37) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus dem Plasmid der positiven Kontrolle von Adenovirus-Serotyp 19 entnommener Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 9. Amplifikation und Detektion einer Verd?nnungsreihe der Targetnukleins?ure

KonzentrationFAMCTRFE10428,1112710428,2104010428119610331,993810332,192210332,396910235,386510235,480010235,280010137,857110133,659101386419100010100001000010?10010?10010?100

Die Ergebnisse werden als CT/RFE-Werte angegeben.

Schlussfolgerung

Diese Primer und Sonden detektierten erfolgreich den als Kontrolle untersuchten Adenovirus-Serotyp 19.

Beispiel 10: Weitere Analyse der Primer- und Sondenkombination aus Beispiel 9.Materialien und Methoden

Die folgenden Reagenzien wurden eingesetzt: Fast Start Master-Puffer (Roche) mit 1 ? Konzentration, 3 Einheiten Fast Start Taq-DNA-Polymerase (Roche) und 150 nM Vorw?rtsamplifikationspuffer (SEQ ID Nrn. 25 und 26) und 150 nM R?ckw?rtsamplifikationsprimer (SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28) wurden zusammen mit 150 nM Sonde (SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 37) eingesetzt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 Mikroliter, wobei 5 Mikroliter aus verschiedenen Adenovirus-Serotypen entnommener Templat-Nukleins?ure pro Reaktion zugegeben wurden und wurde bei einer Konzentration von 3 ? 100 untersucht. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: Halten f?r 600 Sekunden bei 95 Grad C mit Optik aus, 95 Grad C f?r 30 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden mit Optik an (5 Zyklen), 95 Grad C f?r 10 Sekunden mit Optik aus und 55 Grad C f?r 60 Sekunden (40 Zyklen) mit Optik an.

Ergebnisse

Tabelle 10. Amplifikation und Detektion von Adenovirus-Targetnukleins?uren

SerotypCTRFE231,61465533,9903600739366837,462593212231036,38371126,69501231,811761329,7148714346711533,510181633,47291730,2162218401752027,212172134,17332231,211502330,114712433,211102537,36612629,118142729,516372834,210322932,911593028,414963226,620793333,910173434,26903533,17023629,113123730,213933831,81202393016504032,612904229,112614328,818324423,312184532,112894632,511834726,412094829,415654931,5126450328465131,41125

Die Ergebnisse sind als CT- und RFE-Werte angegeben.

Diskussion

Alle untersuchten Serotypen mit Ausnahme von Serotyp 6 wurden unter Verwendung dieser Primer- und Sondenkonzentration detektiert. Dieser Serotyp wurde erfolgreich bei 3 ? 101 TCID50/ml und h?her detektiert.

Beispiel 11. Beispielhafte Nukleins?uresequenzen.

Das vorliegende Beispiel stellt beispielhafte Sequenzen bereit, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind. Diese Tabelle stellt keine Beschr?nkung des Schutzumfangs der Erfindung dar. Sequenzen werden nach dem Handbuch der Weltorganisation f?r geistiges Eigentum (WIPO) bez?glich Information und Dokumentation gewerblichen Eigentums, Norm ST.25 (1998), einschlie?lich der Tabellen 1 bis 6 der Anlage 2 dargestellt. Tabelle 11. Beispielhafte Nukleins?uresequenzenGen des menschlichen Adenvirus 9 f?r Hexon, vollst?ndiges cds, Stamm: Hicks. GenBank Akzessionsnummer AB330090.1 und gi-Nummer GI:190356540. Zuerst gesehen bei NCBI am 13. Juni, 2008. (SEQ ID NR: 47)

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Die hier f?r Zwecke der Illustration beschriebenen Verfahren k?nnen zweckm??ig in Ermangelung eines oder mehrerer Elemente, Einschr?nkung oder Einschr?nkungen, die hier nicht konkret offenbart wurden, praktiziert werden. So werden beispielsweise die Begriffe ?umfassen?, ?einschlie?en?, ?enthalten? usw. allumfassend und ohne Einschr?nkung aufgefasst. Dar?ber hinaus wurden die hier verwendeten Begriffe und Ausdr?cke als Begriffe zur Beschreibung und nicht zur Einschr?nkung eingesetzt, und es ist nicht vorgesehen, die Begriffe und Ausdr?cke zu verwenden, um etwaige ?quivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschlie?en. Es ist offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung m?glich sind. Somit ist es selbstverst?ndlich, dass obwohl die vorliegende Erfindung konkret anhand von bevorzugten Ausf?hrungsformen und wahlweisen Merkmalen offenbart wurde, es einem Fachmann hier enthaltene Modifikation und Variation der Erfindung offensichtlich ist, und dass solche Modifikationen und Variationen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegen.

Die Erfindung wurde hier breit gef?chert und generisch beschrieben. Jeder der eingeschr?nkteren Arten und Untergattungsgruppierungen, die innerhalb der generischen Offenbarung liegen, bilden ebenfalls einen Teil der Verfahren. Dazu geh?rt auch die generische Beschreibung der Verfahren mit einem Vorbehalt oder negativer Begrenzung, der bzw. die Gegenstand aus der Gattung entfernt, unabh?ngig davon, ob das herausgetrennte Material hier konkret erw?hnt wird.

Andere Ausf?hrungsformen liegen innerhalb der folgenden Anspr?che. Wenn dar?ber hinaus Merkmale oder Aspekte der Verfahren im Sinne von Markush-Gruppen beschrieben werden, ist es einem Fachmann offensichtlich, dass die Erfindung dadurch auch im Sinne jedes einzelnen Mitglieds oder jeder einzelnen Untergruppe von Mitgliedern der Markush-Gruppe beschrieben wird.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Ver?ffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.