Title:
Antikörper gegen das Prostata-spezifische Stammzellenantigen und dessen Verwendung
Kind Code:
A1
Abstract:

Die Erfindung betrifft rekombinante an Prostata-spezifisches Stammzellantigen (PSCA) bindende Antikörper. Der erfindungsgemäße Antikörper enthält komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) mit den folgenden Aminosäure-Sequenzen:
– CDR der variablen Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 1, CDR2 SEQ ID No. 2, CDR3 SEQ ID No. 3 und
– CDR der variablen Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 4, CDR2 SEQ ID No. 5, CDR3 SEQ ID No. 6.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder als Diagnostikum. Die Antikörper eignen sich zur Anwendung im Bereich der Medizin, Pharmazie und der biomedizinischen Forschung.



Inventors:
Bachmann, Michael, Prof. Dr. (65779, Kelkheim, DE)
Application Number:
DE102011118022A
Publication Date:
01/03/2013
Filing Date:
06/30/2011
Assignee:
Technische Universität Dresden, 01069 (DE)
International Classes:
Foreign References:
201101428112011-06-16
WO2009032949A22009-03-12
Other References:
Feldmann, A., Stamova, S., Bippes, C.C. et al., The Prostate, 71: 998-1011; 2011.
Attorney, Agent or Firm:
Kailuweit & Uhlemann, Patentanwälte, 01187, Dresden, DE
Claims:
1. An Prostata-spezifisches Stammzellantigen bindender Antik?rper, wobei
? die komplementarit?tsbestimmenden Regionen (CDR) der variablen Region der leichten Kette die folgenden Aminos?ure-Sequenzen umfassen: CDR1 SEQ ID No. 1, CDR2 SEQ ID No. 2, CDR3 SEQ ID No. 3 und
? die CDR der variablen Region der schweren Kette die folgenden Aminos?ure-Sequenzen umfassen: CDR1 SEQ ID No. 4, CDR2 SEQ ID No. 5, CDR3 SEQ ID No. 6.

2. Antik?rper nach Anspruch 1, dessen variable Regionen eine humanisierte Aminos?uresequenz aufweisen.

3. Antik?rper nach Anspruch 1 oder 2, umfassend mindestens zwei unterschiedliche Bindungseinheiten, wobei
? mindestens eine der Bindungseinheiten an Prostata-spezifisches Stammzellantigen bindet und die in Anspruch 1 definierten komplementarit?tsbestimmenden Regionen umfasst und
? mindestens eine weitere der Bindungseinheiten spezifisch an ein anderes Antigen als Prostata-spezifisches Stammzellantigen bindet.

4. Antik?rper nach Anspruch 3, wobei die weitere Bindungseinheit spezifisch an eine Oberfl?chenstruktur auf einer Effektorzelle bindet, wobei die Bindungseinheit vorzugsweise ausgew?hlt ist aus einer Bindungseinheit eines an eine Oberfl?chenstruktur einer Effektorzelle bindenden Antik?rpers oder Liganden.

5. Antik?rper nach Anspruch 4, wobei die Effektorzelle ausgew?hlt ist aus T-Lymphozyten, NK-Zellen und Monozyten, bevorzugt T-Lymphozyten.

6. Antik?rper nach Anspruch 3, wobei die weitere Bindungseinheit spezifisch an ein 10 bis 50 Aminos?uren langes Peptid, bevorzugt ein Peptid mit einer Aminos?uresequenz die einer 10 bis 50 Aminos?uren langen Teilsequenz des humanen La-Proteins entspricht, besonders bevorzugt ein Peptid mit einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76, bindet.

7. Antik?rper nach einem der Anspr?che 3 bis 6 in Form eines Diabody, Triabody oder Tetrabody.

8. Verwendung der Antik?rper nach einem der Anspr?che 1 bis 7 als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen, bevorzugt Prostatakrebs, oder als Diagnostikum.

9. Nukleins?ure, dessen Nukleotidsequenz f?r einen rekombinanten Antik?rper nach einem der Anspr?che 1 bis 7 kodiert.

10. Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 9.

11. Wirtszelle oder nicht-menschlicher Wirtsorganismus enthaltend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 9 oder einen Vektor nach Anspruch 10.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen rekombinanten Antik?rper nach einem der Anspr?che 1 bis 7 in Assoziation mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verd?nnungsmittel oder Tr?ger, bevorzugt in einer f?r die intraven?se Verabreichung geeigneten Form.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, enthaltend mindestens zwei unterschiedliche rekombinante Antik?rper, davon mindestens einen Antik?rper nach einem der Anspr?che 1 bis 7 und mindestens einen weiteren rekombinanten Antik?rper, der mit dem Antik?rper nach einem der Anspr?che 1 bis 7 eine spezifische Bindung eingeht.

14. Diagnostische Zusammensetzung enthaltend einen rekombinanten Antik?rper nach einem der Anspr?che 1 bis 7.

Description:

Die Erfindung betrifft rekombinante an Prostata-spezifisches Stammzellantigen (PSCA) bindende Antik?rper und deren Verwendung in der Diagnostik und Therapie. Die Antik?rper eignen sich zur Anwendung im Bereich der Medizin, Pharmazie und der biomedizinischen Forschung.

Das Prostatakarzinom ist eine der h?ufigsten krebsbedingten Todesursachen in Deutschland. Die Standardtherapie bei einem prim?ren, organbegrenzten Prostatakarzinom ist derzeit die radikale Prostatektomie, d. h. die vollst?ndige Entfernung von Prostata, Samenblasen und Lymphknoten. Eine Alternative dazu stellt die Strahlentherapie dar, die durch Spickung der Prostata mit radioaktivem Material (Brachytherapie) erfolgt. Die meisten Patienten mit prim?rem, lokalem Prostatakarzinom k?nnen erfolgreich durch radikale Prostatektomie und Strahlentherapie behandelt werden. Eine Rezidivbildung tritt bei etwa 20?40% der Betroffenen auf [Roehl 2004].

Gegenw?rtig werden verschiedene antik?rperbasierte Therapieverfahren entwickelt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, Zielstrukturen auf den Krebszellen zu identifizieren, die als Angriffsstellen f?r die antik?rperbasierten Therapeutika dienen k?nnen. Eine geeignete Zielstruktur als Angriffsstelle f?r die Behandlung von Prostatakrebs sind Oberfl?chenproteine, die haupts?chlich im Prostatagewebe vorliegen und die eine ?berexpression auf malignen im Vergleich zu gesunden Zellen zeigen.

Das Prostata-spezifische Stammzellantigen (PSCA) ist ein derartiges Oberfl?chenmolek?l, das spezifisch auf Prostatazellen vorliegt und das in Prostatakarzinomzellen im Vergleich zum gesunden Gewebe vermehrt exprimiert wird (tumorassoziiertes Antigen). Humanes PSCA umfasst 123 Aminos?uren und weist eine N-terminale Signalsequenz, eine C-terminale Glykosylphosphatidylinositol(GPI)-Verankerungssequenz und mehrere N-Glykosylierungsstellen auf. PSCA wird zur Thy-1/Ly-6 Familie der GPI-verankerten Zelloberfl?chenmolek?le gez?hlt, da es u. a. die f?r diese Familie charakteristischen konservierten Cystein-Reste aufweist [Reiter 1998].

Aufgrund der erh?hten Expression in Prostatatumoren ist PSCA ein geeignetes Zielmolek?l f?r die Therapie von Prostatakrebs und es wurden bislang verschiedene Therapiestrategien, die auf PSCA als Target abzielen, entwickelt. Ein Nachweis der Wirksamkeit von PSCA als therapeutischem Target bei der Krebstherapie am Menschen wurde u. a. durch die Vakzinierung mit dendritischen Zellen, die zuvor mit einem PSCA-Peptid beladen wurden, erbracht. Klinische Studien (Phase 1 und 2) mit 12 Hormon- und Chemotherapie-refrakt?ren Prostatakarzinom-Patienten zeigten, dass eine Vakzinierung mit PSCA-Peptid-beladenen Dendritischen Zellen bei f?nf der Patienten eine T-Zell-Antwort gegen PSCA verursachte, die im Mittel mit einer verl?ngerten ?berlebenszeit korrelierte. Bei einem Patienten konnte sogar eine Reduktion der Tumormasse beobachtet werden [Thomas-Kaskel 2006].

WO 2009/032949 A2 offenbart monoklonale anti-PSCA-Antik?rper (1G8), die zum Targeting von Tumoren und zu deren Detektion eingesetzt werden. Die CDR-Regionen der Antik?rper haben die folgenden Aminos?uresequenzen:

variable Region der leichten Kette (1G8)variable Region der schweren Kette (1G8)CDR1SASSSVRFIHWSEQ ID No. 69DYYIHWSEQ ID No. 72CDR2DTSKLASSEQ ID No. 70WIDPENGDTEFVPKFQGSEQ ID No. 73CDR3QQWSSSPFTSEQ ID No. 71TGGFSEQ ID No. 74

Aufgrund der zytotoxischen Eigenschaften des 1G8 Antik?rpers ist dieser f?r Targetingstrategien, die auf der Rekrutierung von Effektorzellen beruhen, ungeeignet (Gu 2005).

Die in WO 2009/032949 A2 offenbarten Antik?rper werden diagnostisch bevorzugt in Form von funktionellen murinen und humanisierten monoklonalen Antik?rpern sowie mit Radionukliden markierten PSCA-spezifischen Minibodies und Diabodies eingesetzt.

[Feldmann 2010] entwickelten bispezifische rekombinante Antik?rper mit einem PSCA-bindenden Paratop und einem CD3-bindenden Paratop. Das PSCA-bindende Paratop der bispezifischen Antik?rper ist vom PSCA-Antik?rper 7F5 abgeleitet [Morgenroth 2007] und umfasst CDR-Regionen mit den folgenden Aminos?uresequenzen:

variable Region der leichten Kette (7F5)variable Region der schweren Kette (7F5)CDR1RTSQDISNYLNSEQ ID No. 27SYTMSSEQ ID No. 30CDR2YTLKLNSSEQ ID No. 28YIHNGGGHTYYPDTIKGSEQ ID No. 31CDR3QQSKTLPWTSEQ ID No. 29RMYYGNSHWYFDVSEQ ID No. 32

Die in [Feldmann 2010] offenbarten bispezifischen Antik?rper f?hrten in vitro erfolgreich zur spezifischen T-Zell-vermittelte Lyse PSCA-positiver Tumorzellen. F?r eine spezifische Lyse von etwa 40% der eingesetzten PSCA-positiven Tumorzellen ist bei einem Verh?ltnis von Effektorzellen zu PSCA-positiven Tumorzellen von 20:1 mindestens 5 ng der in [Feldmann 2010] offenbarten bispezifischen Antik?rper einzusetzen. In vitro konnte mit dem in [Feldmann 2010] offenbarten Antik?rper eine spezifische Lyse von maximal etwa 60% der eingesetzten PSCA-positiven Tumorzellen erreicht werden (in Gegenwart von 50?100 ng des Antik?rpers). Eine weitere Erh?hung der Effektivit?t konnte nicht nachgewiesen werden. Auch in Gegenwart von 1000 ng des bispezifischen Antik?rpers konnte kein h?herer Anteil PSCA-positiver Tumorzellen lysiert werden.

Die bekannten in vitro und in vivo Daten zeigen, dass PSCA ein gro?es Potenzial als Zielantigen f?r die Immuntherapie von Prostatakarzinomen besitzt und als diagnostisches Target geeignet ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Antik?rper gegen PSCA bereitzustellen, die insbesondere in Form von bispezifischen rekombinanten Antik?rpern in geringer Konzentration therapeutisch wirksam sind und PSCA-positive Tumorzellen effektiv lysieren k?nnen.

Die Aufgabe wird erfindungsgem?? gel?st durch einen an Prostata-spezifisches Stammzellantigen (PSCA) bindenden Antik?rper (hierin auch als anti-PSCA Antik?rper bezeichnet), der komplementarit?tsbestimmende Regionen (CDR) mit den folgenden Aminos?ure-Sequenzen enth?lt:

  • ? CDR der variablen Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 1, CDR2 SEQ ID No. 2, CDR3 SEQ ID No. 3 und
  • ? CDR der variablen Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 4, CDR2 SEQ ID No. 5, CDR3 SEQ ID No. 6.

Der erfindungsgem??e Antik?rper, der durch die vorganannten CDRs gekennzeichnet ist, wird hierin auch vereinfacht als MB1 bezeichnet. Die Erfinder stellten im Rahmen umfangreicher Untersuchungen ?berraschend fest, dass der erfindungsgem??e Antik?rper in Form von rekombinant hergestellten bispezifischen Antik?pern die spezifische Lyse PSCA-positiver Tumorzellen auch in sehr geringen Mengen vermitteln kann. Ferner wurde ?berraschend festgestellt, dass die durch die neuen Antik?rper vermittelte spezifische Lyse von PSCA-positiven Tumorzellen effektiver ist. So konnten in in vitro Untersuchungen mit bispezifischen Antik?rpern, die einen erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper enthalten ?ber 90% der eingesetzten PSCA-positiven Tumorzellen lysiert werden. Es kann mit dem neuen anti-PSCA Antik?rper somit die eingesetzte Antik?rpermenge deutlich reduziert werden. Gleichzeitig wird die therapeutische Wirksamkeit erh?ht, da mit dem erfindungsgem??en Antik?rper PSCA-postive Tumorzellen effektiver lysiert werden k?nnen. Aufgrund der geringen Konzentration, in der mit dem erfindungsgem??en Antik?rper eine Wirksamkeit erzielt werden kann, ist mit dem erfindungsgem??en auch eine verbesserte Abt?tung von metastasierenden PSCA-positiven Zellen m?glich. Vergleichsuntersuchungen mit dem aus dem Stand der Technik bekannten anti-PSCA 7F5 in einem vergleichbaren bispezifischen Konstrukt best?tigen deutlich die ?berlegenheit des erfindungsgem??en Antik?rpers sowohl in in vitro (3) als auch in vivo Studien (4).

Bevorzugte erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper enthalten die wie vorstehend definierten CDR-Regionen, wobei die Aminos?uresequenz der variablen Regionen der leichten und schweren Kette mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95% Aminos?ure-Sequenzidentit?t zu folgenden Aminos?uresequenz aufweist:

  • ? variable Region der leichten Kette SEQ ID No. 24, variable Region der schweren Kette SEQ ID No. 26 oder
  • ? variable Region der leichten Kette SEQ ID No. 20, variable Region der schweren Kette SEQ ID No. 22.

Bevorzugt sind davon anti-PSCA Antik?rper mit den oben definierten CDR-Regionen, dessen variable Regionen eine humanisierte Struktur aufweisen. Besonders bevorzugt sind anti-PSCA Antik?rper deren variable Region der leichten Kette die Aminos?uresequenz gem?? SEQ ID No. 24 und deren variable Region der schweren Kette die Aminos?uresequenz gem?? SEQ ID No. 26 enth?lt.

Der Begriff ?Antik?rper? im erfindungsgem??en Sinn umfasst alle Antik?rper oder Antik?rperfragmente, die in der Lage sind, spezifisch an ein Antigen zu binden. Bei rekombinanten Antik?rpern handelt es sich dabei um Antik?rper, die mit Hilfe von gentechnisch ver?nderten Organismen hergestellt werden. Der Begriff Antik?rper umfasst sowohl die kompletten monoklonalen Antik?rper als auch deren epitopbindende Fragmente. Hierbei umfassen die epitopbindenden Fragmente (hier auch als Antik?rperfragmente bezeichnet) diejenigen Teile des Antik?rpers, die in der Lage sind, an das Antigen zu binden. Antik?rperfragmente im Sinne der Erfindung beinhalten Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Einzelketten (single-chain) variable Fragmente (scFv), Einzelketten-Antik?rper, disulfidverlinkte variable Fragmente (sdFv) und Fragmente die entweder eine variable Region der leichten Kette (VL) oder eine variable Region der schweren Kette (VH) enthalten. Antik?rperfragmente enthalten die variablen Regionen entweder allein oder in Kombination mit weiteren Regionen, die ausgew?hlt sind aus der Hinge-Region, und dem ersten, zweiten und dritten Bereich der konstanten Region (CH1, CH2, CH3).

Weiterhin umfasst der Begriff Antik?rper rekombinant hergestellte Antik?rper, wie Diabodies, Triabodies und Tetrabodies. Ebenfalls vom Begriff Antik?rper umfasst sind chim?re Antik?rper, bei denen unterschiedliche Teile des Antik?rpers aus verschiedenen Spezies stammen, wie beispielsweise Antik?rper mit einer murinen variablen Region, welche mit einer humanen konstanten Region kombiniert ist. Humanisierte Antik?rper sind hierin ebenfalls durch den Begriff Antik?rper umfasst. Das Ziel der Humanisierung von Antik?rpern liegt in der Reduktion der Immunogenit?t eines xenogenen Antik?rpers, wie beispielsweise muriner Antik?rper, zur Verwendung im humanen System, wobei die volle Bindungsaffinit?t und die Antigenspezifit?t erhalten bleiben. Humanisierte Antik?rper k?nnen auf verschiedenen bekannten Wegen hergestellt werden, wie beispielsweise durch Resurfacing und CDR-Grafting. Beim Resurfacing werden durch eine Kombination aus Molecular Modelling, statistischen Analysen und Mutagenese alle nicht-CDR-Regionen auf der Oberfl?che des Antik?rpers ver?ndert, so dass diese der Oberfl?che von Antik?rpern des Zielorganismus ?hneln. Beim CDR-Grafting werden die CDR-Regionen des zu humanisierenden Antik?rpers in humane variable Regionen eingebracht.

Antik?rperfragmente sind gegebenenfalls untereinander ?ber einen Linker verkn?pft. Der Linker umfasst eine kurze (bevorzugt 10 bis 50 Aminos?urereste lange) Peptidsequenz, die so ausgew?hlt wird, dass das Antik?rperfragment eine derartige dreidimensionale Faltung der VL, und VH besitzt, dass es die Antigenspezifit?t des kompletten Antik?rpers aufweist. Bevorzugt sind Glycin-Serin-Linker oder Linkerpeptide mit einer Aminos?uresequenz gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76.

Die Bezeichnung ?variable Region? bedeutet hierin die Teile der schweren und leichten Ketten der Antik?rper, die sich in ihrer Sequenz zwischen Antik?rpern unterscheiden und die Spezifit?t des Antik?rpers und die Bindung an sein Antigen bestimmen. Die Variabilit?t ist hierbei nicht gleichm??ig in der variablen Region verteilt, sondern ist ?blicherweise innerhalb dreier definierter Segmente der variablen Region konzentriert, den komplementarit?tsbestimmenden Regionen (CDRs, auch als hypervariable Regionen bezeichnet), die in den variablen Regionen sowohl der leichten als auch der schweren Kette enthalten sind. Die Antigenbindungsstelle eines Antik?rpers, das sogenannte Paratop, ist durch die hypervariablen Regionen (CDR) der leichten und schweren Ketten des Antik?rpers charakterisiert.

Zur Beschreibung von Antik?rpern wird hierin auch die vereinfachte Bezeichnung anti-?Antigen? Antik?rper verwendet, um darzustellen, dass es sich dabei um einen Antik?rper handelt, der spezifisch an das in der Bezeichnung angegebene Antigen bindet. So ist beispielsweise unter einem ?anti-PSCA Antik?rper? im Sinn der Erfindung ein Antik?rper zu verstehen, der spezifisch an das Antigen PSCA bindet. Unter einer spezifischen Bindung eines Antik?rpers an ein bestimmtes Antigen wird hierin verstanden, dass ein Antik?rper mit einer hohen Affinit?t an das bestimmte Antigen bindet und mit einer deutlich geringeren Affinit?t und vorzugsweise nicht an andere Antigene bindet.

Bevorzugte Antik?rper liegen in Form eines scFv-Fragments oder eines F(ab')2-Fragments vor. Weiter bevorzugte Antik?rper sind bispezifische Antik?rper, die rekombinant hergestellt werden und die zwei unterschiedliche Paratope enthalten, von denen eines gegen PSCA und ein anderes nicht gegen PSCA gerichtet ist. Das andere Paratop des bispezifischen Antik?rpers ist dabei vorzugsweise gegen eine Oberfl?chenstruktur auf einer Effektorzelle oder gegen ein 10 bis 50 Aminos?uren langes Peptid (bevorzugt eine 10 bis 50 Aminos?uren lange Sequenz des humanen La-Proteins, besonders bevorzugt gegen ein Peptid mit einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76) gerichtet.

Bevorzugt sind erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper (naive oder rekombinante Antik?rper) mit einer Effektorgruppe konjugiert. Konjugation bedeutet hierbei die Ankopplung eines Stoffs, also der Effektorgruppe, an den Antik?rper. Die Verbindung des Antik?rpers zur Effektorgruppe wird bevorzugt durch rekombinante Expression in Form eines Fusionsproteins oder durch in vitro Methoden hergestellt, wobei die Effektorgruppe bevorzugt ?ber chemische Linkergruppen an den Antik?rper gebunden wird (beispielsweise ?ber Thioetherbindungen oder Disulfidbindungen). Sie k?nnen an den Antik?rper auch durch ein intermedi?res Tr?germolek?l, beispielsweise Serumalbumin, gebunden sein. Gegebenenfalls enth?lt ein erfindungsgem??er Antik?rper mehrere Effektorgruppen. Effektorgruppen sind dabei vorzugsweise ausgew?hlt aus Wirkstoffen, Peptiden (mit einer L?nge von 10 bis 100 Aminos?uren), Proteinen (mit einer L?nge von mehr als 100 Aminos?uren), costimulatorischen Molek?len, Farbstoffen oder Kontrastmitteln.

Bevorzugte erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper sind mit Wirkstoffen, also mit pharmazeutisch wirksamen Stoffen, konjugiert. Bevorzugte Wirkstoffe umfassen Toxine, vorzugsweise Zytostatika, davon bevorzugt ausgew?hlt aus Maytansinoiden und Maytansinoid-Analoga, Taxoiden, CC-1065 und CC-1065 Analoga, Dolastatin und Dolastatin-Analoga, Methotrexat, Daunorubicin, Doxorubicin, Vincristin, Vinblastin, Melphalan, Mitomycin C, Chlorambucil und Calicheamicin.

Weiter bevorzugte erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper sind mit Kontrastmitteln konjugiert. Bevorzugte Kontrastmittel sind Radionuklide, davon bevorzugt die radioaktiven Isotope von Technetium, Rhenium, Yttrium, Kupfer, Gallium, Indium, Bismuth und Platin, insbesondere 99mTc, 90Y, 186Re, 188Re, 68Ga und 111In.

Weiter bevorzugte erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper sind mit einem Protein, bevorzugt einem Enzym, vorzugsweise einem f?r das ADEPT-System geeigneten Enzym, einem costimulatorischen Molek?l, vorzugsweise Toll-like Rezeptor Ligand, davon bevorzugt CpG oder mit einer Nukleins?ure konjugiert.

Weiter bevorzugte erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper sind mit einem Farbstoff vorzugsweise einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert.

Weiter bevorzugte erfindungsgem??e Antik?rper sind mit einem Peptid konjugiert, das eine Bindungsregion enth?lt, an die ein f?r das Peptid spezifischer Antik?rper spezifisch bindet. Bevorzugt umfasst das Peptid eine 10 bis 50 Aminos?uren lange Peptidsequenz einer alpha-helikalen Region des humanen La-Proteins (die Aminos?uresequenz des humanen La Proteins entspricht SEQ ID No. 77). Besonders bevorzugt sind Peptide mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76.

Besonders bevorzugt werden erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper rekombinant hergestellt. Vorzugsweise enthalten erfindungsgem??e rekombinante anti-PSCA Antik?rper mindestens zwei unterschiedliche Bindungseinheiten, wobei

  • ? mindestens eine der Bindungseinheiten spezifisch an PSCA bindet, wobei diese das Paratop des erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rpers enth?lt, und
  • ? mindestens eine weitere der Bindungseinheiten spezifisch an ein anderes Antigen als PSCA, vorzugsweise an eine Oberfl?chenstruktur auf einer Effektorzelle bindet.

Die PSCA-bindende Bindungseinheit umfasst somit einen erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper und enth?lt demzufolge zumindest die folgenden CDR-Regionen:

  • ? CDR der variablen Region der leichten Kette umfassend die folgenden Aminos?ure-Sequenzen: CDR1 SEQ ID No. 1, CDR2 SEQ ID No. 2, CDR3 SEQ ID No. 3 und
  • ? CDR der variablen Region der schweren Kette umfassend die folgenden Aminos?ure-Sequenzen: CDR1 SEQ ID No. 4, CDR2 SEQ ID No. 5, CDR3 SEQ ID No. 6

Unter einer ?Bindungseinheit? im Sinne der Erfindung wird jegliche molekulare Struktur bezeichnet, die definierte Substanzen oder Strukturen spezifisch bindet. Abh?ngig von der Substanz oder Struktur, die gebunden wird, weist die Bindungseinheit dabei verschiedene Strukturen auf Von der Bezeichnung ?Bindungseinheit? im Sinne der Erfindung sind daher sowohl Antik?rper umfasst (in diesem Fall enth?lt die Bindungseinheit zumindest das funktionale Paratop des Antik?rpers) als auch andere Molek?le, vorzugsweise Proteine, die eine spezifische Bindung mit einem Antigen eingehen. Derartige Molek?le sind vorzugsweise Liganden, die spezifisch an eine Oberfl?chenstruktur (beispielsweise einen Oberfl?chenrezeptor) auf einer Zelle, insbesondere einer Effektorzelle, binden.

Bevorzugte Bindungseinheiten, die in erfindungsgem??en Antik?rpern enthalten sind, binden spezifisch an eine Effektorzelle. Die Definition von Effektorzellen im Sinne der Erfindung umfasst alle die Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems, die Immunreaktionen vermitteln oder aktiv daran beteiligt sind. Bevorzugt ist die Effektorzelle ausgew?hlt aus T-Lymphozyten, NK-Zellen, Monozyten, Makrophagen, Dendritischen Zellen und Granulozyten. Besonders bevorzugt sind Bindungseinheiten, die gegen Oberfl?chenstrukturen auf T-Lymphozyten binden.

Enth?lt ein erfindungsgem??er rekombinanter Antik?rper mindestens zwei unterschiedliche Antik?rper (mindestens einen erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper und mindestens einen weiteren Antik?rper, der nicht spezifisch an PSCA bindet), so liegt dieser bevorzugt in Form eines Diabody, Triabody oder Tetrabody vor. Bevorzugt davon sind bispezifische Antik?per aus Einzelketten-Antik?rpern (single chain bispecific diabody, scBsDb) oder bispezifische Tandemantik?rper aus Einzelketten-Antik?rpern (single chain bispecific tandem antibody, scBsTaFv). Ganz besonders bevorzugt liegt ein erfindungsgem??er rekombinanter Antik?rper in Form eines scBsTaFv vor.

Bevorzugte nicht an PSCA-bindende Antik?rper, die in einem erfindungsgem??en rekombinanten Antik?rper enthalten sind (in diesem Fall ist der rekombinante Antik?rper ein bispezifischer Antik?rper), sind Antik?rper, die an eine Oberfl?chenstruktur einer Effektorzelle spezifisch binden. In diesem Fall enth?lt die nicht an PSCA-bindende Bindungseinheit zumindest das Paratop des Antik?rpers, der an eine Oberfl?chenstruktur einer Effektorzelle bindet. Besonders bevorzugte sind die Antik?rper gegen folgende Oberfl?chenstrukturen auf Effektorzellen gerichtet: CD3, CD8, CD4, CD25, CD28, CD16, NKG2D, NKp46, NKp44, aktivierende KIR-Rezeptoren (activating Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors). Ganz besonders bevorzugt sind Antik?rper, die gegen CD3 gerichtet sind (anti CD3-Antik?rper), wobei der anti-CD3 Antik?rper CDR Regionen mit den folgenden Aminos?uresequenzen enth?lt:

  • CDR der variablen Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 66, CDR2 SEQ ID No. 67,? CDR3 SEQ ID No. 68 und
  • ? CDR der variablen Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 58, CDR2 SEQ ID No. 59, CDR3 SEQ ID No. 60.

Weiter bevorzugt sind rekombinante anti-PSCA Antik?rper, die mindestens zwei unterschiedliche Bindungseinheiten enthalten, wobei mindestens eine weitere der Bindungseinheiten ein Ligand (bevorzugt ein Protein oder ein Glykan) ist, der an eine Oberfl?chenstruktur auf einer Effektorzelle spezifisch bindet. Bevorzugte Liganden beeinflussen die Aktivit?t der Effektorzellen durch deren Bindung an die (Effektor-)Zelloberfl?che. Der Ligand ist dabei so ausgew?hlt, dass er spezifisch an Oberfl?chenstrukturen von Effektorzellen bindet und durch die Bindung Signalkaskaden zur Aktivierung der Effektorzellen ausl?st. Bevorzugt ist als Ligand eine Proteinstruktur oder ein Glykan, welcher spezifisch an einen Rezeptor bindet, der spezifisch auf der Oberfl?che von Effektorzellen exprimiert wird, wobei der Ligand durch seine Bindung an den Rezeptor eine Aktivierung der Effektorzelle bewirkt. Besonders bevorzugt sind die Proteinstrukturen ausgew?hlt aus ULB-Ps (z. B. ULB-P2), MICA, MICB und Zytokinen (wie z. B. IL2 und IL15).

Erfindungsgem??e Antik?rper, insbesondere erfindungsgem??e rekombinante Antik?rper, eignen sich zur spezifischen Bindung an PSCA-positive Zellen in vivo und in vitro. Daher umfasst die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen, bevorzugt Prostatakrebs, oder als Diagnostikum.

Die Erfindung umfasst ferner die erfindungsgem??en Antik?rper zur Therapie von Tumorerkrankungen, insbesondere Prostatakrebs. Ebenfalls von der Erfindung umfasst ist die Verwendung der erfindungsgem??en Antik?rper zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere Prostatakrebs.

Eine bevorzugte therapeutische Anwendung der erfindungsgem??en (bevorzugt rekombinanten) Antik?rper ist die Behandlung von Tumorerkrankungen, vorzugsweise Prostatakrebs. In der therapeutischen Anwendung werden die erfindungsgem??en Antik?rper bevorzugt zum Targeting Von therapeutisch wirksamen Substanzen oder Effektorzellen zum Tumorgewebe eingesetzt. Zum Targeting von therapeutisch wirksamen Substanzen zum Tumorgewebe kommen bevorzugt erfindungsgem??e rekombinante Antik?rper zum Einsatz, die mit einem Wirkstoff konjugiert sind. Zum Targeting von Effektorzellen zum Tumorgewebe werden bevorzugt erfindungsgem??e rekombinante Antik?rper eingesetzt, die mindestens zwei unterschiedliche Bindungseinheiten enthalten, wobei mindestens eine der Bindungseinheiten ein erfindungsgem??er anti-PSCA Antik?rper ist und eine weitere der Bindungseinheiten spezifisch an eine Effektorzelle, vorzugsweise an CD3 auf T Zellen, bindet. Bevorzugt werden daf?r die obenstehend genannten Antik?rper eingesetzt.

Von der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die einen erfindungsgem??en Antik?rper in Assoziation mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verd?nnungsmittel oder Tr?ger enth?lt. Bevorzugt liegt die erfindungsgem??e pharmazeutische Zusammensetzung in einer f?r die intraven?se Verabreichung geeigneten Form vor.

Vorzugsweise liegen die Antik?rper in der erfindungsgem??en pharmazeutischen Zusammensetzung in rekombinanter Form als chim?re oder besonders bevorzugt humanisierte Antik?rper vor, die eine verringerte Immunogenit?t aufweisen.

Die erfindungsgem??en pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen verschiedene Dosierungsformen und sind bevorzugt f?r die parenterale, besonders bevorzugt f?r die intraven?se Verabreichung geeignet. Vorzugsweise liegt die parenterale pharmazeutische Zusammensetzung in einer Darreichungsform vor, die zur Injektion geeignet ist. Besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen sind daher L?sungen, Emulsionen oder Suspensionen des Antik?rpers in einem pharmazeutisch annehmbaren Verd?nnungsmittel oder Tr?ger.

Pharmazeutisch annehmbare Tr?ger sind vorzugsweise sterile Fl?ssigkeiten, insbesondere Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzl?sung, 0,3% Glycin und dergleichen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch herk?mmliche, gut bekannte Techniken sterilisiert. Die Zusammensetzungen enthalten bevorzugt pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen, wie etwa diejenigen, die erforderlich sind um n?herungsweise physiologische Bedingungen zu ergeben und/oder die Stabilit?t der in der Zusammensetzung enthaltenen Antik?rper zu erh?hen, wie etwa Mittel zur Einstellung des pH-Werts und Puffermittel, Mittel zur Einstellung der Toxizit?t und dergleichen, vorzugsweise ausgew?hlt aus Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und Natriumlactat.

Bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung eine injizierbare gepufferte L?sung, die zwischen 0,1 bis 500 mg/ml Antik?rper, besonders bevorzugt zwischen 0,1 bis 250 mg/ml Antik?rper, insbesondere zusammen mit 1 bis 500 mMol/l Puffer enth?lt. Die injizierbare L?sung liegt bevorzugt sowohl in einer fl?ssigen oder in einer lyophilisierten Dosierungsform vor. Der Puffer ist bevorzugt ausgew?hlt aus Histidin, Natriumsuccinat, Natriumcitrat, Natriumphosphat und Kaliumphosphat.

Bevorzugt enth?lt eine erfindungsgem??e pharmazeutische Zusammensetzung mindestens zwei unterschiedliche (bevorzugt rekombinante) Antik?rper, wobei mindestens ein erfindungsgem??er anti-PSCA Antik?rper enthalten ist und mindestens ein weiterer rekombinanter Antik?rper, der mit dem erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper eine spezifische Bindung eingeht. Besonders bevorzugt sind die folgenden Kombinationen:

  • a) ein rekombinanter anti-PSCA Antik?rper, der mit einem 10 bis 50 Aminos?uren langen Peptid konjugiert ist und ein weiterer rekombinanter Antik?rper, der spezifisch an das Peptid bindet oder
  • b) ein bispezifischer anti-PSCA Antik?rper, der zus?tzlich einen Antik?rper enth?lt, der an ein 10 bis 50 Aminos?uren langes Peptid bindet und ein weiterer rekombinanter Antik?rper, der gegen ein anderes Antigen als PSCA bindet und der ein Peptid enth?lt, an das der bispezifische anti-PSCA Antik?rper bindet.

Die mindestens zwei unterschiedlichen Antik?rper liegen dabei vorzugsweise separat verpackt in der erfindungsgem??en pharmazeutischen Zusammensetzung vor.

Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung, die die unter a) definierte Kombination enth?lt, umfasst:

  • ? Einen rekombinanten anti-PSCA Antik?rper, der mit einem Peptid konjugiert ist, das eine 10 bis 50 Aminos?uren lange Aminos?uresequenz einer alpha-helikalen Region des humanen La-Proteins enth?lt (die Aminos?uresequenz des humanen La Proteins entspricht SEQ ID No. 77). Bevorzugt ist der anti-PSCA Antik?rper mit einem Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76 konjugiert.
  • ? Einen weiteren (bevorzugt rekombinanten) Antik?rper, der ein Paratop enth?lt, das spezifisch gegen das Peptid des anti-PSCA Antik?rpers bindet und der eine weitere Bindungseinheit enth?lt, die spezifisch an eine Oberfl?chenstruktur einer Effektorzelle bindet. Davon bevorzugte Bindungseinheiten entsprechen den oben definierten. F?r den Fall, dass der rekombinante anti-PSCA Antik?rper mit einem Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76 konjugiert ist, enth?lt der weitere rekombinante Antik?rper vorzugsweise als Paratop, das an das Peptid bindet, die folgenden Aminos?uresequenzen:
    ? CDR der variablen Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 78, CDR2 SEQ ID
  • No. 79, CDR3 SEQ ID No. 80 und CDR der variablen Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 81, CDR2 SEQ ID No. 82, CDR3 SEQ ID No. 83 (hierin auch als ?5B9?-Paratop bezeichnet) oder
    ? CDR der variablen Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 84, CDR2 SEQ ID No. 85, CDR3 SEQ ID No. 86 und CDR der variablen Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 87, CDR2 SEQ ID No. 88, CDR3 SEQ ID No. 89 (hierin auch als ?7B6?-Paratop bezeichnet).

Davon bevorzugte Kombinationen sind

  • ? ein anti-PSCA Antik?rper, der ein Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 enth?lt mit einem weiteren Antik?rper, der das 5B9 Paratop enth?lt oder
  • ? ein anti-PSCA Antik?rper, der ein Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 76 enth?lt mit einem weiteren Antik?rper, der das 7B6 Paratop enth?lt.

Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung, die die unter b) definierte Kombination enth?lt, umfasst:

  • ? Einen weiteren Antik?rper, der spezifisch an eine Oberfl?chenstruktur einer Effektorzelle bindet und der eine 10 bis 50 Aminos?uren lange Aminos?uresequenz einer alpha-helikalen Region des humanen La-Proteins, vorzugsweise ein Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76 enth?lt.
  • ? Einen bispezifischen anti-PSCA Antik?rper, der mit einem Antik?rper konjugiert ist, der die 10 bis 50 Aminos?uren lange Aminos?uresequenz einer alpha-helikalen Region des humanen La-Proteins spezifisch bindet. F?r den Fall, dass der weitere rekombinante Antik?rper ein Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 oder SEQ ID No. 76 enth?lt, enth?lt der bispezifische anti-PSCA Antik?rper bevorzugt ein wie oben definiertes 5B9-Paratop oder 7B6-Paratop.

Davon bevorzugte Kombinationen sind

  • ? ein bispezifischer anti-PSCA Antik?rper der das 5B9 Paratop enth?lt und ein weiterer rekombinanter Antik?rper, der ein Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 75 enth?lt oder
  • ? ein bispezifischer anti-PSCA Antik?rper, der das 7B6 Paratop enth?lt und ein weiterer rekombinanter Antik?rper, der ein Peptid mit einer Aminos?ure-Sequenzidentit?t von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens 99% zu einer der Aminos?uresequenzen gem?? SEQ ID No. 76 enth?lt.

Eine bevorzugte diagnostische Anwendung ist die in vivo Diagnostik, wobei ein mit Kontrastmittel konjugierter erfindungsgem??er anti-PSCA Antik?rper zum gezielten Transport von Kontrastmitteln zum Tumorgewebe eingesetzt wird. Eine weiter bevorzugte diagnostische Anwendung der erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper ist die in vitro Diagnostik, wobei bevorzugt ein mit einem Farbstoff konjugierter erfindungsgem??er anti-PSCA Antik?rper zum Nachweis PSCA-positiver Zellen in einer Probe, insbesondere in einer Gewebeprobe, eingesetzt wird.

Von der Erfindung ist auch eine diagnostische Zusammensetzung umfasst, die einen erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper enth?lt. Der anti-PSCA Antik?rper liegt darin vorzugsweise in einer Pufferl?sung vor, vorzugsweise in gepufferter Salzl?sung.

Die Erfindung umfasst ebenfalls eine Nukleins?ure, dessen Nukleotidsequenz f?r einen erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper kodiert. Bevorzugt enthalten die f?r die CDR der variablen Regionen der leichten und schweren Kette kodierenden Abschnitte folgende Nukleotidsequenzen:

  • ? CDR der variablen Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 7, CDR2 SEQ ID No. 9, CDR3 SEQ ID No. 11 und CDR der variablen Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 13, CDR2 SEQ ID No. 15, CDR3 SEQ ID No. 17 oder
  • ? CDR der variablen Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 8, CDR2 SEQ ID No. 10, CDR3 SEQ ID No. 12 und CDR der variablen Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 14, CDR2 SEQ ID No. 16, CDR3 SEQ ID No. 18.

Der Begriff ?Nukleins?uren? im Sinne der Erfindung umfasst neben Desoxyribonukleins?uren (DNA) und Ribonukleins?uren (RNA) auch alle anderen linearen Polymeren in denen die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) oder Uracil (U) in entsprechender Abfolge angeordnet sind (Nukleins?uresequenz). Die Erfindung umfasst dabei auch die korrespondierenden RNA-Sequenzen (in denen Thymin durch Uracil ersetzt ist), komplement?re Sequenzen und Sequenzen mit modifiziertem Nukleins?urer?ckgrat oder 3' oder 5'-Terminus. Der Begriff ?Nukleins?uresequenzen mit ver?ndertem R?ckgrat? umfasst dabei alle anderen linearen Polymere in denen die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) oder Uracil (U) in entsprechender Abfolge angeordnet sind, wie z. B. Sequenzen mit einem Phosphothioat-, Phosphoramidat- oder O-Methyl-derivatisierten R?ckgrat, Peptid-Nukleins?uren (PNA) und locked nucleic acids (LNA) oder gemischtem R?ckgrat. Der Begriff ?modifizierter 3' oder 5' Terminus? umfasst dabei sowohl Modifikationen, die der Stabilisierung dienen als auch das Anbinden von Markern. Beispiele f?r Marker sind Enzyme, Farbstoffe oder Fluoreszenzfarbstoffe, Radionukleotide, sowie Haptene, wie z. B. Digoxigenin oder Biotin.

Von der Erfindung ist auch ein Vektor (auch: ?Expressionsvektor?) umfasst, der eine erfindungsgem??e Nukleins?ure enth?lt. Im Sinne der Erfindung wird unter einem Expressionsvektor ein Plasmid, Virus oder anderer Tr?ger verstanden, der eine erfindungsgem??e Nukleins?uresequenz rekombinant durch Insertion oder Inkorporation enth?lt. Der Expressionsvektor enth?lt typischerweise einen Replikationsstartpunkt, einen Promoter, sowie spezifische Gensequenzen, die eine ph?notypische Selektion von den Expressionsvektor enthaltenden Wirtszellen erm?glichen.

Die Erfindung umfasst ferner eine Wirtszelle oder einen nicht-menschlichen Wirtsorganismus enthaltend eine erfindungsgem??e Nukleotidsequenz oder einen erfindungsgem??en Vektor. Die Nukleotidsequenz oder der Vektor sind dabei rekombinant in der Wirtszelle oder dem nicht-menschlichen Wirtsorganismus enthalten.

Eine Wirtszelle im Sinne der Erfindung ist eine nat?rlich vorkommende Zelle oder eine transformiert oder genetisch ver?nderte Zelllinie, welche mindestens einen erfindungsgem??en Vektor enth?lt. Die Erfindung umfasst dabei transiente Transfektanten (z. B. durch mRNA-Injektion) oder Wirtszellen, in denen mindestens ein erfindungsgem??er Expressionsvektor als Plasmid oder k?nstliches Chromosom enthalten ist, sowie Wirtszellen in denen ein erfindungsgem??er Expressionsvektor stabil in das Genom des Wirtes integriert ist. Die Wirtszelle ist bevorzugt ausgew?hlt aus Zellen von Prokaryonten und Eukaryonten. Bevorzugte Prokaryontenzellen sind ausgew?hlt aus Zellen von Escherichia coli und Bacillus subtilis. Bevorzugte Eukaryontenzellen sind ausgew?hlt aus Hefezellen (vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris), Insektenellen, amphibischen Zellen und S?ugetierzellen (vorzugsweise CHO, HeLa, HEK293).

Nicht-menschliche Wirtsorganismen enthalten einen erfindungsgem??en Vektor, der stabil in das Genom des Wirtsorganismus oder einzelner Zellen des Wirtsorganismus integriert ist. Bevorzugte Wirtsorganismen sind Pflanzen, Invertebraten oder Vertebraten, insbesondere Bovidae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis, Medaka, Zebrafisch oder Mus musculus, oder Zellen oder Embryonen der genannten Organismen.

Die Erfindung gibt anti-PSCA Antik?rper und dazugeh?rige Expressionssysteme an, mit denen humanes PSCA effektiver gebunden werden kann. Dadurch eignet sich der erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper besonders f?r den Einsatz in Therapiesystemen, bei denen die Abt?tung von Tumorzellen durch Rekrutierung von Effektorzellen vermittelt werden kann. Aufgrund der h?heren Affinit?t des erfindungsgem??en Antik?rpers zu PSCA ist f?r eine Bindung (beispielsweise in der therapeutischen Anwendung) nur noch eine wesentlich geringere Menge an Antik?rper erforderlich. Es konnte gezeigt werden, dass der erfindungsgem??e anti-PSCA Antik?rper in deutlich geringeren Konzentrationen und mit deutlich h?herer Effizienz die spezifische Lyse von PSCA-positiven Tumorzellen vermitteln kann. Dies hat einerseits Kostenvorteile, da der Antik?rperverbrauch reduziert werden kann. Andererseits in der therapeutischen Anwendung ist ein verbessertes Targeting vor allem auch von metastasierenden Zellen zu erwarten, sowie aufgrund der geringeren Einsatzmenge mit weniger Nebenwirkungen zu rechnen.

Anhand folgender Figuren und Ausf?hrungsbeispiele soll die Erfindung n?her erl?utert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschr?nken.

1 Schematische Darstellung unterschiedlicher erfindungsgem??er rekombinanter Antik?rper. A) Bispezifischer Antik?rper in Form eines scBsTaFv enthaltend eine Bindungseinheit gegen PSCA und eine Bindungseinheit gegen CD3. B) Erfindungsgem??er rekombinanter Antik?rper gegen PSCA enthaltend ein Peptid-Tag (5B9), zur Verwendung mit dem ebenfalls dargestellten bispezifischen Antik?rper in Form eines scBsTaFv enthaltend eine Bindungseinheit gegen CD3 und eine Bindungseinheit gegen die 5B9-Region des humanen La-Proteins. C) Erfindungsgem??er rekombinanter Antik?rper gegen PSCA enthaltend ein Peptid-Tag (7B6), zur Verwendung mit dem ebenfalls dargestellten bispezifischen Antik?rper in Form eines scBsTaFv enthaltend eine Bindungseinheit gegen CD3 und eine Bindungseinheit gegen die 7R6-Region des humanen La-Proteins. Die jeweiligen VH und VL Untereinheiten sind ?ber die Linkerpeptide mit den in den Abbildungen angegebenen Aminos?uresequenzen verkn?pft.

2 SDS-PAGE rekombinanter Antik?rper. Spur 1: bispezifischer humanisierter Antik?rper CD3-7B6 (scBsTaFv CD3-7B6); Spur 2: bispezifischer humanisierter Antik?rper CD3-5B9 (scBsTaFv CD3(G4S)-5B9); Spur 3: erfindungsgem??er bispezifischer muriner Antik?rper CD3-PSCA(7F5) (scBsTaFv CD3-PSCA(7F5)); Spur 4: erfindungsgem??er monospezifischer humanisierter Antik?rper scFv PSCA(MB1)-7B6; Spur 5: bispezifischer humanisierter Antik?rper CD3-PSCA(MB1) (scBsTaFv CD3-PSCA(MB1)); Spur 6: erfindungsgem??er monospezifischer humanisierter Antik?rper scFv PSCA(MB1)-5B9. M... Marker mit Fragmentgr??en (von oben nach unten): 70 kDa, 55 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 15 kDa.

3 Spezifische Lyse 51Cr -beladener PC3-PSCA Tumorzellen im Versuch nach Ausf?hrungsbeispiel 4. Die Balken korrespondieren mit folgenden Versuchen: 1 (schwarz) ... humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1; 2 (wei?) muriner bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1; 3 (gestreift) ... humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (Vergleichsbeispiel); 4 (gepunktet) ... muriner bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (Vergleichsbeispiel).

4 Ausgebildete Tumorfl?che nach Transfer von PSCA-positiven Tumorzellen, T Zellen und Antik?rper wie in Ausf?hrungsbeispiel 5 beschrieben. A) Effektor-Target-Verh?ltnis 1:1; B) Effektor-Target-Verh?ltnis 10:1. Die nummerierten Linien korrespondieren mit folgenden Versuchen: 1 ... bispezifischer Kontrollantik?rper anti-CD3xanti-5B9 (Kontrolle); 2 ... monospezifischer humanisierter scFv anti-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1 (Kontrolle); 3 ... Kontrollversuch ohne Antik?rper (Negativkontrolle); 4 ... humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1 (erfindungsgem??); 5 humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) wie in Beispiel 3 beschrieben (Vergleichsbeispiel); 6 ... humanisierter bispezifischer scBsDb CD3xPSCA(7F5), der die PSCA-bindenden variablen Regionen des 7F5 Antik?rpers enth?lt (Vergleichsbeispiel).

Ausf?hrungsbeispiel 1: Herstellung von bispezifischen rekombinanten Antik?rpern (scBsTaFv), die spezifisch an PSCA binden (direktes Targeting)

Zum Einsatz f?r das Targeting von PSCA+ Zellen wurde ein bispezifischer Antik?rper (single chain bispecific diabody, scBsTaFv) hergestellt, der mit einer Bindungseinheit an PSCA und mit der anderen Bindungseinheit an CD3 bindet. Der bispezifische Antik?rper wird hierin auch vereinfacht als CD3-PSCA(MB1) bezeichnet und ist schematisch in 1A abgebildet.

Die PSCA-bindende Dom?ne, enth?lt die variable Region des erfindungsgem??en anti-PSCA MB1 Antik?rpers (muriner anti-PSCA Antik?rper: schwere Kette SEQ ID No. 22, leichte Kette SEQ ID No. 20; humanisierter anti-PSCA Antik?rper: schwere Kette SEQ ID No. 26, leichte Kette SEQ ID No. 24). Sie dient zur Bindung an die PSCA-positiven Tumorzellen. Die andere Dom?ne bindet an CD3, einen Bestandteil des T Zell Rezeptor Komplexes, und dient zur Aktivierung von T Zellen. Dadurch wird die Rekrutierung von T Zellen an die PSCA-positiven Zeilen erm?glicht und vermittelt auf diese Weise die spezifische Lyse der PSCA-positiven Zellen durch die T Zellen.

F?r die Generierung der monoklonalen anti-PSCA MB1 Antik?rper wurden H-2d positive C3Hx Balb/c F1-M?use mit P815-Zellen immunisiert, die PSCA rekombinant auf der Oberfl?che exprimierten. Durch die Fusion von Milzzellen und Myelomzellen entstanden Hybridomazellen, die monoklonale anti-PSCA Antik?rper sezernierten. Nach Einzellklonierung dieser Hybridomazellen konnte der Klon MB1 selektioniert werden. F?r die Generierung von rekombinanten anti-PSCA MB1 Antik?rpern wurden die Nukleins?uresequenzen der variablen Dom?ne der schweren (VH) und leichten (VL) Antik?rperkette identifiziert. Daf?r wurde zun?chst die mRNA aus den anti-PSCA MB1 sezernierenden Hybridomazellen isoliert und in cDNA umgeschrieben. Anschlie?end wurde die variable Dom?ne der schweren Kette vom Isotyp IgG1 mit degenerierten Primern (Primerpaar SEQ ID No. 90 und 91) sowie die variable Dom?ne der leichten ? Kette mit Hilfe degenerierter Primer (Primerpaar SEQ ID No. 92 und 93) amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden jeweils in den Vektor pGEM T-easy subkloniert und sequenziert.

F?r die Klonierung des murinen Einzelkettenfragments (scFv) des anti-PSCA MB1 Antik?rpers (hierin vereingacht als ?scFv MB1? bezeichnet), bei dem die variable Region der schweren Kette ?ber drei Glycin-Serin Linker (G4S, SEQ ID No. 131) mit der variablen Region der leichten Kette verkn?pft ist, wurde die Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des anti-PSCA MB1 Antik?rpers mit Hilfe des Primerpaares gem?? SEQ ID No. 94 und 95 amplifiziert. Die Nukleins?uresequenz der variablen Region der leichten Kette des anti-PSCA MB1 Antik?rpers wurde mit Hilfe des Primerpaares gem?? SEQ ID No. 96 und 97 amplifiziert. Die amplifizierten Nukleins?uren wurden mittels overlap PCR zum scFv PSCA MB1 fusioniert und ?ber SfiI und NotI in den eukaryotischen Expressionsvektor pSecTag2B kloniert (der Expressionsvektor wird hierin auch als ?pSecTag2B_scFv MB1 murin? bezeichnet).

F?r die Klonierung des bispezifischen Tandemantik?rpers (scBsTaFv), der gegen PSCA und CD3 gerichtet ist und der die CDR Regionen des murinen MB1 Antik?rpers enth?lt, wurde die Nukleins?uresequenz eines murinen anti-CD3 scFv mit einem Primerpaar gem?? SEQ ID No. 98 und 99 amplifiziert und ?ber ApaI 3'-seitig vom murinen scFv MB1 in den zuvor produzierten Expressionsvektor ?pSecTag2B_scFv MB1 murin? kloniert, so dass der Vektor ?pSecTag2B_scBsTaFv PSCA(MB1)-CD3 murin? entstand.

F?r die Klonierung des bispezifischen Tandemantik?rpers (scBsTaFv), der gegen PSCA und CD3 gerichtet ist und der die CDR Regionen des humanisierten MB1 Antik?rpers enth?lt, wurden die Ger?stregionen (FWR) der PSCA MB1 und CD3 Antik?rper humanisiert. Daf?r wurden die FWR der der variablen murinen Antik?rperdom?nen gegen die humanen FWR-Sequenzen eines hoch homologen humanen IgG1 ersetzt. Dar?ber hinaus wurden die humanisierten Antik?rpersequenzen hinsichtlich ihrer Expression und Sekretion durch humane Zelllinien optimiert. F?r die Humanisierung des murinen scFv CD3 bzw. scFv MB1 wurden zun?chst die humanisierten VH- und VL-Sequenzen einzeln wie vorstehend beschrieben amplifiziert und anschlie?end ?ber PCR zusammengef?gt. Die Humanisierung der VH- bzw. VL-Sequenz erfolgte dabei durch die Zusammenlagerung von ?berlappenden Oligonukleotiden und anschlie?ender Amplifikation der humanisierten VH- bzw. VL-Nukleins?uresequenz. Um die Sequenzen der ?berlappenden Oligonukleotide festlegen zu k?nnen, wurde zun?chst die murine VH- bzw. VL-Sequenz gegen eine humane IgG Datenbank (NCBI IgBlast) abgeglichen, der humane IgG mit der gr??ten Homologie identifiziert und letztendlich die humanisierte VH- bzw. VL-Sequenz theoretisch erstellt und die ?berlappenden Oligonukleotide synthetisiert. Es wurden verschiedene bispezifische Antik?rper konstruiert, bei denen unterschiedlich lange Linkerpeptide eingesetzt wurden.

Humanisierung des anti-CD3 Antik?rpers

F?r die Humanisierung der variablen Region der schweren Kette des anti-CD3 Antik?rpers wurden Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 100 bis 105 zusammengelagert. Anschlie?end wurde die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des anti-CD3 Antik?rpers (mit einem G4S-Linkerpeptid, SEQ ID No. 132) mit Hilfe des Primerpaares gem?? SEQ ID No. 105 und 106 amplifiziert. F?r die Humanisierung der variablen Region der leichten Kette des anti-CD3 Antik?rpers wurden Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 107 bis 112 zusammengelagert. Die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der leichten Kette des anti-CD3 Antik?rpers wurde mit dem Primerpaar gem?? SEQ ID No. 112 und 113 amplifiziert.

F?r die Generierung des humanisierten scFv des anti-CD3 Antik?rpers, bei dem die variable Region der schweren Kette ?ber einen Glycin-Serin Linker (G4S) mit der variablen Region der leichten Kette verkn?pft ist, wurde zuerst die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des anti-CD3 Antik?rpers ?ber SfiI und BamHI in den Expressionsvektor pSecTag2B kloniert und anschlie?end ?ber BamHI und NotI die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der leichten Kette des anti-CD3 Antik?rpers stromabw?rts davon in denselben Expressionsvektor gesetzt.

F?r die Generierung des humanisierten scFv des anti-CD3 Antik?rpers, bei dem die variable Region der schweren Kette ?ber drei Glycin-Serin Linker (G4S) mit der variablen Region der leichten Kette verkn?pft ist, wurde zuerst die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des anti-CD3 Antik?rpers mit drei Glycin-Serin Linkern (G4S) hergestellt. Daf?r wurde die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des anti-CD3 Antik?rpers (mit drei G4S-Linkerpeptiden) mit Hilfe des Primerpaares gem?? SEQ ID No. 105 und 114 amplifiziert und ?ber SfiI und BamHI in den Expressionsvektor pSecTag2B kloniert und anschlie?end ?ber BamHI und NotI die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der leichten Kette des anti-CD3 Antik?rpers stromabw?rts davon in denselben Expressionsvektor gesetzt.

Humanisierung des anti-PSCA MB1 Antik?rpers

F?r die Humanisierung der variablen Region der leichten Kette des anti-PSCA MB1 Antik?rpers wurden Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 115 bis 118 zusammengelagert. Die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der leichten Kette des anti-PSCA MB1 Antik?rpers wurde mit dem Primerpaar gem?? SEQ ID No. 119 und 120 amplifiziert.

F?r die Humanisierung der variablen Region der schweren Kette des anti-PSCA MB1 Antik?rpers wurden Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 121 bis 125 zusammengelagert. Die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des anti-PSCA MB1 Antik?rpers wurde mit dem Primerpaar gem?? SEQ ID No. 126 und 127 amplifiziert.

Herstellung des bispezifischen humanisierten Antik?rpers scBsTaFv CD3-PSCA(MB1)

Schlie?lich wurden die humanisierten Nukleins?uresequenzen der variablen Region der schweren Kette und der variablen Region der leichten Kette des MB1 Antik?rpers mittels overlap PCR unter Verwendung der Primer gem?? SEQ ID No. 128 und 129 zusammengelagert und amplifiziert. Die so generierte Nukleins?uresequenz codierend f?r den humanisierten scFv MB1 (in der Organisation VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-VH, Linkerpeptid gem?? SEQ ID No. 130) wurde ?ber XhoI und ApaI stromabw?rts von dem oben beschriebenen humanisierten scFv des anti-CD3 Antik?rpers (mit drei G4S-Linkerpeptiden) kloniert, wobei der Expressionsvektor ?pSecTag2B_scBsTaFv PSCA(MB1)-CD3 human? entstand.

Zur Expression des bispezifischen humanisierten Antik?rpers gem?? 1A wurden Hek293T Zellen mit dem Expressionsvektor transfiziert und die sezernierten Antik?rper aus den Zellkultur?berst?nden mittels Nickel-Affinit?tschromatographie gegebenenfalls in Kombination mit einer fraktionierten Ammoniumsulfatf?llung aufgereinigt. 2 Spur 5 zeigt eine SDS-Gelelektrophorese Aufnahme des aufgereinigten bispezifischen Antik?rpers.

Ausf?hrungsbeispiel 2: Herstellung von bispezifischen rekombinanten Antik?rpern, die spezifisch an PSCA binden (modulares Targeting)

Zur Bereitstellung einer erfindungsgem??en pharmazeutischen Zusammensetzung (?modulares Targeting System 1?, schematisch in 1B dargestellt) wurden folgende rekombinante Antik?rper hergestellt:

  • ? erfindungsgem??er rekombinanter anti-PSCA Antik?rper enthaltend ein Peptid gem?? SEQ ID No. 75 (hierin auch ?E5B9?). Dieser Antik?rper wird im Folgenden als scFv PSCA(MB1)-E5B9 bezeichnet.
  • ? bispezifischer Antik?rper (scBsTaFv), der gegen CD3 und das Peptid gem?? SEQ ID No. 75 gerichtet ist. Das gegen CD3 gerichtete Paratop umfasst die folgenden Aminos?uresequenzen der variablen Regionen: schwere Kette SEQ ID No. 65, leichte Kette SEQ ID No. 57. Das gegen das Peptid gem?? SEQ ID No. 75 gerichtete Paratop umfasst folgende Aminos?uresequenzen der hypervariablen Regionen der variablen Regionen: leichte Kette CDR1 SEQ ID No. 78, CDR2 SEQ ID No. 79, CDR3 SEQ ID No. 80, schwere Kette CDR1 SEQ ID No. 81, CDR2 SEQ ID No. 82, CDR3 SEQ ID No. 83. Dieser Antik?rper wird im Folgenden als scBsTaFv CD3-5B9 bezeichnet. Es wurden zwei unterschiedliche scBsTaFv CD3-5B9 hergestellt, die sich lediglich voneinander in dem Linkerpeptid zwischen VH und VL des anti-CD3Antik?rpers unterscheiden (siehe 1B).

Klonierung des humanisierten scFv PSCA(MB1)-E5B9:

F?r die Generierung des humanisierten scFv PSCA(MB1) mit E5B9-Epitop am C-Terminus (MB1 [VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-MB1 VH]-[G4S-E5B9], dargestellt in 1B unten) wurde der in Ausf?hrungsbeispiel 1 beschriebene humanisierte scFv PSCA(MB1) (MB1 VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-MB1 VH-G4S, Linkerpeptide gem?? SEQ ID No. 130 und 132) mittels der Primer gem?? SEQ ID No. 134 und 135 amplifiziert und anschlie?end ?ber SfiI und NotI in pSecTag2B kloniert. Nach Zusammenlagerung der Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 136 und 137 wurde die Nukleins?uresequenz f?r E5B9 ?ber NotI und XhoI 3'-seitig vom humanisierten scFv PSCA(MB1) einkloniert, wobei das Konstrukt ?pSecTag2B_scFv PSCA(MB1)-E5B9 humanisiert? entstand.

Klonierung zweier an T-Zellen und an das E5B9-Peptid bindender Effektormodule ?scBsTaFv CD3(G4S)-5B9? und ?scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9?

Wie schematisch in 1B dargestellt ist, wurden zum Aufbau des modularen Targetingsystems I umfassend das scFv PSCA(MB1)-5B9 zwei sogenannte Effektormodule (bispezifische Antik?rper scBsTaFv CD3-5B9) hergestellt, die sich in der Anzahl der Glycin-Serin (G4S) Elemente des Linkerpeptids zwischen der VH und VL-Kette der anti-CD3 Dom?ne unterscheiden und deshalb als ?scBsTaFv CD3(G4S)-5B9? bzw. ?scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9? bezeichnet wurden.

? Klonierung des ?scBsTaFv CD3(G4S)-5B9? humanisiert (Schema siehe Fig. 1B oben):

F?r die Humanisierung der variablen Region der schweren Kette des 5B9 Antik?rpers (spezifisch gegen das Peptid E5B9 gerichtet) wurden Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 138 bis 142 zusammengelagert. Anschlie?end wurde die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des 5B9 Antik?rpers (mit einem G4S-Linkerpeptid, SEQ ID No. 132) mit Hilfe des Primerpaares gem?? SEQ ID No. 143 und 144 amplifiziert. F?r die Humanisierung der variablen Region der leichten Kette des 5B9 Antik?rpers wurden Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 145 bis 149 zusammengelagert. Die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der leichten Kette des 5B9 Antik?rpers wurde mit dem Primerpaar gem?? SEQ ID No. 150 und 151 amplifiziert.

Schlie?lich wurden die humanisierten Nukleins?uresequenzen f?r 5B9 VH und 5B9 VL mittels overlap PCR unter Verwendung der Primer gem?? SEQ ID No. 152 und 153 zusammengelagert und amplifiziert. Die so generierte Nukleins?uresequenz f?r den humanisierten scFv 5B9 (VH-3xG4S-VL) wurde ?ber XhoI und ApaI stromabw?rts vom humanisierten scFv CD3 VH-G4S-VL in den ?pSecTag2B_scFv CD3 VH-G4S-VL? humanisiert kloniert, wobei der Vektor ?pSecTag2B_scBsTaFv CD3(G4S)-5B9 humanisiert? entstand.

? Klonierung des ?scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9? humanisiert (Schema siehe Fig. 1B Mitte):

Die humanisierte Sequenz f?r scFv 5B9 (VH-3xG4S-VL) wurde ?ber XhoI und ApaI stromabw?rts vom humanisierten scFv CD3 (VH-3xG4S-VL) in den ?pSecTag2B_scFv CD3 VH-3xG4S-VL? humanisiert kloniert, wobei der Vektor ?pSecTag2B_scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9 humanisiert? entstand.

Zur Bereitstellung einer erfindungsgem??en pharmazeutischen Zusammensetzung (?modulares Targeting System 2?, schematisch in 1C dargestellt) wurden folgende rekombinante Antik?rper hergestellt:

  • ? erfindungsgem??er rekombinanter anti-PSCA Antik?rper enthaltend ein Peptid gem?? SEQ ID No. 76 (hierin auch als ?E7B6? bezeichnet). Dieser Antik?rper wird im Folgenden als scFv PSCA(MB1)-E7B6 bezeichnet.
  • ? bispezifischer Antik?rper (scBsTaFv), der gegen CD3 und das Peptid gem?? SEQ ID No. 76 gerichtet ist. Das gegen CD3 gerichtete Paratop umfasst die folgenden Aminos?uresequenzen der variablen Regionen: schwere Kette SEQ ID No. 65, leichte Kette SEQ ID No. 57. Das gegen das Peptid gem?? SEQ ID No. 76 gerichtete Paratop umfasst folgende Aminos?uresequenzen der hypervariablen Regionen der variablen Regionen: leichte Kette CDR1 SEQ ID No. 84, CDR2 SEQ ID No. 85, CDR3 SEQ ID No. 86, schwere Kette CDR1 SEQ ID No. 87, CDR2 SEQ ID No. 88, CDR3 SEQ ID No. 89. Dieser Antik?rper wird im Folgenden als scBsTaFv CD3-7B6 bezeichnet.

Klonierung des humanisierten scFv PSCA(MB1)-E7B6:

F?r die Generierung des humanisierten scFv PSCA(MB1) mit E7B6-Epitop am C-Terminus MB1 [VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-MB1 VH]-[G4S-E7B6], dargestellt in 1C unten) wurde zun?chst die Zusammenlagerung der Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 154 und 155 durchgef?hrt und anschlie?end die Klonierung der E7B6-Nukleins?uresequenz ?ber NotI und XhoI 3'-seitig in ?pSecTag2B_scFv PSCA(MB1) humanisiert? (VL-G4SG4SGASAAG4SG4S-VH-G4S, analog zum oben beschriebenen Konstrukt mit dem E5B9 Peptid), wobei der Vektor ?pSecTag2B_scFv PSCA(MB1)-E7B6 humanisiert? entstand.

Klonierung eines an T-Zellen und an das E7B6-Peptid bindenden Effektormoduls ?scBsTaFv CD3(3xG4S)-7B6? humanisiert:

F?r die Humanisierung der variablen Region der schweren Kette des 7B6 Antik?rpers (spezifisch gegen das Peptid E7B6 gerichtet) wurden ?berlappende Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 156 bis 160 zusammengelagert. Anschlie?end wurde die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der schweren Kette des 7B6 Antik?rpers (mit einem G4S-Linkerpeptid, SEQ ID No. 132) mit Hilfe des Primerpaares gem?? SEQ ID No. 161 und 162 amplifiziert. F?r die Humanisierung der variablen Region der leichten Kette des 7B6 Antik?rpers wurden Oligonukleotide gem?? SEQ ID No. 163 bis 167 zusammengelagert. Die humanisierte Nukleins?uresequenz der variablen Region der leichten Kette des 7B6 Antik?rpers wurde mit dem Primerpaar gem?? SEQ ID No. 168 und 169 amplifiziert.

Schlie?lich wurden die humanisierten Nukleins?uresequenzen f?r 7B6 VH und 7B6 VL mittels overlap PCR unter Verwendung der Primer gem?? SEQ ID No. 170 und 171 zusammengelagert und amplifiziert. Die so generierte Nukleins?uresequenz f?r den humanisierten scFv 7B6 (VH-3xG4S-VL) wurde ?ber XhoI und ApaI stromabw?rts vom humanisierten scFv CD3 VH-G4S-VL in den ?pSecTag2B_scFv CD3 VH-G4S-VL? humanisiert kloniert, wobei der Vektor ?pSecTag2B_scBsTaFv CD3(G4S)-7B6 humanisiert? entstand.

Zur Expression der einzelnen Fusionsproteine der modularen Targeting Systeme 1 und 2 wurden Hek293T Zellen mit den Expressionsvektoren transfiziert und die sezernierten rekombinanten scFv (scFv PSCA-E5B9 oder scFv PSCA-E7B6) und die bispezifischen Antik?rper (scBsTaFv CD3(G4S)-5B9 bzw. scBsTaFv CD3(3xG4S)-5B9 und scBsTaFv CD3-7B6) aus dem Zellkultur?berstand mit Hilfe von Affinit?tschromatographie ?ber Ni-NTA Agarose (Qiagen, Hilden, Deutschland) (gegebenenfalls in Kombination mittels einer fraktionierten Ammoniumsulfatf?llung) aufgereinigt. Per SDS-Page und Immunoblot wurde die Reinheit und Stabilit?t der rekombinanten Antik?rperderivate nachgewiesen (2)

Ausf?hrungsbeispiel 3: Bestimmung der Dissoziationskonstante der Bindung an PSCA

Die Ermittlung der Affinit?tskonstante f?r die jeweilige anti-PSCA Dom?ne der rekombinanten, bispezifischen Antik?rper mit dem anti-PSCA MB1 Antik?rper (erfindungsgem??) und dem anti-PSCA 7F5 Antik?rper (Vergleichsbeispiel, Antik?rper aus [Feldmann 2010]) basierte auf einer durchflusszytometrischen Analyse der Bindung an PSCA-positive PC3 Zellen.

F?r die Generierung der Bindungskurven der rekombinanten anti-PSCA Antik?rperdom?nen wurden jeweils 2 ? 105 PSCA-positive Zellen mit 100 ?l der bispezifischen Antik?rper (MB1 und 7F5) f?r 1 h bei 4?C inkubiert. Die Antik?rper wurden jeweils in folgenden Konzentrationen eingesetzt:

Antik?rpermenge je Ansatz in ngAntik?rper-Konzentration in pmol/l10009000010090005045001090054501900,5450,190,054,50,010,90,0010,09

Um die spezifische Bindung der rekombinanten CD3-PSCA Antik?rper nachzuweisen, wurde ein Maus-anti-c-myc IgG-FITC Nachweisantik?rper (AbD Serotec, D?sseldorf, Deutschland) verwendet, der nach Abschluss des ersten F?rbeschrittes f?r 30 min bei 4?C mit den anti-PSCA Antik?rpermarkierten PSCA-positiven Zellen inkubiert wurde. Als Negativkontrolle wurde eine Probe mitgef?hrt, in der PSCA-positive Zellen nur mit dem Nachweisantik?rper Maus-anti-c-myc IgG-FITC angef?rbt wurde. Die Zellen wurden an einem BD FACS Calibur Flow Cytometer (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) analysiert und die Daten wurden mit Hilfe der Software WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, La Jolla, CA USA) ausgewertet.

Zur Auswertung wurden die ermittelten MFI-Werte (mittlere Fluoreszenzintensit?tswerte) gegen die getesteten Antik?rperkonzentrationen aufgetragen und jeweils eine Trendlinie vom polynomischen Regressionstyp zweiter Ordnung berechnet. Um die Affinit?tskonstante zu ermitteln, wurde eine Trendlinie vom polynomischen Regressionstyp zweiter Ordnung berechnet und eingef?gt. Die daraus resultierende Bindungskurve diente als Grundlage zur Berechnung der Affinit?tskonstanten KD, welche als diejenige Konzentration definert ist, die beim 50%-Wert des maximalen MFI-Wertes und somit bei halbmaximaler S?ttigung der Bindung erreicht wird. Um diese Konstante zu berechnen, wurde zun?chst die erste Ableitung der Bindungskurve, welche einer quadratischen Funktion folgt, gebildet. Um ausgehend von dieser Gleichung das Maximum der Funktion zu ermitteln, wurde die erste Ableitung ?Null? gesetzt und nach x aufgel?st. Durch Einsetzen des erhaltenen x-Wertes in die Ausgangsgleichung wurde das Maximum der Funktion ymax und somit ymax/2, welches dem MFI-Wert bei halbmaximaler Abs?ttigung der Bindungsstellen entspricht, errechnet. Da der KD-Wert dem x-Wert bei ymax/2 entspricht, kann dieser durch Einsetzen des ymax/2-Wertes in die quadratische Funktion der Bindungskurve und Umstellen der Gleichung nach x abschlie?end kalkuliert werden Folgende KD-Werte wurden auf diese Weise f?r die Bindung an PSCA ermittelt:

KDscBsTaFv CD3xPSCA(MB1)6,3 ? 10?7scBsTaFv CD3xPSCA(7F5)2,3 ? 10?6

Es konnte gezeigt damit werden, dass die Affinit?t des erfindungsgem??en anti-PSCA Antik?rper zum Antigen PSCA eine Gr??enordnung h?her ist, als die des aus dem Stand der Technik bekannten Antik?rpers 7F5.

Ausf?hrungsbeispiel 4: Spezifische Lyse von PSCA+ Zellen mit bispezifischen anti-PSCA Antik?rpern

Im Chromfreisetzungstest wurden voraktivierte PBMCs 5 ? 104 mit 5 ? 10351Cr-beladene PC3-PSCA Tumorzellen (Effektor-Target-Verh?ltnis = 10:1) in An- und Abwesenheit der rekombinanten Antik?rper in RPMI Medium in einem Gesamtvolumen von 200 ?l kokultiviert. Dazu wurden die erfindungsgem??en Antik?rper aus Beispiel 1 eingesetzt (sowohl in muriner als auch in humanisierter Form). Als Vergleichsbeispiel wurde der aus dem Stand der Technik bekannter muriner anti-PSCA(7F5) Antik?rper in einem gleichartig aufgebauten bispezifischen Antik?rper eingesetzt. Die variablen Regionen des 7F5 Antik?rpers entsprechen: schwere Kette SEQ ID No. 48, leichte Kette SEQ ID No. 50. Es wurden Versuche mit folgenden konkreten Antik?rperkonstrukten durchgef?hrt:

  • 1. humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1
  • 2. muriner bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1
  • 3. humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (Vergleichsbeispiel)
  • 4. muriner bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) (Vergleichsbeispiel)

Nach 20 h Inkubation bei 37?C im Brutschrank wurde das ins Medium freigesetzte Chrom gemessen. Die spezifische Lyse wurde wie folgt berechnet: Spezifische Lyse in % = (freigesetztes 51Cr ? spontan freigesetztes 51Cr (Minimum)]/[maximal freigesetztes 51Cr (Maximum) ? Minimum] ? 100%

Die Ergebnisse des in vitro Versuchs sind graphisch in 3 dargestellt. Dargestellt ist der prozentuale Anteil lysierter PC3 Zellen an den insgesamt eingesetzten PC3 Zellen (y-Achse). W?hrend die erfindungsgem??en Antik?rper der Versuchsgruppen 1 und 2 bereits bei Mengen von weniger als 1 ng eine starke Lyse der PSCA-positiven Zellen zeigen, ist bei dem bekannten 7F5 Antik?rper in einem vergleichbaren Konstrukt (Versuchsgruppen 3 und 4) eine detektierbare Lyse erst beim Einsatz mehrerer ng des Antik?rpers festzustellen. Maximal wurde eine Lyse von etwa 60% der eingesetzten PC3 Zellen festgestellt. Mit den erfindungsgem??en Antik?rpern konnten bereits beim Einsatz von einer deutlich geringeren Antik?rpermenge eine Lyse von etwa 80% der eingesetzten PC3 Zellen festgestellt werden. Maximal konnten mehr als 90% der eingesetzten PC3 Zellen mit einem erfindungsgem??en Antik?rper (Versuchsgruppe 1) lysiert werden.

Ausf?hrungsbeispiel 5: Hemmung des Tumorwachstums durch scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) humanisiert in vivo

Zum Nachweis der Wirksamkeit des erfindungsgem??en anti-PSCA MB1 Antik?rpers wurde der Effekt eines davon abgeleiteten bispezifischen Antik?rpers scBsTaFv CD3-PSCA(MB1), der nach Ausf?hrungsbeispiel 1 hergestellt wurde (schematisch dargestellt in 1A, oben), im murinen Tumormodell getestet. Als Modellorganismus wurden Nacktm?use eingesetzt, die nach Transfer von PSCA-positiven PC3 Tumorzellen Tumoren ausbilden. Im Versuch wurden PSCA-positiven Tumorzellen in Kombination mit T Zellen und einem Antik?rper transferiert.

Folgende Antik?rper wurden daf?r eingesetzt, wobei je Maus 10 ?g Antik?rper injiziert wurden:

  • (1) bispezifischer Kontrollantik?rper anti-CD3xanti-5B9 (Kontrolle)
  • (2) monospezifischer humanisierter scFv anti-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1 (Kontrolle)
  • (3) Kontrollversuch ohne Antik?rper (Negativkontrolle)
  • (4) humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1
  • (5) humanisierter bispezifischer scBsTaFv CD3-PSCA(7F5) wie in Beispiel 3 beschrieben (Vergleichsbeispiel)
  • (6) humanisierter bispezifischer scBsDb CD3xPSCA(7F5), der die PSCA-bindenden variablen Regionen des 7F5 Antik?rpers enth?lt (Vergleichsbeispiel)

Die Wirkung der bispezifischen Antik?rper beruht auf der Rekrutierung der CD3-positiven T-Zellen zu den PSCA-positiven Tumorzellen und der dadurch vermittelten Lyse der Tumorzellen.

In einem ersten Versuch wurden 5 ? 103 PSCA-positive Tumorzellen in jeweils 8 Nacktm?use pro Versuchsgruppe und 5 ? 103 T-Zellen transferiert (Effektor-Target-Verh?ltnis 1:1). In den Kontrollgruppen (1) und (3) wurde in Abwesenheit eines anti-PSCA Antik?rpers rapides Tumorwachstum festgestellt. Auch der Kontrollversuch (2), bei dem der monospezifische scFv anti-PSCA(MB1) injiziert wurde, zeigte rapides Tumorwachstum. Dadurch l?sst sich ein cytotoxischer Effekt des monospezifischen Antik?rpers ausschlie?en und die Wirksamkeit allein dem bispezifischen Konstrukt zugeschrieben werden. Die Tumorfl?che der gebildeten Tumoren wurde 25 Tage nach Zelltransfer ermittelt. Die drei Kontrollgruppen zeigten keinen signifikanten Unterschied der Tumorfl?che (4A).

Bei Transfer der bispezifischen Vergleichsantik?rpers, die die variablen Regionen des anti-PSCA 7F5 Antik?rpers enthalten (Vergleichsgruppen (5) in Form eines Tandemantik?rpers und (6) in Form eines Diabodys) wurde ebenfalls ein rapides Tumorwachstum festgestellt (Daten nicht dargestellt). Auch in einem zweiten Versuch, bei der die Tumorzellen in einem Effektor-Target-Verh?ltnis von 10:1 (also bei 10-facher Menge T Zellen; Transfer von 5 ? 103 PSCA-positiven Tumorzellen und 5 ? 104 T Zellen) wurde ein rapides Tumorwachstum festgestellt, dass keinen statistisch signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe (1) zeigte (4B). Das Tumorwachstum wurde durch die anti-PSCA 7F5 Antik?rper nicht gehemmt, sondern lediglich leicht verz?gert. Auch bei T Zell ?berschuss kann somit keine in vivo Hemmung des Tumorwachstums durch den anti-PSCA 7F5 Antik?rper festgestellt werden.

Der Transfer des erfindungsgem??en bispezifischen Antik?rpers scBsTaFv CD3-PSCA(MB1) aus Ausf?hrungsbeispiel 1 bei einem Effektor-Target-Verh?ltnis 1:1 konnte das Tumorwachstum signifikant verringern. W?hrend 25 Tage nach Zelltransfer in 2 der 8 Versuchstiere Tumoren mit einer deutlich geringen Fl?che (Durchmesser etwa 2 mm) auftraten, blieben 6 der 8 Versuchstiere tumorfrei (4A). Der erfindungsgem??e anti-PSCA MB1 Antik?rper (Versuchsgruppe (4)) ist somit dem vergleichbar aufgebautem anti-PSCA 7F5 Antik?rper (Versuchsgruppe (5)) hinsichtlich der in vivo Wirksamkeit unter identischen Versuchsbedingungen deutlich ?berlegen.

Zitierte Nichtpatentliteratur

  • Feldmann A, Stamova S. Bippes CC, Bartsch H, Wehner R, Schmitz M, Temme A, Cartellieri M, Bachmann M. Retargeting of T cells to prostate stem cell antigen expressing tumor cells: comparison of different antibody formats. Prostate. 2011 Jun 15; 71(9): 998?1011. doi: 10.1002/pros.21315. Epub 2010 Dec 28.
  • Gu Z, Yamashiro J, Kono E, Reiter RE. Anti-prostate stem cell antigen monoclonal antibody 1G8 induces cell death in vitro and inhibits tumor growth in vivo via a Fc-independent mechanism. Cancer Res. 2005 Oct 15; 65(20): 9495?500.
  • Morgenroth A, Cartellieri M, Schmitz M, G?nes S, Weigle B, Bachmann M, Abken H, Rieber EP, Temme A. Targeting of tumor cells expressing the prostate stem cell antigen (PSCA) using genetically engineered T-cells. Prostate. 2007 Jul 1; 67(10): 1121?31.
  • Reiter, RE., Gu, Z., Watabe, T., Thomas, G., Szigeti, K., Davis, E., Wahl, M., Nisitani, S., Yamashiro, J., Le Beau, M. M., Loda, M. und Witte, O. N. Prostate stem cell antigen: A cell surface marker overexpressed in prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 95(4): 1735?40 (1998)
  • Roehl, K. A., M. Han, C. G. Ramos, J. A. V. Antenor, and W. J. Catalona. Cancer progression and survival rates following anatomical radical retropubic prostatectomy in 3,478 consecutive patients: long-term results. J Urol, 172(3): 910?4, Sep 2004.
  • Thomas-Kaskel, A.-K., R. Zeiser, R. Jochim, C. Robbel, W. Schultze-Seemann, C. F. Waller, and H. Veelken. Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival. Int J Cancer, 119(10): 2428?34, Nov 2006.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Ver?ffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgef?hrten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschlie?lich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA ?bernimmt keinerlei Haftung f?r etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • WO 2009/032949 A2 [0006, 0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Roehl 2004 [0002]
  • Reiter 1998 [0004]
  • Thomas-Kaskel 2006 [0005]
  • Gu 2005 [0007]
  • Feldmann 2010 [0009]
  • Morgenroth 2007 [0009]
  • Feldmann 2010 [0010]
  • Feldmann 2010 [0088]