Title:
Substrate useful for chemiluminescence detection using enhancers or enhanced chemiluminescence reactions on carriers, comprises luminophore luminol, where e.g. enhancer concentration is optimized with respect to luminol concentration
Kind Code:
A1


Abstract:
Substrate for chemiluminescence detection using enhancers or enhanced chemiluminescence (ECL) reactions on carriers, where separated antigens are transferred on sheet-like structures, and is visualized using chemiluminescence by incubating the carrier in the substrate and exposing it in a camera-based imaging system optionally with booster function, comprises luminophore luminol, where the enhancer concentration, the enhancer-luminol ratio, the buffer system, and the hydrogen peroxide concentration are optimized with respect to the luminol concentration. An independent claim is also included for a device for chemiluminescence detection using enhancers/ECL-reactions on carriers, comprising a light-tight dark hood (1) having at least one closable opening (2) for introducing a sample table (3) into the inner space of the dark hood, where the sample table is provided with booster function, which exhibit associated light sources (6) for system validation, and is positioned within the dark hood during the detection such that the sample table is brought in operative connection with a camera (4) with cooling and lens, which is arranged in inner space of the dark hood.



Inventors:
Mixtacki, Heiko, Dipl.-Ing. (09387, Jahnsdorf, DE)
Application Number:
DE102011115480A
Publication Date:
04/11/2013
Filing Date:
10/06/2011
Assignee:
biostep GmbH, 09387 (DE)
Domestic Patent References:
DE69929958T2N/A2006-11-23
DE69733952T2N/A2006-05-24
DE69924617T2N/A2006-01-12
DE19983725T1N/A2003-04-03



Foreign References:
73515902008-04-01
200100466882001-11-29
200900231622009-01-22
EP09627731999-12-08
WO1999063347A21999-12-09
WO2011054644A12011-05-12
Attorney, Agent or Firm:
Findeisen Hübner Neumann, 09112, Chemnitz, DE
Claims:
1. Substrat für Chemilumineszenzdetektionen, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Enhancern/ECL-Reaktionen auf Trägern, wobei aufgetrennte Antigene zunächst auf folienähnliche Gebilde übertragen und nachfolgend mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden, indem der Träger in einem Substrat inkubiert und in einem kamerabasierten Imaging-System mit oder ahne Boosterfunktion exponiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat auf Basis des Luminophors Luminol ausgestaltet ist und hinsichtlich der Luminolkonzentration, der Enhancerkonzentration, des Enhancer-Luminol-Verhältnises, des Puffersystems und der Wasserstoffperoxid-Konzentration optimiert wurde.

2. Vorrichtung für Chemilumineszenzdetektionen, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Enhancern/ECL-Reaktionen auf Trägern, wobei aufgetrennte Antigene zunächst auf folienähnliche Gebilde übertragen und nachfolgend mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden, indem der Träger in einem ECL-Substrat inkubiert und in einem kamerabasierten Imaging-System exponiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine lichtdichte Dunkelhaube (1) mit zumindest einer verschließbaren Öffnung (2) zum Einbringen eines Probentisches (3) in den Innenraum der Dunkelhaube (1) aufweist, wobei der Probentisch (3) mit einer Boosterfunktion ausgestattet ist, zugeordnete Lichtquellen (6) zur Systemvalidierung aufweist und während der Detektion innerhalb der Dunkelhaube (1) derart positioniert wird, dass er mit einer ebenfalls im Innenraum der Dunkelhaube (1) angeordneten Kamera (4) mit Kühlung und Objektiv in Wirkverbindung bringbar ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Positionsänderungen und/oder parameterspezifische Einstellungen von Probentisch (3) und Kamera (4) manuell oder computertechnisch auslösbar sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass dem Probentisch (3) eine Wärmestrahlungsquelle derart zugeordnet ist, dass die Probe von unten gesamtflächig mit Wärmestrahlung inkubiert und auf eine für maximale Lichtemission optimale Temperatur erwärmbar ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle mittels μController und/oder mittels einer externen Steuereinheit (7) erfolgt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle für das jeweils konkret eingesetzte Substrat zur Chemilumineszenzdetektion derart erfolgt, dass die spezifischen Reaktionseigenschaften dieses Substrats berücksichtigt werden.

7. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur im Substrat zur Chemilumineszenzdetektion erfasst wird.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur im Substrat über ein mathematisches Modell auf der Basis der gemessenen Temperatur an der Oberfläche der Wärmestrahlungsquelle berechnet oder direkt mittels eines Temperatursensors erfasst wird.

9. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorrichtung ein internes System zur Normierung zugeordnet ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Normierung mit kalibrierten Photonenquellen erfolgt, die parallel zur Emission der Probe auch Licht emittieren.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Substrat und eine Vorrichtung für Chemilumineszenzdetektionen, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Enhancern/ECL-Reaktionen (Enhanced ChemiLuminescence reaction) auf Westernblots, wobei durch Elektrophorese aufgetrennte Antigene wie Proteine zunächst auf Folien und ähnliche Träger übertragen und nachfolgend mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden, indem der Träger in einem Substrat inkubiert und in einem kamerabasierten Imaging-System exponiert wird.

Zum Nachweis von Makromolekülen wie Proteinen, DNA und RNA werden in den Bereichen der Grundlagenforschung, der Pharmazie und der Medizin neben verschiedenen anderen Verfahren zunehmend Chemilumineszenzverfahren eingesetzt. Derartige Verfahren basieren auf der Überlegung, dass Moleküle unterhalb ihrer Glühtemperatur im UV-Bereich, im sichtbaren Bereich und teilweise auch im IR-Bereich Licht aussenden. Dabei werden die Moleküle nicht physikalisch – beispielsweise durch elektrische Energie, Laser, Lichtquelle oder Wärme – zur Lichtemission angeregt, sondern sie gelangen durch eine chemische Reaktion in einen angeregten Übergangszustand, bevor sie ein stabiles Endprodukt unter Abgabe von Energie in Form von Lichtquanten ausbilden. Das von der Probe emittierte Licht wird mit einem Detektor erfasst, beispielsweise mit einem kamerabasierten System. Die Lichtemissionsrate des Chemilumineszenzsubstrates steigt zu Beginn der Reaktion an und fällt nach dem Erreichen der maximalen Lichtemission aufgrund des Substratverbrauchs wieder ab. Die Effizienz einer Chemilumineszenzreaktion hängt primär von der Zusammensetzung des hierfür eingesetzten Chemilumineszenzsubstrates und den Rahmenbedingungen der Reaktion ab.

Die Intensität des emittierten Lichts ist direkt proportional zum chemischen Umsatz des Luminophors pro Zeiteinheit. Diese Lichtintensität ist von stoffspezifischen Eigenschaften des Luminophors abhängig, wobei die Quantenausbeute der Anzahl der emittierten Lichtquanten der reagierenden Moleküle entspricht. Die Lichtemission eines Systems kann durch Interaktion des Luminophors mit anderen organischen Molekülen stark moduliert werden, indem die Moleküle in Abhängigkeit von ihrer Struktur und den jeweiligen Reaktionsbedingungen entweder als Verstärker (sog. Enhancer) oder als Abschwächer (sog. Quencher) wirksam werden. Beim Einsatz von Enhancern wird die Chemilumineszenzreaktion als ECL-Reaktion (enhanced chemiluminescence reaction) bezeichnet, wobei durch Enhancer Verstärkungen bis zum 1.000-fachen der eigentlichen Grundreaktion erreichbar sind.

Chemilumineszenzverfahren sind in zahlreichen Modifizierungen bekannt. Überwiegend werden Anwendungen auf Grundlage der Peroxidasereaktion mit Wasserstoffperoxid und Luminol und der alkalischen Phosphatase mit Dioxetan-Substraten realisiert. Vorzugsweise werden diese Enzyme kovalent mit sekundären Antikörpern gekoppelt, um die primäre Antigen-Antikörper-Reaktion sichtbar und nachweisbar zu machen.

Bei einer Anwendung auf Westernblots werden durch Elektrophorese aufgetrennte Proteine auf Folien (Nitrozellulose oder Polyvinylpyrrolidon) übertragen, durch spezifische Antikörper gegen bestimmte Proteine nachgewiesen und mit Hilfe der sekundären Antikörper-Enzyme-Konjugate mittels der Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Dabei wird die Folie mit einem Chemilumineszenzreagenz inkubiert und in einem Imaging-System oder auf einem Film exponiert. Eine ECL-Reaktion erfolgt nur an den Stellen des Bluts, an denen das Antigen und nachfolgend die Antikörper gebunden haben. Demzufolge erfolgt auch nur an diesen Stellen der Bluts eine Lichtemission. Die anderen Bereiche der Bluts werden bei der Blutentwicklung durch Proteine oder Detergenzien blockiert, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden. Demzufolge entspricht die Intensität des ausgesandten Lichts der Quantität des gebundenen Antikörper-Enzym-Konjugates und somit der Menge des am Blot gebundenen nachzuweisenden Antigens.

Die Optimierung einer solchen Nachweisreaktion hat die Erfassung von möglichst geringen Antigenmengen (höchste Sensitivität) zum Ziel. So sollen beispielsweise bei einer Proteom-Analyse Proteine nachgewiesen werden, die in lediglich geringer Konzentration vorkommen. Beim Nachweis von Proteinen geringer Menge (sog. low abundant Proteins) ist zwangsläufig die Lichtintensität pro Zeiteinheit niedriger als bei Proteinen, die in einer größeren Quantität vorkommen. Demzufolge muss die Nachweisreaktion hier über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden. Das kostenintensive Detektionssystem (z. B. kamerabasierte Imaging-System) ist somit länger durch diesen Einzelnachweis blockiert bzw. die Filmexposition muss relativ undefiniert und unkontrolliert über mehrere Stunden durchgeführt werden, bis nach dem Zufallsprinzip die passende Expositionszeit gefunden wurde.

Alternativ zur Durchführung von Nachweisreaktionen über einen längeren Zeitraum ist es möglich, die Chemilumineszenzreaktion derart zu boostern, dass in kürzeren Zeitspannen mehr Licht emittiert wird. Grundsätzlich steigt die Chemilumineszenz-Emission während einer definierten Zeitspanne im Sekundenbereich zur optimalen Effizienz an und klingt in unterschiedlichen Zeiträumen entsprechend dem zunehmenden Verbrauch an Substrat wieder ab. Für eine gute Nachweisführung ist es vorteilhaft, dass die Lichtemission schnell auf Höchstwerte ansteigt und möglichst lange Zeit auf diesem Niveau maximaler Werte verbleibt.

Zur Boosterung von Chemilumineszenzreaktionen können verschiedene Lösungsansätze genutzt werden, beispielsweise eine Optimierung der enzymatischen Nachweisreaktion durch Einstellung optimaler Reaktionsbedingungen hinsichtlich der H2O2-Konzentration, des pH-Wertes und der Pufferionen oder eine Optimierung der Zusammensetzung des CL-Substrats durch Auswahl des besten Enhancers, durch die Einstellung der günstigsten Luminophorkonzentration und des besten Enhancer-Luminophor-Verhältnisses. Unser CL-Substrat wurde in allen diesen Punkten optimiert.

Weiterhin kann die Boosterung der Probe durch externe Energiezuführung realisiert werden, beispielsweise durch Lichtblitze, Bestrahlung mit energiereicher Strahlung (Radioaktivität, Röntgen, UV, IR und dergleichen) vor und/oder während der eigentlichen Messung. Dabei kann eine Boosterung der jeweiligen Probe aus einer, mehreren oder auch allen Richtungen (von unten, oben, rechts, links, hinten, vorn) erfolgen. Die Boosterung kann als konstante Energiezuführung oder auch als „Rampe” mit diskontinuierlicher Zuführung entsprechend einer Ablaufsteuerung im Zeitraum der Boosterung erfolgen.

Als eine Variante der externen Zufuhr von Energie zur Reaktionsbeschleunigung ist die sog. Temperaturboosterung bekannt. Hierbei wird durch eine Zufuhr von Wärmeenergie die enzymatische Reaktion beschleunigt und folglich der Substratumsatz erhöht. Dadurch entstehen mehr Luminophor-Moleküle im energiereichen Übergangszustand und es werden mehr Lichtquanten emittiert. Eine solche Wärmezufuhr ist nicht unbegrenzt möglich, da alle Enzyme ein Temperaturoptimum haben, bei dessen Überschreitung die Denaturierung und Inaktivierung einsetzen. Auch die Chemilumineszenz-Substrate haben keine unbegrenzte Temperaturstabilitat. Sinnvoll ist deshalb eine definierte Erwärmung der Proben, wobei definierte Grenzwerte für das CL-Substrat und die Enzyme Peroxidase und Alkalische Phosphatase nicht überschritten werden dürfen.

Unabhängig von der jeweils konkreten Ausführung besteht das Ziel einer Boosterung in der Erhöhung des Reaktionsumsatzes, es sollen also mehr Photonen pro Zeiteinheit verfügbar werden als ohne Boosterung. Für den Nachweis der erfolgenden Chemilumineszenzreaktion sind z. B. kamerabasierte Imaging-Systeme geeignet. Obwohl diesbezüglich bereits mehrere Substrate und Auswertetechniken bekannt sind, besteht weiterhin ein erheblicher Entwicklungsbedarf, der sich primär aus dem zunehmend angestrebten Nachweis von Makromolekülen in lediglich geringer Konzentration ergibt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine technische Lösung zu schaffen, die mit einem akzeptablen Kosten-Zeit-Aufwand einen Nachweis von Makromolekülen auch in geringer Konzentration durch die Chemilumineszenz ermöglicht. Insbesondere wird eine Anwendung mittels Temperaturerhöhung geboosterten ECL-Reaktionen angestrebt. Diese Aufgabe wird gelöst durch die Kombination eines neuartigen ECL-Substrats mit einer spezifischen kamerabasierten Auswerteeinheit. Dabei wird ein Substrat eingesetzt, dessen Basis das Luminophor Luminol ist. Optimiert wurden die Luminophorkonzentration, die Enhancerkonzentration, das Enhancer-/Luminol-Verhältnis sowie die Wasserstoffperoxid-Konzentration und das Puffersystem.

Chemilumineszenzdetektionen mit Peroxidase und Alkalischer Phosphatase finden in der Regel bei Raumtemperatur statt, weil man eine Schädigung der verwendeten Antikörper-Enzymkonjugate und einen thermisch-bedingten Abbau der Chemilumineszenzsubstrate bei erhöhten Expositionstemperaturen befürchtet. Untersuchungen der Anmelderin haben ergeben, dass das erfindungsgemäß vorgeschlagene ECL-Substrat eine wesentlich bessere Temperaturstabilität und ein breiteres Temperaturoptimum (bis 55°C) im Vergleich zu den bisher am Markt verfügbaren Substraten besitzt.

Dieses Substrat ist für durch Temperaturerhöhung geboosterte ECL-Reaktionen geeignet und ermöglicht vorzugsweise eine Boosterung von Westernblot-Nachweisen mit Peroxidase. Wirkungsgrad und Verlauf der Chemilumineszenzreaktion werden durch die chemischen Eigenschaften dieses Substrats vorteilhaft verbessert.

Das übliche Befeuchten und Einschweißen der Blots ist bei – wie hier vorliegend – externer Wärmezuführung nicht möglich, weil sich dann schnell Luftblasen bilden würden, die ein störungsfreies Einlesen der Blots unmöglich machen. Eine Alternative ist daher das Einlegen der Westernblots in eine dünnwandige Kunststoffwanne, so dass die Blots mit Reagenz bedeckt sind. Dabei müssen die Kunststoffwanne und das Reagenz vor Einlegen bzw. Detektion der Blots auf die gewünschte Temperatur gebracht werden, damit die Chemilumineszenzreaktion bei definierten Temperaturen erfolgen kann. Die emittierten Photonen können dann z. B. mit einem kamerabasierten Imaging-System detektiert werden.

Hierfür wird gemäß der Erfindung eine Vorrichtung vorgeschlagen, die eine lichtdichte Dunkelhaube mit zumindest einer verschließbaren Öffnung zum Einbringen eines Probentisches in den Innenraum der Dunkelhaube aufweist, wobei der Probentisch mit einer Boosterfunktion ausgestattet ist, zugeordnete Lichtquellen zur Systemvalidierung aufweist und während der Detektion innerhalb der Dunkelhaube derart positioniert wird, dass er mit einer ebenfalls im Innenraum der Dunkelhaube angeordneten Kamera mit Kühlung und Objektiv in Wirkverbindung bringbar ist. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand von Unteransprüchen, deren technische Merkmale im Ausführungsbeispiel erläutert werden.

Die Effizienz einer Chemilumineszenzreaktion (chemiluminescence yield) entspricht der Integration der Lichtintensität über einen definierten Zeitraum, also der integrierten Fläche unter der Chemilumineszenzkurve. In einem Luminometer wird die Lichtintensität zumeist pro Sekunde durch einen Photomultiplyer bestimmt. Wenn diese Messung intervallfrei über eine Gesamtmesszeit durchgeführt wird, kann durch eine Addition der Sekundenabschnitte das Integral Chemilumineszenzeffizienz in guter Annäherung erfasst werden.

Das kamerabasierte Detektionssystem basiert auf einem „charge coupled device”-Sensor, nachfolgend als CCD-Sensor bezeichnet. Der CCD-Sensor ist ein lichtempfindliches Halbleiterelement, das einfallendes Licht in Abhängigkeit von der Helligkeit in elektrische Spannungswerte umwandelt. Die Belichtungszeit ist proportional zur Anzahl der detektierten Photonen. Dies gilt unter der Voraussetzung, dass die Erfassung innerhalb des linearen Detektionsbereiches des CCD-Sensors erfolgt. Dabei besteht ein Zusammenhang zwischen den Eigenschaften des Gerätes und der Chemilumineszenzreaktion, die beide wesentlich die Nachweisempfindlichkeit und damit die Expositionszeiten des Gesamtsystems beeinflussen.

Für die Reaktionsverläufe ist es wichtig, dass die Temperatur im Chemilumineszenzsubstrat genau erfasst wird, um eine präzise Steuerung der Wärmestrahlungsquelle zu realisieren. Die Erfassung der Substrattemperatur kann über ein mathematisches Modell auf der Basis der gemessenen Temperatur an der Oberfläche der Wärmestrahlungsquelle hochgerechnet werden. Eine wesentlich genauere und damit zu favorisierende Möglichkeit besteht in der direkten Messung mit einem Temperatursensor im ECL-Substrat. Desweitern kann beispielsweise eine Messung mit einem Infrarot-Temperatursensor erfolgen. Mit einer somit berührungslosen Messung kann die Temperatur im Chemilumineszenzsubstrat sehr exakt erfasst werden.

Die zu analysierende Probe wird von unten gesamtflächig mittels Wärmestrahlung auf eine, für die maximale Lichtemission optimale Temperatur erwärmt. Dabei erfolgt die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle durch μController und/oder eine externe Steuereinheit (z. B. PC).

Die Wärmestrahlungsquelle kann während der Chemilumineszenz-Messung auf definierte Temperaturen geregelt oder gemäß einem abgespeicherten Temperaturprofil gesteuert oder auch diskontinuierlich aktiviert werden. Die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle erfolgt vorzugsweise spezifisch für ein jeweils bestimmtes Chemilumineszenz-Substrat, so dass die spezifischen Reaktionseigenschaften des Substrates berücksichtigt werden. Die Steuerung kann alternativ manuell oder computergestützt erfolgen. Bei manueller Steuerung werden zumindest alle wesentlichen Funktionen berücksichtigt, wie Solltemperatur, Einschalten bzw. Ausschalten der Regelung, Festlegung des Betriebsmodus, integrierte Notabschaltung bei thermischen Problemen. Bei einer computergestützten Steuerung können weitere Funktionen berücksichtigt werden. Dies sind neben den Funktionen der manuellen Steuerung beispielsweise die Regelcharakteristik, die Festlegung zum Betriebsmodus, die Definition der Temperatur-Zeit-Verläufe einer Ablaufsteuerung und Speicherung zur erneuten Benutzung, Betriebsstundenzähler, integrierte automatische Abschaltung nach einem vorgegebenen Zeitlimit oder integrierte Notabschaltung bei thermischen Problemen. Mit der Funktionalität der PC-Ansteuerung können Temperatur-Zeit-Abläufe programmiert (vom Anwender per Software erstellt) und die Boosterung über diese Funktion automatisch gesteuert werden.

Der Verlauf einer Chemilumineszenzreaktion und damit die Anzahl der emittierten Photonen pro Zeiteinheit sind von Versuch zu Versuch nicht identisch. Dies hat mehrere Ursachen, die in der chemischen Natur der Reaktion und ihrer Rahmenbedingungen liegen. Um die Ergebnisse der Messungen miteinander vergleichen zu können, ist ein internes System der Normierung notwendig. Dabei erfolgt die Normierung vorzugsweise mit kalibrierten Photonenquellen (zum Beispiel LED's), die parallel zur Emission der Probe auch Licht emittieren. Hierbei ergeben sich funktionelle Vorteile, sofern die kalibrierten Photonenquellen mit einer ähnlichen Wellenlänge wie die Probe emittieren.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung unter Hinweis auf die Zeichnung näher beschrieben. Es zeigen:

1 den grundsätzlichen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung einer erfindungsgemäß ausgestalteten Chemilumineszenzdetektion

2 die gerätetechnische Ausgestaltung zur Normierung der Versuchsergebnisse in einer ersten Ausführung

3 die gerätetechnische Ausgestaltung zur Normierung der Versuchsergebnisse in einer zweiten Ausführung

Die in der Zeichnung stilisiert dargestellte Vorrichtung ist für Chemilumineszenzdetektionen konzipiert, insbesondere für Anwendungen unter Nutzung von Verstärkern/„Enhancern”, bei denen die dann als ECL-Reaktion (enhanced chemiluminescence reaction) bezeichnete Chemilumineszenzreaktion auf ein Vielfaches der an sich üblichen Grundreaktion verstärkt werden kann. Eine bevorzugte Anwendung sind Westernblots, wobei durch Elektrophorese aufgetrennte Proteine zunächst auf folienähnliche Gebilde übertragen und nachfolgend durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden. Hierfür wird das folienähnliche Gebilde in einem Substrat inkubiert und z. B. in einem kamerabasierten Imaging-System exponiert. Gemäß der Erfindung wird ein Substrat verwendet, dessen Zusammensetzung optimiert wurde.

Für die Durchführung von Chemilumineszenzdetektionen unter Verwendung eines derartigen Substrats ist eine in 1 stilisiert dargestellte Vorrichtung geeignet. Die Vorrichtung weist eine lichtdichte Dunkelhaube 1 auf, mit der sehr unterschiedliche Messzeiten realisiert werden können, in Abhängigkeit konkreter Einsatzbedingungen beispielsweise zwischen lediglich einer Sekunde und einem Zeitraum von 30 Tagen.

An der Gehäusewand der Dunkelhaube 1 ist mindestens eine verschließbare Öffnung 2 ausgestaltet. Weiterhin umfasst die Vorrichtung einen Probentisch 3 und eine Kamera 4, die mit Kühlung und Objektiv ausgestattet ist. Probentisch 3 und Kamera 4 werden innerhalb der Dunkelhaube 1 lagefixiert abgestützt, wobei eine solche Abstützung in 1 lediglich als stilisierte Tragstruktur 5 dargestellt ist. Die Kamera 4 und/oder der Probentisch 3 können manuell oder elektromotorisch verfahren werden.

Der Probentisch 3, der durch die Öffnung 2 in den Innenraum der Dunkelhaube 1 ein- oder ausgefahren werden kann, ist mit einer Boosterfunktion ausgestattet und weist zugeordnete Lichtquellen 6 zur Systemvalidierung auf. Während der Detektion wird der Probentisch 3 innerhalb der Dunkelhaube 1 so positioniert, dass er mit der ebenfalls im Innenraum der Dunkelhaube 1 angeordneten Kamera 4 in Wirkverbindung bringbar ist. In Funktionslage sind Probentisch 3 und Kamera 4 – wie aus 1 ersichtlich – vorzugsweise übereinander angeordnet. Positionsänderungen und/oder parameterspezifische Einstellungen von Probentisch 3 und Kamera 4 können alternativ manuell oder computertechnisch ausgelöst werden. So kann beispielsweise die Einstellung von Blende und Fokus der Kamera 4 vom Nutzer manuell eingestellt werden oder über eine Steuerung elektromotorisch erfolgen.

Dem Probentisch 3 ist eine in der Zeichnung nicht näher dargestellte Wärmestrahlungsquelle zugeordnet. Mit der Wärmestrahlungsquelle kann die auf der Oberseite des Probentischs 3 angeordnete Probe von unten gesamtflächig mit Wärmestrahlung beaufschlagt und dadurch auf eine für maximale Lichtemission optimale Temperatur erwärmt werden. Die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle kann alternativ über einen μController oder eine externe Steuereinheit 7 erfolgen, wobei die Wirkverbindung zwischen den Baugruppen in 1 mit einem Pfeil stilisiert dargestellt ist. Dabei ergibt sich eine vorteilhafte Ausgestaltung, sofern die Steuerung der Wärmestrahlungsquelle für das jeweils konkret eingesetzte Substrat zur Chemilumineszenzdetektion derart erfolgt, dass die spezifischen Reaktionseigenschaften dieses Substrats berücksichtigt werden. Die Wärmestrahlungsquelle kann alternativ auch seitlich über der Probe oder direkt über der Probe angeordnet sein. Hierfür ist beispielsweise eine Infrarot-Wärmestrahlungsquelle geeignet.

Weiterhin ist vorgesehen, dass die Temperatur im Substrat zur Chemilumineszenzdetektion erfasst wird. Dies ist möglich, indem die Temperatur über ein mathematisches Modell auf der Basis der gemessenen Temperatur an der Oberfläche der Wärmestrahlungsquelle berechnet oder alternativ direkt mittels eines Temperatursensors erfasst wird.

Weiterhin umfasst die Vorrichtung ein internes System zur Normierung. Diese Normierung erfolgt vorzugsweise mit kalibrierten Photonenquellen, die parallel zur Emission der Probe auch Licht emittieren. 2 und 3 zeigen diesbezügliche Ausführungen unter Nutzung von LED's mit kalibrierten Photonenwerten zur Validierung des Chemilumineszenzsystems und zur Normierung der Versuchsergebnisse. Dabei ist aus 2 eine Variante mit vier LED's ersichtlich, die in zwei Gruppen 3B und 3A unterteilt sind. 3 zeigt eine Variante mit 16 LED's, die hier in vier Gruppen 3D, 3C, 3B und 3A unterteilt sind.

Es ergeben sich funktionelle Vorteile, sofern die kalibrierten Photonenquellen jeweils mit einer ähnlichen Wellenlänge wie die Probe emittieren. Dabei können 1 bis n kalibrierte Photonenquellen zur Normierung zum Einsatz kommen. Der emittierte Photonenwert dieser Lichtquellen ist in einem weiten Bereich von x bis y Photonen pro Zeiteinheit (z. B. 100 Mio. Photonen/ms bis 1 Photon/ms) einstellbar. Die Anzahl der Photonenquellen und die kalibrierten Werte werden unter Beachtung der jeweils relevanten Einsatzbedingungen des konkreten Nutzers ausgewählt.

Bezugszeichenliste

1
lichtdichte Dunkelhaube
2
verschließbare Öffnung
3
Probentisch
4
Kamera mit Kühlung und Objektiv
5
Tragstruktur für Probentisch und Kamera
6
Lichtquellen zur Systemvalidierung
7
μController/externe Steuereinheit