Title:
Use of a crosslinked sulfonated polymer to separate macromolecules from a solution derived from a biological source, where the crosslinked sulfonated polymer is optionally bonded to a scaffolding containing a sulfonated aryl moiety
Kind Code:
A1
Abstract:
Use of a crosslinked sulfonated polymer for the separation of macromolecules from a solution derived from a biological source, is claimed, where the crosslinked sulfonated polymer is optionally bonded to a scaffold containing a sulfonated aryl moiety which is optionally substituted with an aliphatic group.


Inventors:
Arendt, Markus, Dr. (68766, Hockenheim, DE)
Stumm, Gerhard, Dr. (22143, Hamburg, DE)
Welter, Martin, Dr. (69118, Heidelberg, DE)
Schwarz, Thomas, Dr. (42799, Leichlingen, DE)
Application Number:
DE102011107197A
Publication Date:
01/17/2013
Filing Date:
07/13/2011
Assignee:
instrAction GmbH, 67059 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE602005000698T2N/A2007-12-06
DE69823196T2N/A2005-04-14
DE3855145T2N/A1996-09-19
Foreign References:
56457291997-07-08
EP02260351990-07-25
GB1483587A1977-08-24
GB1116800A1968-06-12
Attorney, Agent or Firm:
Stolmár & Partner, 80331, München, DE
Claims:
1. Verwendung eines vernetzten sulfonierten Polymers zur Abtrennung eines Makromolek?ls aus einer L?sung, die aus einer biologischen Quelle stammt, wobei das vernetzte sulfonierte Polymer gebunden an sein Grundger?st eine sulfonierte aromatische Einheit enth?lt, die mit einem aliphatischen Rest substituiert oder unsubstituiert vorliegt.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Grundger?st ein vernetztes Polyvinylger?st ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die sulfonierte aromatische Einheit eine Phenylsulfons?uregruppe ist.

4. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 3, worin das vernetzte sulfonierte Polymer ein sulfoniertes Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer ist.

5. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 4, worin der Vernetzungsgrad des vernetzten sulfonierten Polymers 0,5 bis 50% betr?gt.

6. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 5, worin der Sulfonierungsgrad 1 bis 80% betr?gt, bezogen auf die Molanzahl von Sulfons?uregruppen im Verh?ltnis zu allen zur Polymerisation eingesetzten sulfonierbaren Monomereinheiten.

7. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 6, worin das vernetzte sulfonierte Polymer in Form von Harzpartikeln vorliegt.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Harzpartikel einen mittleren durchschnittlichen Durchmesser von 1 bis 1000 ?m aufweisen.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, worin die Harzpartikel Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 10 bis 400 nm aufweisen.

10. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 9, worin das Makromolek?l ein Peptid ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, worin das Peptid Insulin ist.

12. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 9, worin das vernetzte sulfonierte Polymer mit einem Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymer beschichtet ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin der Vernetzungsgrad des Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymers im Bereich von 5 bis 80% liegt.

14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, worin das Amino-Gruppen enthaltende vernetzte Polymer vernetztes Polyvinylamin ist.

15. Verwendung nach einem der Anspr?che 12 bis 14, worin alle f?r die Vernetzung verwendeten Amino-Gruppen nach der Vernetzung in Form eines Amins vorliegen.

16. Verwendung nach einem der Anspr?che 12 bis 15, worin das Makromolek?l DNA oder RNA ist.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein vernetztes sulfoniertes Polymer oder ein mit einem Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymer beschichtetes vernetztes sulfoniertes Polymer zur Verwendung als Ionenaustauschermaterial mit hoher Salztoleranz zur Abtrennung von Makromolek?len aus einer L?sung, die aus einer biologischen Quelle stammt.

Die Coulomb-Wechselwirkung von Ionenaustauscherharzen ist die am meisten verwendete Wechselwirkung bei chromatographischen Reinigungsverfahren. Bei Ionenaustauscherharzen werden vorzugsweise ionische Gruppen, wie starke S?uren (zum Beispiel Sulfons?ure), starke Basen (zum Beispiel quart?re Amine), schwache S?uren (z. B. Carbons?uren) und schwache Basen (z. B. prim?re oder terti?re Amine) als Gruppen kovalent auf ein starres Matrixmaterial aufgebracht. Diese ionischen Gruppen wechselwirken mit komplement?ren funktionellen Gruppen der zu reinigenden Molek?le, die somit an das Ionenaustauscherharz gebunden werden. Die Elution der durch ionische Wechselwirkung gebundenen Zielmolek?le wird ?blicherweise durch einen Anstieg der Salzkonzentration im Elutionsmittel erzielt, sodass das Zielmolek?l durch ein oder mehrere korrespondierende(s) Salz-Ion(en) ersetzt wird/werden. Relativ niedrige Salzkonzentrationen von weniger als 150 mmol/L sind ?blicherweise ausreichend, um die Coulomb-Wechselwirkung zu brechen und das Zielmolek?l zu eluieren.

In Abh?ngigkeit von dem Ursprung der Mischung, aus der das Zielmolek?l getrennt werden soll, kann die Salzkonzentration bereits h?her sein, als Konzentrationen, die ?blicherweise f?r die Elution verwendet werden k?nnen. Dies hat meist den Nachteil, dass die Zielmolek?le in Gegenwart der hohen Salzkonzentration am Ionenaustauscherharz nicht binden. Insbesondere L?sungen, die aus biologischen Quellen, wie Fermentationsfl?ssigkeiten, K?rperfl?ssigkeiten oder Pflanzenextrakten erhalten werden, ist die Konduktivit?t (elektr. Leitf?higkeit; eine korrespondierende Gr??e zur Salzkonzentration) normalerweise zu hoch f?r den direkten Einsatz von Ionenaustauscherchromatographie. Deshalb ist oft ein unerw?nschter Dilutionsschritt notwendig, um die Konduktivit?t der Mischung zu verringern (Verringerung der Salzkonzentration).

Es gibt etliche bekannte und verf?gbare Ionenaustauscherharze, die in der Lage sind, Substanzen bei einer relativ hohen Salzkonzentration zu binden. Allerdings sind alle bisher bekannten Ionenaustauscherharze nicht mehr in der Lage, biologische Makromolek?le, wie beispielsweise Insulin, mit einer ausreichenden Beladungskapazit?t bei Konzentrationen von mehr als 250 mmol/L Natriumchlorid zu binden. Natriumchlorid soll hier nur beispielhaft erw?hnt sein; prinzipiell k?nnen jedoch auch andere Salze in dieser Molmenge vorliegen. Zudem sind bisher bekannte verwendete Ionenaustauscherharze nicht ?ber den gesamten pH-Bereich von pH 1 bis 14 stabil und somit nicht universell einsetzbar.

Es war deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Abtrennung von Makromolek?len aus einer L?sung, die aus biologischen Quellen stammt, bereitzustellen, indem das verwendete Ionenaustauscherharz eine ?u?erst hohe Salztoleranz gegen?ber den aufgebrachten biologischen L?sungen aufweist. Zudem ist es erw?nscht, dass das verwendete Ionenaustauschermaterial ?ber einen pH-Bereich von 1 bis 14 stabil ist, und es aufgrund seiner hohen Salztoleranz erm?glicht, dass kein zus?tzlicher Dilutionsschritt durchgef?hrt werden muss, um die Salzkonzentration zu vermindern. Ein solches Verfahren h?tte den Vorteil, dass die Kosten f?r L?sungsmittel f?r den zus?tzlichen Dilutionsschritt und f?r die Aufbereitung von Abfallsubstanzen bei der Reinigung von Salz enthaltenden Mischungen vermindert werden k?nnten.

Zur L?sung der genannten Aufgabe stellt die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines vernetzten sulfonierten Polymers zur Abtrennung eines Makromolek?ls aus einer L?sung bereit, die aus einer biologischen Quelle stammt, wobei das vernetzte sulfonierte Polymer gebunden an sein Grundger?st eine sulfonierte aromatische Einheit enth?lt, die mit einem aliphatischen Rest substituiert oder unsubstituiert ist.

In anderen Worten betrifft die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zur Abtrennung eines Makromolek?ls aus einer L?sung, die aus einer biologischen Quelle entstammt, unter Verwendung eines vernetzten sulfonierten Polymers, das gebunden an seinem Grundger?st eine sulfonierte aromatische Einheit enth?lt, die mit einem aliphatischen Rest substituiert oder unsubstituiert ist.

Unter dem Begriff ?Abtrennung? soll sowohl die Gewinnung/Reinigung eines Zielmolek?ls aus der L?sung sowie auch die Entfernung von ungew?nschten Makromolek?len aus der L?sung verstanden werden, so dass das Zielmolek?l in der gereinigten L?sung verbleibt.

Das Grundger?st des vernetzten sulfonierten Polymers kann jegliches bekannte polymere Grundger?st sein, das aus kohlenwasserstoffhaltigen Wiederholungseinheiten besteht. Unter kohlenwasserstoffhaltigen Wiederholungseinheiten versteht man alle denkbaren Verbindungen, die ?berwiegend aus Kohlenstoff und Wasserstoff aufgebaut sind, aber auch Heteroatome enthalten k?nnen. Die Verkn?pfung der Wiederholungseinheiten zu einem Polymer kann durch jegliches bekannte Polymerisationsverfahren erfolgen. Erfindungsgem?? besonders bevorzugt ist die radikalische, kationische oder anionische Olefinpolymerisation. Besonders bevorzugt ist das Grundger?st ein Polyvinylger?st. Das Grundger?st ist vorzugsweise ein vernetztes Grundger?st, sodass ein vernetztes Polymer entsteht. Insbesondere im Falle eines Polyvinylger?stes entsteht die Vernetzung durch Copolymerisation eines Vinylgruppen-haltigen Monomers mit einem Monomer, das zwei Vinylgruppen enth?lt. Es ist aber prinzipiell auch denkbar, dass zun?chst ein Polymer hergestellt wird, das ein lineares Grundger?st aufweist. Die anschlie?ende Vernetzung kann dann anschlie?end durch Reaktion von funktionellen Gruppen in der Seitenkette mit einem Vernetzungsreagenz erfolgen.

Das erfindungsgem?? verwendete vernetzte sulfonierte Polymer enth?lt vorzugsweise Sulfons?ure-Gruppen in der Seitenkette. Die Seitenketten sind im erfindungsgem??en vernetzten sulfonierten Polymer sulfonierte aromatische Einheiten wie weiter unten detailliert beschrieben. Die sulfonierten aromatischen Einheiten sind vorzugsweise durch eine kovalente Einfachbindung an das Grundger?st gebunden. Die sulfonierten aromatischen Einheiten k?nnen zudem mit einem aliphatischen Rest substituiert sein. Besonders bevorzugt ist es, dass die sulfonierten aromatischen Einheiten durch eine kovalente Einfachbindung direkt an ein Atom des Grundger?sts gebunden sind.

Unter einer aromatischen Einheit versteht man in der vorliegenden Erfindung ein mit einem aliphatischen Rest substituiertes oder unsubstituiertes mono- oder polyzyklisches aromatisches Ringsystem. Unter einem aromatischen Ringsystem versteht man im Sinne dieser Erfindung vorzugsweise ein aromatisches Ringsystem mit 6 bis 60 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 6 bis 30, besonders bevorzugt 6 bis 10 Kohlenstoffatomen. Diese aromatischen Ringsysteme k?nnen monozyklisch oder polyzyklisch sein, d. h. sie k?nnen einen Ring (z. B. Phenyl) oder zwei oder mehr Ringe aufweisen, welche auch kondensiert (z. B. Naphthyl) oder kovalent verkn?pft sein k?nnen (z. B. Biphenyl), oder eine Kombination von kondensierten und verkn?pften Ringen beinhalten.

Bevorzugte aromatische Ringsysteme sind zum Beispiel Phenyl, Biphenyl, Triphenyl, Naphthyl, Anthracyl, Binaphthyl, Phenanthryl, Dihydrophenanthryl, Pyren, Dihydropyren, Crysen, Perylen, Tetracen, Pentacen, Benzpyren, Fluoren und Inden. Besonders bevorzugt sind die aromatischen Ringsysteme Phenyl, Biphenyl oder Naphthyl, besonders bevorzugt Phenyl.

Wie bereits erw?hnt k?nnen die aromatischen Ringsysteme durch eine aliphatische Gruppe substituiert sein. Hierbei ist es denkbar, dass das aromatische Ringsystem nicht nur durch eine sondern durch zwei oder mehrere aliphatische Gruppen substituiert ist. Ein aliphatischer Rest ist vorzugsweise ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20, bzw. 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Erfindungsgem??e aliphatische Kohlenwasserstoffreste sind vorzugsweise lineare bzw. verzweigte oder cyclische Alkyl-Gruppen, bei denen auch ein oder mehrere Wasserstoffatome durch Fluor ersetzt sein k?nnen. Beispiele der aliphatischen Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 20 Kohlenwasserstoffatomen schlie?en die folgenden ein: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Iso-Propyl, n-Butyl, Iso-Butyl, sec-Butyl (1-Methylpropyl), tert-Butyl, Iso-Pentyl, n-Pentyl, tert-Pentyl (1,2-Dimethylpropyl), 1,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl (Neopentyl), 1-Ethylpropyl, 2-Methylbutyl, n-Hexyl, Iso-Hexyl, 1,2-Dimehtylbutyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 2-Methylbutyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethylbutyl, 1-Methylbutyl, 1,1-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, 2-Ethylhexyl, Trifluormethyl, Pentafluorethyl und 2,2,2-Trifluorethyl. Besonders bevorzugt als aliphatischer Kohlenwasserstoffrest ist Methyl oder Ethyl.

Au?erordentlich bevorzugt ist es, dass die mit einem aliphatischen Rest substituierte oder unsubstituierte sulfonierte aromatische Einheit des vernetzten sulfonierten Polymers eine Phenylsulfons?ure-Gruppe oder ein Derivat davon ist. Im Falle des Derivats der Phenylsulfons?ure-Gruppe sind Derivate gemeint, die mit einem aliphatischen Rest substituiert sind. In diesem Fall befindet sich vorzugsweise eine Sulfons?ure-Gruppe am Phenylrest in para-Stellung zu der zu dem Grundger?st bindenden Stelle am Phenylring. Der aliphatische Rest ist hierbei vorzugsweise eine Methyl- oder Ethyl-Gruppe, die sich in ortho- und/oder meta-Stellung an der Phenyl-Gruppe zu der zu dem Grundger?st bindenden Stelle am Phenylring befindet.

Besonders bevorzugt ist es jedoch, dass die sulfonierte aromatische Einheit nicht substituiert ist. Hierbei kommt insbesondere ein sulfoniertes vernetztes Polystyrol in Betracht. Die Vernetzung des sulfonierten Polystyrols erfolgt vorzugsweise durch die Copolymerisation von Styrol mit Divinylbenzol, gefolgt von der Sulfonierung der Phenylgruppen. Aber auch jegliche anderen zwei Vinyl-Gruppen enthaltenden Vernetzungsmittel sind hier zur Herstellung eines vernetzten Copolymers denkbar.

Der Vernetzungsgrad des vernetzten sulfonierten Polymers betr?gt erfindungsgem?? vorzugsweise 0,5 bis 50%, besonders bevorzugt 5 bis 45% und am bevorzugtesten 10 bis 35%. Unter der Angabe des Vernetzungsgrads in Prozent wird in der vorliegenden Erfindung der prozentuale Molanteil der eingesetzten zwei Vinyl-Gruppen enthaltenden Verbindung zu der Gesamtanzahl der zu polymerisierenden Monomereinheiten verstanden.

Der Sulfonierungsgrad des vernetzten sulfonierten Polymers betr?gt vorzugsweise 1 bis 80%, st?rker bevorzugt 3 bis 60% und am bevorzugtesten 5 bis 40%. Die Angabe des Sulfonierungsgrads in Prozent bezieht sich auf die Molanzahl von Sulfons?ure-Gruppen im Verh?ltnis zu allen zur Polymerisation eingesetzten Monomereinheiten, die eine sulfonierbare Gruppe aufweisen. Zu den zur Polymerisation eingesetzten Monomereinheiten, die eine sulfonierbare Gruppe aufweisen, versteht man alle Monomereinheiten, die die sulfonierte aromatische Einheit enthalten, als auch alle die Monomereinheiten, die eine sulfonierbare Gruppe, vorzugsweise eine aromatische Einheit, enthalten sowie optional alle Verbindungen, die die Vernetzung verursachen, sofern diese eine sulfonierbare oder sulfonierte Gruppe enthalten. Wird als vernetztes sulfoniertes Polymer sulfoniertes Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer verwendet, so bezieht sich der Sulfonierungsgrad in Prozent auf die Anzahl von Sulfons?ure-Gruppen im Verh?ltnis zu allen im Polymer enthaltenen Phenyl- bzw. Phenylen-Gruppen.

Das in dem erfindungsgem??en Verfahren bzw. in der erfindungsgem??en Verwendung eingesetzte vernetzte sulfonierte Polymer liegt vorzugsweise in Form von regul?r oder irregul?r geformten Harzpartikeln vor. Unter dem Begriff ?regul?r geformt? versteht man in der vorliegenden Erfindung Formen, die sich durch Symmetrieoperationen wie Fl?chenspiegelung, Punktspiegelung oder Drehachsen oder Kombinationen davon darstellen lassen. Besonders bevorzugt ist hier die kugelf?rmige Form zu nennen. Unter dem Begriff ?kugelf?rmig? versteht man nicht nur rein symmetrische Kugeln, sondern auch davon abweichende Formen wie beispielsweise Ellipsen. Es sollen aber auch zwei miteinander zu Hanteln verbundenen kugelf?rmige K?rper hierbei mit eingeschlossen sein. Unter einer irregul?ren Form versteht man jegliche gebrochene Form, die keine Symmetrie aufweist. Die Harzpartikel weisen vorzugsweise einen gemittelten durchschnittlichen Durchmesser von 1 bis 1000 ?m, st?rker bevorzugt von 5 bis 100 ?m und besonders bevorzugt von 10 bis 50 ?m auf.

Das in dem erfindungsgem??en Verfahren bzw. in der erfindungsgem??en Verwendung eingesetzte vernetzte sulfonierte Polymer besitzt vorzugsweise Poren, in denen die eigentliche Wechselwirkung mit den zu trennenden Stoffen stattfindet. Es handelt sich somit vorzugsweise ein por?ses Polymermaterial. Diese Poren weisen vorzugsweise einen durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 400 nm, besonders bevorzugt von 30 bis 100 nm auf. Der Porendurchmesser wird durch eine inverse Gr??enausschlu?chromatographie bestimmt: Dabei wird das zu untersuchende Phasenmaterial in eine Chromatographies?ule gepackt und eine Reihe von Polymergr??enstandards injiziert. Aus dem Verlauf der Kurve bei der Auftragung des Logarithmus der Molmasse des jeweiligen Standards gegen das Elutionsvolumen kann nach literaturbekannten Methoden die Verteilung der Porendurchmesser und somit der mittlere Porendurchmesser bestimmt werden.

Des Weiteren ist es bevorzugt, wenn das vernetzte sulfonierte Polymer ein Porenvolumen im Bereich von 1 bis 3 mL/g aufweist. Das Porenvolumen wird durch die Messung der Wasseraufnahmekapazit?t bestimmt: Das Phasenmaterial, dessen Gewicht im trockenen Zustand bestimmt wurde, wird mit dem L?sungsmittel versetzt f?r das das Porenvolumen bestimmt werden soll (unterschiedliche L?sungsmittel k?nnen aufgrund unterschiedlicher Benetzbarkeit verschiedene Ergebnisse zeigen). F?r die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird Wasser als L?sungsmittel verwendet. ?bersch?ssiges L?sungsmittel wird abfiltriert und das Phasenmaterial in der Zentrifuge von weiterem im Zwischenkornvolumen befindlichen L?sungsmittel befreit. Anschlie?end wird das Material neu gewogen. Allein die Poren sollten noch mit dem L?sungsmittel gef?llt sein. ?ber die Massendifferenz zwischen gef?llten und leeren Poren sowie der Dichte des L?sungsmittels kann das Porenvolumen errechnet werden.

Das im erfindungsgem??en Verfahren bzw. in der erfindungsgem??en Verwendung eingesetzte vernetzte sulfonierte Polymer weist den Vorteil auf, dass es neben dem lipophilen Grundger?st mit den aromatischen Einheiten in der Seitenkette auch ionisierbare Gruppen wie Sulfons?ure-Gruppen enth?lt. Auf diese Weise ist es geeignet, sowohl durch ionische Wechselwirkungen als auch lipophile Wechselwirkungen mit dem Makromolek?l zu interagieren. Hierbei dienen die Sulfons?ure-Gruppen vorzugsweise als anionische -SO3?-Gruppen, die in der Lage sind, ionische Wechselwirkungen mit Kationen des Makromolek?ls einzugehen. Zudem weisen Makromolek?le aus biologischen Quellen, wie beispielsweise Proteine, DNA oder RNA auch liphophile Bereiche auf, die mit den aromatischen Einheiten des vernetzten sulfonierten Polymers als lipophile Matrix wechselwirken k?nnen. Auf diese Weise ist es m?glich, L?sungen, die aus einer biologischen Quelle stammen, einzusetzen, die einen sehr hohen Salzgehalt von bis zu 1 mol/L Salz enthalten k?nnen, ohne, dass es zu einer Elution der Makromolek?le von dem Ionenaustauschermaterial kommt.

Das erfindungsgem?? verwendete vernetzte sulfonierte Polymer wird vorzugsweise zur Gewinnung bzw. Reinigung von Kationen-Gruppen enthaltenen Makromolek?len eingesetzt. Das Makromolek?l ist vorzugsweise ein biologisches Makromolek?l. Das biologische Makromolek?l ist vorzugsweise ein Peptid. Ganz besonders bevorzugt ist das Peptid Insulin. In anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung also vorzugsweise eine Verwendung des vernetzten sulfonierten Polymers zur Reinigung bzw. Gewinnung von Insulin aus einer L?sung, die aus einer biologischen Quelle stammt.

Die Herstellung des vernetzten sulfonierten Polymers erfolgt vorzugsweise durch Sulfonierung eines bereits vernetzten Polymers durch Einsatz von Schwefels?ure und ?hnlichen Materialien, wie dies beispielsweise bei der Herstellung von sulfoniertem vernetzten Polystyrol aus den britischen Patentschriften GB 1116800 und GB 1483587 bekannt ist. Die Herstellung vernetzter Polymere ist Stand der Technik und kann von jedem Fachmann auf dem Gebiet der Polymerchemie ohne erfinderisches Zutun durchgef?hrt werden.

Besonders bevorzugt wird jedoch die Sulfonierung folgenderma?en durchgef?hrt: Je nach angestrebtem Sulfonierungsgrad wird beispielsweise ein Polystyrol-Divinylbenzol-Polymer in einem Gemisch aus Schwefels?ure und Wasser mit einem Wasseranteil von 2 bis 15% bei Temperaturen von 20?C bis 80?C f?r 1 bis 6 Stunden ger?hrt. Die Steigerung des Schwefels?uregehaltes, der Temperatur und der Reaktionszeit f?hrt jedes f?r sich zu einer Steigerung des Sulfonierungsgrades. Durch Einstellung aller drei Parameter kann der angestrebte Sulfonierungsgrad relativ exakt erreicht werden. Nach der Reaktion wird das Polymer mit verd?nnter Schwefels?ure und Wasser gesp?lt.

Erfindungsgem?? ist es auch bevorzugt, dass das vernetzte sulfonierte Polymer mit einem Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymer beschichtet ist.

Das Grundger?st des Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymers ist vorzugsweise das Gleiche wie oben f?r das vernetzte sulfonierte Polymer genannt. Besonders bevorzugt ist das Grundger?st also auch hier ein Polyvinylger?st. An dieses Polyvinylger?st sind vorzugsweise durch kovalente Einfachbindungen Amino-Gruppen direkt an Atome des Grundger?sts gekn?pft.

Unter Amino-Gruppen versteht man erfindungsgem?? prim?re, sekund?re terti?re oder quart?re Amino-Gruppen so wie auch Amidin- oder Guanidin-Gruppen. Das die Amino-Gruppen enthaltende vernetzte Polymer ist jedoch besonders bevorzugt ein vernetztes Polyvinylamin.

Die Vernetzung des Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymers wird vorzugsweise durchgef?hrt, indem ein lineares Polymer, das prim?re oder sekund?re Amino-Gruppen enth?lt, mit einem Vernetzungsreagens umgesetzt wird, das an zwei Enden kovalente Bindungen mit den Amino-Gruppen eingehen kann. Hierf?r ist prinzipiell jedes denkbare Vernetzungsreagens einsetzbar. Besonders bevorzugt werden erfindungsgem?? jedoch Vernetzungsreagenzien eingesetzt, bei denen alle f?r die Vernetzung verwendeten Amino-Gruppen nach der Vernetzung immer noch in Form einer Amino-Gruppe vorliegen. Auf diese Weise wird gew?hrleistet, dass die Amino-Gruppen durch Protonierung/Alkylierung immer noch in der Lage sind, als kotionische Ionenaustauscher-Gruppen zu fungieren. Dies f?hrt zu einer hohen Dichte von Ionenaustauschergruppen auf der ansonsten lipophilen Matrix. Nach der Vernetzung liegen die zuvor prim?ren oder sekund?ren Amino-Gruppen dann als sekund?re oder terti?re Amino-Gruppen vor.

Um den Amino-Gruppen eine positive Ladung zu verleihen, k?nnen diese protoniert werden. Alternativ dazu k?nnen aber auch prim?re, sekund?re oder terti?re Amino-Gruppen durch tri-, bi- oder Monoalkylierung mit einem Alkylierungsreagenz in quart?re Amoniumionen ?berf?hrt werden.

Der Vernetzungsgrad des Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymers liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 80%, besonders bevorzugt im Bereich von 6 bis 60% und am bevorzugtesten im Bereich von 10 bis 40%. Die Prozentzahl bezieht sich hierbei auf die Anzahl der zur Vernetzung verwendeten Amino-Gruppen im Verh?ltnis zu allen Amino-Gruppen des unvernetzten Polymers.

Besonders bevorzugt ist es, wenn das Massenverh?ltnis des Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymers zu dem vernetzten sulfonierten Polymer im Bereich von 0,05 bis 0,3, besonders bevorzugt von 0,08 bis 0,25 und am bevorzugtesten von 0,11 bis 0,20 liegt.

Das vernetzte Amino-Gruppen enthaltende Polymer liegt vorzugsweise in Form einer Schicht/Beschichtung auf dem vernetzten sulfonierten Polymer vor. Hierbei wird das vernetzte sulfonierte Polymer vorzugsweise in der Form von Harzpartikeln eingesetzt und mit dem unvernetzten Amino-Gruppen enthaltenden Polymer beschichtet und anschlie?end mit dem Vernetzungsmittel vernetzt. Auf diese Weise kann eine hohe Konzentration von Amino-Gruppen auf der Oberfl?che verwirklicht werden, ohne dass durch dieses Verfahren vollst?ndig die liphophilen Eigenschaften der Matrix verloren gehen. Somit wird ein Ionenaustauscherharz bereitgestellt, das durch Protonierung/Alkylierung der Amino-Gruppen in der Lage ist, mit anionischen Gruppen des Makromolek?ls zu wechselwirken. Zus?tzlich kann die lipophile Matrix auch lipophile Wechselwirkungen mit dem Makromolek?l eingehen.

Das auf der Oberfl?che des sulfonierten Polymers befindliche Amino-Gruppen enthaltende vernetzte Polymer wird vorzugsweise in den Poren der Harzpartikel des sulfonierten Polymers abgeschieden, d. h. es befindet sich vorzugsweise in den Poren des sulfonierten Polymers.

Das Amino-Gruppen enthaltende vernetzte Polymer weist vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 20000 bis 50000 g/mol, st?rker bevorzugt 30000 bis 46000 g/mol auf.

Besonders bevorzugt werden durch dieses kationische Ionenaustauscherharz Makromolek?le wie DNA oder RNA aus den L?sungen entfernt, so dass die L?sung von dieser gereinigt ist, und erw?nschte Zielmolek?le ohne DNA oder RNA aus der L?sung gewonnen werden k?nnen.

Wie bereits erw?hnt, stammen die erfindungsgem??en Makromolek?le aus biologischen Quellen. Hierbei weisen die Makromolek?le vorzugsweise ein Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 0,2 kDa, st?rker bevorzugt 500 bis 1 kDa und am st?rksten bevorzugt von 300 bis 5 kDa auf.

Unter einer L?sung, die aus einer biologischen Quelle stammt, versteht man L?sungen, die beispielsweise durch Fermentation oder G?rungsprozesse erhalten werden, K?rperfl?ssigkeiten oder Pflanzenextrakte, die vorzugsweise eine Ionenleitf?higkeit im Bereich von 0,1 mS/cm bis 120 mS/cm, st?rker bevorzugt im Bereich von 1 bis 60 mS/cm und am st?rksten bevorzugt von 10 bis 20 mS/cm aufweisen. Diese L?sungen sind vorzugsweise w?ssrige L?sungen. Sie weisen vorzugsweise einen Salzgehalt von bis zu 1,2 mol/L auf. Besonders bevorzugt liegt deren Salzgehalt im Bereich von 0,001 bis 1,2 mol/L, st?rker bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 1,0 mol/L und am st?rksten bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 0,6 mol/L. Unter einem Salz versteht man in der vorliegenden Erfindung jegliches Salz, wie anorganische und organische Salze, die vorzugsweise in biologischen Fl?ssigkeiten vorliegen. Hierbei versteht man unter diesen L?sungen nicht nur L?sungen, die direkt aus den biologischen Quellen gewonnen und verwendet werden, sondern auch L?sungen, die bereits in irgendeiner Weise prozessiert wurden. Unter ?prozessiert? versteht man, dass die L?sungen in irgendeiner Weise vorbehandelt wurden, beispielsweise die Ver?nderung des pH-Wertes oder die Abtrennung von Substanzen vor der erfindungsgem??en Verwendung.

Die Ionenleitf?higkeit wird erfindungsgem?? mit einem Leitf?higkeitsme?ger?t der Firma Greisinger Typ GMH 3430 bestimmt.

Mit den erfindungsgem?? verwendeten vernetzten sulfonierten Polymeren, oder den mit einer Schicht von einem Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymer ?berzogenen vernetzten sulfonierten Polymeren k?nnen somit biologische Makromolek?le aus L?sungen mit einem extrem hohen Salzgehalt gebunden werden, ohne dass die L?sungen zuvor durch zus?tzliche Dilutionsschritte oder Dialysen verd?nnt werden m?ssen. Auf diese Weise stellt die vorliegende Erfindung ein kosteng?nstiges Verfahren/eine kosteng?nstige Verwendung zur Reinigung von biologischen Makromolek?len, vorzugsweise Insulin, monoklonale Antik?rper, DNA oder RNA bereit. Zus?tzlich weisen die verwendeten Ionenaustauschermaterialien den Vorteil auf, dass sie im gesamten pH-Bereich von 1 bis 14, wie er in aus biologischen Quellen stammenden Fl?ssigkeiten vorkommt, eingesetzt werden k?nnen.

Die vorliegende Erfindung betrifft zudem auch die weiteren Ausf?hrungsformen:

  • (i) Verfahren zur Abtrennung eines Makromolek?ls aus einer L?sung, die aus einer biologischen Quelle stammt, unter Verwendung eines vernetzten sulfonierten Polymers, das gebunden an sein Grundger?st eine sulfonierte aromatische Einheit enth?lt, die mit einem aliphatischen Rest substituiert oder unsubstituiert ist.
  • (ii) Verfahren nach Ausf?hrungsform (i), worin das Grundger?st ein vernetztes Polyvinylger?st ist.
  • (iii) Verfahren nach Ausf?hrungsform (i) oder (ii), worin die aromatische Einheit eine Phenylsulfons?ure-Gruppe ist.
  • (iv) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (i) bis (iii), worin das vernetzte sulfonierte Polymer ein sulfoniertes Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer ist.
  • (v) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (i) bis (iv), worin der Vernetzungsgrad des vernetzten sulfonierten Polymers 0,5 bis 50% betr?gt.
  • (vi) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (i) bis (v), worin der Sulfonierungsgrad 1 bis 80% betr?gt, bezogen auf die Molanzahl von Sulfons?ure-Gruppen im Verh?ltnis zu allen zur Polymerisation eingesetzten sulfonierbaren Monomereinheiten.
  • (vii) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (i) bis (vi), worin das vernetzte sulfonierte Polymer in Form von Harzpartikeln vorliegt.
  • (viii) verfahren nach Ausf?hrungsform (vii), worin die Harzpartikel einen mittleren durchschnittlichen Durchmesser von 1 bis 1000 ?m aufweisen.
  • (ix) Verfahren nach Ausf?hrungsform (vii) oder (viii), worin die Harzpartikel Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 10 bis 400 nm aufweisen.
  • (x) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (i) bis (ix), worin das Makromolek?l ein Peptid ist.
  • (xi) Verfahren nach Ausf?hrungsform (x), worin das Peptid Insulin ist.
  • (xii) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (i) bis (ix), worin das vernetzte sulfonierte Polymer mit einem Amino-Gruppe enthaltenden vernetzten Polymer beschichtet ist.
  • (xiii) Verfahren nach Ausf?hrungsform (xii), worin der Vernetzungsgrad des Amino-Gruppen enthaltenden Polymers im Bereich von 5 bis 80% liegt.
  • (xiv) Verfahren nach Ausf?hrungsform (xii) oder (xiii), worin das Amino-Gruppen enthaltende vernetzte Polymer vernetztes Polyvinylamin ist.
  • (xv) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (xii) bis (xiv), worin alle f?r die Vernetzung verwendeten Amino-Gruppen nach der Vernetzung in Form eines Amins vorliegen.
  • (xvi) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (xii) bis (xv), worin das Massenverh?ltnis des vernetzten sulfonierten Polymers zu dem Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymers im Bereich von 3 bis 20 liegt.
  • (xvii) Verfahren nach einer der Ausf?hrungsformen (xii) bis (xvi), worin das Makromolek?l DNA oder RNA ist.

Im Nachfolgenden soll die Erfindung anhand von Figuren und Beispielen erl?utert werden, die jedoch nicht einschr?nkend auf den Schutzumfang zu verstehen sind.

Figuren:

1: Vergleich eines erfindungsgem?? verwendeten Ionenaustauschers mit den nicht erfindungsgem??en Verwendungen zweier Ionenaustauscher nach dem Stand der Technik durch Messung der Beladungskapazit?t mit Insulin in Abh?ngigkeit von der Salzkonzentration.

2: Auftrag der Extinktion des Eluats gegen die Zeit nach Durchfluss einer Fermentationsl?sung durch ein erfindungsgem?? verwendetes Anionentauschermaterial.

3: Vergleich eines erfindungsgem?? verwendeten Ionenaustauschers mit den nicht erfindungsgem??en Verwendungen zweier Ionenaustauscher nach dem Stand der Technik durch Messung der Beladungskapazit?t mit DNA in Abh?ngigkeit von der Salzkonzentration.

Beispiele:Beispiel 1: Herstellung eines Kationenaustauscherharzes auf Basis eines vernetzten sulfonierten Polymers

Ziel des Ansatzes: Sulfonierung des Polystyroltr?gers Araberchrom XT 30 (k?uflich erwerblich bei The Dow Chemical Company, ehemals Rohm & Haas) bei 20?C.

Es wurde 165 mL konz. H2SO4 in einen temperierbaren 250 mL Reaktor gegeben. Zu der Schwefels?ure wurden 30,0 g des Tr?germateriales gegeben und das Einwaagefl?schen drei Mal mit je 20 mL konz. Schwefels?ure nachgesp?lt. Nach der Zugabe des Tr?germaterials wurde die Suspension ger?hrt und auf 20?C temperiert. Nach 2 h Reaktionszeit wurde die Suspension aus den Reaktor abgelassen und auf zwei 150 mL Spritzen verteilt. Die Schwefels?ure wurde abgesaugt und die Phase nacheinander mit 200 mL verd?nnter (62%iger) Schwefels?ure, 125 mL Wasser, 175 mL Methanol, 125 mL Wasser und abschlie?end mit 175 mL Methanol gesp?lt. Die Phase wurde trockengesaugt und anschlie?end bei 50?C im Vakuum getrocknet.

Die Bestimmung der Sulfons?uregruppen erfolgt in einer HPLC-S?ule durch Beladung mit Ammoniumacetat, anschlie?ender Elution des gebundenen Ammoniums und Nachweis ?ber Indophenolblau. Es ergab sich ein Sulfons?uregehalt von 375 ?mol/mL. Dies entspricht einem Sulfonierungsgrad von n?herungsweise 13%. Die Partikelgr??e betr?gt im Mittel 30 ?m. Die Partikel sind sph?risch mit einem mittleren Porendurchmesser von 22 nm und einem mittleren Porenvolumen von 1,25 mL/g.

Beispiel 2: Herstellung eines Anionenaustauschers auf Basis eines mit einem Amino-Gruppen enthaltenden vernetzten Polymer ?berzogenen vernetzten sulfonierten Polymers:

Als Basis f?r das Ionentauschermaterial wird Amberchrom CG1000S von Rohm & Haas verwendet. Dieses wird, wie in Beispiel 1 erl?utert, bei 80?C mit 98%iger Schwefels?ure f?r 3 Stunden sulfoniert. Man erh?lt dabei Partikel mit einer mittleren durchschnittlichen Gr??e von 30 ?m und einem mittleren Porendurchmesser von 22 bis 25 nm. Von dem resultierenden sulfonierten Polystyrol wird die Wasseraufnahmekapazit?t, bzw. das Porenvolumen bestimmt, indem das getrocknete, sulfonierte Polystyrol gewogen, mit dem gleichen Volumen Wasser versetzt wird und anschlie?end ?bersch?ssiges Wasser abzentrifugiert wird. Das in den Poren befindliche Wasser bleibt dabei an seinem Ort. Nach nochmaligem Wiegen kann aus der W?gedifferenz zum trockenen Polystyrol das Porenvolumen zu etwa 1,2 bis 1,3 mL/g ermittelt werden.

Zum Beschichten des Polystyrols wird eine w?ssrige Polyvinylaminl?sung bereitet, die aus Polyvinylamin mit einem mittleren Molgewicht von 35000 g/mol besteht. Der pH-Wert wird auf 9,5 eingestellt. Die Menge des Polyvinylamins betr?gt hierbei 15% des zu beschichtenden Polystyrols, und das Volumen der L?sung betr?gt 95% des ermittelten Porenvolumens des Polystyrols. Die Polyvinylaminl?sung wird zusammen mit dem Polystyrol in eine fest verschlossene PE-Flasche gegeben und f?r 6 Stunden auf einem Siebr?ttler bei hoher Frequenz gesch?ttelt. Dabei mu? auf eine ausreichende Durchmischung geachtet werden. Mach der Prozedur hat sich die Polyvinylaminl?sung in die Poren des Polystyrols gearbeitet. Das Polystyrol wird anschlie?end bei 50?C im Vakuumtrockenschrank zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Zur Vernetzung des Polyvinylamins wird das beschichtete Polystyrol im dreifachen Volumen Isopropanol aufgenommen und mit 5% Diethylenglycoldiglycidylether, bezogen auf die Aminogruppenzahl des Polyvinylamins, versetzt. Das Reaktionsgemisch wird f?r sechs Stunden im Reaktor bei 55?C ger?hrt. Anschlie?end wird es auf eine Glasfilternutsche ?berf?hrt und mit 2 Bettvolumina Isopropanol, 3 Bettvolumina 0,5 M TFA-L?sung, 2 Bettvolumina Wasser, 4 Bettvolumina 1 M Natronlauge und abschlie?end 8 Bettvolumina Wasser gesp?lt.

Beispiel 3: Reinigung von Insulin durch den in Beispiel 1 hergestellten Kationenaustauscher

Die Bestimmung der Beladbarkeit mit Insulin des salztoleranten in Beispiel 1 hergestellten Ionentauschers erfolgt mit einer L?sung von 10 mg/mL Insulin in 30% Isopropanol mit 50 mM Milchs?ure bei pH 3,5 und unterschiedlichen Konzentrationen NaCl. Die Beladbarkeit wurde bei 10% Durchbruch bestimmt und mit zwei Konkurrenzmaterialien verglichen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Als Vergleichsmaterialien wurden die k?uflich erwerblichen Ionenaustauschermaterialien ?Eshumo S? der Fa. Merck (Polyvinylether, Ionenkapazit?t 50?100 ?mol/mL, Partikelgr??e 75?95 ?m) und ?Source 30S? der Fa. GE Healthcare (Polystyrol/Divinylbenzol, Partikelgr??e 30 ?m) verwendet.

W?hrend die Vergleichsmaterialien bei 250 mM NaCl-Gehalt im Laufmittel nur noch sehr geringe Kapazit?t zeigen, die bei h?heren Salzgehalten nicht mehr me?bar ist, zeigt der erfindungsgem?? verwendete Ionentauscher noch eine deutliche Kapazit?t bis 1 M NaCl. Dies ist eindeutig aus Figur abzulesen.

Beispiel 4: Abtrennung von DNA durch Einsatz des in Beispiel 2 hergestellten Anionenaustauscherharzes:

Der erste Schritt im Prozess der Aufreinigung von monoklonalen Antik?rpern aus Fermentationsl?sungen ist die Abreicherung der enthaltenen DNA. Dies funktioniert, indem man die Fermentationsl?sung ?ber eine Phase des in Beispiel 2 hergestellten Anionentauschers ?filtriert?. Die DNA bindet in diesem Schritt an die Phase, und die quantitativ durchlaufende Fermentationsl?sung wird so von der DNA ann?hernd befreit. Daf?r wird der in Beispiel 2 hergestellte Anionentauscher in eine 270 ? 10 mm-S?ule mit einem Bettvolumen von 21,2 mL gepackt und mit zun?chst 500 mM NaKPO4 pH 7,0 und anschlie?end mit 50 mM NaKPO4 pH 7,0 ?quilibriert. Die Fermentationsl?sung wird ?ber einen 0,45 ?m-Filter filtriert und von Niederschl?gen befreit. 300 mL der Fermentationsl?sung werden ?ber eine externe Pumpe auf die S?ule gegeben. Es wird der Durchflu?, das Eluat mit 1 M NaCl pH 6,5 und der Sp?lschritt mit 1 M NaOH aufgefangen.

Der als Durchfluss bezeichnete teil in 2 enth?lt fast ausschlie?lich den monoklonalen Antik?rper und keine DNA. Eine Elution der DNA erfolgt jedoch erst durch das Aufbringen von NaOH.

Der Gehalt an DNA im Durchflu? und in der Fermentationsl?sung wird mit einem Picogreen-Assay nach Herstellerangaben bestimmt. Tabelle 1:

dsDNA
Fermentationsl?sung (gefiltert)
dsDNA
Durchflu?
4767 ?g30 ?g100%0.7%9046 ppm57 ppm

Aus Tabelle 1 geht hervor, dass 99,3% der DNA bei der Filtration ?ber das Phasenmaterial entfernt werden konnten. Die gebundene DNA eluiert nicht im 1 M NaCl-Schritt, sondern erst durch Sp?len mit 1 M NaOH, da hier die Aminogruppen der Phase deprotoniert werden und keine Bindung zur DNA mehr vorliegt.

Alternativ zu dem in Beispiel 2 hergestellten Anionenaustauscher wurden auch die k?uflich erwerblichen Materialen zu Q Sepharose FF der Fa. Amersham Biosciences und Fractogel TMAE der Fa. Merck als Trennmittel wie in Beispiel 4 verwendet. Bei der Bestimmung der statischen Kapazit?t bei verschiedenen Salzgehalten im Vergleich zu Q Sepharose FF und Fractogel TMAE ergibt sich eine h?here Beladbarkeit des entwickelten Ionentauschers auch bei hohen Salzgehalten.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • GB 1116800 [0023]
  • GB 1483587 [0023]