Title:
Konservierungsmittel enthaltend Glykolipide
Kind Code:
A1
Abstract:

Die Erfindung betrifft ein Konservierungsmittel enthaltend ein Glykolipid der Formel (I): wobei
R1 H oder COCH3 bedeutet und
R2 gleich oder verschieden ist und H oder bedeutet, wobei n 1, 2 oder 3 ist und
R3 gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und
R4 OH oder OCH3 bedeutet
oder ein Salz des Glykolipids.



Inventors:
Schlösser, Thomas, Dr. (84489, Burghausen, DE)
Siems, Karsten, Dr. (14552, Michendorf, DE)
Katzer, Werner, Dr. (12207, Berlin, DE)
Kluge, Grit (14959, Trebbin, DE)
Jakupovic, Sven, Dipl.-Ing. (12249, Berlin, DE)
Application Number:
DE102011082891A
Publication Date:
03/21/2013
Filing Date:
09/16/2011
Assignee:
Wacker Chemie AG, 81737 (DE)
International Classes:
Foreign References:
EP14155382004-05-06
26988431955-01-04
Other References:
B. Teichmann, "Das Cellobioselipid Ustilaginsäure aus Ustilago maydis: Biosynthese und transkriptionelle Regulation", Dissertation Universität Marburg, 2009
S.H. Ross, "Antibiotics as preservatives for industrial materials". In: Applied Microbiology, ISSN 0003-6919, 1958, 6, 268 - 273 (abstract) CAPlus [online]. Accession No.1958:105198, In: STN
Claims:
1. Konservierungsmittel enthaltend ein Glykolipid der Formel (I): wobei
R1 H oder COCH3 bedeutet und
R2 gleich oder verschieden ist und H oder bedeutet, wobei n 1, 2 oder 3 ist und
R3 gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und
R4 OH oder OCH3 bedeutet
oder ein Salz des Glykolipids.

2. Konservierungsmittel gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es ein Glykolipid der Formeln (II) bis (XIV) oder eines ihre Salze enthält.

3. Verfahren zur Herstellung der Glykolipide gemäß Formel (I) bis (XIV) dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Ustilago maydis in einem Nährmedium kultiviert wird wobei die Glykolipide durch den Mikroorganismus gebildet werden und die Glykolipide anschließend aus der Kulturbrühe isoliert und gereinigt werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Kultivierungsmediums im pH-Bereich von 3,0 bis 10,0 bevorzugt im pH-Bereich von 4,5 bis 8,5 liegt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Inkubationstemperatur von 20–35°C, bevorzugt von 24–30°C vorliegt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass es über einen Zeitraum von 20 h bis 300 h durchgeführt wird.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die während der Fermentation gebildeten Glykolipide aus der Biomasse und dem Kulturüberstand isoliert, extrahiert und die Verbindungen gemäß Formel (I) bis (XIV) chromatographisch aufgereinigt werden.

8. Verwendung eines Glykolipids gemäß Formel (I) bis (XIV), bevorzugt gemäß Formel (X), (XIV), (VIII) oder (XII) besonders bevorzugt gemäß Formel (X) oder (XIV), oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass die Glykolipide in Mengen von 1 bis 4000 ppm, besonders bevorzugt von 5 bis 640 ppm eingesetzt werden.

10. Konservierungsmittel, enthaltend ein Glykolipid gemäß einer der Formeln (I) bis (XIV) oder eines ihrer Salze.

11. Lebensmittel, enthaltend ein Glykolipid gemäß einer der Formeln (I) bis (XIV) oder eines ihrer Salze.

12. Futtermittel, Kosmetika, Körperpflegeprodukte, Farben und Lacke und technische Emulsionen, enthaltend ein Glykolipid gemäß einer der Formeln (I) bis (XIV) oder eines ihrer Salze.

Description:

Die Erfindung betrifft Konservierungsmittel enthaltend Glykolipide, ein Verfahren zur Herstellung der Glykolipide mit Ustilago maydis und die Verwendung der Glykolipide.

Konservierungsmittel sind Stoffe, die einen Feststoff oder eine Flüssigkeit vor dem Verderb infolge eines Befalls durch Mikroorganismen schützen. Diese Mikroorganismen können beispielsweise Hefen, Schimmelpilze, grampositive oder gramnegative Bakterien sein. Besonders in der Lebensmittelindustrie muss ein Befall von Lebensmitteln durch Hefen, Schimmelpilze oder Bakterien verhindert werden um eine Sicherheit der Produkte über einen begrenzten Zeitraum zu gewährleisten. Dem Wunsch der Verbraucher, ein sicheres und begrenzt haltbares Lebensmittel zu konsumieren, steht der Wunsch nach größtmöglicher Natürlichkeit des Lebensmittels entgegen. Der Verbraucher würde gerne auf den Zusatz von chemisch synthetisierten Zusatzstoffen in Lebensmitteln verzichten. So werden auf dem Markt immer häufiger natürliche Alternativen zu synthetischen Zusatzstoffen angeboten. Ein gutes Beispiel ist der Austausch von synthetischen Farbstoffen in Lebensmitteln durch Farbstoffe natürlichen Ursprungs.

Im Bereich der Konservierung von Lebensmitteln werden bisher natürliche Konservierungsmittel nur in sehr eingeschränkten Spezialanwendungen eingesetzt. Dies liegt an den schlechten sensorischen Eigenschaften der entsprechenden Substanzen oder Extrakte. Besonders in der Getränkeindustrie spielt die Sensorik eines Produkts eine entscheidende Rolle. Aus diesem Grund ist es bisher nicht gelungen natürliche Alternativen zu den chemisch synthetisierten Konservierungsstoffen Sorbinsäure und Benzoesäure in Getränken zu etablieren.

Neben der Konservierung von Lebensmitteln spielen Konservierungsmittel auch bei der Konservierung von Futtermitteln, Kosmetika, Körperpflegeprodukten, Farben und Lacken sowie technischen Emulsionen eine wichtige Rolle.

Glykolipide sind Moleküle, bei denen ein oder mehrere Mono- oder Oligosaccharide glykosidisch an ein Lipid-Molekül gebunden sind. Der Saccharid-Rest im Glykolipid ist für die Namensgebung der verschiedenen Glykolipid-Klassen verantwortlich. Ist beispielsweise das Disaccharid Sophorose Bestandteil eines Glykolipids, spricht man von Sophoroselipiden. Literaturbekannt sind weiterhin Rhamnoselipide, Trehaloselipide, Cellobioselipide und Mannosylerythritollipide.

Ustilago maydis (U. maydis) ist ein Pilz aus der Klasse der Ustilaginomyceten, der Maispflanzen befallen kann. Vor allem in Mexico gilt U. maydis als Nahrungsmittel und wird dort als Delikatesse verzehrt.

Aus EP1415538 ist bekannt dass sich Backwaren durch Rhamnolipide konservieren lassen.

Aus US2698843 ist bekannt, dass das Cellobioselipid Ustilaginsäure antibiotische Wirksamkeit besitzt.

Die Biosynthese der Ustilaginsäure sowie die Verwendung als Agens zur biologischen Kontrolle des pflanzenpathogenen Pilzes Botrytis cinerea sind in der Dissertation von Beate Teichmann (http://archiv.ub.uni-marburg.de/opus/frontdoor.php?source_opus=2342&la=de) beschrieben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Konservierungsmitteln, die eine breite Aktivität gegenüber Hefen, Schimmelpilzen und Bakterien besitzen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Konservierungsmittel enthaltend ein Glykolipid der Formel (I) wobei
R1 H oder COCH3 bedeutet
R2 gleich oder verschieden ist und H oder bedeutet, wobei n 1, 2 oder 3 ist,
R3 gleich oder verschieden ist und H oder OH bedeutet und
R4 OH oder OCH3 bedeutet
oder ein Salz des Glykolipids.

Bevorzugt enthält das Konservierungsmittel ein Glykolipid der Formeln (II) bis (XIV) oder ein Salz der genannten Verbindungen.

Bei dem Salz handelt es sich vorzugsweise um ein Alkali- oder ein Erdalkalisalz.

Vorzugsweise besteht das Konservierungsmittel aus dem Glykolipid gemäß einer der Formeln (I) bis (XIV) oder einem seiner Salze.

Bevorzugt ist ein Glykolipid der Formeln (X), (XIV), (VIII) oder (XII) besonders bevorzugt ein Glykolipid der Formeln (X) oder (XIV), wobei wiederum das Glykolipid der Formel (X) insbesondere bevorzugt ist.

Die Glykolipide gemäß Formel (I) bis (XIV) lassen sich dadurch herstellen, dass der Mikroorganismus U. maydis in einem Nährmedium kultiviert wird, wobei die Glykolipide durch den Mikroorganismus gebildet werden und die Glykolipide anschließend aus dem Medium isoliert und gereinigt werden.

Die Herstellung der Glykolipide der Formeln (I) bis (XIV) mit Hilfe eines U. maydis-Stammes erfolgt vorzugsweise in einem Schüttelkolben oder einem Fermenter nach dem Fachmann bekannten Verfahren.

Als Kohlenstoff-Quelle dienen im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren. Besonders bevorzugt werden als Kohlenstoff-Quellen Glucose, Lactose, Saccharose, D-Mannit oder Glycerin eingesetzt.

Als Stickstoff-Quelle werden im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise Ammoniak, Ammoniumsalze oder Proteinhydrolysate verwendet.

Als weitere Medienzusätze können Salze der Elemente Phosphor, Chlor, Natrium, Magnesium, Stickstoff, Kalium, Calcium, Eisen und in Spuren (d. h. in μM Konzentrationen) Salze der Elemente Molybdän, Bor, Kobalt, Mangan, Zink, Kupfer und Nickel zugesetzt werden.

Des Weiteren können organische Säuren (z. B. Acetat, Citrat), Aminosäuren (z. B. L-Isoleucin, D/L-Methionin) und Vitamine (z. B. Vitamin 31, Vitamin 36, Vitamin 312) dem Medium zugesetzt werden.

Als komplexe Nährstoffquellen können z. B. Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojamehl oder Hefeextrakt zum Einsatz kommen.

Der pH-Wert des Mediums liegt während der Kultivierung bevorzugt im pH-Bereich von 3,0 bis 10,0 besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von 4,5 bis 8,5.

Die Inkubation des U. maydis-Stammes erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, über einen Zeitraum von 20 h bis 300 h und im Bereich der für den jeweiligen Stamm optimalen Wachstumstemperatur. Die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise 20–35°C, besonders bevorzugt ist eine Inkubationstemperatur von 24–30°C. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungszeit zwischen 24 h und 150 h.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reinigung der erfindungsgemäßen Glykolipide welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die während der Fermentation gebildeten Glykolipide aus Biomasse und Kulturüberstand isoliert, extrahiert und die Verbindungen gemäß Formel (I) bis (XIV) chromatographisch, durch selektive Extraktion oder durch Kristallisation aufgereinigt werden.

Die Isolation der Glykolipide aus Biomasse und Kulturüberstand erfolgt in bekannter Art, beispielsweise durch Separation, Zentrifugation, Adsorption oder Membranverfahren.

Dem Fachmann sind verschiedene Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Aceton, Ethanol, Isopropanol, Methylacetat, Ethylacetat, CO2, Propan, Butan, Hexan, Dichlormethan oder Ethylmethylketon bekannt, die zur Extraktion eingesetzt werden können. Bevorzugt wird Methanol zur Extraktion eingesetzt.

Neben den genannten chemischen Aufschlussmethoden kann die Biomasse auch mechanisch wie z. B. durch Hochdruckhomogenisation oder Ultraschall vorbehandelt werden.

Die Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch dem Fachmann bekannte chromatographische Methoden, selektive Extraktion, Ionenaustauschverfahren oder Kristallisation durchgeführt werden. Bevorzugt ist zunächst eine grobe Trennung durch eine Mitteldruckchromatographie (MPLC) sowie eine anschließende Feintrennung durch eine Reversed-Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC).

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen sehr gute konservierende Eigenschaften insbesondere auch gegenüber klassischen Getränkeverderbern wie Alicyclobacillus acidoterrestris, Gluconacetobacter liquefaciens, Lactobacillus plantarum, Penicillium expansum und Zygosaccharomyces rouxii besitzen.

Bei Alicyclobacillus acidoterrestris handelt es sich um einen grampositiven Getränkeverderber, der häufig in Fruchtsäften und Fruchtsaftkonzentraten Probleme bereitet (Walker und Phillips, International Journal of Food Science and Technology 2008, 43, 250–260). Dieser Keim produziert sehr resistente Sporen, die auch bei niedrigen pH-Werten auskeimen können.

Das ebenfalls grampositive Bakterium Lactobacillus plantarum ist ebenfalls ein häufig vorkommender Getränkeverderber und zeichnet sich vor allem durch seine Hitzebeständigkeit in Pasteurisierungsprozessen aus (Alwazeer et al., Journal of Food Protection 2002, 65(10), Seiten 1586–1589).

Bei Gluconacetobacter liquefaciens handelt es sich um einen gramnegativen Verderber, der besonders häufig in Fruchtsäften und stillen fruchtsafthaltigen Getränken Kontaminationen verursacht.

Der Schimmelpilz Penicillium expansum ist ein relevanter Verderber von Säften, Nektaren, fruchtsafthaltigen Getränken, Molkemischgetränken und stillen Getränken wobei das Wachstum meist im Flaschenhals, an der Getränkeoberfläche sowie im Bereich des Verschlusses beobachtet wird.

Bei Zygosaccharomyces rouxii handelt es sich um eine getränkeverderbende Hefe, die neben stark zuckerhaltigen Getränken auch Molkemischgetränke und stille Getränke wie beispielsweise Eistee befallen kann.

Weitere in der Lebensmittelindustrie auftretende Verderbniserreger sind die gärschwache Hefe Brettanomyces naardenensis, das schleimbildende gramnegative Bakterium Enterobacter cloacae, die obligat heterofermentative Hefe Weissella confusa, das als fäkalindikator bekannte gramnegative Bakterium Escherichia coli, die gärkräftige Hefe Saccharomyces cerevisiae, die grampositiven Bakterien Bacillus subtilis und Bacillus cereus, die hitzeresistente Endosporen bilden, sowie die Schimmelpilze Byssochlamys fulva und Aspergillus brasiliensis.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung eines Glykolipids gemäß Formel (I) bis (XIV) oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel, wobei die bereits genannte Bevorzugung der verschiedenen Glykolipide auch hier gilt.

Bevorzugt ist die Verwendung eines Glykolipids gemäß Formel (I) bis (XIV) oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel in Lebensmitteln, besonders bevorzugt in Getränken und milchhaltigen Produkten, ganz besonders bevorzugt in Säften, Nektaren, Erfrischungsgetränken, molkehaltigen Getränken und Joghurtgetränken.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Glykolipide der Formeln (II) bis (XIV) oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel.

Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung der Glykolipide der Formeln (II) bis (XIV) oder eines ihrer Salze als Konservierungsmittel in Lebensmitteln, Futtermitteln, Kosmetika, Körperpflegeprodukten, Farben und Lacken oder technischen Emulsionen, besonders bevorzugt in Getränken und milchhaltigen Produkten, ganz besonders bevorzugt in Säften, Nektaren, Erfrischungsgetränken, molkehaltigen Getränken und Joghurtgetränken.

Die Erfindung betrifft ferner Lebensmittel, die ein erfindungsgemäßes Konservierungsmittel, also ein Glykolipid der Formeln (I) bis (XIV) vorzugsweise der Formeln (II) bis (XIV) enthalten, besonders bevorzugt ein Glykolipid der Formeln (X), (XIV), (VIII) oder (XII) und ganz besonders bevorzugt ein Glykolipid der Formeln (X) oder (XIV) enthalten. Bei den Lebensmitteln handelt es sich vorzugsweise um Getränke oder milchhaltige Produkte. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Getränken um Säfte, Nektare, Erfrischungsgetränke, molkehaltige Getränke und Joghurtgetränke.

Die Erfindung betrifft ferner Futtermittel, Kosmetika, Körperpflegeprodukte, Farben und Lacke sowie technische Emulsionen die ein erfindungsgemäßes Konservierungsmittel, also ein Glykolipid der Formeln (I) bis (XIV) vorzugsweise der Formeln (II) bis (XIV), besonders bevorzugt ein Glykolipid der Formeln (X), (XIV), (VIII) oder (XII) und ganz besonders bevorzugt ein Glykolipid der Formeln (X) oder (XIV) enthalten.

Vorzugsweise werden die genannten Glykolipide in Mengen von 1 bis 4000 ppm, besonders bevorzugt von 5 bis 640 ppm als Konservierungsmittel verwendet. Damit enthalten die erfindungsgemäßen Lebensmittel, Futtermittel, Kosmetika, Körperpflegeprodukte, Farben und Lacke oder technischen Emulsionen die genannten Glykolipide vorzugsweise in diesen Mengen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1: Stammisolierung

Der U. maydis-Stamm ACD 04507fxxx000001 wurde im September 2010 aus Brandsporen eines befallenen Maiskolbens isoliert. Die Probe stammt aus dem Bundesland Brandenburg in Deutschland. Die Haltung des Stammes erfolgte durch Einfrieren einer Suspension in einer Glycerol-haltigen Einfrierlösung bei –80°C. Der Stamm ACD 04507fxxx000001 wurde am 02.09.2011 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 25129 gemäß Budapester Vertrag von der Firma Analyticon Discovery GmbH (Hermannswerder Haus 17, 14473 Potsdam, Deutschland) hinterlegt.

Beispiel 2: Kultivierung

ACD 04507fxxx000001 wurde auf einem MA-Agarmedium (30 g/L Malzextrakt, 15 g/L Agar agar, pH = 7,0) bei 24–25°C revitalisiert. Zur Vorkultur wurden spezielle 500 mL Erlenmeyer-Kolben (500 mL Erlenmeyer-Kolben mit zwei gegenüberliegenden Einstichen; die Einstiche sind etwa 2,5 cm lang, zwischen 2 und 3 cm über dem Boden des Kolbens und in einem Winkel von 30°C zur Horizontalen angeordnet; Die Kolben werden mit Polyurethan-Schaumstopfen von 50 mm Länge und 40 mm Durchmesser steril verschlossen) mit jeweils 100 mL MAT-Medium (30 g/L Malzextrakt, 1 g/L Agar agar, 0,2 Volumenprozent Tween 85, pH = 7,0) durch drei bis vier bewachsene Agarstücke von 11 Tage alten Agarplatten beimpft. Die Vorkulturkolben wurden auf einem Orbitalschüttler mit 50 mm Schüttelradius bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 rpm und 24–25°C zwei Tage inkubiert. Die Hauptkultur erfolgte in ebensolchen Erlenmeyer-Kolben mit jeweils 100 mL GL01-Medium (50 g/L Glucose, 1,7 g/L Yeast Nitrogen Base, pH 6,5; die Glucose- und Yeast Nitrogen Base-Lösungen wurden getrennt autoklaviert). Beimpft wurden die Kolben mit jeweils 10 mL der Vorkultur. Die beimpften Kolben wurden auf einem Orbitalschüttler mit 50 mm Schüttelradius bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 rpm und 24–25°C fünf Tage inkubiert.

Beispiel 3: Ernte und Extraktbereitung

126 Kolben der Hauptkultur wurden in 1 L-Zentrifugenbecher geerntet und in einer Heraeus Sepatech Zentrifuge bei 5300 g für 20 min zentrifugiert. Das so gewonnene Sediment wurde eingefroren und lyophilisiert. Die Extraktion erfolgte mit Methanol und wurde durch 15 min Behandlung im Ultraschallbad und 15 min schütteln unterstützt. Nach einer Filtration wurde das Sediment nochmals auf gleiche Weise mit Methanol extrahiert.

Durch die zweimalige Extraktion wurden 3300 mL einer Lösung erhalten, die 83,7 g Feststoffe enthielt. Der Extrakt wurde nach Zugabe von 168 g Celite getrocknet.

Beispiel 4: Isolierung

Die Isolierung der enthaltenen Verbindungen erfolgte durch ein zweistufiges Verfahren.

1. Stufe: Vortrennung mittels MPLC

Der auf Celite aufgezogene Extrakt wurde durch Mitteldruckchromatographie (MPLC) an RP-18 (200 × 50 mm) mit einem Gradient (Methanol-Wasser) von 57–90% Methanol bei einer Flussrate von 30 mL/min aufgetrennt (siehe Tabelle 1). Tabelle 1: Relevante Fraktionen der MPLC-Trennung

FraktionVolumen [mL]Ausbeute [g]BewertungA1000< 24,23B7501,21C7501,28präparative HPLC, als C-1237-CD7508,47präparative HPLC, als C-1237-DE75017,08präparative HPLC, als C-1237-E und C-1237-RF75015,98G7509,73I7505,04K6000,67

2. Stufe: Feintrennung mittels präparativer RP-HPLC

Zur Isolierung der enthaltenen Verbindungen wurden jeweils max. 3,50 g der MPLC-Fraktionen, die bei der Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) wachstumshemmende Wirkung gegen die Testkeime zeigten, über präparative HPLC mittels der in den Tabellen 2 bis 4 beschriebenen Methoden getrennt. Tabelle 2: Trennungsbedingungen der Fraktion C-1237-C

Stationäre PhaseLiChrospher Select B, 10 μm, 250 × 50 mmFlußrate80 mL/minDetektionELSD, UVLaufmittel ABidest. Wasser + 5 mM Ammoniumformiatund 0,1% Ameisensäure (pH 3)Laufmittel BAcetonitril/Methanol = 1:1 + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure (pH 3)Gradientvon 32% auf 66% B in 57,7 min
Tabelle 3: Trennungsbedingungen der Fraktion C-1237-DStationäre PhaseLiChrospher Select B, 10 μm, 250 × 50 mmFlußrate80 mL/minDetektionELSD, UVLaufmittel ABidest. Wasser + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure (pH 3)Laufmittel BAcetonitril/Methanol = 1:1 + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure (pH 3)Gradientvon 52% auf 74% B in 57,7 min
Tabelle 4: Trennungsbedingungen der Fraktion C-1237-E und -RStationäre PhaseLiChrospher Select B, 10 μm, 250 × 50 mmFlußrate80 mL/minDetektionELSD, UVLaufmittel ABidest. Wasser + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure (pH 3)Laufmittel BAcetonitril/Methanol = 1:1 + 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure (pH 3)Gradient-E: von 42% auf 56% B in 57.7 min
-R: von 56% auf 70% B in 57,7 min

Die isolierten Feinfraktionen wurden per HPLC (Einzelheiten siehe im Folgenden als „Methode 1” tabellarisch dargestellt), LC/MS (Einzelheiten siehe im Folgenden als „Methode 2” tabellarisch dargestellt) und NMR-Spektroskopie charakterisiert und die analytischen Daten zur Klärung der Strukturen genutzt. Methode 1: Analytisches HPLC-ELSD-Verfahren

HPLC SystemMerck HitachiDaten SystemHPLC-Manager D-7000 HSMStationäre PhaseMerck Superseher 60 RP-select B 125 × 4 mm, 4 μm Flußrate1 mL/minDetektionELSD (Sedex 75)Injektionsvolumen10 μLMobile Phase:A: 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure
B: Acetonitril/Methanol = 1:1, Zusatz von 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure (pH 3)
GradientZeit [min]% A% B08515150100180100
Methode 2: Analytisches LC/MS-VerfahrenHPLC SystemPE series 200MS SystemApplied Biosystems API 150, 165 oder 365 Daten SystemAnalyst 1.3 oder Masschrom 1.2.1. Stationäre PhasePhenomenex Luna C8 (2), 5 μm, 50 × 4,6 mm Flußrate1,2 mL/minDetektion(+/(–)-ESI, Fast-Switching-Mode, ELSD (Sedex 75) Injektionsvolumen10 μLMobile Phase:A: 5 mM Ammoniumformiat and 0,1% Ameisensäure
B: Acetonitril/Methanol = 1:1, Zusatz von 5 mM Ammoniumformiat und 0,1% Ameisensäure (pH 3)
GradientZeit [min]% A% B09556010080100

In der folgenden Tabelle 5 sind die Ergebnisse zu Feintrennungen zusammengestellt. Tabelle 5: Mengen und Reinheit der Chargen zu den für das Patent relevanten Strukturen aus C-1237

Batch-IDCompoundIDStrukturformelMenge in mgReinheit in % (HPLC-ELSD)C-1237-C-08NP-018242(III)29,999,2C-1237-C-09NP-018243(IV)60,799,2C-1237-C-12NP-018244(V)15,198,9C-1237-C-14NP-018245(VI)16,498,7C-1237-D-01NP-018243(IV)43,473,5C-1237-D-02NP-018243(IV)213,798,8C-1237-D-10NP-018250(VIII)34,899,3C-1237-D-11NP-018250(VIII)31,875,3C-1237-E-02NP-018243(IV)220,499,8C-1237-E-04NP-018247(XIII)6,398,7C-1237-E-05NP-018248(XI)7,899,5C-1237-E-07NP-018249(VII)69,399,5C-1237-E-08NP-018245(VI)31,296C-1237-E-09NP-018217(XII)187,699,7C-1237-E-11NP-018218(II)29,899C-1237-R-01NP-018218(II)13,798,2C-1237-R-02NP-018255(IX)7,696,1C-1237-R-04NP-018256(X)44,698,4C-1237-R-05NP-018250(VIII)27,893,2

Beispiel 5: Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität

Die Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität erfolgte im Broth-Dilution-Test und wurde in Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit U-Boden durchgeführt. Dieses Verfahren wurde auch zur Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) eingesetzt. Die verwendeten Mikroorganismen sind in Tabelle 6 aufgelistet. Tabelle 6: Verwendete Mikroorganismen

AnalytiCon-CodeDSMZ-, ATCC- bwz, CBS-Nr.GattungSpec. epithetAnzucht-MediumTemperaturTiter nach Inokulation04318bdsm00 2498DSM 2498Alicyclobacillusacidoter restrisAAMA37°C5 × 10204437fdsm06 2841DSM 62841PenicilliumexpansumPDA25°C 1,5 × 10304430bdsm00 5603DSM 5603GluconacetobacterliquefaciensN804A30°C5 × 10204430bdsm02 0174DSM 20174Lactobacillusplantarum ssp plantarumMRSA30°C5 × 10204430fdsm00 7525DSM 7525ZygosaccharomycesrouxiiTM18625°C1,5 × 10300540bATC00 6633ATCC 6633BacillussubtilisCASO30°C5 × 10504318fdsm00 2548DSM 2548SaccharomycescerevisiaeSDA225°C5 × 10504318fdsm00 1988DSM 1988AspergillusbrasiliensisPDA30°C1,5 × 10300540bDSM00 4490DSM 4490BacilluscereusTSA
+SB
30°C5 × 105
04653fCBS00 6115CBS 6115BrettanomycesnaardenensisGPYCA25°C1,5 × 10304428fdsm00 1808DSM 1808ByssochlamysfulvaPDA30°C1,5 × 10304318bdsm00 6234DSM 6234EnterobactercloacaeTSA
+SB
30°C5 × 105
00560bDSM00 1103DSM 1103EscherichiacoliTSA
+SB
37°C5 × 105
04318bdsm02 0194DSM 20194WeissellaconfusaMRSA30°C5 × 102

Zur Inokulumproduktion wurden Sporen von DSM 1988, DSM 1808, DSM 2498 und DSM 62841 bei –80°C eingefroren und direkt verwendet. Der Titer der gefrorenen Suspensionen wurde durch ausplattieren auf Agarplatten bestimmt. Bei anderen Stämmen wurde das Inokulum aus Einzelkolonien frisch bewachsener Agarplatten, typischerweise Übernachtkulturen, hergestellt. Der Titer der Inokulumsuspension wird näherungsweise durch Messung der Absorption bei 625 nm bestimmt. Entspricht diese der Absorption von McFarland-Standard 0.5, wird ein Titer von 108 angenommen.

Der Test wird in Polystyrol-96-well-Platten mit U-Boden durchgeführt. Testsubstanzen werden typischerweise in DMSO, DMSO-Wasser oder Wasser gelöst. Tabelle 7:Zusammenfassung und Übersicht hinsichtlich der Testbedingungen

StammMediumTemperatur, Volumen, InkubationBemerkungA. brasiliensis DSM 1988WAC0830°C, 200 μL, 120 hBreatheEasy-FolieB. fulva DSM 1808WAC0830°C, 200 μL, 120 hBreatheEasy-FolieB. naardenensis CBS 6115WAC0825°C, 200 μL, 120 h P. expansum DSM 62841WAC0825°C, 200 μL, 120 hBreatheEasy-FolieZ. rouxii DSM 7525WAC0825°C, 200 μL, 120 hA. acidoter-restris DSM 2498WAC1437°C, 200 μL, 120 hG. liquefaciens DSM 5603WAC1430°C, 200 μL, 120 hL. plantarum DSM 20174WAC1430°C, 200 μL, 120 hAnaerobW. confusa DSM 20194WAC1430°C, 200 μL, 120 hAnaerobS. cerevisiae DSM 2548SABD25°C, 100 μL, 18–20 hB. cereus DSM 4490MHB II30°C, 100 μL, 18–20 hB. subtilis ATCC 6633MHB II30°C, 100 μL, 18–20 hE. cloacae DSM 6234MHB II37°C, 100 μL, 18–20 hE. coli DSM 1103MHB II37°C, 100 μL, 18–20 h

Der rechnerische Titer der Stämme nach Inokulation ist in Tabelle 7 wiedergegeben. Anaerob wachsende Stämme werden unter Einsatz des BD GasPak EZ Anaerobe System (BD, Tullastr. 8–12, 69126 Heidelberg, Deutschland) inkubiert. Durch die BreathEasy-Folie (Diversified Biotech, 65 Commerce Way, Dedham, MA 02026, USA) wird die Kontamination von benachbarten Wells mit Pilzsporen verhindert.

Die Auswertung des Wachstums erfolgt mittels Binokular und anderer optischer Hilfsmittel. Nähr- und Testmedien:AAMA:

BestandteilLieferant[g]Lösung AHefeextraktBacto 2127200,80(NH4)2SO4Fluka 099800,16MgSO4 × 7 H2OFluka 631400,40CaCl2 × 2 H2OFluka 211010,20KH2PO4Riedel-de Haën 042430,48GlucoseRoth0,80Demineralisiertes Wasser400 mLpH-WertpH 4,0Lösung BSL6800 μLLösung CDemineralisiertes Wasser400 mLAgar agarRoth 521012,0
SL6:Bestandteile[g/L]1ZnSO4 × 7 H2O0,12MnCl2 × 4 H2O0,033H3BO30,34CoCl2 × 6 H2O0,25CuCl2 × 2 H2O0,016NiCl2 × 6 H2O0,027Na2MoO4 × 2 H2O0,038Demineralisiertes Wasser1000 mL
Anleitung zur Herstellung von AAMA:1)Lösung C: Agar agar wird durch aufkochen vor dem Autoklavieren gelöst.2)Lösung A, Lösung B und agarhaltige Lösung C getrennt autoklavieren.3)500 mL Lösung A plus 1 mL Lösung B und 500 mL Lösung C im Wasserbad auf 50°C temperieren, vereinigen und homogenisieren; anschließend dispensieren.
PDA:BestandteilLieferant[g/L]1Potato Dextrose BrothDifco 25492024,02Demineralisiertes Wasser1000 mL3pH-WertpH 7,04Agar agarRoth 521015,0
N804A:BestandteilLieferant[g/L]140% (w/v) Glucose-Lösungaus Roth HN0615 mL2HefeextraktMerck 1037535,03PolypeptonRoth 29035,04MgSO4 × 7 H2OFluka 631401,05Demineralisiertes Wasser985 mL6pH-WertpH 6,87Agar agarRoth 521015,0
MHB II:BestandteilLieferant[g/L]1Mueller-Hinton II BrothBD 21232222,02Demineralisiertes Wasser1000 mL
MRSA:BestandteilLieferant[g/L]1MRS-Bouillon (kühl lagern)Merck 1.1066152,22Demineralisiertes Wasser1000 mL3Agar agarRoth 521015,0
TM186:BestandteilLieferant[g/L]1HefeextraktMerck 1037533,02MalzextraktFluka 701673,03Peptone from soy beanSigma P05215,04GlucoseRoth HN0610,05Demineralisiertes Wasser1000 mL6pH-Wert nicht einstellen7Agar agarRoth 521015,0
CASO:BestandteilLieferant[g/L]1CASO Broth/CASO-BouillonFluka 2209830,02Demineralisiertes Wasser1000 mL3pH-WertpH 7,04Agar agarRoth 521015,0
TSA + SB = TSA mit Schafblut
Agar Platten wurden von der Oxoid Deutschland GmbH, Bestellnummer PB5012A, bezogen. SDA2:BestandteilLieferant[g/L]1Sabouraud Dextrose BrothDifco 23823030,02Demineralisiertes Wasser1000 mL3pH-WertpH 5,6 ± 0,24Agar agarRoth 521015
SABD:BestandteilLieferant[g/L]1Sabouraud Dextrose BrothDifco 23823030,02Demineralisiertes Wasser1000 mL3pH-WertpH 5,6
WAC08:BestandteilLieferant[g/L]1Sabouraud Dextrose BrothDifco 23823012,02GlucoseRoth HN067,03FructoseDiasan15,04SaccharoseHandelsware15,05Demineralisiertes Wasser1000 mL6pH-WertpH 4,5
WAC14:BestandteilLieferant[g]Lösung AHefeextraktBacto 2127202,00(NH4)2SO4Fluka 099800,40MgSO4 × 7 H2OFluka 631401,00CaCl2 × 2 H2OFluka 211010,50KH2PO4RdH 042431,20GlucoseRoth5,00FructoseDiasan5,00SaccharoseHandelsware5,00Demineralisiertes Wasser1000 mLpH-WertpH 4,5Lösung BSL62000 μL
Anleitung zur Herstellung von WAC14:1)Lösung A und Lösung B getrennt autoklavieren.2)Nach dem Autoklavieren Lösung B in die Gefäße mit Lösung A zugeben und homogenisieren.3)Medium in sterile Gefäße dispensieren.

Beispiel 6: Antimikrobielle Aktivität der Fraktionen C-1237-C, C-1237-D und C-1237-E

Verschiedene Mikroorganismen-Stämme wurden, wie in Beispiel 5 ausgeführt, unter Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Fraktionen C-1237-C, C-1237-D und C-1237-E inkubiert. In Tabelle 8 sind die MIC-Werte der Fraktionen C-1237-C, C-1237-D und C-1237-E und in Tabelle 9 die MIC-Werte der isolierten Glykolipide (II) bis (XI) für die einzelnen Mikroorganismen aufgelistet. Tabelle 8: MIC-Werte der Fraktionen C-1237-C, C-1237-D und C-1237-E

FraktionAa MIC [μg/mL]Gl MIC [μg/mL]Lp MIC [μg/mL]Pe MIC [μg/mL]Zr MIC [μg/mL]C-1237-C> 1500640640320320C-1237-D> 1500≤ 20≤ 20≤ 20≤ 20C-1237-E> 1500≤ 20≤ 20≤ 20≤ 20
Aa = Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 2498
Gl = Gluconacetobacter liquefaciens DSM 5603
Lp = Lactobacillus plantarum DSM 20174
Pe = Penicillium expansum DSM 62841
Zr = Zygosaccharomyces rouxii DSM 7525 Tabelle 9: MIC-Werte der Glykolipide (II) bis (XI) in μg/mLSubstanz-IDStrukturformelAaGlLpPeZrNP-018218(II)> 600600> 600600600NP-018242(III)> 600240> 600240240NP-018243(IV)> 600600400240240NP-018244(V)> 600> 600> 600> 600> 600NP-018245(VI)> 600> 600> 600600> 600NP-018248(XI)> 600> 600> 600> 600> 600NP-018249(VII)> 600240> 600120240NP-018250(VIII)> 60032161632NP-018255(IX)> 600400> 600120240NP-018256(X)> 600≤ 8≤ 8≤ 8≤ 8
Aa = Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 2498
Gl = Gluconacetobacter liquefaciens DSM 5603
Lp = Lactobacillus plantarum DSM 20174
Pe = Penicillium expansum DSM 62841
Zr = Zygosaccharomyces rouxii DSM 7525

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 1415538 [0007]
  • US 2698843 [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • http://archiv.ub.uni-marburg.de/opus/frontdoor.php?source_opus=2342&la=de [0009]
  • Walker und Phillips, International Journal of Food Science and Technology 2008, 43, 250–260 [0031]
  • Alwazeer et al., Journal of Food Protection 2002, 65(10), Seiten 1586–1589 [0032]