Title:
Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen
Kind Code:
B3
Abstract:

Beschrieben wird ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren (1) besteht, wobei die Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) einen zu einem ersten Signal-Pin-Abschnitt (5’) von Signal-Nukleinsäureoligomeren (2) komplementären Sonden-Pin-Abschnitt (5) besitzen,
b) Bereitstellen wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren (2), wobei
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen zu dem Sonden-Pin-Abschnitt (5) der Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) komplementären ersten Signal-Pin-Abschnitt (5’) besitzen,
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt (8’) von Target-Nukleinsäureoligomeren (10) komplementären Signal-Erkennungs-Abschnitt (8) besitzen,
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementären Signal-Pin-Abschnitt (5’, 5’’) besitzen, wobei die Hairpin-Struktur eine Schmelztemperatur TPIN aufweist, ...



Inventors:
Hartwich, Gerhard (80639, München, DE)
Application Number:
DE102011056606A
Publication Date:
01/03/2013
Filing Date:
12/19/2011
Assignee:
FRIZ Biochem Gesellschaft für Bioanalytik mbH, 82061 (DE)
International Classes:
Foreign References:
201101361262011-06-09
Other References:
LUO, X. u.a.: Electrochemical techniques on sequence-specific PCR amplicon detection for point-of-care applications. Analyst (2009) 134 (10) 1941-2168
LUO, X. u.a.: Real time electrochemical monitoring of PCR amplicons using electroactive hydrolysis probe. Electrochem. Comm. (Juli 2011) 13 (7) 742-745
Attorney, Agent or Firm:
Graf Glück Habersack Kritzenberger, 93049, Regensburg, DE
Claims:
1. Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren (1) besteht, wobei die Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) einen zu einem ersten Signal-Pin-Abschnitt (5’) von Signal-Nukleinsäureoligomeren (2) komplementären Sonden-Pin-Abschnitt (5) besitzen,
b) Bereitstellen wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren (2), wobei
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen zu dem Sonden-Pin-Abschnitt (5) der Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) komplementären ersten Signal-Pin-Abschnitt (5’) besitzen,
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt (8’) von Target-Nukleinsäureoligomeren (10) komplementären Signal-Erkennungs-Abschnitt (8) besitzen,
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementären Signal-Pin-Abschnitt (5’, 5’’) besitzen, wobei die Hairpin-Struktur eine Schmelztemperatur TPIN aufweist,
– der zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur ausgelegte erste Signal-Pin-Abschnitt (5’) nicht zu den Target-Nukleinsäureoligomeren (10) komplementär ist, und
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) im Bereich des zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur ausgelegten erste Signal-Pin-Abschnitts (5’) mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel (9) modifiziert sind,
c) Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren (10),
d) Bereitstellen einer Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Reaktionslösung zumindest Nukleotide, wenigstens eine Art von Primer (11’, 12’) und wenigstens eine Art von Nukleinsäure-Polymerase (13) mit Exonuklease-Aktivität enthält,
e) Mischen der in Schritt d) bereitgestellten Reaktionslösung mit den in Schritt b) bereitgestellten Signal-Nukleinsäureoligomeren (2) und der in Schritt c) bereitgestellten Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren (10),
f) Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere (10) mittels Nukleinsäureamplifikation unter Bildung von Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücken (14),
g) Inkontaktbringen des in Schritt f) erhaltenen Reaktionsgemisches mit der in Schritt a) bereitgestellten modifizierten Oberfläche,
h) Detektion der gebildeten Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke (14) durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET ≤ TPIN,
i) mehrfache Wiederholung der Schritte f) bis h),
k) Vergleich der verschiedenen in Schritt h) erhaltenen Werte.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) zusätzlich zumindest einen Signal-Dock-Abschnitt (6’), und die Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) zusätzlich einen zu dem Signal-Dock-Abschnitt (6’) der Signal-Nukleinsäureoligomere (2) komplementären Sonden-Dock-Abschnitt (6) besitzen, wobei der Signal-Dock-Abschnitt (6’) der Signal-Nukleinsäureoligomere (2) benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt (5’,) angeordnet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Signal-Dock-Abschnitt (6’) der Signal-Nukleinsäureoligomere (2) nicht zu den Target-Nukleinsäureoligomeren (10) komplementär ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) im Bereich des ersten Signal-Pin-Abschnitts (5’) und/oder im Bereich des benachbart zu dem Signal-Pin-Abschnitt (5’) angeordneten Signal-Dock-Abschnitts (6’) mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel (9) modifiziert sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die zwei Signal-Pin-Abschnitte (5’, 5’’) der Signal-Nukleinsäureoligomere jeweils 4 bis 10 Basen, bevorzugt 5 bis 8 Basen aufweisen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Signal-Erkennungs-Abschnitt (8) der Signal-Nukleinsäureoligomere (2) innerhalb des Loop-Bereichs der Hairpin-Struktur zwischen den Signal-Pin-Abschnitten (5’, 5’’) angeordnet ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der zweite Signal-Pin-Abschnitt (5’’) der Signal-Nukleinsäureoligomere (2) nicht zu den Target-Nukleinsäureoligomeren (10) komplementär ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das freie Ende des zweiten Signal-Pin-Abschnitts (5’’) der Signal-Nukleinsäureoligomere (2) durch ein Nukleotid gebildet wird, das ein invertiertes Nukleosid oder ein di-desoxy-Nukleosid aufweist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) in ihren Sonden-Pin-Abschnitten (5) und/oder in ihren Sonden-Dock-Abschnitten (6) zumindest ein Nukleotid aufweisen, das nicht komplementär zu den entsprechenden Signal-Pin-Abschnitten (5’) und Signal-Dock-Abschnitten (6’) der Signal-Nukleinsäureoligomere (2) oder der Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke (14) ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Detektion der gebildeten Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke (14) in Schritt h) durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET zwischen 20 °C und 60 °C, bevorzugt zwischen 30 °C und 50 °C er folgt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die elektrochemische Detektion durch Amperometrie, Chronocoulometrie, Impedanzmessung oder Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere (10) in Schritt f) durch eine PCR oder durch eine isothermale Amplifikation erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Modifikation der in Schritt a) bereitgestellten modifizierten Oberfläche in der Anbindung von mehreren Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren (1) besteht und die verschiedenen Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren (1) in räumlich abgetrennten Bereichen an die modifizierte Oberfläche gebunden sind.

14. Signal-Nukleinsäureoligomer (1) zur Verwendung in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13, wobei das Signal-Nukleinsäureoligomer (1) einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementären Signal-Pin-Abschnitt (5’, 5’’) aufweist und das Signal-Nukleinsäureoligomer (1) in zumindest einem der Bereiche der zwei Signal-Pin-Abschnitte (5’, 5’’) mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel (9) modifiziert ist.

15. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend eine modifizierte Oberfläche wie in den Ansprüchen 1 bis 13 definiert, eine effektive Menge an Signal-Nukleinsäureoligomeren wie in Anspruch 14 definiert und eine Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation wie in Anspruch 1 definiert.

Description:
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen.

Stand der Technik

In der Krankheitsdiagnose, der mikrobiologischen Diagnostik, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor ist ein Direktnachweis kleinster Mengen von Nukleinsäuren mittlerweile unumgänglich. Zunehmend finden Detektionsverfahren mittels Array-Technologie unter Verwendung sogenannter DNA-Chips Anwendung, die eine oberflächensensitive Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen ermöglichen. Mit Hilfe dieser empfindlichen Methode können Nukleinsäuren mit einer sehr geringen Nachweisgrenze detektiert werden.

Häufig ist jedoch vor der eigentlichen Detektion ein DNA-Amplifizierungsschritt notwendig, in dem die nachzuweisenden DNA-Moleküle vervielfältigt werden, damit sie letztlich in einer Konzentration vorhanden sind, die über der Nachweisgrenze der gewählten Detektionsmethode liegt.

Die PCR stellt eine solche für die Molekularbiologie grundlegende Methode dar, die im Wesentlichen der Vervielfältigung von DNA-Molekülen dient und den schnellen, empfindlichen Direktnachweis kleinster Mengen von DNA oder RNA erlaubt. In den vergangenen Jahren hat diese Methode die Labors erobert, da ihre Anwendung sehr breit und vielschichtig ist. Die PCR hat in fast allen Bereichen der Wissenschaft und Medizin, einschließlich der forensischen Medizin, der pränatalen Diagnostik, der Onkologie und nicht zuletzt in der mikrobiologischen Diagnostik Einzug gehalten. Beispielsweise ist die PCR auf dem Sektor der klinischen Diagnostik meist die Methode der Wahl um z. B. Krankheitserreger nachzuweisen. Ebenso wird sie in der Lebensmittelindustrie als Nachweismethode für belastende Keime angewandt.

Bei der PCR handelt es sich um eine enzymatische Reaktion zur Amplifikation von Nukleinsäuremolekülen, die im Wesentlichen in einem wässrigen bzw. flüssigen Reaktionsgemisch mit sehr kleinen Volumina abläuft. Im Reaktionsgemisch befindet sich eine Nukleinsäure enthaltende Probe und die für die Reaktion außerdem notwendigen Primer, Nukleotide und eine Polymerase. Durch Zugabe von Puffern und vorzugsweise zweiwertigen Ionen wie z. B. Mg2+ wird das Reaktionsgemisch so eingestellt, dass die für die jeweilige Anwendungsart optimalen Reaktionsbedingungen herrschen.

Die Polymerase-Kettenreaktion beruht auf einem immer wiederkehrenden Zyklus aus drei, bei unterschiedlichen Temperaturen ablaufenden Schritten, nämlich Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung.

Bei der Denaturierung wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur größer 90°C, vorzugsweise 94°C bis 95°C erhitzt. Dadurch t rennen sich die beiden komplementären Stränge einer doppelsträngigen DNA, die DNA wird „aufgeschmolzen“ bzw. denaturiert und liegt anschließend in Einzelsträngen vor.

Bei der Hybridisierung (auch „Annealing“) wird die Temperatur auf eine sogenannte „Annealing-Temperatur“ herabgesetzt. Bei dieser Temperatur verbinden sich die Primer mit der DNA, sie hybridisieren.

An den Stellen, an denen der Primer gebunden ist, lagern sich die Polymerasen an und beginnen mit der Verlängerung, indem sie weitere komplementäre Nukleotide am 3’-OH-Ende des Primers anfügen und damit einen Gegenstrang synthetisieren.

Bei jeder Wiederholung obiger drei Schritte verdoppelt sich die Anzahl an kopierten DNA-Molekülen. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise aus einem einzigen DNA-Doppelstrang etwa eine Million Moleküle.

Die Anzahl der Zyklen kann je nach Anwendungsart, Beschaffenheit der Probe und den spezifischen Anforderungen und Reaktionsbedingungen entsprechend gewählt werden. Ebenso kann die Einstellung der Zeitspannen für die einzelnen Schritte an die Erfordernisse bestimmter Anwendungsarten angepasst werden.

Erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang noch eine besondere Art der PCR, die Real-Time-PCR. Diese quantitative PCR Methode erfreut sich in den molekularbiologischen Labors immer größerer Beliebtheit, da sie eine Detektion der Proben-DNA bzw. der Amplifikationsprodukte in Echtzeit und zugleich die Bestimmung der anwesenden Menge einer Proben-DNA erlaubt.

Die Bestimmung der DNA-Menge am Ende einer PCR („Endpunktsbestimmung“) lässt aus vielerlei Gründen nicht direkt Rückschlüsse auf die Zahl der ursprünglich vorliegenden Moleküle zu, da z.B. am Anfang wie auch am Ende der PCR die Bedingungen für die Polymerasen nicht unbedingt optimal sind und daher die Amplifikation nicht über die ganze Reaktionszeit gleichmäßig abläuft. Daher kann die Quantifizierung am Ende einer PCR sehr ungenau sein. Wesentlich genauere Quantifizierungen sind möglich, wenn die Anzahl gebildeter DNA-Moleküle schon während der Reaktion, also nach jedem einzelnen Zyklus, erfasst wird.

Die meisten bekannten Verfahren zur Real-Time-PCR bedienen sich der Fluoreszenzmessung, wobei sequenzunabhängige und seuenzspezifische Detektionsmethoden bekannt sind. Bei den sequenzunabhängigen Detektionsmethoden wird beispielsweise ein interkalierender Fluoreszenzfarbstoff verwendet, welcher sich sequenzunabhängig in doppelsträngige DNA einlagert. Durch Amplifizierung einer DNA erhöht sich die Gesamtmenge an DNA, das Fluoreszenzsignal nimmt zu. Bei sequenzspezifischen Nachweismethoden sollen ganz spezifische Targets oder Gen-Abschnitte in einem Testansatz nachgewiesen und quantifiziert werden. Dazu werden Oligonukleotid-Sonden verwendet, die an die amplifizierte Target-DNA binden.

Mehrere Prinzipien zur sequenzspezifischen Detektion eines Fluoreszenzsignals und damit zur Detektion und Quantifizierung der Target-DNA stehen zur Verfügung. Beispielweise kann der Nachweis über ein so genanntes FRET-Prinzip (Fluorescence Resonance Energy Transfer Prinzip) geführt werden. Dabei werden zwei spezifische Oligonukleotid-Sonden, welche im Target direkt benachbart binden können, eingesetzt. Jede Oligonukleotid-Sonde ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert, wobei einer der Farbstoffe, nach Anregung mit Licht durch seine emittierten Photonen wiederum den zweiten Farbstoff anregt sofern dieser sich in ausreichender Nähe befindet. Das Emissionslicht dieses zweiten Farbstoffes wird mittels einer geeigneten Vorrichtung detektiert. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität spiegelt die Zunahme des Targets wider.

Eine weitere Möglichkeit zur sequenzspezifischen Messung eines Fluoreszenzsignals beruht auf dem Prinzip des Fluoreszenz-Quenching. Eine spezifische fluoreszenzmarkierte Sonde wird zusätzlich mit einem Fluoreszenzquencher ausgestattet, der sich in ausreichender räumlicher Nähe zum Fluorophor befindet, so dass die Sonde wegen des Quench-Vorgangs nicht fluoresziert. Bei geeigneter Konstruktion der Sonde wird aufgrund der Hybridisierung der Sonde an das Target der Quencher räumlich vom Fluoropphor entfernt, das Quenching verhindert und es kommt zur Fluoreszenzemission. Der Quencher kann auch bei an das Target gebundenen Sonden mittels einer geeigneten Exonukleaseaktivität einer Polymerase im PCR-Ansatz abgeschnitten werden. Auch hier spiegelt die Zunahme der Fluoreszenzintensität die Zunahme des Targets wider.

Alternativ zu fluoreszenzabhängigen Detektionsmethoden wird zur Genanalyse mittels eines bereits eingangs erwähnten Detektionsverfahrens über Array-Technologien auf einem Chip beispielsweise auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA-Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. Existieren in der Untersuchungslösung Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, so können die Target-Oligonukleotide durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden.

Verfahren zur oberflächensensitiven Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen sind hinreichend bekannt. So beschreibt beispielsweise die WO 2003/018834 A2 ein Verdrängungsassay zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen. Bei einem solchen elektrochemischen Verfahren werden die Assoziationsereignisse anhand der mit der Assoziation einhergehenden Änderung der elektrochemischen Eigenschaften der Sonden-Moleküle nachgewiesen.

Die WO 2011/069501 A1 kombiniert die hohe Empfindlichkeit einer oberflächensensitiven Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen mit einer vorangegangenen Amplifizierung der Target-Nukleinsäure-Oligomere durch eine PCR. Dadurch kann die Grenze für den Nachweis der ursprünglich in der Probe vorhandenen Target-Nukleinsäureoligomere zu sehr kleinen Konzentrationen verschoben werden.

Als nachteilig an diesen Verfahren hat sich herausgestellt, dass die Verdrängung der an die Sonden-Nukleinsäureoligomere hybridisierten Signal-Nukleinsäureoligomere durch die Target-Nukleinsäureoligomere eine Abnahme der Signalintensität bewirkt. Der Nachweis von Target-Nukleinsäureoligomeren erfolgt also ausgehend von einem maximalen Detektionssignal durch eine nachfolgende Abnahme der Signalintensität.

Es ist allgemein bekannt, dass die Detektion von beliebigen Target-Molekülen mit deutlich besserer Nachweisgrenze erfolgen kann, wenn der Nachweis von einem Null-Signal ausgeht, d.h. bei Abwesenheit der gesuchten Target-Moleküle wird auch kein Signal detektiert. Wünschenswert wäre es, wenn die Signalintensität direkt mit der Anzahl an anwesenden Target-Molekülen korrelieren würde. Aus der Zunahme der Signalintensität könnte dann die Bildung von Target-Molkülen mitverfolgt werden.

Darstellung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen zu schaffen, das den Nachweis von Target-Nukleinsäureoligomeren durch eine Zunahme der Signalintensität ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:

DNADesoxyribonukleinsäure RNARibonukleinsäure AAdenin GGuanin CCytosin TThymin U Uracil BaseA, G, T, C oder U BpBasenpaar NukleinsäureWenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure ist es, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann. Nukleotid, nt Monomerbaustein eines Nukleinsäureoligomers Oligonukleotid, Oligo Äquivalent zu Nukleinsäureoligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge. Sequenz Nukleotidabfolge in einem Nukleinsäureoligomer komplementär Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelsträngiger Nukleinsäureoligomere hybridisieren die beiden Einzelstränge, wobei die Nukleotidabfolge des einen Strangs komplementär zur Nukleotidabfolge des anderen Strangs ist, so dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelsträngiger Nukleinsäureoligomere hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung innerhalb des Hybrids bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet. Perfekter Match Hybrid aus zwei komplementären Nukleinsäure-Oligomeren, bei dem kein Mismatch auftritt. ss Single strand (Einzelstrang) ds Double strand (Doppelstrang) redoxaktiv Bezeichnet die Eigenschaft einer Einheit unter bestimmten äußeren Umständen an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen. Linker, Spacer Molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d.h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Auch unspezifische nt, i.e. nicht zu anderen Basen komplementäre nt, können als Linker/Spacer verwendet werden, insbesondere bei der Anbindung von Sonden-Oligos an eine Oberfläche.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen bereit umfassend die Schritte

  • a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren besteht, wobei die Sonden-Nukleinsäureoligomere einen zu einem ersten Signal-Pin-Abschnitt von Signal-Nukleinsäureoligomeren komplementären Sonden-Pin-Abschnitt besitzen,
  • b) Bereitstellen wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren, wobei
    – die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu dem Sonden-Pin-Abschnitt der Sonden-Nukleinsäureoligomere komplementären ersten Signal-Pin-Abschnitt besitzen,
    – die Signal-Nukleinsäureoligomere einen zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt von Target-Nukleinsäureoligomeren komplementären Signal-Erkennungs-Abschnitt besitzen,
    – die Signal-Nukleinsäureoligomere einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementären Signal-Pin-Abschnitt besitzen, wobei die Hairpin-Struktur eine Schmelztemperatur TPIN aufweist,
    – der erste Signal-Pin-Abschnitt nicht zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementär ist, und
    – die Signal-Nukleinsäureoligomere im Bereich des ersten Signal-Pin-Abschnitts mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel modifiziert sind,
  • c) Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren,
  • d) Bereitstellen einer Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Reaktionslösung zumindest Nukleotide, wenigstens eine Art von Primer und wenigstens eine Art von Nukleinsäure-Polymerase mit Exonuklease-Aktivität enthält,
  • e) Mischen der in Schritt d) bereitgestellten Reaktionslösung mit den in Schritt b) bereitgestellten Signal-Nukleinsäureoligomeren und der in Schritt c) bereitgestellten Probe mit Target-Nukleinsäureoligomeren,
  • f) Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere mittels Nukleinsäureamplifikation unter Bildung von Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücken,
  • g) Inkontaktbringen des in Schritt f) erhaltenen Reaktionsgemisches mit der in Schritt a) bereitgestellten modifizierten Oberfläche,
  • h) Detektion der gebildeten Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET ≤ TPIN,
  • i) mehrfache Wiederholung der Schritte f) bis h),
  • k) Vergleich der verschiedenen in Schritt h) erhaltenen Werte umfasst.

Der Begriff Hairpin wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung für eine DANN-Sekundärstruktur verwendet, bei der durch intramolekulare Basenpaarungen eine Haarnadelstruktur gebildet wird. Ein Hairpin besteht aus einem doppelsträngigen Abschnitt, welcher vorliegend auch als „Doppelhelix-Abschnitt“ oder „Pin“ oder „Stem“ bezeichnet wird und aus einem einzelsträngig vorliegenden Schleifenabschnitt, welcher vorliegend auch als „Loop“ bezeichnet wird.

Die zur Ausbildung des Hairpins zueinander komplementären Abschnitte des Signal-Nukleinsäureoligomers, welche den doppelsträngigen Pin des Hairpins bilden, werden in der vorliegenden Erfindung als „erster und zweiter Signal-Pin-Abschnitt“ bezeichnet. Der vorliegend verwendete Ausdruck „Sonden-Pin-Abschnitt“ beschreibt einen zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt komplementären Abschnitt am Sonden-Nukleinsäureoligomer.

Unter der Angabe „innerhalb der Hairpin-Struktur angeordnete“ Sequenz-Abschnitte wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die Sequenzabschnitte im Loop-Bereich des Hairpins und somit – bezogen auf den Einzelstrang – zwischen den zwei zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementären Signal-Pin-Abschnitten des entsprechenden Einzelstranges angeordnet sind.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „Signal-Erkennungs-Abschnitt“ bezieht sich auf einen zu einem Abschnitt des Target-Nukleinsäureoligomers komplementären Abschnitt des Signal-Nukleinsäureoligomers und bezeichnet einen Sequenzabschnitt im Signal-Nukleinsäureoligomer, welcher aufgrund seiner komplementären Struktur beispielsweise mit einem spezifischen Sequenzabschnitt des Targets einen Doppelstrang ausbilden kann und so zur Erkennung eines nachzuweisenden Targets dient. In Analogie dazu wird vorliegend der entsprechende Abschnitt des Target-Nukleinsäureoligomers, welcher durch den Signal-Erkennungs-Abschnitt erkannt wird, mit „Target-Erkennungs-Abschnitt“ bezeichnet.

Unter einer „weitgehend komplementären Struktur“ werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sequenzabschnitte verstanden, bei denen maximal 10% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Bevorzugt handelt es sich bei einer „weitgehend komplementären Struktur“ im Rahmen der vorliegenden Erfindung um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 5% der Basenpaare Mismatches ausbilden.

Von den erfindungsgemäß bereitgestellten Komponenten liegen unter Normalbedingungen die Signaloligonukleotide vorwiegend in einer Hairpin-Struktur vor, die Target-Nukleinsäureoligomere bilden einen Doppelstrang, die Primer liegen in der Regel einzelsträngig vor und die Nukleinsäure-Polymerase liegt für gewöhnlich ungebunden vor und weist keine Syntheseaktivität auf.

Die Hairpin-Struktur der Signaloligonukleotide besitzt eine Schmelztemperatur TPIN. Unter der Schmelztemperatur einer Hairpin-Struktur wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Temperatur verstanden, bei der 50% der Signaloligonukleotide als Hairpin und 50% der Signaloligonukleotide in offener Form vorliegen.

Zum Start eines Amplifizierungszyklus werden sämtliche potentielle Hybride/Selbsthybride durch eine geeignete, dem Fachmann bekannte Maßnahme wie beispielsweise eine Temperaturerhöhung dissoziiert. Bei einer anschließenden Temperatursenkung hybridisieren die Primer an komplementäre Stellen der noch einzelsträngigen Targets an. Die Polymerase wiederum bindet im Bereich des 3`-OH-Endes der Primer an das Hybrid aus Primer und Target und beginnt mit der Verlängerung des Primers an dessen 3`-OH-Ende. Bei dieser Polymerisierung wird der vorliegende Einzelstrang des Targets als Matrize abgelesen und ein neuer Doppelstrang gebildet.

Der Hairpin des Signaloligonukleotids verbleibt während der Temperaturabsenkung zumindest zum Teil in seiner offenen Form, der Signal-Erkennungs-Abschnitt hybridisiert an den entsprechenden Target-Erkennungs-Abschnitt der einzelsträngig vorliegenden Targets und bildet mit diesem einen Doppelstrang aus.

Da der erste Signal-Pin-Abschnitt des Signaloligonukleotids nicht zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementär ist, hybridisiert dieser nicht mit den Target-Nukleinsäureoligomeren und liegt daher als vom Target abstehender Abschnitt vor. Gelangt nun die Polymerase während der Polymerisierung an eine Stelle des Targets, an der bereits der Signal-Erkennungs-Abschnitt eines Signaloligos gebunden ist, so schneidet das Enzym aufgrund seiner Exonukleaseaktivität den nicht an das Target hybridisierten ersten Signal-Pin-Abschnitt in einem Bereich nahe des hybridisierten Signal-Erkennungs-Abschnittes ab. Dadurch entsteht ein kurzes Signaloligonukleotid-Teilstück, an welches das redoxaktive Detektionslabel gebunden ist und das von einem verbleibenden Signal-Oligonukleotid-Rumpf getrennt ist, welcher wiederum den zweiten Signal-Pin-Abschnitt umfasst. An dieser Stelle sei erwähnt, dass die Signaloligonukleotid-Teilstücke sowohl vom 3’ Ende wie auch vom 5’ Ende des Signaloligonukleotids geschnitten werden können, da sich das redoxaktive Detektionslabel vollkommen gleichwertig im Bereich des 3’ oder des 5’ Endes befinden kann.

Die so entstehenden, mit dem redoxaktiven Detektionslabel modifizierten Signaloligonukleotid-Teilstücke können aufgrund der Signal-Pin-Abschnitte an die dazu komplementären Sonden-Pin-Abschnitte der Sonden-Oligonukleotide und damit an die modifizierte Oberfläche binden. Die redoxaktiven Detektionslabel werden dabei zum elektrochemischen Nachweis von an die modifizierte Oberfläche (Elektroden) durch Hybridisierung mit den Sondenoligonukleotiden gebundenen Signaloligonukleotid-Teilstücken benutzt. Bei Anlegen einer entsprechenden Spannung an die Teststelle wird ein dem Hybridisierungsgrad aus Sondenoligonukleotiden und gebundenen Signaloligonukleotid-Teilstücken entsprechender Strom gemessen. Dieses elektrisch detektierbare Signal ist bei einer Temperatur TDET ≤ TPIN deutlich höher als das entsprechende Signal der ursprünglichen Signaloligonukleotide, da letztere in der Hairpin-Form nicht oder nur zu einem sehr geringen Teil an die Sondenoligonukleotide gebunden werden.

Mit zunehmendem Fortgang der Nukleinsäure-Amplifikation läuft die Replikation der Target-Nukleinsäureoligomere unter Entstehung der Signaloligonukleotid-Teilstücke wiederholt ab und die Konzentration an freien Signaloligonukleotid-Teilstücken nimmt mit zunehmender Amplifizierung zu, was an der Teststelle nachvollzogen werden kann. Die Konzentrationszunahme führt an einer mit Sonden-Nukleinsäureoligomeren belegten Teststelle zu einer – im Vergleich zur Messung bei Zyklus 0 – deutlich beschleunigten Anhybridisierung der Signaloligo-Teilstücke und damit zu einer Zunahme des detektierten elektrochemischen Signals.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt damit eine Methode zur Verfügung, mit der der Fortgang einer Real-Time Nukleinsäure-Amplifikation über eine Zunahme des elektrochemisch detektierten Signals ausgehend von einem im Wesentlich bei Null liegenden Signal verfolgt werden kann. Das elektrochemisch detektierte Signal nimmt proportional zur Zahl der Target-Nukleinsäureoligomere zu. Damit ist der Nachweis geringster Mengen an Target-Nukleinsäureoligomeren möglich.

Bevorzugt sind die Signal-Nukleinsäureoligomere mit mehreren Detektionslabel modifiziert, wodurch Signale mit höherer Intensität erhalten werden. Erfindungsgemäß wird als Detektionslabel eine redoxaktive Substanz verwendet.

Die Signal-Nukleinsäureoligomere weisen bevorzugt 10 bis 200 Basen, insbesondere 20 bis 100 Basen, besonders bevorzugt 25 bis 70 Basen auf. Mit Hilfe von Signal-Nukleinsäureoligomeren dieser Länge können alle gewünschten Targets eindeutig identifiziert werden.

Erfindungsgemäß wird die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere und die Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke mehrfach wiederholt, wodurch die Bestimmung der Zunahme der Signalintensität mit der Zeit im Laufe der Amplifikation der Target-Nukleinsäureoligomere ermöglicht wird.

Die Konzentration der Signal-Nukleinsäureoligomere in dem in Schritt e) hergestellten Gemisch beträgt bevorzugt zwischen 10–15 mol/l und 10–5 mol/l, besonders bevorzugt zwischen 10–13 mol/l und 10–7 mol/l und insbesondere bevorzugt zwischen 10–11 mol/l und 10–7 mol/l.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzen die Signal-Nukleinsäureoligomere zusätzlich zumindest einen Signal-Dock-Abschnitt, und die Sonden-Nukleinsäureoligomere zusätzlich einen zu dem Signal-Dock-Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere komplementären Sonden-Dock-Abschnitt, wobei der Signal-Dock-Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt angeordnet ist. Besonders bevorzugt ist der Sonden-Dock-Abschnitt der Sonden-Nukleinsäureoligomere benachbart zu dem Sonden-Pin-Abschnitt der Sonden-Nukleinsäureoligomere angeordnet. Insbesondere bevorzugt ist der Signal-Dock-Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere nicht zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementär.

Der Signal-Dock-Abschnitt des Signal-Nukleinsäureoligomers befindet sich benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt, welcher mit dem redoxaktiven Detektionslabel versehen ist. Der Sonden-Dock-Abschnitt wiederum ist benachbart zu dem Sonden-Pin-Abschnitt des Sonden-Nukleinsäureoligomers.

Im Falle eines nicht zum Target komplementären Signal-Dock-Abschnitts bleibt dieser auch bei einer Anhybridisierung des Signal-Erkennungs-Abschnittes an das Target zusammen mit dem ersten Signal-Pin-Abschnitt ungebunden und liegt im Wesentlichen vom Target „abstehend“ vor. Dadurch wird sichergestellt, dass in einem mittels der Amplifizierungsreaktion entstehenden Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstück neben dem ersten Signal-Pin-Abschnitt auch der Signal-Dock-Abschnitt enthalten ist. Das Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstück ist somit um den Signal-Dock-Abschnitt verlängert.

Da der Signal-Dock-Abschnitt komplementär zu dem Sonden-Dock-Abschnitt der Sonden-Nukleinsäureoligomere ist, ist der potentielle Hybridisierungsbereich zwischen Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstück und Sonden-Nukleinsäureoligomer verlängert. Durch diese zusätzlich vorhandenen Signal-Dock- und Sonden-Dock-Abschnitte wird eine schnellere und beständigere Bindung der nachfolgend gebildeten Signaloligonukleotid-Teilstücke an die Sonden-Nukleinsäureoligomere bewirkt und somit die Detektionsgenauigkeit erhöht.

Die Tatsache, dass der Signal-Dock-Abschnitt nicht zum Target komplementär ist, erweist sich auch aus einem anderen Grund als vorteilhaft. Zum Target komplementäre Signal-Dock-Abschnitte könnten an die einsträngig vorliegenden Target-Nukleinsäureoligomere binden. Da die Signaloligonukleotid-Teilstücke aber durch Bindung an die Sonden-Nukleinsäureoligomere elektrochemisch detektiert werden sollen, ist eine Bindung an die Target-Nukleinsäureoligomere unerwünscht und wird vorteilhafterweise vermieden.

Besonders vorteilhaft stellt der Signal-Dock-Abschnitt eine Variable dar, die den Signal-Erkennungs-Abschnitt der Signal-Nukleisäureoligomere codiert. So können beispielsweise definierte Signal-Dock-Abschnitte in vorgegebener Weise mit einem spezifischen Signal-Erkennungs-Abschnitt gekoppelt werden, so dass eine bestimmte Sequenz des Signal-Dock-Abschnittes einer ganz bestimmten Target-Sequenz entspricht.

Eine parallele Detektion verschiedener Targets mit Hilfe eines DNA-Chips kann auf diese Weise besonders einfach durchgeführt werden. Es muss dazu lediglich eine entsprechende Anzahl verschiedener Sequenzen als Signal-Dock-Abschnitte der Signal-Nukleinsäureoligomere eingesetzt werden. Auf einem DNA-Chip, welcher an verschiedenen Bereichen Sonden-Nukleinsäureoligomere mit einer Anzahl entsprechend unterschiedlicher Sonden-Dock-Abschnitte aufweist, können unterschiedliche Targets detektiert werden. Werden verschiedene Targets in getrennten Experimenten detektiert, so kann dieselbe Sequenz des Signal-Dock-Abschnittes der Signal-Nukleinsäureoligomere in den verschiedenen Ansätzen verwendet werden.

Bevorzugt sind die Signal-Nukleinsäureoligomere im Bereich des ersten Signal-Pin-Abschnitts und/oder im Bereich des benachbart zu dem Signal-Pin-Abschnitt angeordneten Abschnitts mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel modifiziert. Falls die Signal-Nukleinsäureoligomere zusätzlich einen Signal-Dock-Abschnitt- aufweisen, der benachbart zum ersten Signal-Pin-Abschnitt angeordnet ist, kann das redoxaktive Detektionslabel gleichwertig an einen der beiden genannten Abschnitte gebunden sein. Nach Bildung der kurzen Signaloligonukleotid-Teilstücke durch die Polymerase mit Exonukleaseaktivität sind beide genannten Abschnitte Bestandteil der Signaloligonukleotid-Teilstücke, die nachfolgend an die Sonden-Nukleinsäureoligomere hybridisieren und so detektiert werden.

In Abhängigkeit der Nukleotidsequenz und der Basenlänge der beiden genannten Abschnitte kann beispielsweise aus sterischen Gründen oder aus Gründen der Kopplungschemie einer der beiden genannten Abschnitte besser für die Modifizierung geeignet sein als der andere. Je nach Anwendungsart und je nach Art der Signal-Nukleinsäureoligomere kann die optimale Wahl zur Modifikation getroffen werden.

Zur Sensitivitätserhöhung können einer der beiden genannten Abschnitte oder auch beide Abschnitte mit mehreren Detektionslabel modifiziert sein.

Besonders bevorzugt weisen die zwei Signal-Pin-Abschnitte der Signal-Nukleinsäureoligomere jeweils 4 bis 10 Basen, bevorzugt 5 bis 8 Basen auf. Die genannte Zahl an Basen stellt zum einen sicher, dass unter Normalbedingungen der weit überwiegende Teil der Signal-Nukleinsäureoligomere als Hairpin vorliegt, und zum anderen, dass die Schmelztemperatur des Hairpins im Bereich der bei der Nukleinsäureamplifikation angewendeten Temperaturen liegt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Signal-Erkennungs-Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere innerhalb des Loop-Bereichs der Hairpin-Struktur zwischen den Signal-Pin-Abschnitten angeordnet. Besonders vorteilhaft ist der Signal-Erkennungsabschnitt im loop-Bereich des Hairpins angeordnet. Für den Loop-Bereich eines Hairpins bestehen sowohl bezogen auf die Basenlänge als auch auf die Basenabfolge größere Variationsmöglichkeiten, wodurch ganz unterschiedliche und spezifische Signal-Erkennungs-Abschnitte in unterschiedlichen Längen in den Loop-Bereich integriert werden können.

Zwar ist eine Bindung der Signal-Nukleinsäureoligomere an das Target in ihrer offenkettigen Form erwünscht, da besonders in diesem Fall die Polymerase in reproduzierbarem Ausmaß Signaloligonukleotid-Teilstücke bildet, jedoch findet sich ein weiterer Vorteil der genannten Ausführungsform darin, dass der Loop-Bereich immer einzelsträngig ist und daher eine Bindung des Signal-Oligomers an das Target auch dann möglich ist, wenn das Signal-Oligomer als Hairpin vorliegt. Dies gilt nur bei Vernachlässigung sterischer Hinderungsgründe. Je nach Platzierung der Erkennunssequenz innerhalb des Loops ist ein korrektes Schneiden durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase während der Amplifizierung auch im Fall eines Hybrids aus Hairpin und Target denkbar. Spätestens bei einem darauffolgenden Denaturierungsschritt zerfällt der Pin-Abschnitt des Hairpins, wodurch das Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstück freigesetzt wird und für eine Detektion an der modifizierten Oberfläche zur Verfügung steht.

Bevorzugt ist der zweite Signal-Pin-Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere nicht zu den Target-Nukleinsäureoligomeren komplementär. Da gemäß der genannten Ausführungsform der zweite Signal-Pin-Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere nicht komplementär zur Targetsequenz ist, kann die Polymerase vorteilhafterweise nicht an das Signaloligo andocken und von da aus den Strang verlängern, was zu unerwünschten Nebenprodukten führen könnte.

Ebenfalls bevorzugt sind Ausführungsformen, gemäß denen das freie Ende des zweiten Signal-Pin-Abschnitts der Signal-Nukleinsäureoligomere durch ein Nukleotid gebildet wird, das ein invertiertes Nukleosid oder ein di-desoxy-Nukleosid aufweist. Besonders vorteilhaft wird gemäß dieser Ausführungsform eine Kettenverlängerung am Signal-Nukleinsäureoligomer verhindert und dadurch die Bildung unerwünschter Nebenprodukte vermieden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die Sonden-Nukleinsäureoligomere in ihren Sonden-Pin-Abschnitten und/oder in ihren Sonden-Dock-Abschnitten zumindest ein Nukleotid auf, das nicht komplementär zu den entsprechenden Signal-Pin-Abschnitten und Signal-Dock-Abschnitten der Signal-Nukleinsäureoligomere oder der Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke ist.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Bindung der Signaloligonukleotid-Teilstücke an die Sondenoligonukleotide detektiert. Ein störendes Hintergrundsignal kann sich dadurch ergeben, dass Hairpin-Signaloligonukleotide an die Sondenoligonukleotide binden. Eine bessere Unterscheidung zwischen Signaloligonukleotid-Teilstücken und Hairpin-Signaloligonukleotiden kann dadurch erzielt werden, dass die Sondenoligonukleotide in dem/den Sonden-Pin- und Sonden-Dock-Abschnitt/Abschnitten eine, zwei oder mehrere Basen enthalten, die nicht komplementär zu den entsprechenden Signal-Pin- und Signal-Dock-Abschnitten des Signaloligonukleotids sind. Aufgrund dieser so genannten Mismatches entsteht bei Anbindung von Hairpin-Signaloligonukleotiden und Signaloligonukleotid-Teilstücken an diesen Basen ein sogenanntes „Gap“, das sich stark negativ auf die Anhybridisierung von Hairpin-Signaloligonukleotiden auswirkt, aber nur wenig negativ auf die Anhybridisierung von Signaloligonukleotid-Teilstücken. Damit wird die Bindungskonstante der Hairpin-Signaloligonukleotide an die Sondenoligonukleotide deutlich stärker herabgesetzt als die Bindungskonstante der Signaloligonukleotid-Teilstücke an die Sondenoligonukleotide, wodurch sich ein verstärkter Unterschied zwischen den entsprechenden Signalintensitäten ergibt.

Ein entsprechendes Diskriminierungs-erhöhendes Verhalten an der Sonde lässt sich auch erzielen, wenn die Sonde in dem/den zu den Signaloligonukleotiden komplementären Bereich/Bereichen um eine, zwei oder mehrere Basen kürzer ist als der entsprechende Bereich des Hairpin-Signaloligonukleotids oder Signaloligonukleotid-Teilstücks.

Bevorzugt erfolgt die Detektion der gebildeten Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke in dem erfindungsgemäßen Verfahren durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET zwischen 20 °C und 60 °C, bevorzugt zwischen 30 °C und 50 °C. Bei den genannten Temperaturen ist eine besonders genaue und reproduzierbare Detektion der Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücke möglich.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Amplifizierung der Target-Nukleinsäureoligomere durch eine PCR oder durch eine isothermale Amplifikation. Insbesondere die PCR stellt eine etablierte Methode dar, durch die eine weitestgehend fehlerfreie Amplifikation der Target-Nukleinsäureoligomere sichergestellt werden kann.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Signal-Nukleinsäureoligomer zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei das Signal-Nukleinsäureoligomer einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementäre Signal-Pin-Abschnitt aufweist und das Signal-Nukleinsäureoligomer im Bereich der zwei unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementären Signal-Pin-Abschnitte mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel modifiziert ist.

Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem einen Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens umfassend eine oben beschriebene modifizierte Oberfläche, eine effektive Menge an Signal-Nukleinsäureoligomeren wie sie oben beschrieben sind und eine Reaktionslösung zur Durchführung einer Nukleinsäureamplifikation, wobei die Reaktionslösung zumindest Nukleotide, Primer und wenigstens eine Art von Nukleinsäure-Polymerase mit Exonuklease-Aktivität enthält.

Die leitfähige Oberfläche

Mit dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jedes elektrisch leitfähige Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung derivatisierte oder nicht-derivatisierte Sonden-Nukleinsäureoligomere kovalent oder über andere spezifische Wechselwirkungen zu binden.

Es kann jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke eingesetzt werden insbesondere Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Besonders bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine mit Gold beschichtete Oberfläche verwendet.

Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.

Bindung von Nukleinsäureoligomeren an die Oberfläche

Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäureoligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Sonden-Nukleinsäureoligomere können z.B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Nukleinsäureoligomer vorhandenen oder durch Derivatisierung am Sonden-Nukleinsäureoligomer angebrachten Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen an die Oberfläche gebunden werden. Alternativ können Thiol-modifizierte Sonden-Nukleinsäureoligomere chemisorptiv an z.B. Goldoberflächen gebunden werden. Das Sonden-Nukleinsäureoligomer kann direkt oder über einen Linker/Spacer an die Oberflächenatome oder -molekülen einer Oberfläche gebunden werden. Daneben kann das Sonden-Nukleinsäureoligomer durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z.B. durch Verwendung von biotinylierten Sonden-Nukleinsäureoligomeren zur nicht-kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Die chemische Modifikation der Sonden-Nukleinsäureoligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe kann bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird auch das Nukleinsäureoligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene dem Fachmann bekannte Arten durchgeführt werden. In diesem Zusammenhang wird auf die WO 00/42217 A1 verwiesen.

Daneben ist eine Sondenimmobilisierung auf einem DNA-Chip in P. Liepold, T. Kratzmüller, N. Persike, M. Bandilla, M. Hinz, H. Wieder, H. Hillebrandt, E. Ferrer, G. Hartwich (2008), Analytical and Bioanalytical Chemistry, Vol. 391, S. 1759–1772, Electrically Detected Displacement Assay (EDDA): A Practical Approach to Nucleic Acid Testing in Clinical or Medical Diagnosis detailliert beschrieben.

Sonden-, Target- und Signal-Nukleinsäureoligomere

Die Sonden-Nukleinsäureoligomere der vorliegenden Erfindung bestehen aus Nukleotiden in einer bestimmten Nukleotidabfolge (Sequenz) und liegen an einer Oberfläche immobilisiert vor. Als Target-Nukleinsäureoligomere werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit den Signal-Nukleinsäureoligomeren unter Ausbildung eines Doppelstrang-Hybrids wechselwirken. Target-Nukleinsäureoligomere im Sinne der vorliegenden Erfindung sind also Nukleinsäureoligomere, die als Komplexbindungspartner des komplementären Signal-Nukleinsäureoligomers fungieren. Die Target-Nukleinsäureoligomere, deren Vorhandensein anhand der vorliegenden Erfindung detektiert werden soll, weisen zumindest einen Sequenzbereich auf, dessen Sequenz komplementär oder zumindest weitgehend komplementär zu einem Abschnitt der Signal-Nukleinsäureoligomere ist.

Als Nukleinsäureoligomer oder ns-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges “Rückgrat“ der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z.B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die sequenzspezifische Bindung natürlich vorkommender DNA, oder RNA bzw. daraus abgeleitete (transkribierte oder amplifizierte) Strukturen wie cDNA oder amplifizierte cDNA oder amplifizierte RNA (aRNA).

Bei den Signal-Nukleinsäureoligomeren im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Nukleinsäure-Hairpinstrukturen. Hairpins sind eine spezielle Form von Sekundärstrukturen von Nukleinsäuren und entstehen dadurch, dass ein Sequenzabschnitt eines einzelsträngigen DNA- oder RNA-Moleküls mittels einer „Schleifenbildung“ auf einen komplementären Bereich im selben Molekül unter Ausbildung eines kleinen doppelsträngigen Abschnitts zurückfalten kann. Bei Normalbedingungen ist die Bildung von Hairpins in entsprechenden Nukleinsäuremolekülen thermodynamisch begünstigt. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass Hairpins immer zu einem gewissen Anteil in der geschlossenen Form, also der Hairpin-Form und zu einem gewissen Anteil in der offenen, also einzelsträngigen Form vorliegen, es stellt sich ein thermodynamisches Gleichgeweicht ein. Das Verhältnis von geschlossener zu offener Form wird beispielsweise durch die Temperatur beeinflusst, so liegen zum Beispiel bei der Schmelztemperatur TPIN jeweils die Hälfte der Moleküle geschlossen bzw. offen vor. Die Schmelztemperatur selbst hängt wiederum von der Sequenz der den Pin bzw. Stem ausbildenden komplementären Abschnitte, von deren GC-Gehalt, deren Länge und dergleichen ab.

Detektions-Label / Markierung (Markermolekül)

Die Signal-Nukleinsäureoligomere sind durch Derivatisierung mit einem oder mehreren detektierbaren redoxaktiven Substanzen als Label ausgestattet. Dieses Label ermöglicht die Detektion der Komplexierungsereignisse zwischen den in dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstücken und den oberflächengebundenen Sonden-Nukleinsäureoligomeren.

Als Redoxlabel können Übergangsmetall-Komplexe, insbesondere solche des Kupfers, Eisens, Rutheniums, Osmiums oder Titans mit Liganden wie Pyridin, 4,7-Dimethylphenanthrolin, 9,10-Phenanthrenquinondiimin, Porphyrine und substituierte Porphyrin-Derivate verwendet werden. Daneben ist der Einsatz von Riboflavin, von Chinonen wie Pyrrollochinolinochinon, Ubichinon, Anthrachinon, Naphtochinon oder Menachinon bzw. Derivaten davon, von Metallocenen und Metallocenderivaten wie Ferrocenen und Ferrocenderivaten, Cobaltocenen und Cobaltocenderivaten, von Porphyrinen, Methylenblau, Daunomycin, Dopamin-Derivaten, Hydrochinon-Derivaten (para- oder ortho-Dihydroxy-Benzol-Derivaten, para- oder ortho-Dihydroxy-Anthrachinon-Derivaten, para- oder ortho-Dihydroxy-Naphtochinon-Derivaten) und ähnlichen Verbindungen möglich. Besonders bevorzugt wird Ferrocen oder ein Ferrocen-Derivat als redoxaktives Label eingesetzt.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch indirekte Label verwendet werden. Unter dem Begriff „indirekte Label“ werden solche verstanden, bei denen die eigentlich detektierbare Form des Labels erst über eine enzymkatalysierte Reaktion ensteht. Die detektierbare Form des Labels kann dann an der Oberfläche detektiert werden. Beispiele für solche indirekten Label sind dem Fachmann aus der Literatur bekannt, exemplarisch sei hier alkalische Phosphatase (AP) in Verbindung mit dem Substrat p-Aminophenylphosphat genannt. Liegt AP als indirekter Marker an das Signal-Nukleinsäureoligomer gebunden vor, so kann eine elektrochemische Detektion des Signal-Nukleinsäureoligomers dadurch erfolgen, dass zum Zeitpunkt der Detektion p-Aminophenylphosphat zugegeben wird. Das elektrochemisch inaktive p-Aminophenylphosphat dient als Substrat des Enzyms AP und wird in p-Aminophenol umgewandelt. p-Aminophenol kann nun, nach Diffusion zu einer leitfähigen Oberfläche, elektrochemisch detektiert werden, da diese Form des Substrats (also nach Umsetzung am AP) elektrochemisch aktiv ist. Alternativ kann AP auch zur chromogenen Detektion verwendet werden (z.B. mit 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat in Verbindung mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid).

Oberflächensensitive elektrochemische Detektionsmethoden

Bei elektrochemischen Methoden kann anhand der Kinetik der elektrochemischen Prozesse prinzipiell zwischen an eine Oberfläche adsorbierten und im Überstand gelösten redoxaktiven Detektionslabel unterschieden werden. Oberflächenadsorbierte Detektionslabel werden im allgemeinen schneller elektrochemisch umgesetzt (z.B. oxidiert oder reduziert) als redoxaktive Detektionslabel aus der Volumenphase, da letztere vor der elektrochemischen Umsetzung erst zur (Elektroden-)Oberfläche diffundieren müssen. Als Beispiele für elektrochemische oberflächensensitive Methoden seien die Cyclovaltammetrie, die Amperometrie und die Chronocoulometrie genannt.

Die Methode der Chronocoulometrie z.B. erlaubt es, oberflächennahe redoxaktive Komponenten von (identischen) redoxaktiven Komponenten in der Volumenphase zu unterscheiden und ist z.B. in Steel, A.B., Herne, T.M. und Tarlov M.J.: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670–4677 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben. Der Einsatz der Chronocoulometrie in einem Verdrängungsassay zur Detektion von Nukleinsäureoligomerhybridisierungsereignissen ist detailliert in der WO 03/018834 A2 beschrieben, auf die hiermit in diesem Zusammenhang Bezug genommen wird.

Eine elektochemische Messvariante von Hybridisierungsereignissen unter Verwendung eines DNA-Chips ist in P. Liepold, T. Kratzmüller, N. Persike, M. Bandilla, M. Hinz, H. Wieder, H. Hillebrandt, E. Ferrer, G. Hartwich (2008), Analytical and Bioanalytical Chemistry, Vol. 391, S. 1759–1772, Electrically Detected Displacement Assay (EDDA): A Practical Approach to Nucleic Acid Testing in Clinical or Medical Diagnosis beschrieben.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zur elektrochemischen Detektion Cyclovoltammetrie, Amperometrie, Chronocoulometrie, Impedanzmessung oder Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) eingesetzt. Die genannten Methoden erlauben eine genaue und sichere Detektion der Hybridisierungsereignisse.

Sämtliche im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren können unter Verwendung von DNA-Chips durchgeführt werden. In diesem Fall weist die modifizierte Oberfläche zumindest 2 räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche, bevorzugt zumindest 4 und insbesondere zumindest 12 räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche auf.

Unter "räumlich im Wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer Vermischung von verschiedenen Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren kommen.

Ganz besonders bevorzugt weist die modifizierte Oberfläche zumindest 32, insbesondere zumindest 64, ganz besonders bevorzugt zumindest 96 räumlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche auf.

Die in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellte modifizierte Oberfläche weist bevorzugt eine Fläche von 1 µm2 bis zu 1 mm2, besonders bevorzugt eine Fläche von 10 µm2 bis zu 100 µm2 und insbesondere bevorzugt eine Fläche von rund 50 µm2 auf.

Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform ist in jeweils einem der räumlich im Wesentlichen abgetrennten Bereiche der Oberfläche jeweils eine Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren an die Oberfläche gebunden, wobei sich die verschiedenen Arten von Sonden-Nukleinsäureoligomeren in zumindest einer Base voneinander unterscheiden. Dies erlaubt die parallele Detektion einer Vielzahl verschiedener Arten von Target-Nukleinsäureoligomeren.

Ein CMOS-basierter DNA-Chip für elektrochemische Detektion der Hybridisierung zwischen Sonde und Signaloligonukleotid ist z.B. in Augustyniak, M.; Paulus, C.; Brederlow, R.; Persike, N.; Hartwich, G.; Schmitt-Landsiedel, D.; Thewes, R. (2006), Solid-State Circuits, 2006 IEEE International Conference Digest of Technical Papers, 59–68 A 24 × 16 CMOS-Based Chronocoulometric DNA Microarray beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen

1a ein Sonden-Nukleinsäureoligomer in schematischer Darstellung;

1b ein Signal-Nukleinsäureoligomer in schematischer Darstellung;

1c ein Target-Nukleinsäureoligomer in schematischer Darstellung;

1d Primer und Polymerase in schematischer Darstellung;

2a in schematischer Darstellung die wesentlichen Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens in ihren Hybridisierungszuständen bei Normalbedingungen;

2b in schematischer Darstellung die wesentlichen Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens in ihren Hybridisierungszuständen bei Start eines PCR-Zyklus;

2c in schematischer Darstellung die Replikation des Targets und die Bildung von Signaloligonukleotid-Teilstücken;

3a eine Auftragung des Peakstroms cyclovoltammetrischer Messungen eines Ferrocen-Labels in Abhängigkeit von der Zeit zu Beginn der PCR;

3b eine Auftragung des Peakstroms cyclovoltammetrischer Messungen eines Ferrocen-Labels in Abhängigkeit von der Zeit nach dem 30. PCR-Zyklus;

4 eine Auftragung des Peakstroms cyclovoltammetrischer Messungen eines Ferrocen-Labels jeweils 20 Sekunden nach dem entsprechenden PCR-Zyklus in Abhängigkeit von der Zykluszahl.

Wege zur Ausführung der Erfindung Elektrisch detektierte Real-Time PCR (eRT-PCR)

Zu einem PCR-Ansatz werden Signaloligonukleotide gegeben, die zum einen zu Sondenoligonukleotiden, die auf einer Teststelle eines DNA-Chips immobilisiert sind, und zum anderen zu den Target-Oligonukleotiden (einem Sequenzbereich des Templates bzw. des über PCR zu amplifizierenden DNA-Abschnitts) komplementär sind.

In den 1a bis 1d sind ein Sonden-Nukleinsäuroligomer 1, ein Signal-Nukleinsäureoligomer 2 und die wesentlichen restlichen Komponenten einer elektrisch detektierbaren real-time PCR schematisch dargestellt. 1a zeigt schematisch eine Teststelle eines Mikroarrays mit einem der darauf immobilisierten Sondenoligonukleotide 1. Die Oberfläche 3 der Teststelle besteht aus Gold. Auf der Teststelle ist über Thiolbindungen (-S-) eine Art von Sondenoligonukleotiden 1 immobilisiert. Die Sondenoligonukleotide 1 umfassen die Abschnitte Spacer 4, Sonden-Pin-Abschnitt 5 und Sonden-Dock-Abschnitt 6. Der Sonden-Dock-Abschnitt 6 kann auch zwischen Sonden-Pin-Abschnitt 5 und Spacer 4 angeordnet sein. Daneben ist es möglich, dass Sonden-Pin-Abschnitt 5 und Sonden-Dock-Abschnitt 6 überlappen, also gemeinsame Basen aufweisen.

Die Signaloligonukleotide 2 weisen bei Normalbedingungen (25°C, 1 bar) eine sogenannte Hairpinstruktur auf, die aus einem aus einem ersten und einem zweiten Signal-Pin-Abschnitt 5’, 5’’ aufgebauten Pin-Bereich und einem Loop-Bereich besteht. Benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt 5’ weist das Signaloligonukleotid 2 des vorliegenden Beispiels zusätzlich einen Signal-Dock-Abschnitt 6’ auf, welcher komplementär zu dem Sonden-Dock-Abschnitt 6 der Sondenoligonukleotide 1 ist. Der Hairpin trägt ein kovalent angebundenes elektrisch detektierbares Label 9, wobei im vorliegenden Beispiel der erste Signal-Pin-Abschnitt 5’ mit dem Label markiert ist. Der erste Signal-Pin-Abschnitt 5’ ist komplementär zu dem Sonden-Pin-Abschnitt 5 des Sondenoligonukleotids 1. Ebenso ist es möglich, dass der Signal-Dock-Abschnitt 6’ nicht zwischen Signal-Pin-Abschnitt 5’ und Signal-Erkennungs-Abschnitt 8, sondern endständig am freien Ende des Signal-Pin-Abschnitt 5’ angeordnet ist. Auch können der Signal-Pin-Abschnitt 5’ und der Signal-Dock-Abschnitt 6’ überlappen, also gemeinsame Basen aufweisen.

Der Loop-Bereich der Signaloligonukleotide 2 weist einen Signal-Erkennungsabschnitt 8 auf, welcher komplementär zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt 8’ des Target-Nukleinsäureoligomers 10 (1c) ist. Das Target-Nukleinsäureoligomer liegt in der Regel als Doppelstrang vor und weist Primerbindungsstellen 11, 12 auf, die wiederum komplementär zu den Primern 11’ und 12` (1d) sind. In 1d ist schematisch eine Polymerase 13 mit geeigneter Exonukleaseaktivität dargestellt.

Die 2a bis 2c zeigen schematisch die Grundzüge des Ablaufs einer elektrisch detektierbaren real-time PCR in der Volumenphase. Die wesentlichen Komponenten in ihren Hybridisierungszuständen bei Normalbedingungen (25°C, 1 bar) sind in 2a dargestellt. In der Regel liegen die Signaloligonuleotide 2 in einer Hairpin-Struktur vor, das Target 10 als Doppelstrang, die Primer 11’, 12’ einzelsträngig und die Polymerase 13 in einem nicht an die DNA gebundenen Zustand. Ein PCR-Zyklus wird gestartet, indem die PCR-Lösung kurzzeitig auf ca. 95°C erhitzt wird, um potentielle Hybride/Selbsthybride zu dissoziieren (vgl. 2b). Kühlt man die PCR-Lösung auf eine geeignete Temperatur ab (ca. 70°C), können zum einen die Primer 11’, 12’ mit den einzelsträngigen Targets 10 hybridisieren und die Polymerase 13 kann andocken, zum anderen bleibt der Hairpin des Signaloligonukleotids zumindest zum Teil dissoziiert, und der Signal-Erkennungs-Abschnitt 8 des Signaloligos 2 kann mit dem Target-Erkennungs-Abschnitt 8’ hybridisieren. Da der zweite Signal-Pin-Abschnitt 5’’ des Signaloligos 2 nicht komplementär zur Targetsequenz ist, liegt dieser Abschnitt immer einzelsträngig vor, weshalb die Polymerase 13 nicht an das Signaloligo 2 andocken und von da aus den Strang verlängern kann, was zu unerwünschten Nebenprodukten führen würde. Alternativ oder additiv zu einer nichtkomplementären Ausführung des zweiten Signal-Pin-Abschnittes 5’’ könnte das Signaloligo 2 auch am Ende des zweiten Signal-Pin-Abschnittes 5’’ ein invertiertes Nukleosid oder ein di-desoxy-Nukleosid aufweisen. Auch andere dem Fachmann bekannte Maßnahmen können getroffen werden, um eine Kettenverlängerung des Signal-Oligonukleotids 2 zu vermeiden.

Die für den in 2c skizzierten Zustand geeignete Temperatur ist im Wesentlichen von der Primerhybridisierungstemperatur TP, der Signaloligohybridisierungstemperatur des Signaloligos 2 mit dem Target 10 im Bereich 8/8’ TSO und der Hairpinschmelztemperatur TPin unter den Pufferbedingungen der PCR abhängig und wird beim Primer-/ Sondendesign in silico durch entsprechende Software oder empirische Werte ermittelt. Als grobe Faustregel sollte die für den in 2c skizzierten Vorgang geeignete Temperatur T gelten: T ~ TP ~ TSO ~ (>) TPIN, wobei die Temperatur T zusätzlich in einem Bereich liegen sollte, bei der die Polymerase hohe Raten der Targetreplikation aufweist (in der Regel um 70 °C); T kann in Vorversuchen entsprechend optimiert werden.

Bei geeigneter Konstruktion des Hairpin-Signaloligonukleotids kann T auch kleiner als TPin sein, wenn gewährleistet ist, dass zumindest ein Bruchteil der Signaloligos 2 und/oder auch bei (teilweise) geschlossener Hairpinstruktur an das zumindest im Target-Erkennungs-Abschnitt 8’ einzelsträngige Target 10 anbinden kann. Sind die in 2c skizzierten Voraussetzungen gegeben und weist die Polymerase 13 eine entsprechend geeignete Exonukleaseaktivität aus, wird diese bei der Replikation das an das zu replizierende Target 10 gebundene Signaloligonukleotid 2 in einem Bereich in der Nähe des Übergangs vom Signal-Dock-Abschnitt 6’ zum Signal-Erkennungsabschnitt 8 des Signaloligonukleotids 2 schneiden. Dadurch entsteht ein kurzes Signaloligonukleotid-Teilstück 14, welches vom Signal-Oligonukleotid-Rumpf 15 abgetrennt ist (2c).

Das kovalent gebundene redoxaktive Label, insbesondere Ferrocen 9 der Signaloligonukleotide 2 kann zum elektrochemischen Nachweis von an der modifizierten Oberfläche 3, nämlich den Teststellen (Elektroden) gebundenen/hybridisierten Signaloligonukleotiden 2 benutzt werden. Ferrocen ist reversibel oxidier- und reduzierbar. Bei Anlegen einer entsprechenden Spannung an die Teststelle wird ein dem Hybridisierungsgrad aus Sonden 1 und gebundenen Signaloligos 2 entsprechender Strom gemessen. Entsprechend können die Signaloligo-Teilstücke 14 bei geeigneter Temperatur (TDET ≤ TPIN) an der Teststelle mit Sondenoligo 1 gebunden werden und erzeugen ein elektrisch detektierbares Signal, das bei TDET ≤ TPIN deutlich höher ist als das entsprechende Signal des ursprünglichen Signaloligos 2, da letzteres in der Hairpin-Form nicht oder nur zu einem sehr geringen Teil an die Sonde 1 gebunden wird. Zur Unterstützung der Diskriminierung zwischen Hairpin-Signaloligonukleotid 2 und Signaloligonukleotid-Teilstück 14 kann die Sonde 1 zwischen dem ersten Signal-Pin-Abschnitt 5 und dem Signal-Dock-Abschnitt 6 zusätzlich eine, zwei oder mehrere Basen besitzen, die nicht zum Signaloligonukleotid 2 komplementär sind und bei Anbindung von Hairpin-Signaloligonukleotid 2 und Signaloligonukleotid-Teilstücken 14 Mismatches und / oder ein sogenanntes „Gap“ ausbilden, das sich stark negativ auf die Anhybridisierung von Hairpin-Signaloligonukleotiden 2 auswirkt, aber nur wenig negativ auf die Anhybridisierung von Signaloligonukleotid-Teilstück 14. Ein entsprechendes Diskriminierungs-erhöhendes Verhalten an der Sonde 1 lässt sich auch erzielen, wenn die Sonde 1 im Bereich des ersten Signal-Pin- und/oder des Signal-Dock-Abschnitts 5’, 6’ um eine, zwei oder mehrere Basen kürzer ist als der entsprechende Bereich des Hairpin-Signaloligonukleotids 2 oder Signaloligonukleotid-Teilstücks 14.

In Tabelle 1 sind die für die folgenden eRT-PCR Experimente verwendeten Primer, Sonden-, Signal- und Target-Oligonukleotide zusammengestellt. Tabelle 1: 5’-3’ Sequenzen der in Fig. 1 und 2 skizzierten Oligonukleotide. * (hybridisierbare Sondensequenz in Kleinbuchstaben, Spacer in Großbuchstaben, Gap klein und kursiv sowie Mismatches klein und fett gedruckt)

Mit zunehmendem Fortgang der PCR-Reaktion laufen die mit 2 dargestellten Grundzüge der Amplifikation wiederholt ab und die Konzentration der freien Signaloligonukleotid-Teilstücke 14 nimmt mit zunehmender Zyklenzahl der PCR deutlich zu, was an der Teststelle nachvollzogen werden kann. Die Konzentrationszunahme führt an einer mit Sonden 1 belegten Teststelle (siehe 1a) zu einer – im Vergleich zur Messung bei Zyklus 0 (3a) – deutlich beschleunigten Anhybridisierung der Signaloligonukleotid-Teilstücke 14 (3b).

Die 3a und 3b zeigen Messergebnisse einer elektrisch detektierten Signaländerung zur „real time“ Verfolgung des Fortgangs einer PCR-Reaktion. In 3a ist der Peakstrom cyclovoltammetrischer Messungen des Ferrocen-Labels 9 in Abhängigkeit von der Zeit zu Beginn der PCR (Zyklus 0) für zwei Sonden (Sonde_A_1 und Sonde_A_3, vgl. Tabelle 1) gezeigt. Diese Darstellung entspricht dem Anhybridisierungsverhalten des Signaloligos 2 bzw. Signaloligo-Teilstücks 14, das u.a. von der Konzentration an Signaloligos 2 bzw. Signaloligo-Teilstücken 14 abhängig ist. In 3a ist somit das Anhybridisierungsverhalten des Signaloligonukleotids 2 bei 40°C dargestellt, einer Temperatur bei der das Signaloligonukleotid 2 als Hairpin vorliegt, womit 3a letztendlich auch das Background-Signal der Messung darstellt. In 3b ist eine entsprechende Messung nach dem 30. PCR-Zyklus (der Her-2 PCR, siehe Text) im Vergleich zum Background-Signal (Sonde_A_3 bei 0 Zyklen) dargestellt. Während der PCR wurden über die Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase eine dem Fortgang der Amplifikation entsprechende Menge an Signaloligo-Teilstücken 14 hergestellt. Das Anhybridisierungsverhalten bei Zyklus 30 entspricht im Wesentlichen dem Background-Signal (aus 3a) und dem Signal der gebildeten Signaloligo-Teilstücke 14.

Durchführung einer Real-Time PCR am Beispiel Her-2 PCR (Her-2 = cDNA des human epidermal growth factor receptor 2)

Die Sequenzen der wesentlichen PCR-Komponenten sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Der Mastermix für die PCR Reaktion zur Amplifikation einer Zielsequenz von Her-2 (Template-Menge ca. 103 Kopien) enthält entsprechende Primer (10 µM), den dNTP-Mix (je dNTP 25 µM) und MgAc (3 mM) in einem Standard PCR-Puffer (5 × Bicin Puffer, 250 mM Bicin/KOH, pH 8.2; 575 mM K-Acetat, 40% Glycerol (v/v), Bicine = N,N-Bis(2-hydroxyethyl) Glycin). Zu diesem Mastermix werden das Template und Signaloligonukleotide (50nM), sowie Kontroll-Signaloligonukleotide (50 nM), die vollständig nicht-komlementär zu DNA-Sequenzen der Template-Lösung sind, gegeben. Unmittelbar vor Start der PCR-Reaktion wird PCR-Polymerase mit Exonuklease-Aktivität zugefügt und die Lösung in eine PCR-Kartusche gefüllt.

Funktion und Aufbau der PCR-Kartusche und eines PCR-Cyclers sind in der DE 10 2009 044 431 A1 beschrieben. Bei der PCR-Kartusche handelt es sich um eine Zelle mit einem ungefähren Durchmesser von 20 mm und einer Dicke von 1 mm, in die ein ungefähr 0.5 mm tiefer Hohlzylinder zur Aufnahme der Lösung für die PCR-Reaktion eingebracht ist. Im Inneren der Kartusche befindet sich ein DNA-Chip, dessen Sensorfeld über einen Brückenkanal mit der Reaktionslösung in Flüssigkeitskontakt steht. Der Chip verfügt über eine Durchkontaktierung, so dass die für die Messwerterfassung notwendige elektrische Kontaktierung des DNA-Chips von außen über Federkontakte bewerkstelligt werden kann.

Zur Durchführung der PCR wird die PCR-Kartusche in einem PCR-Cycler angeordnet. Der PCR-Cycler besteht aus 3 Heizblöcken aus einem gut wärmeleitfähigen Material (z.B. Aluminium). Mittels Peltierelementen bzw. Heizmatten, Platinwiderstand zur Temperaturmessung und einer geeigneten Regelelektronik (PID-Regler) werden die Heizblöcke auf die für die PCR-Reaktion nötige Temperatur gebracht. Jeder Block enthält einen Spalt, in den die PCR-Kartusche eingeführt wird. Ober- und unterhalb der Kartusche befindet sich im Bereich des DNA-Chips ein weiterer Heizblock, um die Chiptemperatur unabhängig von der Temperatur für die PCR-Reaktion im Reaktionskanal einzustellen. Dieser zentrische Heizblock dient gleichzeitig zur Vermittelung der Rotationsbewegung der PCR-Kartusche und der Kontaktierung des DNA-Chips in der Kartusche. Durch eine geeignete Wahl der Blockgeometrie kann der Bereich, in der die Zelle eine bestimmte Temperatur aufweist, festgelegt werden. Im vorliegenden Beispiel wurde ein Verhältnis von 2:1:1 des Bereiches mit 95°C zu den Bereichen mit 72°C (Annealing) und 72°C (Elongation) gewählt. Zwischen den Blöcken ist jeweils ein Luftspalt, um die Wärmeübertragung zwischen den Blöcken zu verhindern. Durch Variation der Rotationsfrequenz kann die Zeit, in der die kritischen Temperaturen für die PCR-Reaktion an der Kartusche anliegen, variiert werden.

Vor Start der PCR wird die Reaktionsmischung in dem PCR-Cycler 3 min auf 95°C erhitzt und anschließend abgekühlt und nach leichtem Durchmischen der PCR-Lösung durch geeignete Maßnahmen, die gewährleisten, dass frische Lösung aus dem PCR-Kanal den Chip benetzt, eine erste Messung am integrierten DNA-Chip durchgeführt. Der DNA-Chip trägt an einer der bereitgestellten Teststellen Sonden des Typs Sonde_A_3, die zumindest teilweise komplementär zum Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstück 14 sind und an einer weiteren Teststelle Sonden, die komplementär zum Kontroll-Signaloligonukleotid sind. Die Messung findet bei 40°C statt, also deutlich unter der TPin des Signaloligonukleotids und entspricht den in 3a dargestellten Messwerten.

Nach dieser ersten Normierungsmessung wird die PCR-Reaktion gestartet, die Heizblöcke des PCR-Cyclers werden dazu auf 96°C (Aufschmelzen), 72°C (Annealing) und 72°C (Elongation) eingestellt und die PCR-Kartusche mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2 Umdrehungen pro Minute (i.e. 2 Zyklen pro Minute) in den Heizblöcken gedreht. Das nahezu zentrisch ausgerichtete Sensorfeld des DNA-Chips wird über einen weiteren Heizblock bei ca. 40°C gehalten, Während einer Messung des Hybridisierungsvorgangs am Chip wird die PCR-Kartusche in der Regel weiter gedreht.

In 4 sind zur Darstellung des Amplifikationsverlaufs während der PCR die Peakströme des Anhybridisierungsverhaltens (vgl. 3a, 3b) jeweils 20 Sekunden nach dem entsprechenden PCR-Zyklus in Abhängigkeit von der Zyklenzahl dargestellt. Ab ca. 20 Zyklen steigt dieser Peakstrom deutlich an. Dieser Anstieg ist auf die vermehrte Bildung von Signaloligo-Teilstücken und damit auf vermehrte Amplifikation der Ziel-DNA Her-2 zurückzuführen. Durch geeignete Normierung und Vergleich mit der Kontroll-Teststelle ist es zudem möglich, nicht nur das Vorhandensein der entsprechenden Ziel-Sequenz nachzuweisen, sondern auch auf die ursprünglich vorhanden Menge rückzurechnen (quantitative bzw. semiquantitative real-time PCR).

Bezugszeichenliste

1
Sonden-Nukleinsäureoligomer
2
Signal-Nukleinsäureoligomer
3
Oberfläche der Teststelle
4
Spacer
5
Sonden-Pin-Abschnitt
5’
erster Signal-Pin-Abschnitt
5’’
zweiter Signal-Pin-Abschnitt
6
Sonden-Dock-Abschnitt
6’
Signal-Dock-Abschnitt
8
Signal-Erkennungs-Abschnitt
8’
Target-Erkennungs-Abschnitt
9
redoxaktives Detektionslabel
10
Target-Nukleinsäureoligomer
11, 12
Primerbindungsstellen
11’, 12’
Primer
13
Nukleinsäure-Polymerase
14
Signal-Nukleinsäureoligomer-Teilstück
15
Signal-Nukleinsäureoligomer-Rumpf