Title:
Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen
Kind Code:
B3
Abstract:

Beschrieben wird ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleinsäureoligomeren (1) besteht, wobei die Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) einen zu einem ersten Signal-Pin-Abschnitt (5’) von Signal-Nukleinsäureoligomeren (2) komplementären Sonden-Pin-Abschnitt (5) besitzen,
b) Bereitstellen wenigstens einer Art von Signal-Nukleinsäureoligomeren (2), wobei
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen zu dem Sonden-Pin-Abschnitt (5) der Sonden-Nukleinsäureoligomere (1) komplementären ersten Signal-Pin-Abschnitt (5’) besitzen,
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt (8’) von Target-Nukleinsäureoligomeren (10) komplementären Signal-Erkennungs-Abschnitt (8) besitzen,
– die Signal-Nukleinsäureoligomere (2) einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplementären Signal-Pin-Abschnitt (5’, 5’’) besitzen, wobei die Hairpin-Struktur eine Schmelztemperatur TPIN aufweist, ...



Inventors:
Hartwich, Gerhard (80639, München, DE)
Application Number:
DE102011056606A
Publication Date:
01/03/2013
Filing Date:
12/19/2011
Assignee:
FRIZ Biochem Gesellschaft für Bioanalytik mbH, 82061 (DE)
International Classes:
Foreign References:
201101361262011-06-09
Other References:
LUO, X. u.a.: Electrochemical techniques on sequence-specific PCR amplicon detection for point-of-care applications. Analyst (2009) 134 (10) 1941-2168
LUO, X. u.a.: Real time electrochemical monitoring of PCR amplicons using electroactive hydrolysis probe. Electrochem. Comm. (Juli 2011) 13 (7) 742-745
Attorney, Agent or Firm:
Graf Glück Habersack Kritzenberger, 93049, Regensburg, DE
Claims:
1. Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfl?che, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleins?ureoligomeren (1) besteht, wobei die Sonden-Nukleins?ureoligomere (1) einen zu einem ersten Signal-Pin-Abschnitt (5?) von Signal-Nukleins?ureoligomeren (2) komplement?ren Sonden-Pin-Abschnitt (5) besitzen,
b) Bereitstellen wenigstens einer Art von Signal-Nukleins?ureoligomeren (2), wobei
? die Signal-Nukleins?ureoligomere (2) einen zu dem Sonden-Pin-Abschnitt (5) der Sonden-Nukleins?ureoligomere (1) komplement?ren ersten Signal-Pin-Abschnitt (5?) besitzen,
? die Signal-Nukleins?ureoligomere (2) einen zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt (8?) von Target-Nukleins?ureoligomeren (10) komplement?ren Signal-Erkennungs-Abschnitt (8) besitzen,
? die Signal-Nukleins?ureoligomere (2) einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplement?ren Signal-Pin-Abschnitt (5?, 5??) besitzen, wobei die Hairpin-Struktur eine Schmelztemperatur TPIN aufweist,
? der zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur ausgelegte erste Signal-Pin-Abschnitt (5?) nicht zu den Target-Nukleins?ureoligomeren (10) komplement?r ist, und
? die Signal-Nukleins?ureoligomere (2) im Bereich des zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur ausgelegten erste Signal-Pin-Abschnitts (5?) mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel (9) modifiziert sind,
c) Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleins?ureoligomeren (10),
d) Bereitstellen einer Reaktionsl?sung zur Durchf?hrung einer Nukleins?ureamplifikation, wobei die Reaktionsl?sung zumindest Nukleotide, wenigstens eine Art von Primer (11?, 12?) und wenigstens eine Art von Nukleins?ure-Polymerase (13) mit Exonuklease-Aktivit?t enth?lt,
e) Mischen der in Schritt d) bereitgestellten Reaktionsl?sung mit den in Schritt b) bereitgestellten Signal-Nukleins?ureoligomeren (2) und der in Schritt c) bereitgestellten Probe mit Target-Nukleins?ureoligomeren (10),
f) Amplifizierung der Target-Nukleins?ureoligomere (10) mittels Nukleins?ureamplifikation unter Bildung von Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cken (14),
g) Inkontaktbringen des in Schritt f) erhaltenen Reaktionsgemisches mit der in Schritt a) bereitgestellten modifizierten Oberfl?che,
h) Detektion der gebildeten Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke (14) durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET ? TPIN,
i) mehrfache Wiederholung der Schritte f) bis h),
k) Vergleich der verschiedenen in Schritt h) erhaltenen Werte.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Signal-Nukleins?ureoligomere (2) zus?tzlich zumindest einen Signal-Dock-Abschnitt (6?), und die Sonden-Nukleins?ureoligomere (1) zus?tzlich einen zu dem Signal-Dock-Abschnitt (6?) der Signal-Nukleins?ureoligomere (2) komplement?ren Sonden-Dock-Abschnitt (6) besitzen, wobei der Signal-Dock-Abschnitt (6?) der Signal-Nukleins?ureoligomere (2) benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt (5?,) angeordnet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Signal-Dock-Abschnitt (6?) der Signal-Nukleins?ureoligomere (2) nicht zu den Target-Nukleins?ureoligomeren (10) komplement?r ist.

4. Verfahren nach einem der Anspr?che 2 oder 3, wobei die Signal-Nukleins?ureoligomere (2) im Bereich des ersten Signal-Pin-Abschnitts (5?) und/oder im Bereich des benachbart zu dem Signal-Pin-Abschnitt (5?) angeordneten Signal-Dock-Abschnitts (6?) mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel (9) modifiziert sind.

5. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, wobei die zwei Signal-Pin-Abschnitte (5?, 5??) der Signal-Nukleins?ureoligomere jeweils 4 bis 10 Basen, bevorzugt 5 bis 8 Basen aufweisen.

6. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 5, wobei der Signal-Erkennungs-Abschnitt (8) der Signal-Nukleins?ureoligomere (2) innerhalb des Loop-Bereichs der Hairpin-Struktur zwischen den Signal-Pin-Abschnitten (5?, 5??) angeordnet ist.

7. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 6, wobei der zweite Signal-Pin-Abschnitt (5??) der Signal-Nukleins?ureoligomere (2) nicht zu den Target-Nukleins?ureoligomeren (10) komplement?r ist.

8. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 7, wobei das freie Ende des zweiten Signal-Pin-Abschnitts (5??) der Signal-Nukleins?ureoligomere (2) durch ein Nukleotid gebildet wird, das ein invertiertes Nukleosid oder ein di-desoxy-Nukleosid aufweist.

9. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 8, wobei die Sonden-Nukleins?ureoligomere (1) in ihren Sonden-Pin-Abschnitten (5) und/oder in ihren Sonden-Dock-Abschnitten (6) zumindest ein Nukleotid aufweisen, das nicht komplement?r zu den entsprechenden Signal-Pin-Abschnitten (5?) und Signal-Dock-Abschnitten (6?) der Signal-Nukleins?ureoligomere (2) oder der Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke (14) ist.

10. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 9, wobei die Detektion der gebildeten Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke (14) in Schritt h) durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET zwischen 20 ?C und 60 ?C, bevorzugt zwischen 30 ?C und 50 ?C er folgt.

11. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 10, wobei die elektrochemische Detektion durch Amperometrie, Chronocoulometrie, Impedanzmessung oder Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 11, wobei die Amplifizierung der Target-Nukleins?ureoligomere (10) in Schritt f) durch eine PCR oder durch eine isothermale Amplifikation erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 12, wobei die Modifikation der in Schritt a) bereitgestellten modifizierten Oberfl?che in der Anbindung von mehreren Arten von Sonden-Nukleins?ureoligomeren (1) besteht und die verschiedenen Arten von Sonden-Nukleins?ureoligomeren (1) in r?umlich abgetrennten Bereichen an die modifizierte Oberfl?che gebunden sind.

14. Signal-Nukleins?ureoligomer (1) zur Verwendung in einem Verfahren nach den Anspr?chen 1 bis 13, wobei das Signal-Nukleins?ureoligomer (1) einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplement?ren Signal-Pin-Abschnitt (5?, 5??) aufweist und das Signal-Nukleins?ureoligomer (1) in zumindest einem der Bereiche der zwei Signal-Pin-Abschnitte (5?, 5??) mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel (9) modifiziert ist.

15. Kit zur Durchf?hrung eines Verfahrens nach einem der Anspr?che 1 bis 13 umfassend eine modifizierte Oberfl?che wie in den Anspr?chen 1 bis 13 definiert, eine effektive Menge an Signal-Nukleins?ureoligomeren wie in Anspruch 14 definiert und eine Reaktionsl?sung zur Durchf?hrung einer Nukleins?ureamplifikation wie in Anspruch 1 definiert.

Description:
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen.

Stand der Technik

In der Krankheitsdiagnose, der mikrobiologischen Diagnostik, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor ist ein Direktnachweis kleinster Mengen von Nukleins?uren mittlerweile unumg?nglich. Zunehmend finden Detektionsverfahren mittels Array-Technologie unter Verwendung sogenannter DNA-Chips Anwendung, die eine oberfl?chensensitive Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen erm?glichen. Mit Hilfe dieser empfindlichen Methode k?nnen Nukleins?uren mit einer sehr geringen Nachweisgrenze detektiert werden.

H?ufig ist jedoch vor der eigentlichen Detektion ein DNA-Amplifizierungsschritt notwendig, in dem die nachzuweisenden DNA-Molek?le vervielf?ltigt werden, damit sie letztlich in einer Konzentration vorhanden sind, die ?ber der Nachweisgrenze der gew?hlten Detektionsmethode liegt.

Die PCR stellt eine solche f?r die Molekularbiologie grundlegende Methode dar, die im Wesentlichen der Vervielf?ltigung von DNA-Molek?len dient und den schnellen, empfindlichen Direktnachweis kleinster Mengen von DNA oder RNA erlaubt. In den vergangenen Jahren hat diese Methode die Labors erobert, da ihre Anwendung sehr breit und vielschichtig ist. Die PCR hat in fast allen Bereichen der Wissenschaft und Medizin, einschlie?lich der forensischen Medizin, der pr?natalen Diagnostik, der Onkologie und nicht zuletzt in der mikrobiologischen Diagnostik Einzug gehalten. Beispielsweise ist die PCR auf dem Sektor der klinischen Diagnostik meist die Methode der Wahl um z. B. Krankheitserreger nachzuweisen. Ebenso wird sie in der Lebensmittelindustrie als Nachweismethode f?r belastende Keime angewandt.

Bei der PCR handelt es sich um eine enzymatische Reaktion zur Amplifikation von Nukleins?uremolek?len, die im Wesentlichen in einem w?ssrigen bzw. fl?ssigen Reaktionsgemisch mit sehr kleinen Volumina abl?uft. Im Reaktionsgemisch befindet sich eine Nukleins?ure enthaltende Probe und die f?r die Reaktion au?erdem notwendigen Primer, Nukleotide und eine Polymerase. Durch Zugabe von Puffern und vorzugsweise zweiwertigen Ionen wie z. B. Mg2+ wird das Reaktionsgemisch so eingestellt, dass die f?r die jeweilige Anwendungsart optimalen Reaktionsbedingungen herrschen.

Die Polymerase-Kettenreaktion beruht auf einem immer wiederkehrenden Zyklus aus drei, bei unterschiedlichen Temperaturen ablaufenden Schritten, n?mlich Denaturierung, Hybridisierung und Verl?ngerung.

Bei der Denaturierung wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur gr??er 90?C, vorzugsweise 94?C bis 95?C erhitzt. Dadurch t rennen sich die beiden komplement?ren Str?nge einer doppelstr?ngigen DNA, die DNA wird ?aufgeschmolzen? bzw. denaturiert und liegt anschlie?end in Einzelstr?ngen vor.

Bei der Hybridisierung (auch ?Annealing?) wird die Temperatur auf eine sogenannte ?Annealing-Temperatur? herabgesetzt. Bei dieser Temperatur verbinden sich die Primer mit der DNA, sie hybridisieren.

An den Stellen, an denen der Primer gebunden ist, lagern sich die Polymerasen an und beginnen mit der Verl?ngerung, indem sie weitere komplement?re Nukleotide am 3?-OH-Ende des Primers anf?gen und damit einen Gegenstrang synthetisieren.

Bei jeder Wiederholung obiger drei Schritte verdoppelt sich die Anzahl an kopierten DNA-Molek?len. Nach 20 Zyklen entstehen auf diese Weise aus einem einzigen DNA-Doppelstrang etwa eine Million Molek?le.

Die Anzahl der Zyklen kann je nach Anwendungsart, Beschaffenheit der Probe und den spezifischen Anforderungen und Reaktionsbedingungen entsprechend gew?hlt werden. Ebenso kann die Einstellung der Zeitspannen f?r die einzelnen Schritte an die Erfordernisse bestimmter Anwendungsarten angepasst werden.

Erw?hnenswert ist in diesem Zusammenhang noch eine besondere Art der PCR, die Real-Time-PCR. Diese quantitative PCR Methode erfreut sich in den molekularbiologischen Labors immer gr??erer Beliebtheit, da sie eine Detektion der Proben-DNA bzw. der Amplifikationsprodukte in Echtzeit und zugleich die Bestimmung der anwesenden Menge einer Proben-DNA erlaubt.

Die Bestimmung der DNA-Menge am Ende einer PCR (?Endpunktsbestimmung?) l?sst aus vielerlei Gr?nden nicht direkt R?ckschl?sse auf die Zahl der urspr?nglich vorliegenden Molek?le zu, da z.B. am Anfang wie auch am Ende der PCR die Bedingungen f?r die Polymerasen nicht unbedingt optimal sind und daher die Amplifikation nicht ?ber die ganze Reaktionszeit gleichm??ig abl?uft. Daher kann die Quantifizierung am Ende einer PCR sehr ungenau sein. Wesentlich genauere Quantifizierungen sind m?glich, wenn die Anzahl gebildeter DNA-Molek?le schon w?hrend der Reaktion, also nach jedem einzelnen Zyklus, erfasst wird.

Die meisten bekannten Verfahren zur Real-Time-PCR bedienen sich der Fluoreszenzmessung, wobei sequenzunabh?ngige und seuenzspezifische Detektionsmethoden bekannt sind. Bei den sequenzunabh?ngigen Detektionsmethoden wird beispielsweise ein interkalierender Fluoreszenzfarbstoff verwendet, welcher sich sequenzunabh?ngig in doppelstr?ngige DNA einlagert. Durch Amplifizierung einer DNA erh?ht sich die Gesamtmenge an DNA, das Fluoreszenzsignal nimmt zu. Bei sequenzspezifischen Nachweismethoden sollen ganz spezifische Targets oder Gen-Abschnitte in einem Testansatz nachgewiesen und quantifiziert werden. Dazu werden Oligonukleotid-Sonden verwendet, die an die amplifizierte Target-DNA binden.

Mehrere Prinzipien zur sequenzspezifischen Detektion eines Fluoreszenzsignals und damit zur Detektion und Quantifizierung der Target-DNA stehen zur Verf?gung. Beispielweise kann der Nachweis ?ber ein so genanntes FRET-Prinzip (Fluorescence Resonance Energy Transfer Prinzip) gef?hrt werden. Dabei werden zwei spezifische Oligonukleotid-Sonden, welche im Target direkt benachbart binden k?nnen, eingesetzt. Jede Oligonukleotid-Sonde ist mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert, wobei einer der Farbstoffe, nach Anregung mit Licht durch seine emittierten Photonen wiederum den zweiten Farbstoff anregt sofern dieser sich in ausreichender N?he befindet. Das Emissionslicht dieses zweiten Farbstoffes wird mittels einer geeigneten Vorrichtung detektiert. Die Zunahme der Fluoreszenzintensit?t spiegelt die Zunahme des Targets wider.

Eine weitere M?glichkeit zur sequenzspezifischen Messung eines Fluoreszenzsignals beruht auf dem Prinzip des Fluoreszenz-Quenching. Eine spezifische fluoreszenzmarkierte Sonde wird zus?tzlich mit einem Fluoreszenzquencher ausgestattet, der sich in ausreichender r?umlicher N?he zum Fluorophor befindet, so dass die Sonde wegen des Quench-Vorgangs nicht fluoresziert. Bei geeigneter Konstruktion der Sonde wird aufgrund der Hybridisierung der Sonde an das Target der Quencher r?umlich vom Fluoropphor entfernt, das Quenching verhindert und es kommt zur Fluoreszenzemission. Der Quencher kann auch bei an das Target gebundenen Sonden mittels einer geeigneten Exonukleaseaktivit?t einer Polymerase im PCR-Ansatz abgeschnitten werden. Auch hier spiegelt die Zunahme der Fluoreszenzintensit?t die Zunahme des Targets wider.

Alternativ zu fluoreszenzabh?ngigen Detektionsmethoden wird zur Genanalyse mittels eines bereits eingangs erw?hnten Detektionsverfahrens ?ber Array-Technologien auf einem Chip beispielsweise auf einer Oberfl?che eine Bibliothek bekannter DNA-Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. Existieren in der Untersuchungsl?sung Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplement?r sind, so k?nnen die Target-Oligonukleotide durch Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden.

Verfahren zur oberfl?chensensitiven Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen sind hinreichend bekannt. So beschreibt beispielsweise die WO 2003/018834 A2 ein Verdr?ngungsassay zur Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen. Bei einem solchen elektrochemischen Verfahren werden die Assoziationsereignisse anhand der mit der Assoziation einhergehenden ?nderung der elektrochemischen Eigenschaften der Sonden-Molek?le nachgewiesen.

Die WO 2011/069501 A1 kombiniert die hohe Empfindlichkeit einer oberfl?chensensitiven Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen mit einer vorangegangenen Amplifizierung der Target-Nukleins?ure-Oligomere durch eine PCR. Dadurch kann die Grenze f?r den Nachweis der urspr?nglich in der Probe vorhandenen Target-Nukleins?ureoligomere zu sehr kleinen Konzentrationen verschoben werden.

Als nachteilig an diesen Verfahren hat sich herausgestellt, dass die Verdr?ngung der an die Sonden-Nukleins?ureoligomere hybridisierten Signal-Nukleins?ureoligomere durch die Target-Nukleins?ureoligomere eine Abnahme der Signalintensit?t bewirkt. Der Nachweis von Target-Nukleins?ureoligomeren erfolgt also ausgehend von einem maximalen Detektionssignal durch eine nachfolgende Abnahme der Signalintensit?t.

Es ist allgemein bekannt, dass die Detektion von beliebigen Target-Molek?len mit deutlich besserer Nachweisgrenze erfolgen kann, wenn der Nachweis von einem Null-Signal ausgeht, d.h. bei Abwesenheit der gesuchten Target-Molek?le wird auch kein Signal detektiert. W?nschenswert w?re es, wenn die Signalintensit?t direkt mit der Anzahl an anwesenden Target-Molek?len korrelieren w?rde. Aus der Zunahme der Signalintensit?t k?nnte dann die Bildung von Target-Molk?len mitverfolgt werden.

Darstellung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen zu schaffen, das den Nachweis von Target-Nukleins?ureoligomeren durch eine Zunahme der Signalintensit?t erm?glicht.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gem?? unabh?ngigem Patentanspruch 1 gel?st. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abh?ngigen Anspr?chen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abk?rzungen und Begriffe benutzt:

DNADesoxyribonukleins?ure RNARibonukleins?ure AAdenin GGuanin CCytosin TThymin U Uracil BaseA, G, T, C oder U BpBasenpaar Nukleins?ureWenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleins?ure bezieht sich auf ein beliebiges "R?ckgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat R?ckgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-R?ckgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-R?ckgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleins?ure ist es, dass sie nat?rlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann. Nukleotid, nt Monomerbaustein eines Nukleins?ureoligomers Oligonukleotid, Oligo ?quivalent zu Nukleins?ureoligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht n?her spezifizierter Basenl?nge. Sequenz Nukleotidabfolge in einem Nukleins?ureoligomer komplement?r Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelstr?ngiger Nukleins?ureoligomere hybridisieren die beiden Einzelstr?nge, wobei die Nukleotidabfolge des einen Strangs komplement?r zur Nukleotidabfolge des anderen Strangs ist, so dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbr?cken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick Struktur doppelstr?ngiger Nukleins?ureoligomere hybridisieren die beiden Einzelstr?nge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbr?cken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung innerhalb des Hybrids bildet keine Wasserstoffbr?cken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet. Perfekter Match Hybrid aus zwei komplement?ren Nukleins?ure-Oligomeren, bei dem kein Mismatch auftritt. ss Single strand (Einzelstrang) ds Double strand (Doppelstrang) redoxaktiv Bezeichnet die Eigenschaft einer Einheit unter bestimmten ?u?eren Umst?nden an ein geeignetes Oxidationsmittel Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Reduktionsmittel Elektronen aufzunehmen. Linker, Spacer Molekulare Verbindung zwischen zwei Molek?len bzw. zwischen einem Oberfl?chenatom, Oberfl?chenmolek?l oder einer Oberfl?chenmolek?lgruppe und einem anderen Molek?l. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette k?uflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen k?nnen auch photoaktivierbar sein, d.h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenl?nge aktiviert. Auch unspezifische nt, i.e. nicht zu anderen Basen komplement?re nt, k?nnen als Linker/Spacer verwendet werden, insbesondere bei der Anbindung von Sonden-Oligos an eine Oberfl?che.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion von Nukleins?ureoligomer-Hybridisierungsereignissen bereit umfassend die Schritte

  • a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfl?che, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von Sonden-Nukleins?ureoligomeren besteht, wobei die Sonden-Nukleins?ureoligomere einen zu einem ersten Signal-Pin-Abschnitt von Signal-Nukleins?ureoligomeren komplement?ren Sonden-Pin-Abschnitt besitzen,
  • b) Bereitstellen wenigstens einer Art von Signal-Nukleins?ureoligomeren, wobei
    ? die Signal-Nukleins?ureoligomere einen zu dem Sonden-Pin-Abschnitt der Sonden-Nukleins?ureoligomere komplement?ren ersten Signal-Pin-Abschnitt besitzen,
    ? die Signal-Nukleins?ureoligomere einen zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt von Target-Nukleins?ureoligomeren komplement?ren Signal-Erkennungs-Abschnitt besitzen,
    ? die Signal-Nukleins?ureoligomere einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplement?ren Signal-Pin-Abschnitt besitzen, wobei die Hairpin-Struktur eine Schmelztemperatur TPIN aufweist,
    ? der erste Signal-Pin-Abschnitt nicht zu den Target-Nukleins?ureoligomeren komplement?r ist, und
    ? die Signal-Nukleins?ureoligomere im Bereich des ersten Signal-Pin-Abschnitts mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel modifiziert sind,
  • c) Bereitstellen einer Probe mit Target-Nukleins?ureoligomeren,
  • d) Bereitstellen einer Reaktionsl?sung zur Durchf?hrung einer Nukleins?ureamplifikation, wobei die Reaktionsl?sung zumindest Nukleotide, wenigstens eine Art von Primer und wenigstens eine Art von Nukleins?ure-Polymerase mit Exonuklease-Aktivit?t enth?lt,
  • e) Mischen der in Schritt d) bereitgestellten Reaktionsl?sung mit den in Schritt b) bereitgestellten Signal-Nukleins?ureoligomeren und der in Schritt c) bereitgestellten Probe mit Target-Nukleins?ureoligomeren,
  • f) Amplifizierung der Target-Nukleins?ureoligomere mittels Nukleins?ureamplifikation unter Bildung von Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cken,
  • g) Inkontaktbringen des in Schritt f) erhaltenen Reaktionsgemisches mit der in Schritt a) bereitgestellten modifizierten Oberfl?che,
  • h) Detektion der gebildeten Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET ? TPIN,
  • i) mehrfache Wiederholung der Schritte f) bis h),
  • k) Vergleich der verschiedenen in Schritt h) erhaltenen Werte umfasst.

Der Begriff Hairpin wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung f?r eine DANN-Sekund?rstruktur verwendet, bei der durch intramolekulare Basenpaarungen eine Haarnadelstruktur gebildet wird. Ein Hairpin besteht aus einem doppelstr?ngigen Abschnitt, welcher vorliegend auch als ?Doppelhelix-Abschnitt? oder ?Pin? oder ?Stem? bezeichnet wird und aus einem einzelstr?ngig vorliegenden Schleifenabschnitt, welcher vorliegend auch als ?Loop? bezeichnet wird.

Die zur Ausbildung des Hairpins zueinander komplement?ren Abschnitte des Signal-Nukleins?ureoligomers, welche den doppelstr?ngigen Pin des Hairpins bilden, werden in der vorliegenden Erfindung als ?erster und zweiter Signal-Pin-Abschnitt? bezeichnet. Der vorliegend verwendete Ausdruck ?Sonden-Pin-Abschnitt? beschreibt einen zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt komplement?ren Abschnitt am Sonden-Nukleins?ureoligomer.

Unter der Angabe ?innerhalb der Hairpin-Struktur angeordnete? Sequenz-Abschnitte wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die Sequenzabschnitte im Loop-Bereich des Hairpins und somit ? bezogen auf den Einzelstrang ? zwischen den zwei zur Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplement?ren Signal-Pin-Abschnitten des entsprechenden Einzelstranges angeordnet sind.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck ?Signal-Erkennungs-Abschnitt? bezieht sich auf einen zu einem Abschnitt des Target-Nukleins?ureoligomers komplement?ren Abschnitt des Signal-Nukleins?ureoligomers und bezeichnet einen Sequenzabschnitt im Signal-Nukleins?ureoligomer, welcher aufgrund seiner komplement?ren Struktur beispielsweise mit einem spezifischen Sequenzabschnitt des Targets einen Doppelstrang ausbilden kann und so zur Erkennung eines nachzuweisenden Targets dient. In Analogie dazu wird vorliegend der entsprechende Abschnitt des Target-Nukleins?ureoligomers, welcher durch den Signal-Erkennungs-Abschnitt erkannt wird, mit ?Target-Erkennungs-Abschnitt? bezeichnet.

Unter einer ?weitgehend komplement?ren Struktur? werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Sequenzabschnitte verstanden, bei denen maximal 10% der Basenpaare Mismatches ausbilden. Bevorzugt handelt es sich bei einer ?weitgehend komplement?ren Struktur? im Rahmen der vorliegenden Erfindung um Sequenzabschnitte, bei denen maximal 5% der Basenpaare Mismatches ausbilden.

Von den erfindungsgem?? bereitgestellten Komponenten liegen unter Normalbedingungen die Signaloligonukleotide vorwiegend in einer Hairpin-Struktur vor, die Target-Nukleins?ureoligomere bilden einen Doppelstrang, die Primer liegen in der Regel einzelstr?ngig vor und die Nukleins?ure-Polymerase liegt f?r gew?hnlich ungebunden vor und weist keine Syntheseaktivit?t auf.

Die Hairpin-Struktur der Signaloligonukleotide besitzt eine Schmelztemperatur TPIN. Unter der Schmelztemperatur einer Hairpin-Struktur wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Temperatur verstanden, bei der 50% der Signaloligonukleotide als Hairpin und 50% der Signaloligonukleotide in offener Form vorliegen.

Zum Start eines Amplifizierungszyklus werden s?mtliche potentielle Hybride/Selbsthybride durch eine geeignete, dem Fachmann bekannte Ma?nahme wie beispielsweise eine Temperaturerh?hung dissoziiert. Bei einer anschlie?enden Temperatursenkung hybridisieren die Primer an komplement?re Stellen der noch einzelstr?ngigen Targets an. Die Polymerase wiederum bindet im Bereich des 3`-OH-Endes der Primer an das Hybrid aus Primer und Target und beginnt mit der Verl?ngerung des Primers an dessen 3`-OH-Ende. Bei dieser Polymerisierung wird der vorliegende Einzelstrang des Targets als Matrize abgelesen und ein neuer Doppelstrang gebildet.

Der Hairpin des Signaloligonukleotids verbleibt w?hrend der Temperaturabsenkung zumindest zum Teil in seiner offenen Form, der Signal-Erkennungs-Abschnitt hybridisiert an den entsprechenden Target-Erkennungs-Abschnitt der einzelstr?ngig vorliegenden Targets und bildet mit diesem einen Doppelstrang aus.

Da der erste Signal-Pin-Abschnitt des Signaloligonukleotids nicht zu den Target-Nukleins?ureoligomeren komplement?r ist, hybridisiert dieser nicht mit den Target-Nukleins?ureoligomeren und liegt daher als vom Target abstehender Abschnitt vor. Gelangt nun die Polymerase w?hrend der Polymerisierung an eine Stelle des Targets, an der bereits der Signal-Erkennungs-Abschnitt eines Signaloligos gebunden ist, so schneidet das Enzym aufgrund seiner Exonukleaseaktivit?t den nicht an das Target hybridisierten ersten Signal-Pin-Abschnitt in einem Bereich nahe des hybridisierten Signal-Erkennungs-Abschnittes ab. Dadurch entsteht ein kurzes Signaloligonukleotid-Teilst?ck, an welches das redoxaktive Detektionslabel gebunden ist und das von einem verbleibenden Signal-Oligonukleotid-Rumpf getrennt ist, welcher wiederum den zweiten Signal-Pin-Abschnitt umfasst. An dieser Stelle sei erw?hnt, dass die Signaloligonukleotid-Teilst?cke sowohl vom 3? Ende wie auch vom 5? Ende des Signaloligonukleotids geschnitten werden k?nnen, da sich das redoxaktive Detektionslabel vollkommen gleichwertig im Bereich des 3? oder des 5? Endes befinden kann.

Die so entstehenden, mit dem redoxaktiven Detektionslabel modifizierten Signaloligonukleotid-Teilst?cke k?nnen aufgrund der Signal-Pin-Abschnitte an die dazu komplement?ren Sonden-Pin-Abschnitte der Sonden-Oligonukleotide und damit an die modifizierte Oberfl?che binden. Die redoxaktiven Detektionslabel werden dabei zum elektrochemischen Nachweis von an die modifizierte Oberfl?che (Elektroden) durch Hybridisierung mit den Sondenoligonukleotiden gebundenen Signaloligonukleotid-Teilst?cken benutzt. Bei Anlegen einer entsprechenden Spannung an die Teststelle wird ein dem Hybridisierungsgrad aus Sondenoligonukleotiden und gebundenen Signaloligonukleotid-Teilst?cken entsprechender Strom gemessen. Dieses elektrisch detektierbare Signal ist bei einer Temperatur TDET ? TPIN deutlich h?her als das entsprechende Signal der urspr?nglichen Signaloligonukleotide, da letztere in der Hairpin-Form nicht oder nur zu einem sehr geringen Teil an die Sondenoligonukleotide gebunden werden.

Mit zunehmendem Fortgang der Nukleins?ure-Amplifikation l?uft die Replikation der Target-Nukleins?ureoligomere unter Entstehung der Signaloligonukleotid-Teilst?cke wiederholt ab und die Konzentration an freien Signaloligonukleotid-Teilst?cken nimmt mit zunehmender Amplifizierung zu, was an der Teststelle nachvollzogen werden kann. Die Konzentrationszunahme f?hrt an einer mit Sonden-Nukleins?ureoligomeren belegten Teststelle zu einer ? im Vergleich zur Messung bei Zyklus 0 ? deutlich beschleunigten Anhybridisierung der Signaloligo-Teilst?cke und damit zu einer Zunahme des detektierten elektrochemischen Signals.

Das erfindungsgem??e Verfahren stellt damit eine Methode zur Verf?gung, mit der der Fortgang einer Real-Time Nukleins?ure-Amplifikation ?ber eine Zunahme des elektrochemisch detektierten Signals ausgehend von einem im Wesentlich bei Null liegenden Signal verfolgt werden kann. Das elektrochemisch detektierte Signal nimmt proportional zur Zahl der Target-Nukleins?ureoligomere zu. Damit ist der Nachweis geringster Mengen an Target-Nukleins?ureoligomeren m?glich.

Bevorzugt sind die Signal-Nukleins?ureoligomere mit mehreren Detektionslabel modifiziert, wodurch Signale mit h?herer Intensit?t erhalten werden. Erfindungsgem?? wird als Detektionslabel eine redoxaktive Substanz verwendet.

Die Signal-Nukleins?ureoligomere weisen bevorzugt 10 bis 200 Basen, insbesondere 20 bis 100 Basen, besonders bevorzugt 25 bis 70 Basen auf. Mit Hilfe von Signal-Nukleins?ureoligomeren dieser L?nge k?nnen alle gew?nschten Targets eindeutig identifiziert werden.

Erfindungsgem?? wird die Amplifizierung der Target-Nukleins?ureoligomere und die Detektion der Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke mehrfach wiederholt, wodurch die Bestimmung der Zunahme der Signalintensit?t mit der Zeit im Laufe der Amplifikation der Target-Nukleins?ureoligomere erm?glicht wird.

Die Konzentration der Signal-Nukleins?ureoligomere in dem in Schritt e) hergestellten Gemisch betr?gt bevorzugt zwischen 10?15 mol/l und 10?5 mol/l, besonders bevorzugt zwischen 10?13 mol/l und 10?7 mol/l und insbesondere bevorzugt zwischen 10?11 mol/l und 10?7 mol/l.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der vorliegenden Erfindung besitzen die Signal-Nukleins?ureoligomere zus?tzlich zumindest einen Signal-Dock-Abschnitt, und die Sonden-Nukleins?ureoligomere zus?tzlich einen zu dem Signal-Dock-Abschnitt der Signal-Nukleins?ureoligomere komplement?ren Sonden-Dock-Abschnitt, wobei der Signal-Dock-Abschnitt der Signal-Nukleins?ureoligomere benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt angeordnet ist. Besonders bevorzugt ist der Sonden-Dock-Abschnitt der Sonden-Nukleins?ureoligomere benachbart zu dem Sonden-Pin-Abschnitt der Sonden-Nukleins?ureoligomere angeordnet. Insbesondere bevorzugt ist der Signal-Dock-Abschnitt der Signal-Nukleins?ureoligomere nicht zu den Target-Nukleins?ureoligomeren komplement?r.

Der Signal-Dock-Abschnitt des Signal-Nukleins?ureoligomers befindet sich benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt, welcher mit dem redoxaktiven Detektionslabel versehen ist. Der Sonden-Dock-Abschnitt wiederum ist benachbart zu dem Sonden-Pin-Abschnitt des Sonden-Nukleins?ureoligomers.

Im Falle eines nicht zum Target komplement?ren Signal-Dock-Abschnitts bleibt dieser auch bei einer Anhybridisierung des Signal-Erkennungs-Abschnittes an das Target zusammen mit dem ersten Signal-Pin-Abschnitt ungebunden und liegt im Wesentlichen vom Target ?abstehend? vor. Dadurch wird sichergestellt, dass in einem mittels der Amplifizierungsreaktion entstehenden Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?ck neben dem ersten Signal-Pin-Abschnitt auch der Signal-Dock-Abschnitt enthalten ist. Das Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?ck ist somit um den Signal-Dock-Abschnitt verl?ngert.

Da der Signal-Dock-Abschnitt komplement?r zu dem Sonden-Dock-Abschnitt der Sonden-Nukleins?ureoligomere ist, ist der potentielle Hybridisierungsbereich zwischen Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?ck und Sonden-Nukleins?ureoligomer verl?ngert. Durch diese zus?tzlich vorhandenen Signal-Dock- und Sonden-Dock-Abschnitte wird eine schnellere und best?ndigere Bindung der nachfolgend gebildeten Signaloligonukleotid-Teilst?cke an die Sonden-Nukleins?ureoligomere bewirkt und somit die Detektionsgenauigkeit erh?ht.

Die Tatsache, dass der Signal-Dock-Abschnitt nicht zum Target komplement?r ist, erweist sich auch aus einem anderen Grund als vorteilhaft. Zum Target komplement?re Signal-Dock-Abschnitte k?nnten an die einstr?ngig vorliegenden Target-Nukleins?ureoligomere binden. Da die Signaloligonukleotid-Teilst?cke aber durch Bindung an die Sonden-Nukleins?ureoligomere elektrochemisch detektiert werden sollen, ist eine Bindung an die Target-Nukleins?ureoligomere unerw?nscht und wird vorteilhafterweise vermieden.

Besonders vorteilhaft stellt der Signal-Dock-Abschnitt eine Variable dar, die den Signal-Erkennungs-Abschnitt der Signal-Nukleis?ureoligomere codiert. So k?nnen beispielsweise definierte Signal-Dock-Abschnitte in vorgegebener Weise mit einem spezifischen Signal-Erkennungs-Abschnitt gekoppelt werden, so dass eine bestimmte Sequenz des Signal-Dock-Abschnittes einer ganz bestimmten Target-Sequenz entspricht.

Eine parallele Detektion verschiedener Targets mit Hilfe eines DNA-Chips kann auf diese Weise besonders einfach durchgef?hrt werden. Es muss dazu lediglich eine entsprechende Anzahl verschiedener Sequenzen als Signal-Dock-Abschnitte der Signal-Nukleins?ureoligomere eingesetzt werden. Auf einem DNA-Chip, welcher an verschiedenen Bereichen Sonden-Nukleins?ureoligomere mit einer Anzahl entsprechend unterschiedlicher Sonden-Dock-Abschnitte aufweist, k?nnen unterschiedliche Targets detektiert werden. Werden verschiedene Targets in getrennten Experimenten detektiert, so kann dieselbe Sequenz des Signal-Dock-Abschnittes der Signal-Nukleins?ureoligomere in den verschiedenen Ans?tzen verwendet werden.

Bevorzugt sind die Signal-Nukleins?ureoligomere im Bereich des ersten Signal-Pin-Abschnitts und/oder im Bereich des benachbart zu dem Signal-Pin-Abschnitt angeordneten Abschnitts mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel modifiziert. Falls die Signal-Nukleins?ureoligomere zus?tzlich einen Signal-Dock-Abschnitt- aufweisen, der benachbart zum ersten Signal-Pin-Abschnitt angeordnet ist, kann das redoxaktive Detektionslabel gleichwertig an einen der beiden genannten Abschnitte gebunden sein. Nach Bildung der kurzen Signaloligonukleotid-Teilst?cke durch die Polymerase mit Exonukleaseaktivit?t sind beide genannten Abschnitte Bestandteil der Signaloligonukleotid-Teilst?cke, die nachfolgend an die Sonden-Nukleins?ureoligomere hybridisieren und so detektiert werden.

In Abh?ngigkeit der Nukleotidsequenz und der Basenl?nge der beiden genannten Abschnitte kann beispielsweise aus sterischen Gr?nden oder aus Gr?nden der Kopplungschemie einer der beiden genannten Abschnitte besser f?r die Modifizierung geeignet sein als der andere. Je nach Anwendungsart und je nach Art der Signal-Nukleins?ureoligomere kann die optimale Wahl zur Modifikation getroffen werden.

Zur Sensitivit?tserh?hung k?nnen einer der beiden genannten Abschnitte oder auch beide Abschnitte mit mehreren Detektionslabel modifiziert sein.

Besonders bevorzugt weisen die zwei Signal-Pin-Abschnitte der Signal-Nukleins?ureoligomere jeweils 4 bis 10 Basen, bevorzugt 5 bis 8 Basen auf. Die genannte Zahl an Basen stellt zum einen sicher, dass unter Normalbedingungen der weit ?berwiegende Teil der Signal-Nukleins?ureoligomere als Hairpin vorliegt, und zum anderen, dass die Schmelztemperatur des Hairpins im Bereich der bei der Nukleins?ureamplifikation angewendeten Temperaturen liegt.

Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform der vorliegenden Erfindung ist der Signal-Erkennungs-Abschnitt der Signal-Nukleins?ureoligomere innerhalb des Loop-Bereichs der Hairpin-Struktur zwischen den Signal-Pin-Abschnitten angeordnet. Besonders vorteilhaft ist der Signal-Erkennungsabschnitt im loop-Bereich des Hairpins angeordnet. F?r den Loop-Bereich eines Hairpins bestehen sowohl bezogen auf die Basenl?nge als auch auf die Basenabfolge gr??ere Variationsm?glichkeiten, wodurch ganz unterschiedliche und spezifische Signal-Erkennungs-Abschnitte in unterschiedlichen L?ngen in den Loop-Bereich integriert werden k?nnen.

Zwar ist eine Bindung der Signal-Nukleins?ureoligomere an das Target in ihrer offenkettigen Form erw?nscht, da besonders in diesem Fall die Polymerase in reproduzierbarem Ausma? Signaloligonukleotid-Teilst?cke bildet, jedoch findet sich ein weiterer Vorteil der genannten Ausf?hrungsform darin, dass der Loop-Bereich immer einzelstr?ngig ist und daher eine Bindung des Signal-Oligomers an das Target auch dann m?glich ist, wenn das Signal-Oligomer als Hairpin vorliegt. Dies gilt nur bei Vernachl?ssigung sterischer Hinderungsgr?nde. Je nach Platzierung der Erkennunssequenz innerhalb des Loops ist ein korrektes Schneiden durch die Exonukleaseaktivit?t der Polymerase w?hrend der Amplifizierung auch im Fall eines Hybrids aus Hairpin und Target denkbar. Sp?testens bei einem darauffolgenden Denaturierungsschritt zerf?llt der Pin-Abschnitt des Hairpins, wodurch das Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?ck freigesetzt wird und f?r eine Detektion an der modifizierten Oberfl?che zur Verf?gung steht.

Bevorzugt ist der zweite Signal-Pin-Abschnitt der Signal-Nukleins?ureoligomere nicht zu den Target-Nukleins?ureoligomeren komplement?r. Da gem?? der genannten Ausf?hrungsform der zweite Signal-Pin-Abschnitt der Signal-Nukleins?ureoligomere nicht komplement?r zur Targetsequenz ist, kann die Polymerase vorteilhafterweise nicht an das Signaloligo andocken und von da aus den Strang verl?ngern, was zu unerw?nschten Nebenprodukten f?hren k?nnte.

Ebenfalls bevorzugt sind Ausf?hrungsformen, gem?? denen das freie Ende des zweiten Signal-Pin-Abschnitts der Signal-Nukleins?ureoligomere durch ein Nukleotid gebildet wird, das ein invertiertes Nukleosid oder ein di-desoxy-Nukleosid aufweist. Besonders vorteilhaft wird gem?? dieser Ausf?hrungsform eine Kettenverl?ngerung am Signal-Nukleins?ureoligomer verhindert und dadurch die Bildung unerw?nschter Nebenprodukte vermieden.

Gem?? einer weiteren bevorzugten Ausf?hrungsform der vorliegenden Erfindung weisen die Sonden-Nukleins?ureoligomere in ihren Sonden-Pin-Abschnitten und/oder in ihren Sonden-Dock-Abschnitten zumindest ein Nukleotid auf, das nicht komplement?r zu den entsprechenden Signal-Pin-Abschnitten und Signal-Dock-Abschnitten der Signal-Nukleins?ureoligomere oder der Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke ist.

In dem erfindungsgem??en Verfahren wird die Bindung der Signaloligonukleotid-Teilst?cke an die Sondenoligonukleotide detektiert. Ein st?rendes Hintergrundsignal kann sich dadurch ergeben, dass Hairpin-Signaloligonukleotide an die Sondenoligonukleotide binden. Eine bessere Unterscheidung zwischen Signaloligonukleotid-Teilst?cken und Hairpin-Signaloligonukleotiden kann dadurch erzielt werden, dass die Sondenoligonukleotide in dem/den Sonden-Pin- und Sonden-Dock-Abschnitt/Abschnitten eine, zwei oder mehrere Basen enthalten, die nicht komplement?r zu den entsprechenden Signal-Pin- und Signal-Dock-Abschnitten des Signaloligonukleotids sind. Aufgrund dieser so genannten Mismatches entsteht bei Anbindung von Hairpin-Signaloligonukleotiden und Signaloligonukleotid-Teilst?cken an diesen Basen ein sogenanntes ?Gap?, das sich stark negativ auf die Anhybridisierung von Hairpin-Signaloligonukleotiden auswirkt, aber nur wenig negativ auf die Anhybridisierung von Signaloligonukleotid-Teilst?cken. Damit wird die Bindungskonstante der Hairpin-Signaloligonukleotide an die Sondenoligonukleotide deutlich st?rker herabgesetzt als die Bindungskonstante der Signaloligonukleotid-Teilst?cke an die Sondenoligonukleotide, wodurch sich ein verst?rkter Unterschied zwischen den entsprechenden Signalintensit?ten ergibt.

Ein entsprechendes Diskriminierungs-erh?hendes Verhalten an der Sonde l?sst sich auch erzielen, wenn die Sonde in dem/den zu den Signaloligonukleotiden komplement?ren Bereich/Bereichen um eine, zwei oder mehrere Basen k?rzer ist als der entsprechende Bereich des Hairpin-Signaloligonukleotids oder Signaloligonukleotid-Teilst?cks.

Bevorzugt erfolgt die Detektion der gebildeten Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke in dem erfindungsgem??en Verfahren durch eine elektrochemische Detektionsmethode bei einer Temperatur TDET zwischen 20 ?C und 60 ?C, bevorzugt zwischen 30 ?C und 50 ?C. Bei den genannten Temperaturen ist eine besonders genaue und reproduzierbare Detektion der Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cke m?glich.

Gem?? einer besonders bevorzugten Ausf?hrungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Amplifizierung der Target-Nukleins?ureoligomere durch eine PCR oder durch eine isothermale Amplifikation. Insbesondere die PCR stellt eine etablierte Methode dar, durch die eine weitestgehend fehlerfreie Amplifikation der Target-Nukleins?ureoligomere sichergestellt werden kann.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Signal-Nukleins?ureoligomer zur Verwendung in einem erfindungsgem??en Verfahren, wobei das Signal-Nukleins?ureoligomer einen ersten und einen zweiten unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplement?re Signal-Pin-Abschnitt aufweist und das Signal-Nukleins?ureoligomer im Bereich der zwei unter Ausbildung einer Hairpin-Struktur zueinander komplement?ren Signal-Pin-Abschnitte mit zumindest einem redoxaktiven Detektionslabel modifiziert ist.

Die vorliegende Erfindung umfasst au?erdem einen Kit zur Durchf?hrung eines erfindungsgem??en Verfahrens umfassend eine oben beschriebene modifizierte Oberfl?che, eine effektive Menge an Signal-Nukleins?ureoligomeren wie sie oben beschrieben sind und eine Reaktionsl?sung zur Durchf?hrung einer Nukleins?ureamplifikation, wobei die Reaktionsl?sung zumindest Nukleotide, Primer und wenigstens eine Art von Nukleins?ure-Polymerase mit Exonuklease-Aktivit?t enth?lt.

Die leitf?hige Oberfl?che

Mit dem Begriff "leitf?hige Oberfl?che" wird jedes elektrisch leitf?hige Tr?germaterial bezeichnet, das geeignet ist direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung derivatisierte oder nicht-derivatisierte Sonden-Nukleins?ureoligomere kovalent oder ?ber andere spezifische Wechselwirkungen zu binden.

Es kann jeder Tr?ger mit einer elektrisch leitf?higen Oberfl?che beliebiger Dicke eingesetzt werden insbesondere Oberfl?chen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Besonders bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine mit Gold beschichtete Oberfl?che verwendet.

Daneben k?nnen auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberfl?chen beliebiger Dicke verwendet werden. S?mtliche Halbleiter k?nnen als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, ?-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls s?mtliche bin?ren Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben k?nnen tern?re Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.

Bindung von Nukleins?ureoligomeren an die Oberfl?che

Verfahren zur Immobilisierung von Nukleins?ureoligomeren an einer Oberfl?che sind dem Fachmann bekannt. Die Sonden-Nukleins?ureoligomere k?nnen z.B. kovalent ?ber Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Tr?germaterials mit nat?rlicherweise am Nukleins?ureoligomer vorhandenen oder durch Derivatisierung am Sonden-Nukleins?ureoligomer angebrachten Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen an die Oberfl?che gebunden werden. Alternativ k?nnen Thiol-modifizierte Sonden-Nukleins?ureoligomere chemisorptiv an z.B. Goldoberfl?chen gebunden werden. Das Sonden-Nukleins?ureoligomer kann direkt oder ?ber einen Linker/Spacer an die Oberfl?chenatome oder -molek?len einer Oberfl?che gebunden werden. Daneben kann das Sonden-Nukleins?ureoligomer durch die bei Immunoassays ?blichen Methoden verankert werden wie z.B. durch Verwendung von biotinylierten Sonden-Nukleins?ureoligomeren zur nicht-kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberfl?chen. Die chemische Modifikation der Sonden-Nukleins?ureoligomere mit einer Oberfl?chen-Ankergruppe kann bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingef?hrt werden. Dabei wird auch das Nukleins?ureoligomer direkt oder ?ber einen Linker/Spacer mit den Oberfl?chenatomen oder -molek?len einer Oberfl?che der oben beschriebenen Art verkn?pft. Diese Bindung kann auf verschiedene dem Fachmann bekannte Arten durchgef?hrt werden. In diesem Zusammenhang wird auf die WO 00/42217 A1 verwiesen.

Daneben ist eine Sondenimmobilisierung auf einem DNA-Chip in P. Liepold, T. Kratzm?ller, N. Persike, M. Bandilla, M. Hinz, H. Wieder, H. Hillebrandt, E. Ferrer, G. Hartwich (2008), Analytical and Bioanalytical Chemistry, Vol. 391, S. 1759?1772, Electrically Detected Displacement Assay (EDDA): A Practical Approach to Nucleic Acid Testing in Clinical or Medical Diagnosis detailliert beschrieben.

Sonden-, Target- und Signal-Nukleins?ureoligomere

Die Sonden-Nukleins?ureoligomere der vorliegenden Erfindung bestehen aus Nukleotiden in einer bestimmten Nukleotidabfolge (Sequenz) und liegen an einer Oberfl?che immobilisiert vor. Als Target-Nukleins?ureoligomere werden Molek?le bezeichnet, die spezifisch mit den Signal-Nukleins?ureoligomeren unter Ausbildung eines Doppelstrang-Hybrids wechselwirken. Target-Nukleins?ureoligomere im Sinne der vorliegenden Erfindung sind also Nukleins?ureoligomere, die als Komplexbindungspartner des komplement?ren Signal-Nukleins?ureoligomers fungieren. Die Target-Nukleins?ureoligomere, deren Vorhandensein anhand der vorliegenden Erfindung detektiert werden soll, weisen zumindest einen Sequenzbereich auf, dessen Sequenz komplement?r oder zumindest weitgehend komplement?r zu einem Abschnitt der Signal-Nukleins?ureoligomere ist.

Als Nukleins?ureoligomer oder ns-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. Der Begriff Nukleins?ure bezieht sich auf ein beliebiges ?R?ckgrat? der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat R?ckgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-R?ckgrat der PNA oder auf analoge R?ckgrat-Strukturen, wie z.B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-R?ckgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleins?ure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die sequenzspezifische Bindung nat?rlich vorkommender DNA, oder RNA bzw. daraus abgeleitete (transkribierte oder amplifizierte) Strukturen wie cDNA oder amplifizierte cDNA oder amplifizierte RNA (aRNA).

Bei den Signal-Nukleins?ureoligomeren im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Nukleins?ure-Hairpinstrukturen. Hairpins sind eine spezielle Form von Sekund?rstrukturen von Nukleins?uren und entstehen dadurch, dass ein Sequenzabschnitt eines einzelstr?ngigen DNA- oder RNA-Molek?ls mittels einer ?Schleifenbildung? auf einen komplement?ren Bereich im selben Molek?l unter Ausbildung eines kleinen doppelstr?ngigen Abschnitts zur?ckfalten kann. Bei Normalbedingungen ist die Bildung von Hairpins in entsprechenden Nukleins?uremolek?len thermodynamisch beg?nstigt. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass Hairpins immer zu einem gewissen Anteil in der geschlossenen Form, also der Hairpin-Form und zu einem gewissen Anteil in der offenen, also einzelstr?ngigen Form vorliegen, es stellt sich ein thermodynamisches Gleichgeweicht ein. Das Verh?ltnis von geschlossener zu offener Form wird beispielsweise durch die Temperatur beeinflusst, so liegen zum Beispiel bei der Schmelztemperatur TPIN jeweils die H?lfte der Molek?le geschlossen bzw. offen vor. Die Schmelztemperatur selbst h?ngt wiederum von der Sequenz der den Pin bzw. Stem ausbildenden komplement?ren Abschnitte, von deren GC-Gehalt, deren L?nge und dergleichen ab.

Detektions-Label / Markierung (Markermolek?l)

Die Signal-Nukleins?ureoligomere sind durch Derivatisierung mit einem oder mehreren detektierbaren redoxaktiven Substanzen als Label ausgestattet. Dieses Label erm?glicht die Detektion der Komplexierungsereignisse zwischen den in dem erfindungsgem??en Verfahren gebildeten Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?cken und den oberfl?chengebundenen Sonden-Nukleins?ureoligomeren.

Als Redoxlabel k?nnen ?bergangsmetall-Komplexe, insbesondere solche des Kupfers, Eisens, Rutheniums, Osmiums oder Titans mit Liganden wie Pyridin, 4,7-Dimethylphenanthrolin, 9,10-Phenanthrenquinondiimin, Porphyrine und substituierte Porphyrin-Derivate verwendet werden. Daneben ist der Einsatz von Riboflavin, von Chinonen wie Pyrrollochinolinochinon, Ubichinon, Anthrachinon, Naphtochinon oder Menachinon bzw. Derivaten davon, von Metallocenen und Metallocenderivaten wie Ferrocenen und Ferrocenderivaten, Cobaltocenen und Cobaltocenderivaten, von Porphyrinen, Methylenblau, Daunomycin, Dopamin-Derivaten, Hydrochinon-Derivaten (para- oder ortho-Dihydroxy-Benzol-Derivaten, para- oder ortho-Dihydroxy-Anthrachinon-Derivaten, para- oder ortho-Dihydroxy-Naphtochinon-Derivaten) und ?hnlichen Verbindungen m?glich. Besonders bevorzugt wird Ferrocen oder ein Ferrocen-Derivat als redoxaktives Label eingesetzt.

In dem erfindungsgem??en Verfahren k?nnen auch indirekte Label verwendet werden. Unter dem Begriff ?indirekte Label? werden solche verstanden, bei denen die eigentlich detektierbare Form des Labels erst ?ber eine enzymkatalysierte Reaktion ensteht. Die detektierbare Form des Labels kann dann an der Oberfl?che detektiert werden. Beispiele f?r solche indirekten Label sind dem Fachmann aus der Literatur bekannt, exemplarisch sei hier alkalische Phosphatase (AP) in Verbindung mit dem Substrat p-Aminophenylphosphat genannt. Liegt AP als indirekter Marker an das Signal-Nukleins?ureoligomer gebunden vor, so kann eine elektrochemische Detektion des Signal-Nukleins?ureoligomers dadurch erfolgen, dass zum Zeitpunkt der Detektion p-Aminophenylphosphat zugegeben wird. Das elektrochemisch inaktive p-Aminophenylphosphat dient als Substrat des Enzyms AP und wird in p-Aminophenol umgewandelt. p-Aminophenol kann nun, nach Diffusion zu einer leitf?higen Oberfl?che, elektrochemisch detektiert werden, da diese Form des Substrats (also nach Umsetzung am AP) elektrochemisch aktiv ist. Alternativ kann AP auch zur chromogenen Detektion verwendet werden (z.B. mit 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat in Verbindung mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid).

Oberfl?chensensitive elektrochemische Detektionsmethoden

Bei elektrochemischen Methoden kann anhand der Kinetik der elektrochemischen Prozesse prinzipiell zwischen an eine Oberfl?che adsorbierten und im ?berstand gel?sten redoxaktiven Detektionslabel unterschieden werden. Oberfl?chenadsorbierte Detektionslabel werden im allgemeinen schneller elektrochemisch umgesetzt (z.B. oxidiert oder reduziert) als redoxaktive Detektionslabel aus der Volumenphase, da letztere vor der elektrochemischen Umsetzung erst zur (Elektroden-)Oberfl?che diffundieren m?ssen. Als Beispiele f?r elektrochemische oberfl?chensensitive Methoden seien die Cyclovaltammetrie, die Amperometrie und die Chronocoulometrie genannt.

Die Methode der Chronocoulometrie z.B. erlaubt es, oberfl?chennahe redoxaktive Komponenten von (identischen) redoxaktiven Komponenten in der Volumenphase zu unterscheiden und ist z.B. in Steel, A.B., Herne, T.M. und Tarlov M.J.: Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold, Analytical Chemistry, 1998, Vol. 70, 4670?4677 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben. Der Einsatz der Chronocoulometrie in einem Verdr?ngungsassay zur Detektion von Nukleins?ureoligomerhybridisierungsereignissen ist detailliert in der WO 03/018834 A2 beschrieben, auf die hiermit in diesem Zusammenhang Bezug genommen wird.

Eine elektochemische Messvariante von Hybridisierungsereignissen unter Verwendung eines DNA-Chips ist in P. Liepold, T. Kratzm?ller, N. Persike, M. Bandilla, M. Hinz, H. Wieder, H. Hillebrandt, E. Ferrer, G. Hartwich (2008), Analytical and Bioanalytical Chemistry, Vol. 391, S. 1759?1772, Electrically Detected Displacement Assay (EDDA): A Practical Approach to Nucleic Acid Testing in Clinical or Medical Diagnosis beschrieben.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der vorliegenden Erfindung werden zur elektrochemischen Detektion Cyclovoltammetrie, Amperometrie, Chronocoulometrie, Impedanzmessung oder Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) eingesetzt. Die genannten Methoden erlauben eine genaue und sichere Detektion der Hybridisierungsereignisse.

S?mtliche im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren k?nnen unter Verwendung von DNA-Chips durchgef?hrt werden. In diesem Fall weist die modifizierte Oberfl?che zumindest 2 r?umlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche, bevorzugt zumindest 4 und insbesondere zumindest 12 r?umlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche auf.

Unter "r?umlich im Wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfl?che verstanden, die ganz ?berwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von Sonden-Nukleins?ureoligomeren modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche r?umlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer Vermischung von verschiedenen Arten von Sonden-Nukleins?ureoligomeren kommen.

Ganz besonders bevorzugt weist die modifizierte Oberfl?che zumindest 32, insbesondere zumindest 64, ganz besonders bevorzugt zumindest 96 r?umlich im Wesentlichen abgetrennte Bereiche auf.

Die in Schritt a) des erfindungsgem??en Verfahrens bereitgestellte modifizierte Oberfl?che weist bevorzugt eine Fl?che von 1 ?m2 bis zu 1 mm2, besonders bevorzugt eine Fl?che von 10 ?m2 bis zu 100 ?m2 und insbesondere bevorzugt eine Fl?che von rund 50 ?m2 auf.

Gem?? einer weiteren, besonders bevorzugten Ausf?hrungsform ist in jeweils einem der r?umlich im Wesentlichen abgetrennten Bereiche der Oberfl?che jeweils eine Art von Sonden-Nukleins?ureoligomeren an die Oberfl?che gebunden, wobei sich die verschiedenen Arten von Sonden-Nukleins?ureoligomeren in zumindest einer Base voneinander unterscheiden. Dies erlaubt die parallele Detektion einer Vielzahl verschiedener Arten von Target-Nukleins?ureoligomeren.

Ein CMOS-basierter DNA-Chip f?r elektrochemische Detektion der Hybridisierung zwischen Sonde und Signaloligonukleotid ist z.B. in Augustyniak, M.; Paulus, C.; Brederlow, R.; Persike, N.; Hartwich, G.; Schmitt-Landsiedel, D.; Thewes, R. (2006), Solid-State Circuits, 2006 IEEE International Conference Digest of Technical Papers, 59?68 A 24 ? 16 CMOS-Based Chronocoulometric DNA Microarray beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausf?hrungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen n?her erl?utert werden. Es zeigen

1a ein Sonden-Nukleins?ureoligomer in schematischer Darstellung;

1b ein Signal-Nukleins?ureoligomer in schematischer Darstellung;

1c ein Target-Nukleins?ureoligomer in schematischer Darstellung;

1d Primer und Polymerase in schematischer Darstellung;

2a in schematischer Darstellung die wesentlichen Komponenten des erfindungsgem??en Verfahrens in ihren Hybridisierungszust?nden bei Normalbedingungen;

2b in schematischer Darstellung die wesentlichen Komponenten des erfindungsgem??en Verfahrens in ihren Hybridisierungszust?nden bei Start eines PCR-Zyklus;

2c in schematischer Darstellung die Replikation des Targets und die Bildung von Signaloligonukleotid-Teilst?cken;

3a eine Auftragung des Peakstroms cyclovoltammetrischer Messungen eines Ferrocen-Labels in Abh?ngigkeit von der Zeit zu Beginn der PCR;

3b eine Auftragung des Peakstroms cyclovoltammetrischer Messungen eines Ferrocen-Labels in Abh?ngigkeit von der Zeit nach dem 30. PCR-Zyklus;

4 eine Auftragung des Peakstroms cyclovoltammetrischer Messungen eines Ferrocen-Labels jeweils 20 Sekunden nach dem entsprechenden PCR-Zyklus in Abh?ngigkeit von der Zykluszahl.

Wege zur Ausf?hrung der Erfindung Elektrisch detektierte Real-Time PCR (eRT-PCR)

Zu einem PCR-Ansatz werden Signaloligonukleotide gegeben, die zum einen zu Sondenoligonukleotiden, die auf einer Teststelle eines DNA-Chips immobilisiert sind, und zum anderen zu den Target-Oligonukleotiden (einem Sequenzbereich des Templates bzw. des ?ber PCR zu amplifizierenden DNA-Abschnitts) komplement?r sind.

In den 1a bis 1d sind ein Sonden-Nukleins?uroligomer 1, ein Signal-Nukleins?ureoligomer 2 und die wesentlichen restlichen Komponenten einer elektrisch detektierbaren real-time PCR schematisch dargestellt. 1a zeigt schematisch eine Teststelle eines Mikroarrays mit einem der darauf immobilisierten Sondenoligonukleotide 1. Die Oberfl?che 3 der Teststelle besteht aus Gold. Auf der Teststelle ist ?ber Thiolbindungen (-S-) eine Art von Sondenoligonukleotiden 1 immobilisiert. Die Sondenoligonukleotide 1 umfassen die Abschnitte Spacer 4, Sonden-Pin-Abschnitt 5 und Sonden-Dock-Abschnitt 6. Der Sonden-Dock-Abschnitt 6 kann auch zwischen Sonden-Pin-Abschnitt 5 und Spacer 4 angeordnet sein. Daneben ist es m?glich, dass Sonden-Pin-Abschnitt 5 und Sonden-Dock-Abschnitt 6 ?berlappen, also gemeinsame Basen aufweisen.

Die Signaloligonukleotide 2 weisen bei Normalbedingungen (25?C, 1 bar) eine sogenannte Hairpinstruktur auf, die aus einem aus einem ersten und einem zweiten Signal-Pin-Abschnitt 5?, 5?? aufgebauten Pin-Bereich und einem Loop-Bereich besteht. Benachbart zu dem ersten Signal-Pin-Abschnitt 5? weist das Signaloligonukleotid 2 des vorliegenden Beispiels zus?tzlich einen Signal-Dock-Abschnitt 6? auf, welcher komplement?r zu dem Sonden-Dock-Abschnitt 6 der Sondenoligonukleotide 1 ist. Der Hairpin tr?gt ein kovalent angebundenes elektrisch detektierbares Label 9, wobei im vorliegenden Beispiel der erste Signal-Pin-Abschnitt 5? mit dem Label markiert ist. Der erste Signal-Pin-Abschnitt 5? ist komplement?r zu dem Sonden-Pin-Abschnitt 5 des Sondenoligonukleotids 1. Ebenso ist es m?glich, dass der Signal-Dock-Abschnitt 6? nicht zwischen Signal-Pin-Abschnitt 5? und Signal-Erkennungs-Abschnitt 8, sondern endst?ndig am freien Ende des Signal-Pin-Abschnitt 5? angeordnet ist. Auch k?nnen der Signal-Pin-Abschnitt 5? und der Signal-Dock-Abschnitt 6? ?berlappen, also gemeinsame Basen aufweisen.

Der Loop-Bereich der Signaloligonukleotide 2 weist einen Signal-Erkennungsabschnitt 8 auf, welcher komplement?r zu einem Target-Erkennungs-Abschnitt 8? des Target-Nukleins?ureoligomers 10 (1c) ist. Das Target-Nukleins?ureoligomer liegt in der Regel als Doppelstrang vor und weist Primerbindungsstellen 11, 12 auf, die wiederum komplement?r zu den Primern 11? und 12` (1d) sind. In 1d ist schematisch eine Polymerase 13 mit geeigneter Exonukleaseaktivit?t dargestellt.

Die 2a bis 2c zeigen schematisch die Grundz?ge des Ablaufs einer elektrisch detektierbaren real-time PCR in der Volumenphase. Die wesentlichen Komponenten in ihren Hybridisierungszust?nden bei Normalbedingungen (25?C, 1 bar) sind in 2a dargestellt. In der Regel liegen die Signaloligonuleotide 2 in einer Hairpin-Struktur vor, das Target 10 als Doppelstrang, die Primer 11?, 12? einzelstr?ngig und die Polymerase 13 in einem nicht an die DNA gebundenen Zustand. Ein PCR-Zyklus wird gestartet, indem die PCR-L?sung kurzzeitig auf ca. 95?C erhitzt wird, um potentielle Hybride/Selbsthybride zu dissoziieren (vgl. 2b). K?hlt man die PCR-L?sung auf eine geeignete Temperatur ab (ca. 70?C), k?nnen zum einen die Primer 11?, 12? mit den einzelstr?ngigen Targets 10 hybridisieren und die Polymerase 13 kann andocken, zum anderen bleibt der Hairpin des Signaloligonukleotids zumindest zum Teil dissoziiert, und der Signal-Erkennungs-Abschnitt 8 des Signaloligos 2 kann mit dem Target-Erkennungs-Abschnitt 8? hybridisieren. Da der zweite Signal-Pin-Abschnitt 5?? des Signaloligos 2 nicht komplement?r zur Targetsequenz ist, liegt dieser Abschnitt immer einzelstr?ngig vor, weshalb die Polymerase 13 nicht an das Signaloligo 2 andocken und von da aus den Strang verl?ngern kann, was zu unerw?nschten Nebenprodukten f?hren w?rde. Alternativ oder additiv zu einer nichtkomplement?ren Ausf?hrung des zweiten Signal-Pin-Abschnittes 5?? k?nnte das Signaloligo 2 auch am Ende des zweiten Signal-Pin-Abschnittes 5?? ein invertiertes Nukleosid oder ein di-desoxy-Nukleosid aufweisen. Auch andere dem Fachmann bekannte Ma?nahmen k?nnen getroffen werden, um eine Kettenverl?ngerung des Signal-Oligonukleotids 2 zu vermeiden.

Die f?r den in 2c skizzierten Zustand geeignete Temperatur ist im Wesentlichen von der Primerhybridisierungstemperatur TP, der Signaloligohybridisierungstemperatur des Signaloligos 2 mit dem Target 10 im Bereich 8/8? TSO und der Hairpinschmelztemperatur TPin unter den Pufferbedingungen der PCR abh?ngig und wird beim Primer-/ Sondendesign in silico durch entsprechende Software oder empirische Werte ermittelt. Als grobe Faustregel sollte die f?r den in 2c skizzierten Vorgang geeignete Temperatur T gelten: T ~ TP ~ TSO ~ (>) TPIN, wobei die Temperatur T zus?tzlich in einem Bereich liegen sollte, bei der die Polymerase hohe Raten der Targetreplikation aufweist (in der Regel um 70 ?C); T kann in Vorversuchen entsprechend optimiert werden.

Bei geeigneter Konstruktion des Hairpin-Signaloligonukleotids kann T auch kleiner als TPin sein, wenn gew?hrleistet ist, dass zumindest ein Bruchteil der Signaloligos 2 und/oder auch bei (teilweise) geschlossener Hairpinstruktur an das zumindest im Target-Erkennungs-Abschnitt 8? einzelstr?ngige Target 10 anbinden kann. Sind die in 2c skizzierten Voraussetzungen gegeben und weist die Polymerase 13 eine entsprechend geeignete Exonukleaseaktivit?t aus, wird diese bei der Replikation das an das zu replizierende Target 10 gebundene Signaloligonukleotid 2 in einem Bereich in der N?he des ?bergangs vom Signal-Dock-Abschnitt 6? zum Signal-Erkennungsabschnitt 8 des Signaloligonukleotids 2 schneiden. Dadurch entsteht ein kurzes Signaloligonukleotid-Teilst?ck 14, welches vom Signal-Oligonukleotid-Rumpf 15 abgetrennt ist (2c).

Das kovalent gebundene redoxaktive Label, insbesondere Ferrocen 9 der Signaloligonukleotide 2 kann zum elektrochemischen Nachweis von an der modifizierten Oberfl?che 3, n?mlich den Teststellen (Elektroden) gebundenen/hybridisierten Signaloligonukleotiden 2 benutzt werden. Ferrocen ist reversibel oxidier- und reduzierbar. Bei Anlegen einer entsprechenden Spannung an die Teststelle wird ein dem Hybridisierungsgrad aus Sonden 1 und gebundenen Signaloligos 2 entsprechender Strom gemessen. Entsprechend k?nnen die Signaloligo-Teilst?cke 14 bei geeigneter Temperatur (TDET ? TPIN) an der Teststelle mit Sondenoligo 1 gebunden werden und erzeugen ein elektrisch detektierbares Signal, das bei TDET ? TPIN deutlich h?her ist als das entsprechende Signal des urspr?nglichen Signaloligos 2, da letzteres in der Hairpin-Form nicht oder nur zu einem sehr geringen Teil an die Sonde 1 gebunden wird. Zur Unterst?tzung der Diskriminierung zwischen Hairpin-Signaloligonukleotid 2 und Signaloligonukleotid-Teilst?ck 14 kann die Sonde 1 zwischen dem ersten Signal-Pin-Abschnitt 5 und dem Signal-Dock-Abschnitt 6 zus?tzlich eine, zwei oder mehrere Basen besitzen, die nicht zum Signaloligonukleotid 2 komplement?r sind und bei Anbindung von Hairpin-Signaloligonukleotid 2 und Signaloligonukleotid-Teilst?cken 14 Mismatches und / oder ein sogenanntes ?Gap? ausbilden, das sich stark negativ auf die Anhybridisierung von Hairpin-Signaloligonukleotiden 2 auswirkt, aber nur wenig negativ auf die Anhybridisierung von Signaloligonukleotid-Teilst?ck 14. Ein entsprechendes Diskriminierungs-erh?hendes Verhalten an der Sonde 1 l?sst sich auch erzielen, wenn die Sonde 1 im Bereich des ersten Signal-Pin- und/oder des Signal-Dock-Abschnitts 5?, 6? um eine, zwei oder mehrere Basen k?rzer ist als der entsprechende Bereich des Hairpin-Signaloligonukleotids 2 oder Signaloligonukleotid-Teilst?cks 14.

In Tabelle 1 sind die f?r die folgenden eRT-PCR Experimente verwendeten Primer, Sonden-, Signal- und Target-Oligonukleotide zusammengestellt. Tabelle 1: 5?-3? Sequenzen der in Fig. 1 und 2 skizzierten Oligonukleotide. * (hybridisierbare Sondensequenz in Kleinbuchstaben, Spacer in Gro?buchstaben, Gap klein und kursiv sowie Mismatches klein und fett gedruckt)

Mit zunehmendem Fortgang der PCR-Reaktion laufen die mit 2 dargestellten Grundz?ge der Amplifikation wiederholt ab und die Konzentration der freien Signaloligonukleotid-Teilst?cke 14 nimmt mit zunehmender Zyklenzahl der PCR deutlich zu, was an der Teststelle nachvollzogen werden kann. Die Konzentrationszunahme f?hrt an einer mit Sonden 1 belegten Teststelle (siehe 1a) zu einer ? im Vergleich zur Messung bei Zyklus 0 (3a) ? deutlich beschleunigten Anhybridisierung der Signaloligonukleotid-Teilst?cke 14 (3b).

Die 3a und 3b zeigen Messergebnisse einer elektrisch detektierten Signal?nderung zur ?real time? Verfolgung des Fortgangs einer PCR-Reaktion. In 3a ist der Peakstrom cyclovoltammetrischer Messungen des Ferrocen-Labels 9 in Abh?ngigkeit von der Zeit zu Beginn der PCR (Zyklus 0) f?r zwei Sonden (Sonde_A_1 und Sonde_A_3, vgl. Tabelle 1) gezeigt. Diese Darstellung entspricht dem Anhybridisierungsverhalten des Signaloligos 2 bzw. Signaloligo-Teilst?cks 14, das u.a. von der Konzentration an Signaloligos 2 bzw. Signaloligo-Teilst?cken 14 abh?ngig ist. In 3a ist somit das Anhybridisierungsverhalten des Signaloligonukleotids 2 bei 40?C dargestellt, einer Temperatur bei der das Signaloligonukleotid 2 als Hairpin vorliegt, womit 3a letztendlich auch das Background-Signal der Messung darstellt. In 3b ist eine entsprechende Messung nach dem 30. PCR-Zyklus (der Her-2 PCR, siehe Text) im Vergleich zum Background-Signal (Sonde_A_3 bei 0 Zyklen) dargestellt. W?hrend der PCR wurden ?ber die Exonukleaseaktivit?t der Taq-Polymerase eine dem Fortgang der Amplifikation entsprechende Menge an Signaloligo-Teilst?cken 14 hergestellt. Das Anhybridisierungsverhalten bei Zyklus 30 entspricht im Wesentlichen dem Background-Signal (aus 3a) und dem Signal der gebildeten Signaloligo-Teilst?cke 14.

Durchf?hrung einer Real-Time PCR am Beispiel Her-2 PCR (Her-2 = cDNA des human epidermal growth factor receptor 2)

Die Sequenzen der wesentlichen PCR-Komponenten sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Der Mastermix f?r die PCR Reaktion zur Amplifikation einer Zielsequenz von Her-2 (Template-Menge ca. 103 Kopien) enth?lt entsprechende Primer (10 ?M), den dNTP-Mix (je dNTP 25 ?M) und MgAc (3 mM) in einem Standard PCR-Puffer (5 ? Bicin Puffer, 250 mM Bicin/KOH, pH 8.2; 575 mM K-Acetat, 40% Glycerol (v/v), Bicine = N,N-Bis(2-hydroxyethyl) Glycin). Zu diesem Mastermix werden das Template und Signaloligonukleotide (50nM), sowie Kontroll-Signaloligonukleotide (50 nM), die vollst?ndig nicht-komlement?r zu DNA-Sequenzen der Template-L?sung sind, gegeben. Unmittelbar vor Start der PCR-Reaktion wird PCR-Polymerase mit Exonuklease-Aktivit?t zugef?gt und die L?sung in eine PCR-Kartusche gef?llt.

Funktion und Aufbau der PCR-Kartusche und eines PCR-Cyclers sind in der DE 10 2009 044 431 A1 beschrieben. Bei der PCR-Kartusche handelt es sich um eine Zelle mit einem ungef?hren Durchmesser von 20 mm und einer Dicke von 1 mm, in die ein ungef?hr 0.5 mm tiefer Hohlzylinder zur Aufnahme der L?sung f?r die PCR-Reaktion eingebracht ist. Im Inneren der Kartusche befindet sich ein DNA-Chip, dessen Sensorfeld ?ber einen Br?ckenkanal mit der Reaktionsl?sung in Fl?ssigkeitskontakt steht. Der Chip verf?gt ?ber eine Durchkontaktierung, so dass die f?r die Messwerterfassung notwendige elektrische Kontaktierung des DNA-Chips von au?en ?ber Federkontakte bewerkstelligt werden kann.

Zur Durchf?hrung der PCR wird die PCR-Kartusche in einem PCR-Cycler angeordnet. Der PCR-Cycler besteht aus 3 Heizbl?cken aus einem gut w?rmeleitf?higen Material (z.B. Aluminium). Mittels Peltierelementen bzw. Heizmatten, Platinwiderstand zur Temperaturmessung und einer geeigneten Regelelektronik (PID-Regler) werden die Heizbl?cke auf die f?r die PCR-Reaktion n?tige Temperatur gebracht. Jeder Block enth?lt einen Spalt, in den die PCR-Kartusche eingef?hrt wird. Ober- und unterhalb der Kartusche befindet sich im Bereich des DNA-Chips ein weiterer Heizblock, um die Chiptemperatur unabh?ngig von der Temperatur f?r die PCR-Reaktion im Reaktionskanal einzustellen. Dieser zentrische Heizblock dient gleichzeitig zur Vermittelung der Rotationsbewegung der PCR-Kartusche und der Kontaktierung des DNA-Chips in der Kartusche. Durch eine geeignete Wahl der Blockgeometrie kann der Bereich, in der die Zelle eine bestimmte Temperatur aufweist, festgelegt werden. Im vorliegenden Beispiel wurde ein Verh?ltnis von 2:1:1 des Bereiches mit 95?C zu den Bereichen mit 72?C (Annealing) und 72?C (Elongation) gew?hlt. Zwischen den Bl?cken ist jeweils ein Luftspalt, um die W?rme?bertragung zwischen den Bl?cken zu verhindern. Durch Variation der Rotationsfrequenz kann die Zeit, in der die kritischen Temperaturen f?r die PCR-Reaktion an der Kartusche anliegen, variiert werden.

Vor Start der PCR wird die Reaktionsmischung in dem PCR-Cycler 3 min auf 95?C erhitzt und anschlie?end abgek?hlt und nach leichtem Durchmischen der PCR-L?sung durch geeignete Ma?nahmen, die gew?hrleisten, dass frische L?sung aus dem PCR-Kanal den Chip benetzt, eine erste Messung am integrierten DNA-Chip durchgef?hrt. Der DNA-Chip tr?gt an einer der bereitgestellten Teststellen Sonden des Typs Sonde_A_3, die zumindest teilweise komplement?r zum Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?ck 14 sind und an einer weiteren Teststelle Sonden, die komplement?r zum Kontroll-Signaloligonukleotid sind. Die Messung findet bei 40?C statt, also deutlich unter der TPin des Signaloligonukleotids und entspricht den in 3a dargestellten Messwerten.

Nach dieser ersten Normierungsmessung wird die PCR-Reaktion gestartet, die Heizbl?cke des PCR-Cyclers werden dazu auf 96?C (Aufschmelzen), 72?C (Annealing) und 72?C (Elongation) eingestellt und die PCR-Kartusche mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2 Umdrehungen pro Minute (i.e. 2 Zyklen pro Minute) in den Heizbl?cken gedreht. Das nahezu zentrisch ausgerichtete Sensorfeld des DNA-Chips wird ?ber einen weiteren Heizblock bei ca. 40?C gehalten, W?hrend einer Messung des Hybridisierungsvorgangs am Chip wird die PCR-Kartusche in der Regel weiter gedreht.

In 4 sind zur Darstellung des Amplifikationsverlaufs w?hrend der PCR die Peakstr?me des Anhybridisierungsverhaltens (vgl. 3a, 3b) jeweils 20 Sekunden nach dem entsprechenden PCR-Zyklus in Abh?ngigkeit von der Zyklenzahl dargestellt. Ab ca. 20 Zyklen steigt dieser Peakstrom deutlich an. Dieser Anstieg ist auf die vermehrte Bildung von Signaloligo-Teilst?cken und damit auf vermehrte Amplifikation der Ziel-DNA Her-2 zur?ckzuf?hren. Durch geeignete Normierung und Vergleich mit der Kontroll-Teststelle ist es zudem m?glich, nicht nur das Vorhandensein der entsprechenden Ziel-Sequenz nachzuweisen, sondern auch auf die urspr?nglich vorhanden Menge r?ckzurechnen (quantitative bzw. semiquantitative real-time PCR).

Bezugszeichenliste

1
Sonden-Nukleins?ureoligomer
2
Signal-Nukleins?ureoligomer
3
Oberfl?che der Teststelle
4
Spacer
5
Sonden-Pin-Abschnitt
5?
erster Signal-Pin-Abschnitt
5??
zweiter Signal-Pin-Abschnitt
6
Sonden-Dock-Abschnitt
6?
Signal-Dock-Abschnitt
8
Signal-Erkennungs-Abschnitt
8?
Target-Erkennungs-Abschnitt
9
redoxaktives Detektionslabel
10
Target-Nukleins?ureoligomer
11, 12
Primerbindungsstellen
11?, 12?
Primer
13
Nukleins?ure-Polymerase
14
Signal-Nukleins?ureoligomer-Teilst?ck
15
Signal-Nukleins?ureoligomer-Rumpf