Title:
Monoklonaler anti-Idiotyp-Antikörper Ganglidiomab
Kind Code:
A1
Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft einen anti-idiotypischen Antikörper, der das Disialogangliosid GD2 nachahmt. GD2 wird auf neuroektodermalen Tumoren exprimiert. Weiterhin umfasst ist eine entsprechende Hybridomzelllinie und ein korrespondierendes Polynucleotid, sowie eine entsprechende pharmazeutische Zubereitung bzw. einen Impfstoff. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Antikörpers oder Polynucleotids zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum, ein Verfahren zur Detektion einer gegen GD2 gerichteten Immunantwort und ein Verfahren zur Detektion bzw. quantitativen Bestimmung der Konzentration eines Anti-GD2-Antikörpers sowie zur Detektion von Zellen, die einen anti-GD2 Antikörper oder ein Derivat eines anti-GD2 Antikörpers exprimieren.



Inventors:
Lode, Holger, Prof. Dr. med. (17493, Greifswald, DE)
Application Number:
DE102011054413A
Publication Date:
04/18/2013
Filing Date:
10/12/2011
Assignee:
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, 17489 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE10059930A1N/A2002-05-29
Foreign References:
56539771997-08-05
58540691998-12-29
Other References:
Foon, K.A. et al. Journal of Clinical Oncology, 2000, 18(2), 376-384.
Sen, G. et al. Journal of Immunotherapy, 1998, 21(1):75-83.
Attorney, Agent or Firm:
Wablat Lange Karthaus Anwaltssozietät, 14129, Berlin, DE
Claims:
1. Anti-idiotypischer Antik?rper, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminos?uresequenz der variablen Region der leichten Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variblen Region der schweren Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 3 ist, wobei der Antik?rper als Disialogangliosid-GD2-anti-Idiotyp-Antik?rper wirksam ist.

2. Anti-idiotypischer Antik?rper gem?? Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminos?uresequenz der variablen Region der leichten Kette identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variablen Region der schweren Kette identisch zur SEQ ID Nr 3 ist.

3. Anti-idiotypischer Antik?rper gem?? Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antik?rper monoklonal oder rekombinant, vorzugsweise monoklonal, ist.

4. Hybridomzelllinie, die einen Antik?rper gem?? einem der Anspr?che 1?3 erzeugt.

5. Polynucleotid, umfassend Nucleotidsequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die f?r den Antik?rper gem?? einem der Anspr?che 1?3 kodieren.

6. Polynucleotid gem?? Anspruch 5, umfassend Nucleotidsequenzen, welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die f?r den Antik?rper gem?? einem der Anspr?che 1?3 kodieren.

7. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antik?rpers gem?? einem der Anspr?che 1?3 oder eines Polynucleotids gem?? einem der Anspr?che 5 oder 6.

8. Impfstoff, enthaltend eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antik?rpers gem?? einem der Anspr?che 1?3 oder eines Polynucleotids gem?? einem der Anspr?che 5 oder 6.

9. Impfstoff gem?? Anspruch 8, weiterhin enthaltend mindestens ein Adjuvanz.

10. Antik?rper gem?? einem der Anspr?che 1?3 oder Polynucleotid gem?? einem der Anspr?che 5 oder 6 zur Ausl?sung einer Immunantwort in einem Individuum.

11. Antik?rper oder Polynucleotid zur Verwendung gem?? Anspruch 10 zur Ausl?sung einer gegen das Antigen Disialogangliosid GD2 gerichteten Immunantwort in einem Individuum.

12. Antik?rper oder Polynucleotid zur Verwendung gem?? einem Anspr?che 10 oder 11 zur Behandlung oder Pr?vention (Impfung) einer mit GD2-Expression assoziierten Erkrankung.

13. Antik?rper oder Polynucleotid zur Verwendung gem?? Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mit GD2 assoziierte Erkrankung ein neuroektodermaler Turmor ist, welcher GD2 exprimiert.

14. Antik?rper oder Polynucleotid zur Verwendung gem?? Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der neuroektodermale Turmor ausgew?hlt ist aus Melanom, Neuroblastom, Sarkom, kleinzelligem Lungenkarzinom und Glioblastom.

15. Verfahren zur Detektion einer gegen GD2 gerichteten Immunantwort, umfassend das in Kontaktbringen einer biologischen Probe des Probanden in vitro mit einem Antik?rper gem?? einem der Anspr?che 1?3 und Bestimmen, ob eine gegen GD2 gerichtete Immunantwort auftritt.

16. Verfahren zur Detektion bzw. quantitativen Bestimmung der Konzentration eines Anti-GD2-Antik?rpers oder dessen Derivats in Proben von K?rperfl?ssigkeit eines Probanden, welchem dieser Anti-GD2-Antik?rper oder dessen Derivat verabreicht wird, wobei die K?rperfl?ssigkeitsprobe in vitro mit einem Antik?rper gem?? einem der Anspr?che 1?3 in Kontakt gebracht wird und dass Ausma? der Reaktion quantitativ bestimmt wird.

17. Verfahren gem?? Anspruch 16, wobei die K?rperfl?ssigkeit Blutserum ist.

18. Verfahren zur Detektion von Zellen, die genetisch manipuliert wurden, um rekombinante Derivate eines anti-GD2-Antik?rpers zu exprimieren, wobei zellhaltige Proben mit einem Antik?rper gem?? einem der Anspr?che 1?3 in Kontakt gebracht werden und dass Ausma? der Reaktion quantitativ bestimmt wird.

Description:

Bei neuroektodermalen Tumoren ist das Disialogangliosid GD2 hochexprimiert. Hierzu z?hlen das Melanom (30% der F?lle), das Neuroblastom (100% der F?lle), das kleinzellinge Lungenkarzinom (15% der F?lle) sowie das Glioblastom (100% der F?lle). Auch bei verschiedenen Sarkomen wurde das GD2 als Antigen beschrieben.

Das Neuroblastom stellt den h?ufigsten soliden, extrakraniellen Tumor im fr?hen Kindesalter dar. Es handelt sich hierbei um einen malignen, neuroektodermalen Tumor, der aus entarteten Zellen besteht, die der Neuralleiste entstammen und bei der Bildung des sympathischen Nervensystems in einem unreifen Stadium verblieben sind (Neuroblasten). Ihr Auftreten konzentriert sich auf das fr?he Kindesalter; so treten 40% der Tumoren im ersten Lebensjahr auf, w?hrend mit zunehmendem Lebensalter die Inzidenz abnimmt

Aufgrund der immer noch schlechten Prognosen bei Hochrisikopatienten sowie einer gro?en Zahl an auftretenden Rezidiven, hat die Entwicklung von adjuvanten immuntherapeutischen Strategien zur Bek?mpfung des Neuroblastoms einen besonderen Stellenwert in der p?diatrischen Onkologie eingenommen. Es lassen sich passive und aktive Immuntherapiekonzepte voneinander unterscheiden, die aber ein gemeinsames Ziel verfolgen: die Aktivierung des k?rpereigenen Immunsystems zur Zerst?rung der malignen Tumorzellen.

Eine wichtige Voraussetzung f?r die Durchf?hrung von immuntherapeutischen Strategien ist das Vorhandensein von tumorassoziierten Antigenen (TAA), die in hohem Ma?e auf der Oberfl?che von Tumorzellen exprimiert werden und dadurch geeignete Zielstrukturen f?r derartige Therapiekonzepte darstellen. Ein solches Oberfl?chenantigen, welches in gro?er Zahl auf neuroektodermalen Tumoren, wie dem Neuroblastom, gebildet wird, ist das Disialogangliosid GD2 [Schulz et al., 1984], das zuerst von Reiko F. Irie als onkofetales Antigen (OFA-I-2) entdeckt und beschrieben wurde [Irie et. al, 1976]. Hierbei handelt es sich um ein Glykosphingolipid [Cahan et. al, 1982], dessen hydrophober Teil (Ceramid) in der Zellmembran verankert ist und der glykosidisch gebundene Kohlenhydratanteil zur Au?enseite der Membran pr?sentiert wird.

Die physiologische, sehr geringe GD2-Expression in gesunden Geweben ist auf Neuronen, peripheren Nervenenden sowie Melanozyten beschr?nkt [Svennerholm et al., 1994], wodurch GD2 zu einem geeigneten tumorassoziiertem Zielantigen beim Neuroblastom wird, was wiederum als Grundlage f?r passive und aktive immuntherapeutische Strategien dient.

Passive Immuntherapie

Im Rahmen einer passiven Immuntherapie werden spezifische monoklonale Antik?rper verabreicht, die ein bestimmtes Antigen, wie z.B. GD2 bei neuroektodermalen Tumoren wie dem Neuroblastom, erkennen und mit einer sehr hohen Affinit?t binden k?nnen. Daraufhin werden diverse immunologische Effektormechanismen (z.B. Opsonierung, Neutralisation, Komplementaktivierung, ADCC) ausgel?st, die zu einer effektiven Immunantwort gegen das erkannte Antigen beitragen.

Der erste murine monoklonale anti-GD2 Antik?rper 14.18 (IgG3) wurde mittels klassischer Hybridomtechnik nach Immunisierung von BALB/c M?usen mit humanen LAN-1 Neuroblastomzellen erzeugt [Mujoo et. al, 1987]. Durch einen Klassenwechsel zu IgG2 entstand der murine anti-GD2 Antik?rper 14G2a mit gesteigerter ADCC- bzw. CDC-Aktivit?t, der dann als erster Antik?rper beim Neuroblastom klinisch zum Einsatz kam und erste Erfolge erzielte [Handgretinger et al., 1992]. Bei 4 von insgesamt 9 im Stadium 4 befindlichen Patienten konnten hier Komplettremissionen sowie partielle Remissionen erzielt werden. Allerdings traten im Rahmen der Therapie Polyneuropathien mit starken Schmerzen auf, die mit Morphin behandelt werden mussten. Diese Nebenwirkungen sind auf die Expression von GD2 auf peripheren Nervenenden zur?ckzuf?hren. Dar?ber hinaus traten ?berempfindlichkeitsreaktionen, wie Juckreiz, Exantheme und Urtikaria auf, die durch die Chim?risierung von 14G2a mit den konstanten Regionen der schweren und leichten Kette eines humanen Immunglobulins der Klasse IgG1 [Gillies et al., 1989] weitgehend gelindert werden konnten. Der daraus entstandene chim?re anti-GD2 Antik?rper ch14.18 wurde daraufhin in einer pr?klinischen [Mueller et al., 1990] sowie in einigen klinischen Studien erfolgreich auf seine Wirksamkeit getestet [Handgretinger et al., 1995], [Yu et al., 1998].

Die zytotoxische Aktivit?t von ch14.18 konnte zun?chst durch eine Kombinationstherapie mit GM-CSF [Ozkaynak et al., 2000], sowie in einer weiteren Phase-I-Pilotstudie durch zus?tzliche Gabe von GM-CSF und IL-2 [Gilman et al., 2009] erheblich verbessert werden. Die Kinderonkologin Dr. Alice Yu pr?sentierte im Mai 2009 die Ergebnisse der randomisierten Children`s Oncology Group (COG) ANBL0032 Phase-III-Studie. Das 2-Jahres-Ereignis-freie ?berleben einer Gruppe von Hochrisiko-Neuroblastom Patienten, die nach einer Stammzelltransplantation eine Immuntherapie mit ch14.18 in Kombination mit GM-CSF, IL-2 sowie 13-cis-Retins?ure erhielten wurde mit einer Standardtherapie-Gruppe von Patienten verglichen, die nach der Stammzelltransplantation nur mit 13-cis-Retins?ure weiterbehandelt wurden. 46% der Kinder ohne Immuntherapie und 66% der Kinder mit Immuntherapie zeigten nach zwei Jahren keine Krankheitszeichen. Diese Daten f?hrten zur Aufhebung der Randomisierung, woraufhin alle erkrankten Kinder die Immuntherapie mit ch14.18 erhielten [Yu et al., 2010]. Derzeit wird der Effekt einer adjuvanten Immuntherapie mit ch14.18 in Kombination mit IL-2 und 13-cis-Retins?ure auf die ?berlebenswahrscheinlichkeit von Stadium 4 Neuroblastom-Patienten in einer Phase-III-Studie (HR-NBL-1/ESIOP) in Europa getestet, allerdings ohne den Zusatz von GM-CSF, da dieses im europ?ischem Raum nicht in ausreichender Menge als GMP-Produkt f?r den klinischen Einsatz zur Verf?gung steht. Dar?ber hinaus wird in der Fachwelt gegenw?rtig noch ?ber das tats?chliche therapeutische Potential von GM-CSF diskutiert.

Die zytotoxische Wirkung des chim?ren anti-GD2 Antik?rpers ch14.18 l?sst sich ?ber zwei wesentliche Effektorfunktionen erkl?ren: der antik?rperabh?ngigen zellvermittelten Zytotoxizit?t (ADCC), die vor allem ?ber nat?rliche Killerzellen vermittelt wird und der komplementabh?ngigen Zytotoxizit?t (CDC). Beide Mechanismen f?hren zur Lyse der Tumorzellen. Bindet ch14.18 auf der Oberfl?che von Neuroblastomzellen an GD2, so kann der Fc-Teil des Antik?rpers durch Fc-Rezeptor(CD16)-tragende NK-Zellen erkannt und gebunden werden, was wiederum zu einer Kreuzvernetzung der Rezeptoren und zur Aussch?ttung zytotoxischer Mediatoren aus den NK-Zellen f?hrt. Die komplementvermittelte Lyse der Tumorzellen wird durch die Komplementbindungsstelle am Fc-Teil des ch14.18 ausgel?st. Nach GD2-Bindung kommt es zur Anlagerung des Faktors C1q an den Antik?rper, wodurch die Komplementkaskade eingeleitet und in deren Endphase der zytolytische membrane-attack-complex (C9) gebildet wird [Murphy et al., 2008]. Eine Kombinationstherapie aus ch14.18 und dem immunstimulatorischen Zytokin IL-2 zielt darauf ab, die IL-2-Rezeptor tragenden NK-Zellen zu stimulieren, um den Effekt der antik?rperabh?ngigen zellvermittelten Zytotoxizit?t zu verst?rken.

Da ein Immunglobulin der Klasse G jedoch nur eine Halbwertszeit von circa 21 Tagen [Waldmann et al., 1969], ist f?r die Aufrechterhaltung einer passiven anti-Tumor Immunantwort die wiederholte Applikation von ch14.18 notwendig. Dar?ber hinaus bleibt die Bildung eines B- und T-Zell-Ged?chtnisses aus, welches eine entscheidende Rolle bei der fr?hzeitigen Bek?mpfung eines Rezidivs spielen k?nnte. Diese Nachteile k?nnen jedoch durch die Einf?hrung einer aktiven Immuntherapiestrategie ?berwunden werden.

Aktive Immuntherapie

Das Ziel einer aktiven Immunisierung ist die spezifische Aktivierung des Immunsystems mit Hilfe eines Vakzins, das eine humorale und/oder zellul?re Immunantwort induziert. Beim Neuroblastom existieren bisher verschiedene Ans?tze zur Herstellung eines Vakzins auf der Grundlage des tumorassoziierten Antigens GD2. Eine aktive Immunisierung mit dem Antigen selbst (GD2/KLH-Konjugat) f?hrte nicht zur Induktion der gew?nschten aktiven Immunantwort, denn in der durchgef?hrten Phase-I-Studie konnten keine anti-GD2 Antik?rper detektiert werden, wohingegen aber ein hoher Titer an Antik?rpern gegen das Immunadjuvanz KLH verzeichnet worden ist [Becker et al., 2002]. Eine Erkl?rung daf?r liefern die Arbeiten von Mond et al. Aufgrund seiner Glykolipid-Natur handelt es sich bei GD2 um ein ausgesprochen schwaches Immunogen. Es ist ein T-Zell-unabh?ngiges Antigen, d. h. es wird nicht wie Proteinfragmente durch professionelle antigenpr?sentierende Zellen ?ber klassische MHC-Komplexe pr?sentiert. Die Folge ist eine ineffiziente Immunantwort ohne die Einbeziehung des adaptiven Immunsystems [Mond et al., 1995]. Einzig eine Pr?sentation durch CD1 ist denkbar. Hierbei handelt es sich um MHC-I-?hnliche Molek?le, die auch auf der Oberfl?che von antigenpr?sentierenden Zellen wie dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert werden und Lipidantigene pr?sentieren k?nnen [Zeng et al., 1997]. Eine unikale Subpopulation der T-Lymphozyten reagiert besonders auf diese Art der Antigenpr?sentation, die nat?rlichen Killer-T(NKT)-Zellen. Durch die Produktion von Th1- und Th2-Zytokinen [Joyce, 2001] spielen sie bei der Vermittlung zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eine wichtige Rolle. Die Funktion der NKT-Zellen bei der Tumorabwehr ist allerdings noch nicht eindeutig gekl?rt. Die Untersuchung der zu einer Anti-Tumor-Antwort beitragenden Mechanismen ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Eine ?berlegung stellt dabei die Aktivierung von NK-Zellen durch NKT-Zellen dar [Eberl et al., 2000].

Aktive Immunisierungsstrategien k?nnen also nur realisiert werden, wenn die Glykolipid-Natur des GD2 so ver?ndert wird, dass aus dem schwachen Immunogen ein klassisches Antigen, also ein Protein bzw. Peptid wird, welches f?r die Erkennung durch T-Lymphozyten prozessiert und ?ber MHC-Komplexe pr?sentiert werden kann. Ein Ansatz zur ?berwindung der T-Zell-Unabh?ngigkeit stellt die Herstellung von DNA-Vakzinen dar. Das Prinzip beruht darauf, die DNA-Sequenzen, die f?r das tumorassoziierte Antigen kodieren, in ein geeignetes Expressionssystem zu integrieren, welches dann nach in vivo Applikation zur Synthese des Proteins f?hrt, das anschlie?end einer wirkungsvollen Antigenprozessierung und -pr?sentation zugef?hrt wird. F?r die Entwicklung von DNA-Vakzinen wurden bisher verschiedene wirkungsvolle Ans?tze verfolgt. Eine M?glichkeit besteht in der Verwendung von DNA-Vakzinen, die f?r zyklische, GD2 nachahmende Dekapeptide kodieren [F?rster-Waldl et al., 2005]. Die Wirksamkeit dieser sogenannten GD2-Peptid-Mimotope (von griech. Mimos: Nachahmer, Imitator), die Bildung von anti-GD2-Antik?rpern zu induzieren, wurde in einem geeigneten Maus-Modell gezeigt [Riemer et al., 2006]. Des Weiteren wurden diese GD2-Peptid-Mimotope gut charakterisiert [Fest et al., 2006] und optimiert [Bleeke et al., 2009].

Eine alternative Grundlage f?r die Herstellung von DNA-Vakzinen gegen das Neuroblastom bietet die Generierung eines anti-Idiotyp-Antik?rpers, der an seiner Antigenbindungsstelle ein ?internes Abbild? von GD2 darstellt und daher anstelle des urspr?nglichen Antigens als Vakzin eingesetzt werden kann.

Anti-Idiotyp-Antik?rper

Anti-Idiotyp-Antik?rper (anti-Id-AK) entstehen, wenn im Rahmen einer Immunreaktion gegen ein bestimmtes Fremd-Antigen der gebildete antigenerkennende Antik?rper selbst als Antigen agiert (). Die strukturelle ?hnlichkeit des Antigens GD2 und eines solchen anti-Id-Ak kann therapeutisch genutzt werden, um anstelle des Antigens den anti-Id-Ak als Vakzine zur Induktion einer aktiven Immunantwort einzusetzen. Auf diesem Weg ist es m?glich, die Glykolipid-Natur des GD2 in ein Protein ?umzuwandeln? und durch die Bildung von anti-anti-Idiotyp-Antik?rpern, die in der Lage sind, auch das schwach immunogene GD2 auf den Neuroblastomzellen zu erkennen, eine klinisch relevante anti-Tumor-Immunantwort zu erreichen.

Das therapeutische Potential von anti-Idiotyp-Antik?rpern wurde mittlerweile in einigen pr?klinischen sowie klinischen Studien erforscht. Erste Erfolge erzielten Wissenschaftler durch eine klassische Anti-Idiotyp-Vakzinierung in einem Sarkommodell der Ratte [Dunn et al., 1987]. Die immunisierten Tiere wiesen eine deutlich geringere Anzahl an Lungenmetastasen des anschlie?end intraven?s inokulierten Sarkoms auf. In einem Melanom-Mausmodell konnte eine signifikant bessere ?berlebenswahrscheinlichkeit bei Tieren mit einem bereits etablierten Tumor nach der Applikation eines anti-Idiotyp-Antik?rpers mit Mimikry des Gangliosids GM3 beobachtet werden [Jinnohara et al., 1998]. Weitere Studien mit ?hnlichen Ergebnissen wurden mit tumorassoziierten Antigenen des Nierenzellkarzinoms [Uemura et al., 1994] sowie des Melanoms [Chattopadhyay et al., 1991] erreicht. Der m?gliche Einsatz von Anti-Idiotyp-Antik?rpern bei Patienten mit malignen Erkrankungen wurde dar?ber hinaus in diversen klinischen Studien getestet. So konnte bei Patienten mit malignem Melanom, die mit dem anti-Id-Ak MK2-23, der ein Abbild des HMW-MAA-Melanomantigens darstellt, therapiert worden sind, eine signifikant bessere ?berlebensdauer beobachtet werden [Mittelman et al., 1995].

Auch auf dem Gebiet der Neuroblastomforschung existieren erste Ans?tze zur anti-Idiotyp-Vakzinierung. Eine amerikanische Arbeitsgruppe um Sunil K. Chatterjee entwickelte den anti-Idiotyp-Antik?rper 1A7, der ein internes Abbild des Disialogangliosids GD 2 darstellt [Sen et al., 1998; Zeytin et al., 2000]. Durch eine Immunisierung von M?usen und Kaninchen mit 1A7 konnte eine humorale Immunantwort gegen das urspr?ngliche Antigen GD2 erzeugt werden. In einer Phase-II-Studie wurde der anti-Id-Ak 1A7 unter dem Namen TriGemTM Patienten mit fortgeschrittenem Melanom verabreicht. In 40 der 47 behandelten Erkrankten konnte eine IgG-dominierte Immunantwort nachgewiesen werden [Foon et al., 1998].

Allerdings besteht ein stetiger Bedarf nach weiteren Alternativen. Daher war das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem die Bereitstellung eines alternativen anti-Idiotyp-Antik?rpers zum Antigen GD2, welcher im Vergleich zum bekannten 1A7 eine ver?nderte Bindungsaffinit?t aufweisen sollte.

Diese Aufgabe wird mit einem anti-idiotypischer Antik?rper gem?? Anspruch 1 gel?st. Weitere bevorzugte Ausf?hrungsformen ergeben sich aus den weiteren Anspr?chen.

In anderen Worten wird die Aufgabe mit einem anti-idiotypischen Antik?rper gem?? Anspruch 1 gel?st, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminos?uresequenz der variablen Region der leichten Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variblen Region der schweren Kette zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 3 ist, wobei der Antik?rper als Disialogangliosid-GD2-anti-Idiotyp-Antik?rper wirksam ist.

Identit?t zu mindestens 95% bedeutet, dass eine oder mehrere Aminos?uren entfernt, hinzugef?gt oder ausgetauscht sind unter Beibehaltung der Funktion des Antik?rpers.

Vorzugsweise ist der anti-idiotypischer Antik?rper dadurch gekennzeichnet, dass die Aminos?uresequenz der variablen Region der leichten Kette identisch zur SEQ ID Nr 1 und die der variablen Region der schweren Kette identisch zur SEQ ID Nr 3 ist.

Der anti-idiotypische Antik?rper ist monoklonal, polyklonal oder rekombinant (erzeugt). Vorzugsweise werden rekombinante oder monoklonale Antik?rper genutzt. In einer Ausf?hrungsform ist der Antik?rper daher rekombinant. In einer anderen Ausf?hrungsform ist der Antikp?rper monoklonal.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls eine Hybridomzelllinie, die einen antiidiotypischen Antik?rper wie vorangehend beschrieben erzeugt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Polynucleotid, umfassend Nucleotidsequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die f?r den oben beschriebenen anti-idiotypischen Antik?rper kodieren.

Identit?t zu mindestens 95% bedeutet hier, dass ein oder mehrere Nucleotide entfernt, hinzugef?gt oder ausgetauscht unter Beibehaltung der Funktion des resultierenden Antik?rpers.

Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid Nucleotidsequenzen, welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind und die f?r den anti-idiotypischen Antik?rper kodieren.

Dass das Polynucleotid die Nucleotidsequenzen welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind, bzw. welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind, umfasst, bedeutet, dass auch l?ngere Polynucleotide mit umfasst sind, welche die entsprechenden Sequenzen lediglich als einen Bestandteil enthalten. Dies betrifft insbesondere Fusionsgene, beispielsweise Fusionsgene mit den Nucleotidsequenzen gem?? SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 (bzw. Sequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zu SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind) mit einem Zytokin, beispielsweise GMCSF. Deartige Konstrukte sind explizit mit umfasst. Lediglich in einer eingeschr?nkten Ausf?hrungsform besteht das erfindungsgem??e Polynucleotid aus Nucleotidsequenzen, welche identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 sind bzw. aus Nucleotidsequenzen, welche zu mindestens 95% identisch zur SEQ ID Nr 2 und SEQ ID Nr 4 und die f?r den antiidiotypischen Antik?rper kodieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenso eine pharmazeutische Zubereitung, die eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antik?rpers oder Polynucleotids wie oben dargestellt enth?lt. Ebenso umfasst ist ein Impfstoff, enthaltend eine wirksame Menge des anti-idiotypischen Antik?rpers oder Polynucleotids. Der Impfstoff enth?lt in einer bevorzugten Ausf?hrungsform mindestens ein Adjuvanz.

Der anti-idiotypische Antik?rper oder das Polynucleotid wird erfindungsgem?? zur Ausl?sung einer Immunantwort in einem Individuum verwendet. Vorzugsweise wird er zur Ausl?sung einer gegen das Antigen Disialogangliosid GD2 gerichteten Immunantwort in einem Individuum eingesetzt.

In einer besonders bevorzugten Ausf?hrungsform wird der anti-idiotypische Antik?rper oder das Polynucleotid zur Behandlung oder Pr?vention (Impfung) einer mit GD2-Expression assoziierten Erkrankung verwendet. Die mit GD2 assoziierte Erkrankung ist vorzugsweise ein neuroektodermaler Turmor, welcher GD2 exprimiert. Der neuroektodermale Turmor ist vorzugsweise ausgew?hlt aus Melanom, Neuroblastom, Sarkom (Ewingsarkom, Osteosarkom), kleinzelligem Lungenkarzinom und Glioblastom. H?chst bevorzugt handelt es sich um Neuroblastome. In anderen Worten stellt der erfindungsgem??e anti-idiotypische Antik?rper oder das Polynucleotid einen Krebsimpfstoff dar, d. h. er kann zur aktiven Immunisierung gegen neuroektodermale Tumore genutzt werden.

Ein weiteres erfindungsgem??es Einsatzgebiet ist ein Verfahren zur Detektion einer gegen GD2 gerichteten Immunantwort, umfassend das in Kontaktbringen einer biologischen Probe des Probanden in vitro mit dem anti-idiotypischen Antik?rper und Bestimmen, ob eine gegen GD2 gerichtete Immunantwort auftritt.

Eine weitere bevorzugte Ausf?hrungsform ist ein Verfahren zur Detektion bzw. quantitativen Bestimmung der Konzentration eines anti-GD2-Antik?rpers sowie dessen Derivate (anti-GD2-Antik?rper-Konjugate (Toxinen oder Radionuklide), Antik?rper-Fusionsproteine (Immunzytokine, Immuntoxine), single-chain Varianten) in Proben von K?rperfl?ssigkeit eines Probanden, welchen diese anti-GD2-Antik?rper oder dessen Derivate verabreicht wird/werden, wobei die K?rperfl?ssigkeitsprobe in vitro mit dem anti-idiotypischen Antik?rper in Kontakt gebracht wird und dass Ausma? der Reaktion quantitativ bestimmt wird. Bei der K?rperfl?ssigkeit handelt es sich vorzugsweise um Blutserum.

Eine weitere Ausf?hrungsform ist ein Verfahren zur Detektion von Zellen, die genetisch manipuliert wurden, um rekombinante Derivate eines anti-GD2-Antik?rpers zu exprimieren. Bei diesen Zellen handelt es sich vorzugsweise um NK-Zellen (Esser 2011) oder T-Zellen (Pule 2008), die einen chim?ren Antigen-Rezeptor tragen (z.B. NK-92-scFv(ch14.18)-zeta). Zellhaltige Proben werden mit dem anti-idiotypischen Antik?rper in Kontakt gebracht und dass Ausma? der Reaktion wird quantitativ bestimmt.

Nachfolgend wird die Erfindung im Detail erl?utert:

Anti-Idiotyp-Antik?rper Ganglidiomab

Es wurde das Konzept des GD2-anti-Idiotyp-Antik?rpers 1A7 aufgegriffen, um einen neuen, frei verf?gbaren anti-Idiotyp-Antik?rper zu generieren und die Arbeit auf dem Gebiet der neuroektodermalen Tumore wie dem Neuroblastom voranzutreiben.

Es wurde ein neuer muriner GD2-anti-Idiotyp-Antik?rper mittels klassischer Hybridomtechnik erstellt (Zusammenarbeit mit der Firma BioGenes GmbH, Berlin) [K?hler et al., 1975].

BALB/c-M?use wurden nach einem festgelegten Immunisierungsprotokoll ?ber 39 Tage mit dem murinen anti-GD2 Antik?rper 14G2a in Kombination mit komplettem oder inkomplettem Freudschen Adjuvans immunisiert (). Aus den Milzen der M?use wurde durch die Fusion mit der Myelomzelllinie SP2/0 Hybridomzellen generiert, die nun in der Lage sind, Antik?rper zu produzieren. Diese Klone wurden selektiert sowie nach der Methode der limitierenden Verd?nnung vereinzelt und expandiert. Der Subklon, der nach diesen Selektions- und Klonierungsphasen stabil Antik?rper gegen den anti-GD2-Antik?rper 14G2a produzierte, wurde ausgew?hlt und als anti-14G2a Klon 17-9 benannt. Die Bestimmung des Antik?rper-Isotyps ergab, dass es sich bei dem durch die Hybridomzellen 17-9 produzierten Antik?rper um ein Immunglobulin der Klasse IgG1 mit zwei ? leichten Ketten handelt. Dieser Antik?rper, d. h. der erfindungsgem??e anti-idiotypische Antik?rper, erhielt den Namen Ganglidiomab.

Der mittels Hybridomtechnik neu gewonnene anti-Idiotyp-Antik?rper Ganglidiomab wird sowohl als Protein als auch als Grundlage f?r die Herstellung von DNA-Vakzinen eingesetzt, um eine aktive anti-Tumor-Immunantwort gegen neuroektodermale Tumore, z.B. das Neuroblastom, zu erreichen. Um dieses Ziel zu verfolgen wurde Ganglidiomab auf DNA- und Protein-Ebene untersucht und charakterisiert. Es wurde mit Hilfe der Bindungseigenschaften des anti-GD2-Antik?rpers ch14.18 gezeigt, dass es sich bei Ganglidiomab tats?chlich um einen anti-Idiotyp-Antik?rper handelt. Weiterhin wurden die DNA-Sequenzen identifiziert, die f?r die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des Antik?rpers kodieren. Auf der Basis dieser Sequenzen, kann die Entwicklung von DNA-Impfstoffen zuk?nftig realisiert werden. Ferner ist mit dieser Sequenzinformation die Herstellung von rekombinanten Varianten von Ganglidiomab m?glich. Weiterhin wurde zur rekombinanten Herstellung von Ganglidiomab ein geeignetes Expressionssystem erzeugt. Die Expressionsvektoren pFUSE-CHIg-mG1 sowie pFUSE2-CLIg-mk sind eigens f?r die Antik?rper-Generierung konzipiert worden. pFUSE-CHIg-mG1 kodiert dabei f?r die konstanten Regionen der schweren Kette eines Antik?rpers der Klasse IgG1. Auf dem Vektor pFUSE2-CLIg-mk hingegen ist die DNA-Sequenz integriert, die f?r die konstante Region der ? leichten Kette kodiert. Durch die Klonierung der variablen Regionen in diese Vektoren und eine Co-Transfektion in CHO-Zellen ist es m?glich, ein vollst?ndiges Immunglobulin zu exprimieren. Auf diesem Weg soll festgestellt werden, dass der durch die CHO-Zellen produzierte und sezernierte Antik?rper an seinem Paratop ein ?internes Abbild? von GD2 darstellt und durch einen anti-GD2-Antik?rper gebunden werden kann. Durch den Nachweis dieses Prinzips k?nnen die identifizierten Sequenzen der variablen Regionen von Ganglidiomab f?r die Herstellung von DNA-Vakzinen genutzt werden, um eine aktive Immunantwort gegen das schwach immunogene GD2 zu erzeugen.

BeispieleMethodenKultivierung von Suspensionszelllinien

Zur Gewinnung der RNA als Ausgangsmaterial f?r alle folgenden molekularbiologischen und immunologischen Arbeiten, wurden die Hybridomzelllinie anti-14G2A Klon 17-9 sowie transduzierte NK-92-Zellen (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta) kultiviert.

Die Hybridomzellen und die NK-92-Zellen wurden ebenfalls in einer 75 cm2 Zellkulturflasche in jeweils 15 ml des entsprechenden Mediums, sowie folgenden Zus?tzen kultiviert:

Anti-14G2a-Klon 17-9 NK-92-scFv8ch14.18)-zeta(X-VIVO)DMEM X-VIVO 10FCS (inakt.)10% Humanserum 5%Penicillin/Streptomycin1% IL-2 100 U/mlMEM NEAA1 x G-418 0,6 mg/ml?-ME50 ?M

Auch diese Zelllinien wurden regelm??ig unter einem inversen Mikroskop betrachtet. Je nach Zellwachstum wurde alle 2?3 Tage ein Mediumwechsel durchgef?hrt oder die Zellen passagiert. Bei einem Mediumaustausch sowie beim Splitten der Zellen wurde das gesamte Medium mit den Zellen aus der Flasche abgenommen und in einem 50 ml Falcon R?hrchen gesammelt. Die Zellsuspension wurde anschlie?end zentrifugiert (5 min, 300 x g, RT) und das Zellpellet in frischem Kulturmedium resuspendiert. Bei einem Mediumwechsel wurde die gesamte Zellsuspension wieder in die Zellkulturflasche ?bertragen. Um die Zellen jedoch zu passagieren, wurden sie entsprechend ihres Wachstums gesplittet.

Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen

Bei der Kryokonservierung werden Zellen in einem geeigneten Einfriermedium (90% Humanalbumin und 10% DMSO) eingefroren und in fl?ssigem Stickstoff bei ?196?C gelagert. Zur Rekultivierung wurden die Zellen in einem 37?C warmen Wasserbad aufgetaut und in entsprechendem Kulturmedium gewaschen und resuspendiert und die Zellsuspension in eine Zellkulturflasche ?berf?hrt.

Immunologische MethodenDurchflusszytometrische Untersuchung der anti-Idiotyp-Eigenschaften

Im ersten Schritt wurden die anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab durchflusszytometrisch untersucht. Dabei kamen humane NK-92-Zellen zur Anwendung, die genetisch modifiziert wurden, sodass sie einen GD2-spezifischen chim?ren Antigenrezeptor auf ihrer Oberfl?che exprimieren. Dieser Rezeptor ist ein Fusionsprotein aus einem Einzelketten-variablen Fragment (single chain variable fragment, scFv) des chim?ren anti-GD2-Antik?rpers ch14.18 mit der zeta-Kette des CD3-Komplexes als signaltransduzierender Dom?ne (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta) [Esser et al., 2011] ().

Existiert ein molekulares Mimikry zwischen Ganglidiomab und dem Disialogangliosid GD2, kann er durch den Rezeptor der NK-92-Zellen gebunden und detektiert werden.

In der Messung wurde dabei die Bindung durch die NK-92-Zellen mit drei verschiedenen Konzentrationen von Ganglidiomab im Kultur?berstand getestet (1 ?g, 0,5 ?g und 0,25 ?g). Als Positivkontrolle wurde der bereits charakterisierte GD2-anti-Idiotyp-Antik?rper 1A7 in den Konzentrationen 1 ?g, 0,5 ?g und 0,25 ?g eingesetzt. Ein Isotyp-Antik?rper der Klasse IgG1 kam als Negativkontrolle zum Einsatz. Alle verwendeten Antik?rper wurden in FACS-Puffer (1% BSA, 0,1% EDTA, 0,1% NaN3 in 1 ? PBS) verd?nnt. F?r die Messung wurden pro Ansatz 1 ? 106 transduzierte NK-92-Zellen zentrifugiert (7 min, 2300 rpm, RT), in je 100 ?l Antik?rperl?sung (Ganglidiomab, 1A7, Isotyp-Kontrolle) resuspendiert (15 min, 4?C, lichtgesch?tzt). Im Anschluss wurde 1 ml FACS-Puffer auf die Zellen gegeben, zentrifugiert (7 min, 2300 rpm, RT) und das Zellpellet in je 100 ?l einer 1:200 Verd?nnung des PE-gekoppelten Sekund?rantik?rpers (PE-rat-anti-mouse IgG1) resuspendiert (15 min, 4?C, lichtgesch?tzt). In einem letzten Waschschritt mit 1 ml FACS-Puffer wurde ungebundener Sekund?rantik?rper entfernt, um unspezifische Signale zu vermeiden. Die Zellen wurden zentrifugiert (7 min, 2300 rpm, RT), in 500 ?l FACS-Puffer aufgenommen und die Suspension anschlie?end in ein 5 ml Rundbodenr?hrchen ?berf?hrt. Durch die Zugabe des DNA-Farbstoffes 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), der spezifisch zwischen die Basen Cytosin und Guanin interkaliert, konnte der Anteil lebender Zellen ermittelt werden. Die Messung erfolgte mit dem BD FACS CantoTM II.

Enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay (ELISA)

Der ELISA ist eine sensitive immunologische Methode zum quantitativen Nachweis bestimmter Antigene oder Antik?rper in einer L?sung auf der Grundlage einer klassischen Antigen-Antik?rper-Reaktion. Bei einem kompetitiven ELISA konkurrieren entweder enzymmarkiertes und unmarkiertes Antigen miteinander um die Bindung an einen beschichteten Antik?rper (direkter kompetitiver ELISA) oder ein gebundenes Antigen konkurriert mit dem immobilisierten Antigen um die freien Bindungsstellen der Antik?rper (indirekter kompetitiver ELISA).

Indirekter kompetitiver ELISA

Die anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab wurden mit Hilfe eines indirekten kompetitiven ELISA untersucht. Dabei wurde eine 96-well Polysorb Mikrotiterplatte mit dem GD2-Antigen (50 ng/well in ? 99,9% Methanol) beschichtet (1 h bei 50?C) und dann die freien, ungebundenen Stellen der Platte durch 100 ?l/well eines Blockierungspuffers (1% BSA in 1 ? PBS) ges?ttigt (?ber Nacht bei 4?C). Anschlie?end wurde die Platte 3 ? mit 200 ?l/well Waschpuffer (0,1% BSA in PBS) gewaschen und verschiedene Verd?nnungen des Kultur?berstandes der Hybridomzellkultur 17-9 (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 0) zusammen mit einer definierten Menge an anti-GD2-Antik?rper ch14.18 (500 ng/ml) auf die Platte gegeben (2 h bei 37?C).

Handelt es sich bei Ganglidiomab tats?chlich um einen anti-Idiotyp-Antik?rper, der eine strukturelle ?hnlichkeit mit GD2 aufweist, so kommt es zwischen Ganglidiomab und dem gebundenen GD2 zu einer Kompetition um die freien Antigenbindungsstellen von ch14.18. Demzufolge findet eine Inhibition der spezifischen Bindung von ch14.18 an das gebundene GD2 statt ().

Je mehr Ganglidiomab dabei im Kultur?berstand vorhanden ist, desto mehr ch14.18 wird durch Ganglidiomab abgefangen. Somit ist weniger ch14.18 f?r die Bindung an das beschichtete GD2 verf?gbar. Zur Detektion des an GD2 gebundenen ch14.18 wurde ein enzymgekoppelter Sekund?rantik?rper (goat-anti-human-IgG(Fc)-HRP, 1:20000, 1 h bei 37?C) verwendet,. Die Messung der Reaktion erfolgte mittels einer TMB-L?sung (75 ?l/well). Hierbei handelt es sich um ein chromogenes Substrat, welches durch die an den Sekund?rantik?rper gekoppelte Meerrettich-Peroxidase (HRP) in einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Wasserstoffperoxid dient als Substrat f?r die gebundene Peroxidase. Die beim Abbau entstehenden Sauerstoffradikale f?hren zur Oxidation des chromogenen Substrates TMB, was sich durch die Bildung eines blauen Farbstoffes zeigt. Zusammensetzung der TMB-L?sung (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin), 50 ml:

TMB 0,005 gDMSO 500 ?l TMB in DMSO l?sen+ 49,5 ml Natriumacetat (0,1 M)L?sung filtrieren

10 ml TMB-L?sung wurden mit 3,34 ?l H2O2 versetzt, sofort auf die Platte pipettiert und 30 min im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde anschlie?end mit 50 ?l/well H2SO4 (2 N L?sung) gestoppt, wobei ein stabiler gelber Farbkomplex entstand. Abschlie?end konnte die Absorption bei einer Wellenl?nge von 450 nm im ELISA-Reader der Firma BioTek gemessen werden.

Molekularbiologische Methoden

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen erfolgte mittels RNeasy? Mini Kit (siehe Standardprotokoll des Herstellers). Die Bestimmung der Nukleins?ure-Konzentration wurde photometrisch durch Absorption bei einer Wellenl?nge von 260 nm bestimmt. Reverse Tramskription der RNA in komplement?re einzelstr?ngige DNA (cDNA) erfolgte mit dem SuperScript? II Reverse Transcriptase Kit (siehe Standardprotokoll des Herstellers).

Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab:
Alle Primer f?r die Durchf?hrung der Polymerasekettenreaktionen der vorliegenden Arbeit wurden durch die Firma Eurofins MWG Operon in Ebersberg synthetisiert.

F?r die Amplifikation der zu bestimmenden DNA-Sequenzen, die f?r die variable Region der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab kodieren, wurden in verschiedenen Ans?tzen, hoch degenerierte 5' Primer verwendet, die an konservierte Strukturen im ersten Framework der variablen Region von leichter und schwerer Kette eines Antik?rpers binden [Wang et al., 2000], (Tab. 1) oder an der Leader-Sequenz vor Beginn der variablen Regionen (Tab. 2) laut Protokoll: ?Cloning and expression of immunoglobulin variable regions using PCR with redunant primers? in ?Current Protocols in Immunology? [Coligan et al., 2002]. Bei degenerierten Primern handelt es sich um ein Gemisch aus Oligonukleotiden mit unterschiedlichen Basen an den sogenannten Wobblepositionen eines Tripletts. Jeder dieser Primer besitzt also eine andere Sequenz, wodurch die Synthese der einzigartigen DNA-Sequenzen der variablen Regionen von Ganglidiomab erm?glicht wird. Die eingesetzten isotypspezifischen 3' Primer binden jeweils an die erste konstante Region der IgG1 schweren Kette bzw. der ? leichten Kette.

Mit Hilfe einer Gradienten-PCR, bei der ausgehend von einer mittleren Temperatur ein Gradient von ? 10?C gew?hlt wurde, konnte die optimale Annealing-Temperatur f?r die Primer ermittelt werden. Die PCR-Produkte wurden anschlie?end in einem Agarosegel aufgetrennt. Das Primergemisch, bei dem ein DNA-Fragment entstanden ist, wurde im n?chsten Schritt zur Amplifikation der variablen Regionen eingesetzt. Tab. 1: Primersequenzen zur Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab (1.Polymerasekettenreaktion)

Der Reaktionsansatz f?r die PCR zur Amplifikation der DNA-Sequenzen, die f?r die variable Region der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab kodiert, ist im Folgenden aufgef?hrt. Der gebrauchsfertige Red Taq 1,1 ? Master Mix enth?lt unter anderem 0,11 U/?l der Taq DNA Polymerase sowie 0,22 mM dNTPs. Reaktionsansatz 1. Polymerasekettenreaktion (20 ?l):

Schwere Kette: 1x Red Taq 1,1 ? Master Mix (1,5 mM MgCl2)1 ?l 10 pmol/?l Primerforward MH11 ?l 10 pmol/?l Primerreverse IgG10,5 ?l cDNA?-leichte Kette: 1x Red Taq 1,1 ? Master Mix (1,5 mM MgCl2)1 ?l 10 pmol/?l Primerforward Mk1 ?l 10 pmol/?l Primerreverse Kc0,5 ?l cDNA
Temperaturprofil der 1. Polymerasekettenreaktion:Tab. 2: Primersequenzen zur Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab (2. Polymerasekettenreaktion)

Die Primer beinhalten Restriktionsschnittstellen f?r NheI (GCT AGC), EcoRI (GAA TTC), XhoI (CTC GAG) und BstAPI (GCA NNNNN TGC) (unterstrichen) sowie die Ribosomenbindungsstelle (Kozak-Sequenz) (fett gedruckt). Reaktionsansatz 2. Polymerasekettenreaktion (20 ?l):

Schwere Kette:17,5 ?l Red Taq 1,1 ? Master Mix (2,0 mM MgCl2)1 ?l 10 pmol/?l Primerforward MHALT3.RV1 ?l 10 pmol/?l Primerreverse RPHJ0,5 ?l cDNA?-leichte Kette:17,5 ?l Red Taq1,1 ? Master Mix (2,0 mM MgCl2)1 ?l10pmol/?l Primerforward MLALT5.RV1 ?l10pmol/?l Primerreverse RPLJ0,5 ?lcDNA
Temperaturprofil der 2. Polymerasekettenreaktion:

Um die Reinheit der PCR-Produkte zu gew?hrleisten, wurden sie mit Hilfe eines Agarosegels aufgetrennt und anschlie?end aus diesem Gel aufgereinigt.

DNA-Extraktion aus Agarosegelen

Die Aufreinigung der aufgetragenen PCR-Prdoukte aus dem Agarosegel erfolgte mit dem Nucleo Spin? Extract II Kit nach dem Standardprotokoll des Herstellers.

TA-Klonierung der PCR-Produkte in den pCR?2.1-TOPO Vektor

Um die DNA-Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab mittels Sequenzierung zu identifizieren, wurden die PCR-Produkte in den pCR?2.1-TOPO Vektor (Vektorkarte in ) kloniert und anschlie?end in elektrokompetente E. coli-Bakterien transformiert. F?r die Klonierung wurde das TOPO TA cloning? Kit verwendet (siehe Standardprotokoll des Herstellers).

Zun?chst wurde die im Kit enthaltene Salzl?sung (1,2 M NaCl; 0,06 M MgCL2) 1:4 mit A. dest. verd?nnt. Mit folgendem Reaktionsansatz wurden die PCR-Produkte in den pCR?2.1-TOPO Vektor ligiert: Reaktionsansatz:

Schwere Kette: 2 ?l PCR-Produkt: variable Region der schweren Kette (SK)1 ?l Salzl?sung 2 ?l A. dest.10 ng pCR?2.1-TOPO Vektor?-leichte Kette: 2 ?l PCR-Produkt: variable Region der leichten Kette (LK)1 ?l Salzl?sung 2 ?l A. dest.10 ng pCR?2.1-TOPO Vektor

Der Ansatz wurde vorsichtig gemischt, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschlie?end auf Eis abgek?hlt.

Transformation von One Shot? TOP10 elektrokompetenten Bakterien

Unter einer Transformation versteht man die Aufnahme von frei vorliegender DNA in kompetente Bakterienzellen. Bei den im TOPO TA cloning? Kit vorhandenen One Shot? Top10 Bakterien handelt es sich um einen elektrokompetenten E.coli-Stamm (siehe Herstellerbeschreibung) mit folgendem Genotyp:
F?r die Transformation wurden zwei R?hrchen ? 50 ?l One Shot? TOP10 elektrokompetente E.coli langsam auf Eis aufgetaut und mit 2 ?l des jeweiligen Reaktionsansatzes vorsichtig vermischt. Der gesamte Ansatz wurde anschlie?end in eine auf Eis vorgek?hlte Elektroporationsk?vette (2 mm Spaltbreite) ?berf?hrt, in den Multiporator eingesetzt und der Impuls mit folgenden Ger?teeinstellungen gestartet:

Spannung U: 2500 VZeitkonstante(?): 5 msAnzahl der Pulse(n): 1

Sofort nach dem Impuls wurden die Bakterien in der K?vette mit 350 ?l auf 37?C vorgew?rmten S.O.C. Medium versetzt, in ein 1,5 ml R?hrchen ?berf?hrt und eine Stunde bei 37?C sch?ttelnd (600 rpm) inkubiert, um die Antibiotika-Resistenz aufzubauen. 50 ?l der Zellsuspensionen wurden auf selektiven LB-Agar-Platten (50 ?g/ml Ampicillin), die zuvor mit 40 ?l X-Gal (40 mg/ml in DMF) beschichtet worden sind, ausplattiert und ?ber Nacht bei 37?C inkubiert. Zusammensetzung LB (Luira/Miller)-Agarplatten:

Trypton 10 g/lHefeextrakt 5 g/lNatriumchlorid 10 g/lAgar 15 g/lpH-Wert 7,0 ? 0,2

Herstellung:

  • 40 g Trockenmedium in 1 l A. dest.
  • 15 min bei 121?C autoklavieren

Mini-Plasmidpr?paration

F?r eine Mini-Plasmidpr?paration wurden die auf den selektiven Agarplatten gewachsenen Einzelkolonien gepickt und in 3 ml LB-Medium mit 50 ?g/ml Ampicillin ?ber Nacht im Sch?ttelinkubator bei 37?C und 160 rpm inkubiert. Zusammensetzung LB (Luria/Miller)-Medium:

Trypton 10 g/lHefeextrakt 5 g/lNatriumchlorid 10 g/lpH-Wert 7,0 ? 0,2

Herstellung:

  • 25 g Trockenmedium in 1 l A. dest.
  • 15 min bei 121?C autoklavieren

Die Isolation der Plasmide erfolgte am n?chsten Tag mit Hilfe des QIAprep? Spin Miniprep Kits nach dem Standardprotokoll des Herstellers.

Restriktionsanalyse

Durch eine Restriktionsanalyse wurde anhand der Gr??e des PCR-Produktes eine erfolgreiche Ligation des Inserts ?berpr?ft. Im pCR?2.1-TOPO Plasmid befinden sich vor und nach der MCS die Erkennungssequenzen f?r die Restriktionsendonuklease EcoRI. Um eine erfolgreiche Insertion der DNA-Sequenzen, die f?r die variable Region der schweren und ?-leichten Kette kodieren, zu ?berpr?fen, wurden die Plasmide mit EcoRI in dem vom Hersteller empfohlenen dazugeh?rigen Puffer geschnitten. Die Auswertung erfolgte anschlie?end durch die elektrophoretische Auftrennung der entstandenen Banden in einem Agarosegel (2%). Reaktionsansatz Restriktionsanalyse (20 ?l):

Schwere Kette(SK): 1 ?g pC?R2.1-TOPO Vektor-SK2 ?l 10 ? NEB Puffer EcoRI 2 U EcoRIad 20 ?l A. dest.?-leichte Kette(LK): 1 ?g pC?R2.1-TOPO Vektor-LK2 ?l 10 ? NEB Puffer EcoRI2 U EcoRIad 20 ?l A. dest.

Sequenzierung der Plasmide erfolgte durch die Firma LGC Genomics. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit Hilfe der 5. Auflage der KABAT Datenbank ?Sequences of Proteins of Immunological Interest? [Kabat et al., 1991].

Herstellung der Expressionssysteme

Durch eine Ligation der variablen Regionen in die Vektoren pFUSE-CHIg-mG1 und pFUSE2-CLIg-mk wurde das Expressionssystem f?r die nachfolgende Transfektion in CHO-Zellen hergestellt (Vektorkarten pFUSE-CHIg-mG1 und pFUSE2-CLIg-mk siehe Produktbeschreibung des Herstellers). Restriktionsansatz pFUSE-CHIg-mG1 und pCR?2.1-TOPO Vektor-SK:

KomponentepFUSE-CHIg-mG1pCR?2.1-TOPO Vektor-SKMenge Vektor3 ?g5 ?g10 ? NEB-Puffer 43 ?l5 ?lBSA100 ?g/ml100 ?g/mlEcoRI4 U4 U NheI4 U4 UA. dest.dd 30 ?ldd 50 ?l

Die Ans?tze wurden 2 h bei 37?C inkubiert und die Restriktionsenzyme anschlie?end 20 min bei 65?C hitzeinaktivert. Um die Religation des Expressionsvektors zu vermeiden, wurden die 5'-Phosphatreste durch die Zugabe einer alkalischen Phosphatase (0,5 U/?g Vektor- DNA) 1 h bei 37?C entfernt. Restriktionsansatz pFUSE2-CLIg-mk und pCR?2.1-TOPO Vektor-LK:

KomponentepFUSE2-CLIg-mkpCR?2.1-TOPO Vektor-LKMenge Vektor3 ?g5 ?g10 ? NEB-Puffer 43 ?l5 ?lBSA100 ?g/ml100 ?g/mlXhoI4 U4 UBstAPI4 U4 UA. dest.dd 30 ?ldd 50 ?l

Die Ans?tze wurden zun?chst 2 h bei 37?C (XhoI) und anschlie?end 2 h bei 60?C (BstAPI) inkubiert, hitzeinaktivert und die 5'-Phosphatreste durch das Enzym alkalische Phosphatase (s. o.) entfernt. Die geschnittenen Produkte wurden anschlie?end mittels Agarosegelelektrophorese aufgereinigt und ligiert.

F?r die Ligation wurde der Expressionsvektor mit der entsprechenden variablen Region in verschiedenen molaren Verh?ltnissen von 1:1, 1:3 und 1:9 in einem Ligationspuffer gemischt und durch die Zugabe der T4 DNA-Ligase ligiert. Mit folgender Formel konnte die Menge des einzusetzenden Inserts ausgehend von 50 ng Vektor berechnet werden. ng Insert = ng Vektor ? kb Insertkb Vektor ? RatioInsertVektorLigationsansatz EcoRI/NheI-CIP-pFUSE-CHIg-mG1 + EcoRI/NheI-SK (21 ?l):

50 ng EcoRI/NheI-CIP-pFUSE-CHIg-mG115 ng EcoRI/NheI-SKad 10 ?l A. dest.10 ?l 2 ? Quick Ligation Reaction Puffer1 ?l Quick T4 DNA-Ligase
Ligationsansatz XhoI/BstAPI-CIP-pFUSE2-CLIg-mk + XhoI/BstAPI-SK (21 ?l):50 ng XhoI/BstAPI-CIP-pFUSE2-CLIg-mk15 ng XhoI/BstAPI-SKad 10 ?l A. dest.10 ?l 2 ? Quick Ligation Reaction Puffer1 ?l Quick T4 DNA-Ligase

Die Ligationsans?tze wurden 1 h lang bei RT inkubiert. Anschlie?end erfolgte die Transformation in chemisch kompetente E.coli JM109 mit folgendem Genotyp:
endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17, (rk-, mk-), relA1, supE44, (lac-proAB), [?, traD36, proAB, laqI q Z M15]

Hierzu wurden 50 ?l der Bakterien mit 10 ?l Ligationsansatz vorsichtig vermischt und 20 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss erfolgte 60 s lang ein Hitzeschock bei 42?C in einem nicht sprudelnden Wasserbad. Die Bakterien wurden dann 2 min auf Eis abgek?hlt und mit 300 ml S.O.C. Medium versetzt. Nach einer einst?ndigen Inkubation bei 37?C und 650 rpm wurden die Bakterien auf selektiven LB-Agarplatten mit 50 ?g/ml Zeocin f?r erfolgreich transformierte Bakterien mit pFUSE-CHIg-mG1-SK bzw. 100 ?g/ml Blasticidin f?r die mit pFUSE2-CLIg-mk-LK transformierten Bakterien ausplattiert.

Am darauf folgenden Tag wurden Kolonien gepickt und mittels einer Kolonie-PCR auf eine erfolgreiche Ligation des entsprechenden Inserts ?berpr?ft. Daf?r wurde etwa die H?lfte der Bakterienkolonie in 50 ?l steriles A. dest. ?berf?hrt, f?r 2 min auf 96?C erhitzt und zentrifugiert. Der ?berstand konnte dann als Template f?r die folgende PCR eingesetzt werden. Als Positivkontrolle wurde an Stelle des ?berstandes die cDNA eingesetzt, die als Template zur Synthese und Amplifikation der variablen Regionen eingesetzt wurde. Reaktionsansatz Kolonie-PCR pFUSE-CHIg-mG1-SK (50 ?l):

17,5 ?l Red Taq 1,1 ? Master Mix (2,0 mM MgCl2)1 ?l 10 pmol/?l PrimerforwardMHALT3.RV1 ?l 10 pmol/?l Primerreverse RPHJ30,5 ?l Template
Reaktionsansatz Kolonie-PCR pFUSE2-CLIg-mk-LK (50 ?l):17,5 ?l Red Taq 1,1 ? Master Mix (2,0 mM MgCl2)1 ?l 10 pmol/?l PrimerforwardMLALT5.RV1 ?l 10 pmol/?l PrimerreverseRPLJ30,5 ?l Template
Temperaturprofil der Kolonoie ? PCR:

Mittels Agarose-Gelelektrophorese wurden die PCR-Produkte anschlie?end aufgetrennt, um sie auf die erfolgreiche Insertion der variablen Regionen zu analysieren. Das restliche Material von 5 positiven Kolonien wurde erneut gepickt und in 3 ml LB-Medium mit 50 ?g/ml Zeocin bzw. 100 ?g/ml Blasticidin ?ber Nacht im Sch?ttelinkubator bei 37?C und 160 rpm vermehrt. Am darauffolgenden Tag konnten die Plasmide isoliert und durch einen Restriktionsverdau zus?tzlich auf das Vorhandensein des Inserts ?berpr?ft werden.

Proteinanalytische Methoden Herstellung von Zelllysaten

F?r die Durchf?hrung proteinanalytischer Untersuchungen mussten zun?chst die Zellproteine gewonnen werden. Daf?r wurden 1 ? 106 anti-14G2A Hybridomzellen 17-9 mit PBS gewaschen und in 300 ?l Lysispuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, 0,02% NaN3) der mit 1 ?l eines Protease-Inhibitor-Cocktails versetzt war, 30 min auf Eis lysiert. Der Protease-Inhibitor-Cocktail setzt sich aus den Inhibitoren 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid (AEBSF), Pepstatin A, E-64, Bestatin, Leupetin und Aprotinin zusammen und wird zur Inaktivierung von Serin-, Cystein-, Aspartatproteasen sowie Aminopeptidasen eingesetzt, damit der Abbau der Proteine verhindert wird.

Im Anschluss an die Zelllyse wurde das Lysat zentrifugiert (15 min, 10000 ? g, 4?C). Der proteinhaltige ?berstand wurde vorsichtig abgenommen, die Proteinkonzentration nach Bradford gemessen und bis zur weiteren Analyse bei ?20?C gelagert.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blot

F?r den Nachweis von Ganglidiomab im Zelllysat und Kultur?berstand wurde ein 8% Trenngel sowie ein 4% Sammelgel verwendet (Tab. 3). Eine definierte Menge des Proteins (20 ?g bzw. 40 ?g) wurden in einem Verh?ltnis von 1:2 mit Laemmli-Probenpuffer versetzt. F?r reduzierende Bedingungen mit ?-Mercaptoethanol wurden 950 ?l Laemmli-Probenpuffer mit 50 ?l ?-Mercaptoethanol versetzt und ebenfalls im Verh?ltnis 1:2 mit der Probe vermischt. Diese Ans?tze wurden anschlie?end 5 min bei 95?C erhitzt, um die Proteine vollst?ndig zu denaturieren. Das polymerisierte SDS-PAGE-Gel wurde anschlie?end vertikal in die Elektrophoresekammer eingespannt. Der Tank wurde mit 1 ? Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,3) vollst?ndig gef?llt, der Kamm entfernt und die Proben in die Taschen pipettiert. Als Gr??enstandard wurde der Precision Plus ProteinTM WesternCTM Standard mitgef?hrt. F?r die Konzentrierung der Proben im Sammelgel wurde f?r die ersten 20 min ein elektrisches Feld mit einer Spannung von 80 V angelegt. Mit dem Eintritt in das Trenngel wurde diese auf 110 V erh?ht. Nach ca. 1,5 h wurde die Gelelektrophorese beendet. Tab. 3: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel

Komponente Trenngel (8%)Sammelgel (4%)1,5 M Tris-HCl (Sammelgelpuffer), 0,4% SDS, pH 6,8-925 ?l0,5 M Tris-HCl (Trenngelpuffer), 0,4% SDS, pH 8,83000 ?l-40% Acrylamid/Bisacrylamid2400 ?l415 ?lA. dest.6550 ?l2400 ?lL?sung mischen12,5% APS96 ?l30 ?lTEMED10 ?l3,75 ?l

Transfer auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF)

Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der Proteine in einem Natriumdodecyl-Polyacrylamidgel erfolgte der Transfer der Proteine im Nass-Blot-Verfahren auf eine proteinbindende PVDF-Membran (0,2 ?m Porengr??e). Der Proteintransfer erfolgte unter st?ndigem R?hren des Puffers 1 h bei konstanten 100 V.

Immundetektion

Unspezifische Proteinbindestellen der PVDF-Membran wurden direkt nach dem Proteintransfer 50 min bei RT mit 5% Magermilch geblockt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit dem Prim?rantik?rper ch14.18 (1 ?g/ml in TTBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5)) bei 4?C ?ber Nacht. Am darauffolgenden Tag wurde die Membran zur Entfernung nicht gebundener Antik?rper 6 ? 10 min mit TTBS gewaschen. Im weiteren Schritt wurde die Membran mit dem Sekund?rantik?rper goat-anti-human (Fc-spezifisch)-HRP in einer Verd?nnung von 1:20000 in TTBS f?r 45 min bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert. In diese Antik?rperl?sung wurde zur Visualisierung des Markers das Precision ProteinTM StrepTactin-HRP-Konjugat in einer Verd?nnung von 1:10000 gegeben. Nach der Entfernung ungebundenen Sekund?rantik?rpers durch mehrere Waschschritte (6 ? 10 min mit TTBS), konnte das Substrat zur Visualisierung der detektierten Proteine vorbereitet werden. Daf?r wurde 6 ml Immun-StarTM HRP Luminol/Enhancer mit 6 ml Immun-StarTM HRP Peroxide Buffer gemischt und anschlie?end f?r 5 min auf die Membran gegeben. Die an den Sekund?rantik?rper gekoppelte Peroxidase kann das Luminol oxidieren, wodurch ein Chemilumineszenzsignal entsteht, das dann mit Hilfe des ChemieDocTM XRS+ Molecular Imager aufgenommen wurde.

Coomassie-F?rbung

Eine Coomassie-F?rbung wird zur F?rbung der in einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennten Proteine oder zur Kontrolle des Gels auf nicht transferierte Proteine nach dem Transfer auf eine Tr?germembran benutzt (50 ml BioSafeTM Coomassie G-250 Stain-F?rbel?sung f?r 1 h). Durch das nachfolgende Waschen des Gels mit A. dest (3 ? 10 min), wurde das Gel entf?rbt und die Proteinbanden erscheinen blau.

Nachweis der anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab

Im ersten Schritt wurde der neue Antik?rper Ganglidiomab auf seine anti-Idiotyp-Eigenschaften getestet.

Beispiel 1: Durchflusszytometrische Untersuchung der anti-Idiotyp-Eigenschaften

Eine M?glichkeit die Spezifit?t eines Antik?rpers zu bestimmen, ist eine Messung von fluoreszenzmarkierten Zellen, die ein f?r den zu untersuchenden Antik?rper spezifisches Antigen auf ihrer Oberfl?che exprimieren. Mit Hilfe von genetisch ver?nderten NK-92-Zellen, die einen GD2-spezifischen chim?ren Antigenrezeptor auf ihrer Oberfl?che tragen, sollte durchflusszytometrisch bestimmt werden, ob es sich bei dem neu generierten Ganglidiomab um einen anti-Idiotyp-Antik?rper handelt. Die genetisch modifizierte NK-Zelllinie NK92-scFv(ch14.18)-zeta exprimiert ein Einzelketten-variables Fragment (scFv) des Antik?rpers ch14.18 und bindet spezifisch an GD2 [Esser et al., 2011]. Demnach sollte Ganglidiomab im Kultur?berstand der Hybridomzellen den chim?ren Rezeptor binden. Zun?chst wurde der Anteil lebender Zellen durch die Zugabe des DNA-Farbstoffs 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), der sich in die DNA apoptotischer Zellen einlagert, bestimmt. Nur dieser Anteil der Zellen wurde f?r die Messung und Auswertung der Daten verwendet. Durch die Messung der Isotyp-Kontrolle wurde der Schwellenwert f?r das Analysenfenster festgelegt. Demnach wurden alle Signale ab einer Fluoreszenzintensit?t von 102 f?r positiv bewertet. In , A sind die Daten zur Analyse der Bindung von Ganglidiomab durch die humanen, genetisch modifizierten NK-Zellen im Vergleich zu dem bereits in der Literatur beschriebenen GD2-anti-Idiotyp-Antik?rper 1A7 [Sen et al., 1998; Zeytin et al., 2000] dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass Ganglidiomab durch die NK-Zellen gebunden werden kann (, A). Weiterhin konnte eine konzentrationsabh?ngige Abnahme der Signalst?rke von Ganglidiomab verzeichnet werden (, B).

NK-Zellen, die genetisch modifiziert wurden, tragen auf ihrer Zelloberfl?che einen GD2-spezifischen Rezeptor, der aus der antigenbindenden Dom?ne des chim?ren anti-GD2-Antik?rpers ch14.18 und der zeta-Kette des CD3-Komplexes als signaltransduzierender Dom?ne besteht (NK-92-scFv(ch14.18)-zeta) [Esser et al., 2011]. In der Analyse wurde gezeigt, dass Ganglidomab durch die NK-Zellen spezifisch gebunden werden kann. Ein Vergleich mit dem bereits in der Literatur beschriebenen GD2-anti-Idiotyp-Antik?rper 1A7 [Sen et al., 1998; Zeytin et al., 2000], der als Positivkontrolle beim Assay diente, erbrachte den Nachweis, dass es sich bei Ganglidiomab tats?chlich um einen anti-Idiotypen handelt, der strukturelle ?hnlichkeit mit dem Disialogangliosid GD2 besitzt und dementsprechend durch den GD2-spezifischen Rezeptor der transduzierten NK-92-Zellen spezifisch gebunden wird. Interessanterweise zeigte Ganglidiomab eine h?here Bindungsaffinit?t zum chim?ren Rezeptor der transduzierten, humanen NK-92-Zellen, als der bekannte anti-Idiotyp-Antik?rper 1A7, was Ganglidiomab zu einem effektiveren anti-Idiotyp-Antik?rper f?r eine aktive Immuntherapie machen k?nnte. Um die Bindungsaffinit?t von Ganglidiomab zu ch14.18 im Vergleich mit 1A7 besser beurteilen zu k?nnen, ist es m?glich, mit Hilfe der Biacore-Technologie eine Echtzeitmessung der jeweiligen Bindungsst?rken durchzuf?hren. Mit diesem Verfahren lassen sich labelfreie Analysen der Proteininteraktionen sowie Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen realisieren.

Beispiel 2: Indirekter kompetitiver ELISA

Im n?chsten Schritt der Charakterisierung des anti-Idiotyp-Antik?rpers sollte mit Hilfe eines indirekten kompetitiven ELISA der Antik?rper Ganglidiomab im Kultur?berstand der Hybridomzelllinie anti-14G2A Klon 17-9 auf seine anti-Idiotyp-Eigenschaften untersucht und die konzentrationsabh?ngige Inhibition der spezifischen Bindung von ch14.18 an GD2 durch Ganglidiomab dargestellt werden. Das Reaktionsprinzip bestand dabei in der Kompetition des im Kultur?berstand befindlichen Ganglidiomabs mit immobilisiertem GD2 um die freien Antigenbindungsstellen des anti-GD2-Antik?rpers ch14.18. Die Intensit?t des gemessenen Signals ist dabei umgekehrt proportional zur Menge des Antik?rpers Ganglidiomab im Kultur?berstand. In ist die Inhibition in Abh?ngigkeit von der Verd?nnungsstufe des Hybridom-Kultur?berstandes 17-9 dargestellt.

Eine 100%ige Inhibition der Bindung von ch14.18 an GD2 konnte durch den Einsatz des unverd?nnten Kultur?berstandes erreicht werden. Selbst bei einer Verd?nnung von 1:25 war nur eine leichte Abnahme der Hemmung zu verzeichnen. Dieser Effekt nahm jedoch mit st?rkerer Verd?nnung des Kultur?berstandes zu. Bei der entsprechenden Isotyp-Kontrolle, also einem Antik?rper der gleichen Immunglobulinklasse mit einer anderen Epitopspezifit?t, konnte dieser Effekt nicht gezeigt werden.

Das durchflusszytometrische Ergebnis aus Beispiel 1 wird durch die Daten des kompetitiven ELISA bekr?ftigt. Es konnte eine 100%ige Inhibition der spezifischen Bindung des chim?ren anti-GD2-Antik?rpers ch14.18 an das beschichtete Antigen GD2 durch Ganglidiomab im Kultur?berstand der Hybridomzellen 17-9 nachgewiesen werden. Der Antik?rper ch14.18 wird durch Ganglidiomab zu 100% spezifisch gebunden. Aus diesem Grund findet keine Bindung ch14.18 an das beschichtete GD2 statt.

Beispiel 3: Immunologischer Nachweis von Ganglidiomab mittels Western Blot

Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, im Anschluss an die Transfektion in CHO-Zellen, die Antik?rper-Expression durch die pFUSE-Vektoren im Kultur?berstand bzw. auch in den Zellen nachzuweisen. Daf?r ist ein geeigneter Western Blot f?r den immunologischen Nachweis von Ganglidiomab im Zelllysat sowie im Kultur?berstand etabliert worden. Zur Detektion dient der monoklonale anti-GD2-Antik?rper ch14.18 als Prim?rantik?rper, dessen humaner Fc-Teil wiederum durch einen HRP-gekoppelten goat-anti-human-Sekund?rantik?rper erkannt und gebunden werden kann.

zeigt das Ergebnis einer Proteinanalyse mittels Western Blot, bei dem Ganglidiomab sowohl im Zelllysat, als auch im Kultur?berstand der Hybridomzelllinie anti-14G2A Klon 17-9 nachgewiesen wurde. Es zeigt sich je eine Bande bei 250 kDa.

Beispiel 4: Vergleichende Untersuchung der Affinit?t der anti-Idiotyp Antik?rper Ganglidiomab und 1A7 an den nominalen Antik?rper ch14.18 mittel Biacore Messungen

Die vergleichende Messung der Affinit?ten von anti-Idiotyp Antik?rper Ganglidiomab und 1A7 an den nominalen Antik?rper ch14.18 mittels Biacore Messungen beruht auf dem Prinzip der Oberfl?chenplasmonenresonanzspektroskopie. Auf der Goldschicht des Sensor-Chips befindet sich eine d?nne Schicht aus carboxymethylierten Dextranen, welche nach ihrer Aktivierung die zu untersuchenden Liganden binden k?nnen (Immobilisation des Liganden). Die Menge des Liganden spielt f?r die Analyse eine entscheidende Rolle. Verschiedene Konzentrationen der beiden Liganden (ch14.18 und Rituximab als Negativkontrolle) wurden getestet. F?r die Immobilisation wurde jeweils eine Konzentration von 2,3 ?g/ml verwendet.

Auf den Chip wurden zwei Liganden immobilisiert:

  • 1. Kanal: Negativkontrolle (Rituximab)
  • 2. Kanal: ch14.18

Ganglidiomab und 1A7 werden ?ber die beiden Kan?le in festgelegten Konzentrationen injiziert. Dabei sind folgende Parameter relevant: Flussrate (wie schnell der Antik?rper ?ber die Liganden gegeben wird), Kontaktzeit oder Assoziation (zwischen dem Liganden und dem Antik?rper) und Dissoziationszeit. Nach Vorversuchen wurden folgende Parameter als optimal gefunden:

Flussrate: 5 ?l/minKontaktzeit: 1080 sDissoziationszeit: 780 s

Folgende Konzentrationen der zu untersuchenden Antik?rper (Ganglidiomab und 1A7) wurden f?r die Analyse verwendet:

  • 1. 193,33 ?g/ml
  • 2. 96,67 ?g/ml
  • 3. 46,77 ?g/ml
  • 4. 23,39 ?g/ml
  • 5. 11,6 ?g/ml
  • 6. 5,8 ?g/ml
  • 7. 2,9 ?g/ml
  • 8. 1,46 ?g/ml
  • 9. 0,73 ?g/ml

Die Affinit?t der ch14.18 und Ganglidiomab bzw. ch14.18 und 1A7 wird zun?chst mithilfe der ?steady state? Analyse evaluiert. KD-Werte:

1. ch14.18 und Ganglidiomab: 3,18E?072. ch14.18 und 1A7: 1,76E?07

Es ist festzustellen, dass die KDs der beiden Antiidiotyp-Antik?rper sich voneinander unterscheiden.

F?r die Erfassung der einzelnen Assoziations- bzw. Dissoziationskonstanten wurden drei mathematische Modelle analysiert: Monovalente Bindung, bivalente Bindung und Heterogene Bindung. Das Modell der ?bivalente Bindung? beschreibt das Bindungsverhalten am besten. Entsprechend dieses Modells werden w?hrend der Assoziationsphase zwei Komplexe gebildet: AB und AB2. Die Assoziationskonstante des ersten Komplexes hei?t ka1, des zweiten ka2. Bei der Dissoziation sind ebenfalls zwei Komplexe von einander zu unterscheiden: AB und AB2. Dementsprechend gibt es auch zwei Dissoziationskonstanten: kd1 und kd2. (siehe ). Entsprechend des bivalenten Bindungsmodells ergeben sich die in Tabelle 4 dargestellten Werte. Tab. 4 Assoziationskonstanten der beiden Komplexe:

ch14.18-Ganglidiomab ch14.18-1A7AB 5,77E+03 9,99E+03AB2 2,99E?03 3,96E?04
Dissoziationskonstanten der beiden Komplexe:ch14.18-Ganglidiomab ch14.18-1A7AB 6,60E?04 3,36E?03AB2 1,52E?02 9,69E?03

Im Vergleich zu einander ergibt sich folgendes Ergebnis: Bei der AB Bindung assoziiert 1A7 mit ch14.18 um 1,7-fach st?rker als Ganglidiomab. Jedoch dissoziiert 1A7 von ch14.18 5-fach st?rker als Gangdlidiomab. Bei der AB2 von Ganglidiomab und ch14.18 ist die Assoziation um 7-fach und die Dissoziation um 1,62-fach st?rker, als von 1A7 und ch14.18.

Hieraus ergibt sich ein klarer Unterschied zwischen ganglidiomab und 1A7.

Beispiel 5: Induktion einer humoralen anti-GD2 Immunantwort nach Immunisierung mit Ganglidiomab

Die Wirkung von ganglidiomab als Antigen zur Induktion einer anti-GD2 Immunantwort wurde in immunkompetenten M?usen untersucht. Zu diesem Zweck wurden Balb/c M?use mit an Al(OH)3 adsorbiertem Ganglidiomab immunisiert. Dieses erfolgte durch intraperitoneale Injektion von 100 ?g Ganglidiomab (Al(OH)3) an den Tagen 3, 17 und 31. Das Serum zur Bestimmung einer anti-GD2 Immunantwort wurde an den Zeitpunkten 0, 10, 25, 38 und 55 aus der Schwanzvene entnommen.

Eine Anti-GD2 Immunantwort wurde durch einen ELISA-Assay getestet, bei dem GD2 auf der Platte immobilisiert vorlag (50 ng/well). Zu diesem Zweck werden 50 ng GD2 in 50 ?l Methanol pro well einer 96 Lochplatte (Nunc 96well Polysorp Plate) pipettiert. Das Methanol wird bei 50?C verdampft (1 h). Unspezifische Bindung wird durch Zugabe von 100 ?l 1% BSA/PBS Puffer (pH 7,4) blockiert (4?C, ?ber Nacht). Blockingpuffer wird vorbereitet.

Das Serum der immunisierten M?use wurde mit dem immobilisierten GD2 in folgenden Arbeitsschritten inkubiert:

  • 1. Blotten: Platte auf Papiertuch leicht ausklopfen
  • 2. 3 ? mit 0,1% BSA-PBS-Waschpuffer waschen
  • 3. Pro Probe 6 ? 100 ?l PBS in ein 1,5 ml R?hrchen vorlegen
  • 4. Proben vorbereiten: 10 ?l Mausserum + 190 ?l PBS (Verd?nnung 1:20) [Proben 1?8]
  • 5. Platte dreimal waschen (siehe oben)
  • 6. 50?l Proben (Probe 1?8), Positivkontrolle (PK, 14G2a), Negativkontrolle (NK, IgG2a Isotypkontrolle) oder Blanks werden nach folgendem Schema in die Vertiefungen der 96 Lochplatte pipettiert:
  • 7. Platte mit einer Folie abdecken
  • 8. Bei 37?C 2 Stunden inkubieren (oder ?ber Nacht bei +4?C)
  • 9. Sekund?rantik?rper Goat-anti-Mouse-Fc-HRP (Sigma, A9309) vorbereiten: 1:20000 in PBS (1,1 ?l + 22 ml f?r 2 Platten), vortexen
  • 10. Platte f?nfmal waschen (siehe oben)
  • 11. 50 ?l Sekund?rantik?rper pro Well pipettieren:
  • 12. 1 Stunde bei 37?C inkubieren (lichtgesch?tzt)
  • 13. Platte f?nfmal waschen (siehe oben)
  • 14. 75 ?l TMB-L?sung pro Well pipettieren
  • s15. 30 min im Dunkeln bei RT inkubieren (Positivkontrollen werden intensiv blau)
  • 16. 50 ?l von 2NH2SO4 pro Well pipettieren, um die Reaktion zu stoppen
  • 17. bei 450 nm die Absorption messen

Der relative Anstieg der Absorption wurde berechnet, indem der Wert an Tag 0 (vor Immunisierung) = 1 gesetzt wurde.

Alle mit ganglidiomab immunisierten M?use zeigten eine antiGD2 spezifische Immunantwort. Der Titerverlauf ist in gezeigt. In diesem Beispiel ist gezeigt, dass Ganglidiomab eine humorale Immunantwort ausl?sen kann, die gegen GD2 gerichtet ist und somit als Vakzine bei neuroetodermalen Tumoren ausgenutzt werden kann.

Beispiel 6: Identifizierung der DNA-Sequenzen der variablen Regionen von Ganglidiomab6.1 RNA-Qualit?tskontrolle

Nachdem die anti-Idiotyp-Eigenschaften von Ganglidiomab gezeigt werden konnten, sollten im n?chsten Schritt die DNA-Sequenzen identifiziert werden, die f?r die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des anti-Idiotyp-Antik?rpers kodieren. Daf?r wurde zun?chst die Gesamt-RNA aus den antik?rperproduzierenden Hybridomzellen gewonnen. Die Integrit?t der isolierten RNA (2 ?g) wurde in einem Agarosegel (1%) ?berpr?ft ().

Mit einem Anteil von mehr als 80% macht die ribosomale RNA den gr??ten Anteil der Gesamt-RNA aus. Aus diesem Grund l?sst sie sich mittels Agarose-Gelelektrophorese leicht detektieren. In sind zwei deutlich voneinander getrennte Banden sichtbar, die der 28S rRNA der 60S Untereinheit bzw. der 18S rRNA der 40S Untereinheit der 80S Ribosomen entsprechen und f?r eine intakte, nicht degradierte RNA stehen. Das Vorhandensein von intakter RNA war die Voraussetzung f?r die nachfolgende Synthese der komplement?ren cDNA.

6.2 Amplifikation der variablen Regionen von Ganglidiomab

Der erste Ansatz, die variablen Regionen der schweren und leichten Kette zu amplifizieren bestand darin, hoch degenerierte 5'-Primer zu verwenden, die an konservierte Strukturen im ersten Framework des Antik?rpers binden (Tab. 1) sowie 3'-Primer, die jeweils an der ersten konstanten Region der IgG schweren Kette und der ?-leichten Kette binden. Mit diesen Primern konnten die ersten Sequenzen der variablen Regionen erhalten werden, die jedoch aufgrund der unterschiedlichen Basen an den Wobblepositionen der Primergemische im ersten Framework einige Variationen der Nukleotidsequenz aufwiesen. Auch aus dem Vergleich von 20 Sequenzen pro Kette ergab sich keine ?bereinstimmung. Alle erhaltenen Sequenzen unterschieden sich an den Wobblepositionen und somit auch in der resultierenden Aminos?uresequenz. Im zweiten Ansatz kamen dann degenerierte 5'-Primer zur Anwendung, die den Vorteil hatten, an eine h?her konservierte Struktur im Antik?rper, der Signalsequenz, zu binden (Tab. 2). Diese Sequenz kodiert f?r das so genannte Signalpeptid und ist nach der Translation f?r den Transport des gebildeten Immunglobulins verantwortlich. Bei diesen Primern handelte es sich um ein Gemisch aus nicht degenerierten (ohne Wobblepositionen) und degenerierten (mit Wobblepositionen) Oligonukleotiden. Da nur die Aminos?urensequenz des Framework 1 der variablen Regionen durch die Wobblepositionen nicht eindeutig identifiziert werden konnten, wurden die 3'-Primer f?r die 2.

Polymerasekettenreaktion anhand der Sequenz des Famework 4 neu erstellt. Im Hinblick auf die im weiteren Verlauf der Arbeit folgende Klonierung in ein eukaryotisches Expressionssystem zur Charakterisierung des Antik?rpers auf Proteinebene, wurden geeignete Restriktionsschnittstellen sowie die Kozak-Sequenz (CACC) als Ribosomenbindungsstelle f?r die Expression in die Primer integriert. Der Aufbau der zur Amplifikation verwendeten Primer ist in schematisch dargestellt.

Aufgrund der unterschiedlichen Schmelztemperaturen der Primer-Paare wurden die optimalen Annealing-Temperaturen mittels Gradienten-PCR ermittelt und die PCR so optimiert, sodass sie zur Synthese der variablen Region der leichten und schweren Kette von Ganglidiomab eingesetzt werden konnte.

zeigt die PCR-Produkte der beiden durchgef?hrten Polymerasekettenreaktionen zur Synthese der variablen Regionen nach Auftrennung in einem Agarosegel. Beide Bilder zeigen ein PCR-Produkt bei ca. 450 bp. Diese Produkte wurden aus dem Agarosegel aufgereinigt und f?r die TA-Klonierung in die pCR?2.1-TOPO-Vektoren weiterverwendet.

6.3 Restriktionsanalyse

Die DNA-Fragmente, die f?r die variablen Regionen der schweren und leichten Kette von Ganglidiomab kodieren, wurden f?r die Sequenzierung in die Plasmide pCR?2.1-TOPO kloniert (siehe oben). Die Selektion der rekombinanten Plasmide erfolgte mittels Blau/Wei?-Screening, wobei die erfolgreiche Ligation der PCR-Produkte in die pCR?2.1-TOPO-Plasmide durch das Wachstum von wei?en Kolonien auf den Selektionsplatten angezeigt wurde. Nach Isolierung der Plasmide aus den Bakterien, erfolgte eine Kontrollrestriktion mittels des Enzyms EcoRI. Bei einer erfolgreichen Ligation der PCR-Produkte ergibt sich neben der Bande f?r die Plasmide eine zweite f?r das klonierte PCR-Produkt bei ca. 450 bp. zeigt die im Agarosegel aufgetragenen Restriktionsans?tze nach der elektrophoretischen Auftrennung. Es konnte nachgewiesen werden, dass bei allen isolierten Plasmiden das Insert vorhanden war. Die rekombinanten Plasmide wurden anschlie?end durch die Firma LGC Genomics sequenziert.

6.4 Sequenzanalyse der variablen Regionen von Ganglidiomab

Die Analyse der Sequenzen erfolgte mit dem Programm DNAStar? Lasergene? Version 8.1. F?r die leichte und schwere Kette von Ganglidiomab wurden je 10 Sequenzen ausgewertet. 7 von 10 Sequenzen f?r die variable Region der leichten Kette stimmten dabei ?berein und 4 von 10 bei der schweren Kette, die dann letztendlich als die richtigen Sequenzen f?r die variablen Regionen angesehen wurden. Die bei der Amplifikation eingesetzte Taq-Polymerase weist zwar eine hohe Prozessivit?t auf, besitzt aber keine 3'-5'-Exonucleaseaktivit?t (proof-reading). Damit werden falsch eingebaute Nukleotide von der Polymerase nicht erkannt und entfernt. Dies ist der Grund daf?r, dass einige Sequenzen Punktmutationen aufwiesen. Die Sequenzen wurden mittels der Kabat-Datenbank: ?Sequences of Proteins of Immunological Interest? ausgewertet. In dieser Datenbank sind unter anderem die Nukleotid- und Aminos?uresequenzen der verschiedenen Signalpeptide sowie der variablen und konstanten Regionen von Immunglobulinen unterschiedlicher Spezies aufgelistet. Anhand dieser Daten konnten die erhaltenen Sequenzen in die unterschiedlichen Abschnitte der Frameworks und hypervariablen Bereiche (CDRs) eingeteilt werden. In den und 16 sind die identifizierten Sequenzen der variablen Region der leichten Kette (A) sowie der schweren Kette (B) aufgef?hrt. Es konnte anhand der Sequenzen festgestellt werden, dass das f?r die variable Region kodierende Gen eine L?nge von 399 bp aufweist und die DNA-Sequenz, die f?r die variable Region der schweren Kette von Ganglidiomab kodiert, aus insgesamt 426 Nukleotiden besteht (ohne Restriktionsschnittstellen und Kozak-Sequenz).

Mit Hilfe der KABAT-Datenbank wurden die erhaltenen Sequenzen von Ganglidiomab identifiziert und mit dem auf gleiche Weise generierten anti-Idiotyp-Antik?rper 1A7 verglichen. Dabei fielen einige Abweichungen der Aminos?uresequenzen in den hybervariablen Regionen besonders bei der schweren Kette auf, was die unterschiedlichen Bindungsaffinit?ten zu ch14.18 erkl?ren k?nnte.

Durch einen weiteren V-Quest-Abgleich [Giudicelli et al., 2004; Giudicelli et al., 2006] mit den bekannten Maus-Keimbahngenen der IMGT-Datenbank (ImMunoGeneTics Information System) konnte ermittelt werden, dass es sich bei Ganglidiomab nicht um einen hypermutierten Antik?rper handelt. Die Analyse des V-Elementes der variablen Region der leichten Kette ergab eine ?bereinstimmung von 99,32% mit der Keimbahnkonfiguration einer Maus (Mus musculus) des Stammes Balb/c. 292 von 294 Nukleotiden stimmen ?berein. Das V-Element der variablen Region der schweren Kette zeigt eine ?bereinstimmung von 98,25% mit der Keimbahnkonfiguration. 280 von 285 Nukleotiden stimmen hier ?berein.

Herstellung der ExpressionssystemeRestriktion der Expressionsvektoren und der Sequenzierungsplasmide

Zur Generierung der rekombinanten Expressionsvektoren wurden pFUSE-CHIg-mG1 sowie pFUSE2-CLIg-mk mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten, um sie f?r die nachfolgende Ligation zu linearisieren (). Die Vektoren wurden nach der Restriktion enzymatisch mittels einer alkalischen Phosphatase dephosphoryliert, um eine Religation der Vektoren zu verhindern.

Die f?r die variable Region der leichten und schweren Kette von Ganglidiomab kodierenden Sequenzen, wurden aus dem Sequenzierungsvektor pCR?2.1-TOPO herausgeschnitten (). Das Herausschneiden des DNA-Fragments f?r die variable Region der leichten Kette (LK) erfolgte durch einen Doppelverdau von pCR?2.1-TOPO-LK mit BstAPI und XhoI, wobei der Ansatz zun?chst f?r 2 h bei 37?C und anschlie?end f?r weitere 2 h bei 60?C inkubiert wurde, da das Restriktionsenzym BstAPI nur bei dieser Temperatur eine optimale Aktivit?t von 100% besitzt. F?r das DNA-Fragment ergab sich eine Bande bei 400 bp. Da der pCR?2.1-TOPO-Vektor zwei weitere Erkennungssequenzen f?r die Enzyme BstAPI und XhoI aufweist, wurde bei der Restriktion ein zus?tzliches DNA-Fragment mit einer Gr??e von 665 bp aus dem Vektor geschnitten, welches im Agarosegel auf der entsprechenden H?he erkennbar ist. Nur das DNA-Fragment mit der korrekten Gr??e wurde anschlie?end aus dem Gel aufgereinigt, daher bestand also nicht die Gefahr, dass im Anschluss das falsche Fragment in die Expressionsvektoren kloniert wird. Das andere rekombinante Plasmid pCR?2.1-TOPO-SK, in dem die Sequenz f?r die variable Region der schweren Kette (SK) integriert ist, wurde ebenfalls durch einen Doppelverdau mit EcoRI/NheI geschnitten. Da es im Vektor keine weiteren Erkennungssequenzen f?r diese Enzyme gibt, entsteht nur ein Fragment mit einer Gr??e von 426 bp.

Die aufgereinigten DNA-Fragmente sollten im Anschluss in die Expressionsvektoren ligiert und transformiert werden.

Ligation und Transformation in Escherichia coli

F?r die Selektion erfolgreich transformierter Bakterien kamen die Antibiotika Zeocin (pFUSE-CHIg-mG1) und Blasticidin (pFUSE2-CLIg-mk) zur Anwendung. Die Analyse der Bakterienkolonien erfolgte mittels Kolonie-PCR. Bei einer erfolgreichen Transformation der Bakterien mit den rekombinanten Expressionsvektoren, ergeben sich nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarosegel spezifische Banden bei 400 bp f?r die leichte Kette und 426 bp bei der schweren Kette. zeigt das Ergebnis einer Kolonie-PCR mit dem Koloniematerial mit pFUSE-CHIg-mG1-SK transformierter E. coli. Insgesamt wurden 84 Kolonien mit dieser Methode analysiert, wobei 80 eine Bande der richtigen erwarteten Gr??e von 426 bp aufwiesen. Als Positivkontrolle diente die cDNA, die als Template f?r die Synthese und Amplifikation der variablen Regionen verwendet wurde.

Um die Insertion durch einen Restriktionsverdau zu ?berpr?fen, wurden 5 der positiven Kolonien in einer ?ber-Nacht-Kultur vermehrt, am darauf folgenden Tag die Plasmide isoliert und mittels Doppelverdau durch EcoRI/NheI auf das Vorhandensein des Inserts und die Integrit?t der Schnittstellen ?berpr?ft. Bei allen 5 Proben konnte das Insert mit der richtigen Gr??e aus dem Vektor herausgeschnitten werden ().

Bei 4 von 5 Plasmiden stellte sich die Frage nach einer weiteren unspezifischen Bande bei ca. 1,2 kb. Es wurde vermutet, dass es sich um ein unspezifisches Produkt des Restriktionsenzyms EcoRI handelt. Daher wurde ein sequentieller Verdau des Leervektors pFUSE-CHIg-mG1 mit EcoRI und NheI durchgef?hrt, bei dem das Bandenmuster nach unterschiedlicher Inkubationszeiten (15, 30, 45, 60 und 120 min) mit EcoRI und NheI ?berpr?ft werden sollte. Die zeigt das Ergebnis der elektrophoretischen Auftrennung aller Ans?tze.

Es ist deutlich zu sehen, das das Enzym EcoRI bereits nach 15 min Inkubationszeit bei 37?C beginnt, unspezifisch zu schneiden. Die Intensit?t dieser Bande nimmt mit zunehmender Inkubationszeit zu. Es konnte also davon ausgegangen werden, dass die Bande mit der Gr??e von ca. 1,2 kb der unspezifischen Bande in entspricht.

Beschreibung der Abbildungen

: Jerne's Netzwerkmodell der idiotypischen Wechselwirkungen am Beispiel von GD2
Im Rahmen einer Immunreaktion gegen GD2, kommt es zur Bildung eines spezifischen Antik?rpers (Ak 1), dessen Paratop zum einen das Antigen erkennt und zum anderen selbst immunogen wirkt, wodurch ein anti-Idiotyp-Antik?rper (Ak 2) erzeugt wird, der ein ?internes Abbild? des urspr?nglichen Antigens GD2 bildet. Konsekutiv f?hrt dieser Antik?rper zu einer weiteren Immunreaktion und die daraus resultierenden Antik?rper (Ak 3) k?nnen aufgrund des ?molekularen Mimikry? zwischen GD2 und anti-Idiotyp (Ak 2) mit dem Antigen GD2 kreuz reagieren und so einen therapeutischen Effekt induzieren.

: Generierung eines Antik?rpers mittels klassischer Hybridomtechnologie am Beispiel von Ganglidiomab
Nach der Immunisierung von Balb/c M?usen mit dem anti-GD2-Ak-14G2a wurden die B-Zellen der Maus isoliert (1.) und durch die Fusion mit der Myelomzelllinie SP2/0 immortalisiert. Die daraus hervorgehenden Hybridomzellen (2.) wurden auf ihre Antik?rperspezifit?t getestet (3.). Das Ganglidiomab-produzierende Hybridom wurde selektiert (4.) und f?r die Antik?rpergewinnung weiterkultiviert (5.).

: Chim?rer Rezeptor der NK-92-scFv(ch14.18)-zeta

: Prinzip des indirekten kompetitiven ELISA am Beispiel der Inhibition der spezifischen Bindung von ch14.18 an GD2 durch Ganglidiomab.

: Vektorkarte pCR?2.1-TOPO.

: Durchflusszytometrische Analyse der Bindung von Ganglidiomab und 1A7 an den chim?ren Rezeptor auf humanen NK92-scFv(ch14.18)-zeta-Zellen
Dargestellt ist die Bindung von Ganglidiomab an den chim?ren Rezeptor auf humanen NK92-scFv(ch14.18)-zeta-Zellen im Vergleich zum bekannten anti-Idiotyp-Antik?rper 1A7 (A). Eine Abnahme der Konzentration von Ganglidiomab im Kultur?berstand der Hybridomzellen 17-9 von 0,5 ?g auf 0,25 ?g korreliert mit einer Abnahme der Fluoreszenzintensit?t (B).

: Indirekter kompetitiver ELISA
Konzentrationsabh?ngige Inhibition der spezifischen Bindung des anti-GD2-Antik?rpers ch14.18 an GD2 durch die Anwesenheit von Ganglidiomab im Kultur?berstand der Hybridomzellen 17-9.

: Western Blot zum immunologischen Nachweis von Ganglidiomab
Nachweis von Ganglidiomab im Zelllysat (1) sowie im Kultur?berstand (2) mittels dem anti-GD2-Antik?rper ch14.18. M: Precision Plus ProteinTM WesternCTM Standard.

: Schematische Darstellung der Komplexe zwischen anti-Idiotyp Antik?rper Ganglidiomab sowie 1A7 und dem nominalen Antik?rper ch14.18.

: GD2 spezifische anti-Ganglidiomab Immunantwort in BALB/c M?usen.

: Auftrennung der isolierten Gesamt-RNA (2 ?g) mittels Agarose-Gelelektrophorese
Die beiden gro?en 28S rRNA- und 18S rRNA-Molek?le der 60S bzw. 40S Untereinheit stehen f?r eine intakte, nicht degradierte RNA.

: Bindungsstellen der Primer zur Amplifikation der variablen Region am Beispiel der leichten Kette von Ganglidomab

: PCR-Produkte: Variable Region der leichten Kette (A) und schweren Kette (B) von Ganglidiomab [M: Marker (100 bp)]

: Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese nach Restriktionskontrolle der rekombinanten pCR?2.1-TOPO Plasmide mit EcoRI
Die DNA-Fragmente, die f?r die variablen Regionen der leichten Kette (A) sowie der schweren Kette (B) kodieren, konnten erfolgreich mittels des Restriktionsenzyms EcoRI aus je 5 pCR?2.1-TOPO Plasmiden heraus geschnitten werden (Spur 1?5). M: Marker (100 bp).

: Nukleotid- und Aminos?uresequenzen f?r die variablen Regionen der leichten (A) Kette von Ganglidiomab.

: Nukleotid- und Aminos?uresequenzen f?r die variablen Regionen der schweren (B) Kette von Ganglidiomab.
Gezeigt sind die Nukleotidsequenzen und die dazu geh?rigen Aminos?uresequenzen im Einbuchstabencode der variablen Regionen von leichter Kette (A) und schwerer Kette (B) von der Leadersequenz bis zum Framework 4.

: Linearisierung von pFUSE-CHIg-mG1 und pFUSE2-CLIg-mk
Doppelverdau von pFUSE-CHIg-mG1 durch EcoRI/NheI (A). Spur 1: ungeschnittener Vektor. Spur 2: geschnittener Vektor. (B) Doppelverdau von pFUSE2-CLIg-mk durch XhoI/BstAPI. Spur1: ungeschnittener Vektor. Spur 2: geschnittener Vektor. M: Marker (10 kb).

: Restriktionsverdau der rekombinanten Sequenzierungsplasmide pCR?2.1-TOPO
Bandenmuster nach Restriktionsverdau der rekombinanten pCR?2.1-TOPO-Vektoren-LK mit BstAPI/XhoI (A) sowie der pCR?2.1-TOPO-Vektoren-SK mit EcoRI/NheI (B). M: Marker (10 kb)

: Elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte einer Kolonie-PCR Beispielhaft sind 18 der 84 untersuchten Kolonien gezeigt (Spur 1?18). M: Marker (100 bp), PK: Positivkontrolle

: Restriktionsverdau der rekombinanten Vektoren pFUSE-CHIg-mG1-SK Bandenmuster nach Restriktionsverdau der 5 rekombinanten Vektoren pFUSE-CHIg-mG1-SK mit EcoRI/NheI. M: Marker (100 bp)

: Sequentieller Verdau von pFUSE-CHIg-mG1 mit NheI (A) und EcoRI (B)
(A): Sequentieller Verdau von pFUSECHIg-mG1 mit NheI nach 15, 30, 45, 60 und 120 min (Spur 1?5). Spur 6: Leervektor ungeschnitten. M: Marker (100 bp).
(B): Sequentieller Verdau von pFUSE-CHIg-mG1 mit EcoRI nach 15, 30, 45, 60 und 120 min (Spur 1?5). Spur 6: Leervektor ungeschnitten. M: Marker (100 bp)

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Abk?rzungsverzeichnis

  • 7-AAD
    7-Aminoactinomycin D
    ADCC
    antik?rperabh?ngige zellvermittelte Zytotoxizit?t
    (antibody-dependent cellular cytotoxicity)
    A. dest.
    destilliertes Wasser (Aqua destillata)
    Abb.
    Abbildung
    Ak
    Antik?rper
    Anti-Id-Ak
    anti-Idiotyp-Antik?rper
    APS
    Ammoniumpersulfat
    AS
    Aminos?ure
    ?-ME
    beta-Mercaptoethanol
    bp
    Basenpaare
    BSA
    Rinderserumalbumin (bovine serum albumine)
    bzw.
    beziehungsweise
    Ca2+
    Calcium
    CD
    cluster of differentiation
    CDC
    komplementabh?ngige Zytotoxizit?t
    (complement-dependent cytotoxicity)
    CDRs
    hypervariable Regionen (complementarity determining regions)
    CHO-Zellen
    Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (chinese hamster ovary)
    CIP
    alkalische Phosphatase (calf intestine alkaline phosphatase)
    cDNA
    komplement?re DNS (complementary DNA)
    COG
    Children's Oncology Group
    DEPC
    Diethylpyrocarbonat
    DMEM
    Dulbecco?s Modified Eagle Medium
    DMF
    Dimethylformamid
    DMSO
    Dimethylsulfoxid
    DSMZ
    Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
    DNA
    Desoxyribonukleins?ure (deoxyribonucleic acid)
    dNTPs
    Desoxyribonukleotidtriphosphate
    DTT
    Dithiothreitol
    E.coli
    Escherichia coli
    EDTA
    Ethylendiamintetraessigs?ure
    ELISA
    enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay
    (enzyme-linked immunosorbent assay)
    Fab
    antigen-bindendes Fragment (fragment of antigen binding)
    FACS
    fluorescence activated cell sorting
    Fc
    konstanter Teil (f)
    FCS
    fetales K?lberserum (fetal calf serum)
    GM-CSF
    Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
    (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
    GMP
    Good Manufacturing Practice
    HRP
    Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)
    Ig
    Immunglobulin
    IL-2
    Interleukin-2
    inakt.
    inaktiviert
    INRG
    International Neuroblastoma Risk Group
    INSS
    International Neuroblastoma Staging System
    ITS
    Insulin-Transferrin-Selen
    IUB
    International Union of Biochemistry
    IUPAC
    International Union of Pure and Applied Chemistry
    KLH
    H?mocyanin der Gro?en Kalifornischen Schl?ssellochnapfschnecke
    (keyhole limpet hemocyanin)
    LB-Medium
    lysogeny broth-Medium
    MCS
    multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site)
    MEM-NEAA
    Minimum Eessential Medium ? Non Essential Amino Acids
    Mg2+
    Magnesium
    MHC
    Haupthistokompatibilit?skomplex (major histocompatibility complex)
    MMLV-RT
    Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Transkriptase
    mycN
    v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived
    NB-Zelle
    Neuroblastom-Zelle
    NK-Zellen
    nat?rliche Killerzellen
    PBS
    phosphatgepufferte Kochsalzl?sung (phosphate buffered saline)
    PCR
    Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
    PE
    Phycoerythrin
    PVDF
    Polyvinylidenfluorid
    RNA
    Ribonukleins?ure (ribonucleic acid)
    RT
    Raumtemperatur
    RT-PCR
    Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
    scFv
    single chain variable fragments
    SDS
    Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
    SDS-PAGE
    Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
    (Sodium-Dodecyl-Sulfate-Polyacrylamid Gel Electrophoresis)
    SIOPEN R NET
    International Society of Paediatric Oncology European Neuroblastoma Research Network
    TAA
    tumorassoziiertes Antigen
    TAE-Puffer
    Tris-Acetat-EDTA-Puffer
    Taq-Polymerase
    Thermus aquaticus Polymerase
    TEMED
    Tetramethylethandiamin
    Th
    T-Helferzellen
    TMB
    3,3',5,5'-tetramethylbenzidin
    Tris
    Trishydroxymethylaminomethan
    u. a.
    unter anderem
    UV
    Ultraviolett
    WB
    Western Blot
    WHO
    Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization)
    X-Gal
    5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-?-D-galactopyranosid

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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