Title:
Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle zur gezielten Abtötung von Zellen, Verwendung derselben sowie Applikationskit
Kind Code:
A1
Abstract:

Aufgabe war es, Zellen in einem breiten Anwendungsgebiet, wirksam, zuverlässig und möglichst effektiv im Organismus abzutöten, ohne dass die vorgenannten Nachteile an sich bekannter chemischer, physikalischer, biochemischer oder molekularbiologischer Methoden auftreten.
Erfindungsgemäß sind die biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle (8) mit ihrer Nukleotidsequenz zur Bindungsmöglichkeit an die mRNA (7, 9, 10, 11) mehrerer Gene ausgebildet, um durch Anbindung mehrere, insbesondere eine Vielzahl, „Off-Target”-Effekte für zellabtötende Stress-Situationen auszulösen, durch welche unabhängig von dem klassischen Einsatz der Moleküle zur Reduktion der Expression eines einzelnen Gens, die Zelle (2) so massiv beeinflusst wird, dass diese abstirbt oder in der Zelle (2) der programmierte Zelltod (Apoptose) eingeleitet wird.
Anwendung finden diese Moleküle insbesondere zur gezielten Abtötung von Tumor- und Virus-infizierten Zellen, sowie von Pflanzen- und Pilzzellen.



Inventors:
Pöhlmann, Tobias, Dr. (08058, Zwickau, DE)
Günther, Rolf, Dr. (22559, Hamburg, DE)
Application Number:
DE102011009470A
Publication Date:
08/09/2012
Filing Date:
01/21/2011
Assignee:
Friedrich-Schiller-Universität Jena, 07743 (DE)
International Classes:
Foreign References:
200802426322008-10-02
201001059332010-04-29
WO2005078097A22005-08-25
WO2009020344A22009-02-12
KR1020070114923A
WO2008098569A22008-08-21
KR20070114923A2007-12-05
70567042006-06-06
58980311999-04-27
Other References:
Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG. The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct; 1(4): 383-9.
Gillespie EH, Gibbons SA. Autoclaves and their dangers and safety in laboratories. J Hyg (Lond). 1975 Dec; 75(3): 475-87.
National Toxicology Program. Final Report on Carcinogens Background Document for Formaldehyde. Rep Carcinog Backgr Doc. 2010 Jan; (10-5981): i-512.
Tanaka S, Arii S. Current status of molecularly targeted therapy for hepatocellular carcinoma: basic science. Int J Clin Oncol. 2010 Jun; 15(3): 235-41. Epub 2010 May 27.
Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494-8
Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921-7
Ikeda et. al.: "Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006
FEDOROV Y et. al., Offtarget effects by siRNA can induce toxic phenotype. RNA (2006), 12: 1188-1196.
Claims:
1. Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle mit zumindest einer auf mRNA-Bindung ausgerichteten Nukleotidsequenz zur gezielten Beeinflussung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Nukleotidsequenz der Nukleotid-Moleküle (8) zur Bindungsmöglichkeit für die mRNA (3, 4, 5, 6) mehrerer Gene ausgebildet ist, um durch Anbindung der Nukleotid-Moleküle an die mRNA (3, 4, 5, 6) dieser Gene mehrere, insbesondere eine Vielzahl, toxisch auf die Zelle (2) wirkende „Off-Target”-Effekte für zellabtötende Stress-Situationen auszulösen.

2. Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleotide RNA, siRNA, PNA, DNA oder LNA eingesetzt werden und eine Größe von 10–300 bp aufweisen.

3. Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Moleküle (8) spezifische Sequenzen enthalten, welche an sich und auch ohne Bindung an eine mRNA Stressreaktionen in Zellen hervorrufen, beispielsweise AAA, UUU, GCCA, UGGC, GUCCUUCAA, UGUGU, AUUUG, GUUUU, AUUUU, CUUUU, UUUUU oder GUUUG.

4. Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass diese (8), insbesondere zu deren Einbringung in Zellen (2), an Moleküle, wie beispielsweise Zell-penetrierende Peptide, gebunden oder in Reagenzien, wie beispielsweise Polyethylenimine, Nanopartikel oder Lipide, eingebunden sind.

5. Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass diese (8) mindestens eine der Nukleotidsequenzen GGUA, CGUC, CGUU, CCAA, AAGG, GGUG, CUCG, CUCC, CUCU, CUUA, GGUC, GGUU, AAAG, AAAC, AAAU, AAGA, AAGC, AAGU, AACA, AACG, AACC, AACU, AAUA, CUUU, AAUG, AAUC, AAUU, AGGA, AGUG, AGUC, AGUU, ACAA, ACAG, ACAC, ACAU, ACGA, ACGG, ACGC, ACGU, ACCA, CAUU, CGAA, ACCG, ACCC, ACCU, ACUA, ACUG, ACUC, ACUU, AUAA, GGAG, GGAC, GGAU, GGGA, GGGC, GGGU, GGCA, GGCG, GGCC, GGCU, GCAA, GCAG, GCAC, GCAU, AUAG, AUAC, AUAU, AUGA, AUGG, AUGC, AUGU, AUCA, CGCG, CGCC, CGCU, AUCG, AUCC, AUCU, AUUA, AUUG, AUUC, AUUU, GAAA, GAAG, GAAC, GAAU, GAGA, GAGG, GAGC, GAGU, GACA, GACG, GACC, GACU, GAUA, GAUG, GAUC, GAUU, GGAA, GCGA, GCGG, GCGC, GCGU, GCCA, GCCG, GCCC, GCCU, GCUA, GCUG, GCUC, GCUU, GUAA, GUAG, GUAC, GUAU, GUGA, GUGG, GUGC, GUGU, GUCA, GUCG, GUCC, GUCU, GUUA, GUUG, GUUC, GUUU, CAAA, CAAG, CAAC, CAAU, CAGA, CAGG, CAGC, CAGU, CACA, CACG, CACC, CACU, CAUA, CAUG, CAUC, CGAG, CGAC, CGAU, CGGA, CGGG, CGGC, CGGU, CGCA, CGUA, CGUG, CCAG, CCAC, CCAU, CCGA, CCGG, CCGC, CCGU, CCCA, AGAA, AGAG, AGAC, AGAU, CCCG, CCCU, AGGG, AGGC, AGGU, AGCA, CCUA, CCUG, CCUC, CCUU, CUAA, CUAG, CUAC, CUAU, AGCG, AGUA, CUGA, CUGG, CUGC, CUGU, CUCA, CUUG, CUUC, AGCC, AGCU enthalten.

6. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 5 zur gezielten Abtötung eukaryontischer Zellen, insbesondere tierischer, pflanzlicher oder Pilzzellen.

7. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 5 zur gezielten Abtötung virus-infizierter Zellen.

8. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 5 zur gezielten Abtötung prokaryontischer Zellen.

9. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass diese in Kombination mit Proteaseinhbitoren eingesetzt werden.

10. Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 5, bestehend zumindest aus
– wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das biologisch wirksame Molekül enthält und weiter enthalten kann:
– mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Zell-penetrierende Peptide, Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide,
– mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Moleküle oder das Transfektionssystem enthält,
– Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B,
– eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie
– eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.

Description:

Die Erfindung betrifft biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von Nukleotiden, mit denen gezielt Zellen abgetötet werden können, die Verwendung der biologisch wirksamen Moleküle sowie einen Applikationskit zur Anwendung.

Verfahren, mit denen biologische Zellen gezielt abgetötet werden sollen, benutzen klassischer Weise physikalische Mittel, wie UV-Strahlung, Hitze, u. a., (Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG. The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct; 1(4): 383–9.; Gillespie EH, Gibbons SA. Autoclaves and their dangers and safety in laboratories. J Hyg (Lond). 1975 Dec; 75(3): 475–87.) oder chemische Substanzen, beispielsweise Säuren, Laugen, Formaldehyde, (National Toxicology Program. Final Report on Carcinogens Background Document for Formaldehyde. Rep Carcinog Backgr Doc. 2010 Jan; (10–5981): i-512.) welche die Struktur der Zelle an sich zerstören. Diese Mittel sind häufig umweltschädlich und kaum im Organismus anwendbar. Um in einem Organismus Zellen abzutöten, werden biochemische Mittel (Proteininhibitoren, Antagonisten, Zytostatika, u. a.) verwendet (Tanaka S, Arii S. Current status of molecularly targeted therapy for hepatocellular carcinoma: basic science. Int J Clin Oncol. 2010 Jun; 15(3): 235–41. Epub 2010 May 27.), welche Zellen massiv in ihrer Physiologie beeinflussen und so ebenfalls zu einem Absterben der Zelle führen können. Allerdings können durch keines dieser Verfahren spezifische Zellarten im Organismus gezielt abgetötet werden, da diese Substanzen auf alle Zellen gleichermaßen wirken.

Ein molekularbiologischer Ansatz, Zellen gezielt zu beeinflussen ist der der Einsatz kurzer, doppelsträngiger RNA. Diese so genannten siRNA (engl. short interfering RNA) Moleküle können klassischer Weise nach ihrer Aktivierung mit der mRNA des Zielgens interagieren und bilden zusammen mit speziellen Endoribonukleasen einen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung „RISC” (RNA induced silencing complex). Der RISC Komplex bindet an die Target-mRNA, wobei Endonukleasen die Ziel-mRNA schneiden. Auf diese Weise wird die Genexpression verhindert und somit das Entstehen von Zielproteinen gehemmt.

Die Hemmung der Genexpression durch Einbringen von kurzen (19–23 bp), doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) in eukaryotische Zellen, die spezifisch für einen Sequenzabschnitt der mRNA eines Zielgens ist, wurde bereits beschrieben (Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494–8; Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921–7; US 5,898,031 A; US 7,056,704 B2).

Mit Hilfe solcher Moleküle wird nicht das Ablesen eines Gens und die Produktion einer mRNA verhindert, sondern es wird durch die siRNA ein zelleigener Mechanismus initiiert, der die Target-mRNA abbaut. Schließlich wird, wie vorbeschrieben, die Bildung eines spezifischen Proteins unterdrückt, ohne die Expression weiterer Gene zu beeinträchtigen (post-transcriptional gene silencing).

Für derzeitige Anwendungen von siRNA wird häufig angestrebt, ausschließlich die Expression eines einzigen Gens in einer Zelle zu unterdrücken. Effekte, bei denen mehrere Gene gleichzeitig oder unspezifisch ausgeschalten werden sind somit nicht erwünscht, weshalb die Sequenzen der siRNA so gestaltet werden, dass diese Effekte unterbunden werden.

Ebenfalls wurden Methoden entwickelt, verstärkt Zellen eines Zielgewebes mit siRNA in vivo zu transfizieren (Ikeda et. al.: „Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA”, Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006) oder durch Bindung kurzer Peptide, welche zellspezifisch abgespalten werden eine Zellspezifität zu erreichen (WO 2008/098569 A2). Durch den Einsatz dieser modifizierten siRNA Moleküle kann erreicht werden, dass selektiv in bestimmten Zellen die Expression von Genen reduziert bzw. unterbunden wird.

Ist die verwendete siRNA Sequenz spezifisch für überlebenswichtige Gene der Zelle, kann dadurch das Absterben der Zelle bewirkt werden. Dieser Prozess kann durch die genannten Mechanismen ggf. auch zellspezifisch angewandt werden.

Nachteilig ist allerdings, dass das Abschalten eines einzigen Genes bzw. weniger Gene häufig nicht zwangsläufig zum Absterben dieser Zelle führt; häufig müssten dazu spezifisch mehrere Gene gleichzeitig abgeschaltet werden, um den gewünschten Effekt zu erreichen. Beispielsweise für therapeutische Anwendungen wäre es wünschenswert, wenn mittels siRNA Molekülen Zellen direkt abgetötet werden könnten. Dadurch könnten insbesondere unter Verwendung der genannten Methoden ganz spezifisch Tumorzellen oder Virus-infizerte Zellen abgetötet werden.

Darüber hinaus besteht häufig das Problem, dass bei dem Genom vom Tumor- oder Virus-infizierten Zellen häufig Mutationen auftreten, weshalb die verwendeten siRNA Moleküle unwirksam werden können und somit die beabsichtigte Zellbeeinflussung versagt oder zumindest nicht effektiv eingesetzt werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Zellen in einem breiten Anwendungsgebiet, wirksam, zuverlässig und möglichst effektiv im Organismus abzutöten, ohne dass die vorgenannten Nachteile an sich bekannter chemischer, physikalischer, biochemischer oder molekularbiologischer Methoden auftreten.

Erfindungsgemäß sind die biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle, beispielsweise auf Grundlage von RNA, siRNA, PNA, DNA oder LNA, mit ihrer Nukleotidsequenz zur Bindungsmöglichkeit an die mRNA mehrerer Gene darauf orientiert, durch Anbindung an diese Gene mehrere, insbesondere eine Vielzahl, „Off-Target”-Effekte für zellabtötende Stress-Situationen auszulösen.

Mit dieser Stress-Situation wird unabhängig von dem klassischen Einsatz der Nukleotid-Moleküle, insbesondere von siRNA, zur Reduktion der Expression eines einzelnen Gens, die Zelle durch die unspezifische Nukleotidsequenz so massiv beeinflusst, dass die Zelle abstirbt oder in der Zelle der programmierte Zelltod (Apoptose) eingeleitet wird.

Zwar sind, wie eingangs beschrieben, Nukleotid-Moleküle, beispielsweise auf Grundlage von siRNA, mit einer auf mRNA-Bindung ausgerichteten Nukleotidsequenz an sich hinreichend bekannt, jedoch ist diese Nukleotidsequenz dort jeweils spezifisch für die mRNA eines oder weniger Gene ausgerichtet, um mit selektiver Bindung an das bezweckte Zielgen eine definierte Genmanipulation in der Zelle und auf diese Weise eine genorientierte Zellbeeinflussung vorzunehmen.

Mit der Erfindung ist die Nukleotidsequenz bewusst so ausgestaltet, um an mehrere, insbesondere eine Vielzahl, mRNAs von Genen andocken zu können, ggf. auch unabhängig davon, ob diese für eine Bindung möglichen mRNAs der Gene nun in der Zelle auch tatsächlich vorhanden sind oder nicht. Vordergründiges Ziel der vorschlagsgemäß beabsichtigten mRNA-Bindung ist also keine vorgenannte auf die Zellaktivität ausgerichtete Genmanipulierung, sondern es sollen insbesondere mit einer Vielzahl (eigentlich beliebiger) mRNA-Bindungen der Nukleotid-Moleküle möglichst viele „Off-Target”-Effekte” ausgelöst werden, die bisher zur zielgerichteten Genbeeinflussung möglichst zu vermeiden oder zu vermindern waren. Mit den möglichst vielen „Off-Target”-Effekten” soll vielmehr für die Zelle eine übergroße Stress-Situation erzeugt werden, welche die Zielzelle nicht bewältigen kann und durch welche die besagte Zielzelle (nicht durch gezielte Manipulation der Genexpression, sondern durch allgemeinen Stress) bewusst abgetötet wird.

Die mit der Genbindung zwangsläufig und bekannter Weise auftretende und auf die Zellaktivität einwirkende spezielle Genbeeinflussung ist dabei ein Nebeneffekt und könnte je nach Wirkung der Genbeeinflussung die Zelleinwirkung (zusätzlich zur besagten erfindungsgemäß beabsichtigten Stress-Situation) ggf. weiter unterstützen.

Die Auswahl der durch die Nukleotidsequenz bindungsmöglichen Zielgene wird damit nicht oder zumindest nicht vordergründig als Zieleffekt von einer beabsichtigten Gen-Manipulation zur Zellbeeinflussung, sondern von der zweckbestimmten Wirkung der durch die Genbindungen erreichbaren „Off-Target”-Effekte” und die mit denselben in der Zelle hervorgerufenen Stress-Situation bestimmt.

Um die besagten „Off-Target”-Effekte zu erzeugen, werden die Nukleotidsequenzen so gewählt, dass diese nicht wie klassischerweise nur mit einem Zielgen, sondern mit so viel wie möglich Zielgenen der Zellen übereinstimmen. Dadurch wird für eine Vielzahl von Genen eine toxisch wirkende Nukleotid-Interferenz erzeugt und die Physiologie der Zelle massiv beeinflusst.

Diese vorgeschlagene Anwendung kann in Kombination mit bekannten Mechanismen zum Erreichen einer Zellspezifität und mit an sich bekanten Möglichkeiten der Stabilisierung beispielsweise von siRNA und zur verbesserten Aufnahme der Nukleotid-Moleküle in Zellen angewandt werden.

Die vorgeschlagenen Nukleotidsequenzen sind nicht auf die Verwendung als klassische siRNA beschränkt; auch kurze (10–20 bp) doppelsträngige oder einzelsträngige RNA, lange (20–300 bp) doppel- oder einzelsträngige RNA, DNA oder chemische Analoge, wie beispielsweise PNA, können mit den vorgeschlagenen Nukleotidsequenzen zum Einsatz kommen.

Zusätzlich zu der Induktion der besagten „Off-Target”-Effekte kann die zellschädigende Wirkung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle durch bekannte Stressinduzierende Nukleotid-Sequenzabfolgen unterstützt werden (FEDOROV Y et. al., Offtarget effects by siRNA can induce toxic phenotype. RNA (2006), 12: 1188–1196.) Durch ein geeignetes Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel, Polyethylenimin oder Liposomen, können die Wirkstoffmoleküle in an sich bekannter Weise in die Zellen eingebracht werden.

Die Molekülkonstrukte können zum besseren Transport in bzw. an die Zellen sowie zu ihrer Stabilisierung oder zu ihrer Detektion außerdem an weitere Stoffe (beispielsweise Nanopartikel als Trägersystem oder Fluorochrome) gebunden werden.

Die biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle sind geeignet zur gezielten Abtötung eukaryontischer Zellen, insbesondere tierischer, pflanzlicher oder Pilzzellen, sowie virus-infizierter und prokaryontischer Zellen.

Bei Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle können diese auch in Kombination mit Proteaseinhibitoren eingesetzt werden.

Vorteilhaft ist ein Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle, bestehend zumindest aus

  • – wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das biologisch wirksame Molekül enthält und weiter enthalten kann:
  • – mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide,
  • – mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Moleküle oder das Transfektionssystem enthält,
  • – Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B und C
  • – eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie
  • – eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen:

1: Schematische Darstellung einer bekannten siRNA, welche in eine Zelle eingebracht wird, für eine mRNA spezifisch ist und die Expression eines Zielgens unterdrückt

2: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen siRNA, welche in eine Zelle eingebracht wird und dort so viel wie möglich unspezifische RNAi Effekte (Off-Target Effekte) auslöst

3: Schematische Darstellung einer siRNA, welche in eine Zelle eingebracht wird und dort keine Verminderung der Expression von Genen und den Abbau von mRNAs bezweckt, sondern den Zelltod mittels in der Zelle durch spezifische Sequenzabschnitte der siRNA hervorgerufene Stressreaktionen.

In 1 ist der Mechanismus einer herkömmlichen und bekannten siRNA 1 dargestellt, welche in eine Zelle 2 eingebracht wird (siehe symbolisierte Pfeildarstellung) und eine spezielle für eine Anbindung an eine erste genspezifische mRNA 3 Nukleotidsequenz (nicht explizit dargestellt) besitzt. Darauf hin wird die siRNA 1 in den RNA Induced Silencing Complex (RISC) eingebaut (ebenfalls nicht explizit dargestellt), welcher die siRNA 1 in ihre zwei einzelnen Stränge teilt und sich der Antisense-Strang der siRNA 1 zusammen mit dem RISC an die erste mRNA 3 anlagert. Darauf hin wird die genspezifische erste mRNA 3 zerschnitten und fragmentiert, wodurch die Expression eines Zielgens, basierend auf der ersten mRNA 3, unterdrückt wird (vgl. abgebaute erste mRNA 7 in 1). Die darauf hin frei gewordene und in den RISC eingebundene siRNA 1 lagert sich nun an die nächste in der Zelle 2 vorhandene spezifische erste mRNA 3 an und baut diese ebenfalls ab. Dabei wird darauf abgezielt, dass jede siRNA 1 an nur eine spezifische erste mRNA 3 bindet und diese abbaut. Weitere in der Zelle 2 außerdem vorhandene zweite andere mRNA 4, dritte andere mRNA 5 und vierte andere mRNA 6 bleiben im Gegensatz zur ersten mRNA 3 jeweils von der siRNA 1 bzw. deren nicht explizit dargesteller Nukleotidsequenz unberührt, so dass Gene zu den mRNA 46 keine veränderte Expression erfahren. Diese Methode ist hinreichend bekannt.

2 zeigt als Vergleich den Mechanismus einer erfindungsgemäßen siRNA 8, welche in die Zelle 2 eingebracht wird (siehe ebenfalls symbolisierte Pfeildarstellung), in welcher sich wiederum beispielhaft die erste mRNA 3, die zweite mRNA 4, die dritte mRNA 5 sowie die vierte mRNA 6 befinden. Die vorgeschlagene siRNA 8 enthält (aus Übersichtsgründen nicht explizit dargestellt) eine Kette aus einer oder mehreren der Nukleotidsequenzen GGUA, CGUC, CGUU, CCAA, AAGG, GGUG, CUCG, CUCC, CUCU, CUUA, GGUC, GGUU, AAAG, AAAC, AAAU, AAGA, AAGC, AAGU, AACA, AACG, AACC, AACU, AAUA, CUUU, AAUG, AAUC, AAUU, AGGA, AGUG, AGUC, AGUU, ACAA, ACAG, ACAC, ACAU, ACGA, ACGG, ACGC, ACGU, ACCA, CAUU, CGAA, ACCG, ACCC, ACCU, ACUA, ACUG, ACUC, ACUU, AUAA, GGAG, GGAC, GGAU, GGGA, GGGC, GGGU, GGCA, GGCG, GGCC, GGCU, GCAA, GCAG, GCAC, GCAU, AUAG, AUAC, AUAU, AUGA, AUGG, AUGC, AUGU, AUCA, CGCG, CGCC, CGCU, AUCG, AUCC, AUCU, AUUA, AUUG, AUUC, AUUU, GAAA, GAAG, GAAC, GAAU, GAGA, GAGG, GAGC, GAGU, GACA, GACG, GACC, GACU, GAUA, GAUG, GAUC, GAUU, GGAA, GCGA, GCGG, GCGC, GCGU, GCCA, GCCG, GCCC, GCCU, GCUA, GCUG, GCUC, GCUU, GUAA, GUAG, GUAC, GUAU, GUGA, GUGG, GUGC, GUGU, GUCA, GUCG, GUCC, GUCU, GUUA, GUUG, GUUC, GUUU, CAAA, CAAG, CAAC, CAAU, CAGA, CAGG, CAGC, CAGU, CACA, CACG, CACC, CACU, CAUA, CAUG, CAUC, CGAG, CGAC, CGAU, CGGA, CGGG, CGGC, CGGU, CGCA, CGUA, CGUG, CCAG, CCAC, CCAU, CCGA, CCGG, CCGC, CCGU, CCCA, AGAA, AGAG, AGAC, AGAU, CCCG, CCCU, AGGG, AGGC, AGGU, AGCA, CCUA, CCUG, CCUC, CCUU, CUAA, CUAG, CUAC, CUAU, AGCG, AGUA, CUGA, CUGG, CUGC, CUGU, CUCA, CUUG, CUUC, AGCC, AGCU so dass die Gesamtheit der in der Kette gebundenen Nukleotidsequenzen im Gegensatz zu 1 nicht nur auf eine einzige der mRNA 36 abbauend wirkt, sondern auf mehrere bzw. eine Vielzahl und damit alle in 2 dargestellten mRNA Moleküle (mRNA 36) bindet. Dabei ist es möglich, dass zumindest eine ausgewählte Nukleotidsequenz auf mehrere oder alle der dargestellten mRNA Moleküle (mRNA 36) bindet oder jeweils eine ausgewählte Nukleotidsequenz wirkt jeweils selektiv auf eine spezifische mRNA 36. Wichtig ist, dass möglichst viele (im besten Fall alle) der mRNA 36 durch die Kette (Gesamtheit aller Nukleotidsequenzen) der siRNA 8 gebunden und abgebaut werden (vgl. abgebaute erste bis vierte mRNA 7, 9, 10, 11 in 2).

Durch den Abbau der besagten Vielzahl von mRNA Molekülen (im vorliegenden Beispiel vereinfachend lediglich vier mRNA Moleküle dargestellt) werden mehrere bis zahlreiche unspezifische RNAi Effekte (Off-Target Effekte) ausgelöst, indem die siRNA 8 mit (im besten Falle) nur einer Nukleotidsequenz die Expression mehrerer bis vieler Gene unterdrückt (vgl. abgebaute mRNA 7, 9, 10, 11 in 2) mit dem Ziel, auf diese Weise die Zelle 2 abzutöten, welche durch die massive Wirkung der siRNA 8 abstirbt.

Als Beispiel kann durch die siRNA 8 mit einer Nukleotidsequenz (5'-3') UUAACUGUAUCUGGAGCtt die mRNA der Gene Suppressor Of Cytokine Signaling-1 (SOCS1, NM_003745.1), N-acetylneuraminic acid phosphatase (NANP, NM_152667.2), Transmembrane Protein 215 (TMEM215, NM_212558.2) und des CD81-Moleküls (CD81, NM_004356.3) abgebaut werden. Eine Nukleotidsequenz der siRNA 8 AACUGUAUCUGGAGCtt ist spezifisch wirksam für die mRNAs der Gene Suppressor Of Cytokine Signaling 1 (SOCS1, NM_003745.1) und N-Acetylneuraminic Acid Phosphatase (NANP, NM_152667.2). Eine Nukleotidsequenz GGCUGAACAAAGGAGAtt wirkt spezifisch auf den Major Histocompatibility Complex, Class-I, G (HLA-G, NM_002127.4), Glycerol Kinase 5 (putative) (GK5, NM_001039547.1) und DIP2 disco-interacting protein 2 homolog C (NM_014974.2). Entsprechend wirkt die siRNA 8 mit der Sequenz GCUCACCAAUGGAGAtt spezifisch auf den Complement Component (3b/4b) Receptor 1 (Knops blood group) (CR1, NM_000651.4), transcript variant S, Complement Component (3b/4b) Receptor 1 (Knops blood group) (CR1, NM_000573.3), transcript variant F und die Glutathione S-transferase alpha 4 (GSTA4, NM_001512.3). Als weitere Beispiele für die Nukleotidsequenz der siRNA 8 seien die Sequenz UGGCUGGCUGGCUGGCtt, vorteilhaft gegen die Pyroglutamyl-peptidase I (PGPEP1, NM_017712.2), Rap guanine nucleotide exchange factor (GEF) 3 (RAPGEF3, NM_006105.5), transcript variant 2 und den Retinoid X Receptor, alpha (RXRA, NM_002957.4) sowie die Sequenz GUCUAUCAGCACAAUtt gegen den Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (acute-phase response factor) (STAT3, NM_213662.1), transcript variant 3, Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (acute-phase response factor) (STAT3, NM_003150.3), transcript variant 2, Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (acute-phase response factor) (STAT3, NM_139276.2), transcript variant 1, Protocadherin alpha 9 (PCDHA9, NM_014005.3) und Secernin 3 (SCRN3, NM_024583.3) genannt.

Des Weiteren können die einzelnen Sequenzen der siRNA 8 auch in Kombination zeitgleich oder zeitlich getrennt verabreicht sowie in gleichen oder unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt werden, um eine Vielzahl von Genen effizient auszuschalten bzw. mRNAs abzubauen.

In 3 ist ein zusätzlicher Effekt dargestellt, welcher die toxische Wirkung der vorbeschriebenen erfindungsgemäßen siRNA 8 noch weiter unterstützen kann. Dabei werden zusätzlich eine oder mehrere Nukleotidsequenzen (wie beispielsweise AAA, UUU GCCA, UGGC, GUCCUUCAA, UGUGU, AUUUG, GUUUU, AUUUU, CUUUU, UUUUU oder GUUUG) in eine siRNA 12 eingebunden, welche bekanntermaßen solche Stressreaktionen in der Zelle 2 hervorrufen, die nicht auf die Bindung der siRNA 8 an eine oder mehrere mRNA zurückzuführen sind. Dabei vermindern diese Nukleotidsequenzen der siRNA 12 mit dieser Wirkung, nach Einbringung der siRNA 12 in die Zelle 2 nicht die Expression von Genen und den Abbau von mRNAs (vgl. in 3 die dargestellten und nicht mit diesen Nukleotidsequenzen abgebauten mRNA 36), sondern induzieren unspezifische Stressreaktionen in der Zelle, welche zusätzlich zu der gemäß 2 beschriebenen Wirkung auftreten und damit noch verstärkter zum Absterben der Zelle 2 führen.

Bezugszeichenliste

1, 8, 12
siRNA
2
Zelle
3, 4, 5, 6
genspezifische mRNA
7, 9, 10, 11
abgebaute genspezifische mRNA

Sequenzprotokoll

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • US 5898031 A [0004]
  • US 7056704 B2 [0004]
  • WO 2008/098569 A2 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG. The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct; 1(4): 383–9. [0002]
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