Title:
Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle zur gezielten Abtötung von Zellen, Verwendung derselben sowie Applikationskit
Kind Code:
A1
Abstract:

Aufgabe war es, Zellen in einem breiten Anwendungsgebiet, wirksam, zuverlässig und möglichst effektiv im Organismus abzutöten, ohne dass die vorgenannten Nachteile an sich bekannter chemischer, physikalischer, biochemischer oder molekularbiologischer Methoden auftreten.
Erfindungsgemäß sind die biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle (8) mit ihrer Nukleotidsequenz zur Bindungsmöglichkeit an die mRNA (7, 9, 10, 11) mehrerer Gene ausgebildet, um durch Anbindung mehrere, insbesondere eine Vielzahl, „Off-Target”-Effekte für zellabtötende Stress-Situationen auszulösen, durch welche unabhängig von dem klassischen Einsatz der Moleküle zur Reduktion der Expression eines einzelnen Gens, die Zelle (2) so massiv beeinflusst wird, dass diese abstirbt oder in der Zelle (2) der programmierte Zelltod (Apoptose) eingeleitet wird.
Anwendung finden diese Moleküle insbesondere zur gezielten Abtötung von Tumor- und Virus-infizierten Zellen, sowie von Pflanzen- und Pilzzellen.



Inventors:
Pöhlmann, Tobias, Dr. (08058, Zwickau, DE)
Günther, Rolf, Dr. (22559, Hamburg, DE)
Application Number:
DE102011009470A
Publication Date:
08/09/2012
Filing Date:
01/21/2011
Assignee:
Friedrich-Schiller-Universität Jena, 07743 (DE)
International Classes:
Foreign References:
200802426322008-10-02
201001059332010-04-29
WO2005078097A22005-08-25
WO2009020344A22009-02-12
KR1020070114923A
WO2008098569A22008-08-21
KR20070114923A2007-12-05
70567042006-06-06
58980311999-04-27
Other References:
Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG. The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct; 1(4): 383-9.
Gillespie EH, Gibbons SA. Autoclaves and their dangers and safety in laboratories. J Hyg (Lond). 1975 Dec; 75(3): 475-87.
National Toxicology Program. Final Report on Carcinogens Background Document for Formaldehyde. Rep Carcinog Backgr Doc. 2010 Jan; (10-5981): i-512.
Tanaka S, Arii S. Current status of molecularly targeted therapy for hepatocellular carcinoma: basic science. Int J Clin Oncol. 2010 Jun; 15(3): 235-41. Epub 2010 May 27.
Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494-8
Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921-7
Ikeda et. al.: "Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006
FEDOROV Y et. al., Offtarget effects by siRNA can induce toxic phenotype. RNA (2006), 12: 1188-1196.
Claims:
1. Biologisch wirksame Nukleotid-Molek?le mit zumindest einer auf mRNA-Bindung ausgerichteten Nukleotidsequenz zur gezielten Beeinflussung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Nukleotidsequenz der Nukleotid-Molek?le (8) zur Bindungsm?glichkeit f?r die mRNA (3, 4, 5, 6) mehrerer Gene ausgebildet ist, um durch Anbindung der Nukleotid-Molek?le an die mRNA (3, 4, 5, 6) dieser Gene mehrere, insbesondere eine Vielzahl, toxisch auf die Zelle (2) wirkende ?Off-Target?-Effekte f?r zellabt?tende Stress-Situationen auszul?sen.

2. Biologisch wirksame Nukleotid-Molek?le gem?? Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleotide RNA, siRNA, PNA, DNA oder LNA eingesetzt werden und eine Gr??e von 10?300 bp aufweisen.

3. Biologisch wirksame Nukleotid-Molek?le gem?? Anspr?chen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Molek?le (8) spezifische Sequenzen enthalten, welche an sich und auch ohne Bindung an eine mRNA Stressreaktionen in Zellen hervorrufen, beispielsweise AAA, UUU, GCCA, UGGC, GUCCUUCAA, UGUGU, AUUUG, GUUUU, AUUUU, CUUUU, UUUUU oder GUUUG.

4. Biologisch wirksame Nukleotid-Molek?le gem?? Anspr?chen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass diese (8), insbesondere zu deren Einbringung in Zellen (2), an Molek?le, wie beispielsweise Zell-penetrierende Peptide, gebunden oder in Reagenzien, wie beispielsweise Polyethylenimine, Nanopartikel oder Lipide, eingebunden sind.

5. Biologisch wirksame Nukleotid-Molek?le gem?? einem oder mehreren der Anspr?che 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass diese (8) mindestens eine der Nukleotidsequenzen GGUA, CGUC, CGUU, CCAA, AAGG, GGUG, CUCG, CUCC, CUCU, CUUA, GGUC, GGUU, AAAG, AAAC, AAAU, AAGA, AAGC, AAGU, AACA, AACG, AACC, AACU, AAUA, CUUU, AAUG, AAUC, AAUU, AGGA, AGUG, AGUC, AGUU, ACAA, ACAG, ACAC, ACAU, ACGA, ACGG, ACGC, ACGU, ACCA, CAUU, CGAA, ACCG, ACCC, ACCU, ACUA, ACUG, ACUC, ACUU, AUAA, GGAG, GGAC, GGAU, GGGA, GGGC, GGGU, GGCA, GGCG, GGCC, GGCU, GCAA, GCAG, GCAC, GCAU, AUAG, AUAC, AUAU, AUGA, AUGG, AUGC, AUGU, AUCA, CGCG, CGCC, CGCU, AUCG, AUCC, AUCU, AUUA, AUUG, AUUC, AUUU, GAAA, GAAG, GAAC, GAAU, GAGA, GAGG, GAGC, GAGU, GACA, GACG, GACC, GACU, GAUA, GAUG, GAUC, GAUU, GGAA, GCGA, GCGG, GCGC, GCGU, GCCA, GCCG, GCCC, GCCU, GCUA, GCUG, GCUC, GCUU, GUAA, GUAG, GUAC, GUAU, GUGA, GUGG, GUGC, GUGU, GUCA, GUCG, GUCC, GUCU, GUUA, GUUG, GUUC, GUUU, CAAA, CAAG, CAAC, CAAU, CAGA, CAGG, CAGC, CAGU, CACA, CACG, CACC, CACU, CAUA, CAUG, CAUC, CGAG, CGAC, CGAU, CGGA, CGGG, CGGC, CGGU, CGCA, CGUA, CGUG, CCAG, CCAC, CCAU, CCGA, CCGG, CCGC, CCGU, CCCA, AGAA, AGAG, AGAC, AGAU, CCCG, CCCU, AGGG, AGGC, AGGU, AGCA, CCUA, CCUG, CCUC, CCUU, CUAA, CUAG, CUAC, CUAU, AGCG, AGUA, CUGA, CUGG, CUGC, CUGU, CUCA, CUUG, CUUC, AGCC, AGCU enthalten.

6. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le gem?? Anspr?chen 1 bis 5 zur gezielten Abt?tung eukaryontischer Zellen, insbesondere tierischer, pflanzlicher oder Pilzzellen.

7. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le gem?? Anspr?chen 1 bis 5 zur gezielten Abt?tung virus-infizierter Zellen.

8. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le gem?? Anspr?chen 1 bis 5 zur gezielten Abt?tung prokaryontischer Zellen.

9. Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le gem?? Anspr?chen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass diese in Kombination mit Proteaseinhbitoren eingesetzt werden.

10. Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le gem?? Anspr?chen 1 bis 5, bestehend zumindest aus
? wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das biologisch wirksame Molek?l enth?lt und weiter enthalten kann:
? mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Zell-penetrierende Peptide, Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide,
? mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Molek?le oder das Transfektionssystem enth?lt,
? Verd?nnungs- und Reaktionspuffer f?r die Inhalte der Ampullen A, B,
? eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kan?le und andere ben?tigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie
? eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.

Description:

Die Erfindung betrifft biologisch wirksame Molek?le auf Grundlage von Nukleotiden, mit denen gezielt Zellen abget?tet werden k?nnen, die Verwendung der biologisch wirksamen Molek?le sowie einen Applikationskit zur Anwendung.

Verfahren, mit denen biologische Zellen gezielt abget?tet werden sollen, benutzen klassischer Weise physikalische Mittel, wie UV-Strahlung, Hitze, u. a., (Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG. The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct; 1(4): 383?9.; Gillespie EH, Gibbons SA. Autoclaves and their dangers and safety in laboratories. J Hyg (Lond). 1975 Dec; 75(3): 475?87.) oder chemische Substanzen, beispielsweise S?uren, Laugen, Formaldehyde, (National Toxicology Program. Final Report on Carcinogens Background Document for Formaldehyde. Rep Carcinog Backgr Doc. 2010 Jan; (10?5981): i-512.) welche die Struktur der Zelle an sich zerst?ren. Diese Mittel sind h?ufig umweltsch?dlich und kaum im Organismus anwendbar. Um in einem Organismus Zellen abzut?ten, werden biochemische Mittel (Proteininhibitoren, Antagonisten, Zytostatika, u. a.) verwendet (Tanaka S, Arii S. Current status of molecularly targeted therapy for hepatocellular carcinoma: basic science. Int J Clin Oncol. 2010 Jun; 15(3): 235?41. Epub 2010 May 27.), welche Zellen massiv in ihrer Physiologie beeinflussen und so ebenfalls zu einem Absterben der Zelle f?hren k?nnen. Allerdings k?nnen durch keines dieser Verfahren spezifische Zellarten im Organismus gezielt abget?tet werden, da diese Substanzen auf alle Zellen gleicherma?en wirken.

Ein molekularbiologischer Ansatz, Zellen gezielt zu beeinflussen ist der der Einsatz kurzer, doppelstr?ngiger RNA. Diese so genannten siRNA (engl. short interfering RNA) Molek?le k?nnen klassischer Weise nach ihrer Aktivierung mit der mRNA des Zielgens interagieren und bilden zusammen mit speziellen Endoribonukleasen einen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung ?RISC? (RNA induced silencing complex). Der RISC Komplex bindet an die Target-mRNA, wobei Endonukleasen die Ziel-mRNA schneiden. Auf diese Weise wird die Genexpression verhindert und somit das Entstehen von Zielproteinen gehemmt.

Die Hemmung der Genexpression durch Einbringen von kurzen (19?23 bp), doppelstr?ngigen RNA-Molek?len (siRNA) in eukaryotische Zellen, die spezifisch f?r einen Sequenzabschnitt der mRNA eines Zielgens ist, wurde bereits beschrieben (Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494?8; Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921?7; US 5,898,031 A; US 7,056,704 B2).

Mit Hilfe solcher Molek?le wird nicht das Ablesen eines Gens und die Produktion einer mRNA verhindert, sondern es wird durch die siRNA ein zelleigener Mechanismus initiiert, der die Target-mRNA abbaut. Schlie?lich wird, wie vorbeschrieben, die Bildung eines spezifischen Proteins unterdr?ckt, ohne die Expression weiterer Gene zu beeintr?chtigen (post-transcriptional gene silencing).

F?r derzeitige Anwendungen von siRNA wird h?ufig angestrebt, ausschlie?lich die Expression eines einzigen Gens in einer Zelle zu unterdr?cken. Effekte, bei denen mehrere Gene gleichzeitig oder unspezifisch ausgeschalten werden sind somit nicht erw?nscht, weshalb die Sequenzen der siRNA so gestaltet werden, dass diese Effekte unterbunden werden.

Ebenfalls wurden Methoden entwickelt, verst?rkt Zellen eines Zielgewebes mit siRNA in vivo zu transfizieren (Ikeda et. al.: ?Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA?, Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006) oder durch Bindung kurzer Peptide, welche zellspezifisch abgespalten werden eine Zellspezifit?t zu erreichen (WO 2008/098569 A2). Durch den Einsatz dieser modifizierten siRNA Molek?le kann erreicht werden, dass selektiv in bestimmten Zellen die Expression von Genen reduziert bzw. unterbunden wird.

Ist die verwendete siRNA Sequenz spezifisch f?r ?berlebenswichtige Gene der Zelle, kann dadurch das Absterben der Zelle bewirkt werden. Dieser Prozess kann durch die genannten Mechanismen ggf. auch zellspezifisch angewandt werden.

Nachteilig ist allerdings, dass das Abschalten eines einzigen Genes bzw. weniger Gene h?ufig nicht zwangsl?ufig zum Absterben dieser Zelle f?hrt; h?ufig m?ssten dazu spezifisch mehrere Gene gleichzeitig abgeschaltet werden, um den gew?nschten Effekt zu erreichen. Beispielsweise f?r therapeutische Anwendungen w?re es w?nschenswert, wenn mittels siRNA Molek?len Zellen direkt abget?tet werden k?nnten. Dadurch k?nnten insbesondere unter Verwendung der genannten Methoden ganz spezifisch Tumorzellen oder Virus-infizerte Zellen abget?tet werden.

Dar?ber hinaus besteht h?ufig das Problem, dass bei dem Genom vom Tumor- oder Virus-infizierten Zellen h?ufig Mutationen auftreten, weshalb die verwendeten siRNA Molek?le unwirksam werden k?nnen und somit die beabsichtigte Zellbeeinflussung versagt oder zumindest nicht effektiv eingesetzt werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Zellen in einem breiten Anwendungsgebiet, wirksam, zuverl?ssig und m?glichst effektiv im Organismus abzut?ten, ohne dass die vorgenannten Nachteile an sich bekannter chemischer, physikalischer, biochemischer oder molekularbiologischer Methoden auftreten.

Erfindungsgem?? sind die biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le, beispielsweise auf Grundlage von RNA, siRNA, PNA, DNA oder LNA, mit ihrer Nukleotidsequenz zur Bindungsm?glichkeit an die mRNA mehrerer Gene darauf orientiert, durch Anbindung an diese Gene mehrere, insbesondere eine Vielzahl, ?Off-Target?-Effekte f?r zellabt?tende Stress-Situationen auszul?sen.

Mit dieser Stress-Situation wird unabh?ngig von dem klassischen Einsatz der Nukleotid-Molek?le, insbesondere von siRNA, zur Reduktion der Expression eines einzelnen Gens, die Zelle durch die unspezifische Nukleotidsequenz so massiv beeinflusst, dass die Zelle abstirbt oder in der Zelle der programmierte Zelltod (Apoptose) eingeleitet wird.

Zwar sind, wie eingangs beschrieben, Nukleotid-Molek?le, beispielsweise auf Grundlage von siRNA, mit einer auf mRNA-Bindung ausgerichteten Nukleotidsequenz an sich hinreichend bekannt, jedoch ist diese Nukleotidsequenz dort jeweils spezifisch f?r die mRNA eines oder weniger Gene ausgerichtet, um mit selektiver Bindung an das bezweckte Zielgen eine definierte Genmanipulation in der Zelle und auf diese Weise eine genorientierte Zellbeeinflussung vorzunehmen.

Mit der Erfindung ist die Nukleotidsequenz bewusst so ausgestaltet, um an mehrere, insbesondere eine Vielzahl, mRNAs von Genen andocken zu k?nnen, ggf. auch unabh?ngig davon, ob diese f?r eine Bindung m?glichen mRNAs der Gene nun in der Zelle auch tats?chlich vorhanden sind oder nicht. Vordergr?ndiges Ziel der vorschlagsgem?? beabsichtigten mRNA-Bindung ist also keine vorgenannte auf die Zellaktivit?t ausgerichtete Genmanipulierung, sondern es sollen insbesondere mit einer Vielzahl (eigentlich beliebiger) mRNA-Bindungen der Nukleotid-Molek?le m?glichst viele ?Off-Target?-Effekte? ausgel?st werden, die bisher zur zielgerichteten Genbeeinflussung m?glichst zu vermeiden oder zu vermindern waren. Mit den m?glichst vielen ?Off-Target?-Effekten? soll vielmehr f?r die Zelle eine ?bergro?e Stress-Situation erzeugt werden, welche die Zielzelle nicht bew?ltigen kann und durch welche die besagte Zielzelle (nicht durch gezielte Manipulation der Genexpression, sondern durch allgemeinen Stress) bewusst abget?tet wird.

Die mit der Genbindung zwangsl?ufig und bekannter Weise auftretende und auf die Zellaktivit?t einwirkende spezielle Genbeeinflussung ist dabei ein Nebeneffekt und k?nnte je nach Wirkung der Genbeeinflussung die Zelleinwirkung (zus?tzlich zur besagten erfindungsgem?? beabsichtigten Stress-Situation) ggf. weiter unterst?tzen.

Die Auswahl der durch die Nukleotidsequenz bindungsm?glichen Zielgene wird damit nicht oder zumindest nicht vordergr?ndig als Zieleffekt von einer beabsichtigten Gen-Manipulation zur Zellbeeinflussung, sondern von der zweckbestimmten Wirkung der durch die Genbindungen erreichbaren ?Off-Target?-Effekte? und die mit denselben in der Zelle hervorgerufenen Stress-Situation bestimmt.

Um die besagten ?Off-Target?-Effekte zu erzeugen, werden die Nukleotidsequenzen so gew?hlt, dass diese nicht wie klassischerweise nur mit einem Zielgen, sondern mit so viel wie m?glich Zielgenen der Zellen ?bereinstimmen. Dadurch wird f?r eine Vielzahl von Genen eine toxisch wirkende Nukleotid-Interferenz erzeugt und die Physiologie der Zelle massiv beeinflusst.

Diese vorgeschlagene Anwendung kann in Kombination mit bekannten Mechanismen zum Erreichen einer Zellspezifit?t und mit an sich bekanten M?glichkeiten der Stabilisierung beispielsweise von siRNA und zur verbesserten Aufnahme der Nukleotid-Molek?le in Zellen angewandt werden.

Die vorgeschlagenen Nukleotidsequenzen sind nicht auf die Verwendung als klassische siRNA beschr?nkt; auch kurze (10?20 bp) doppelstr?ngige oder einzelstr?ngige RNA, lange (20?300 bp) doppel- oder einzelstr?ngige RNA, DNA oder chemische Analoge, wie beispielsweise PNA, k?nnen mit den vorgeschlagenen Nukleotidsequenzen zum Einsatz kommen.

Zus?tzlich zu der Induktion der besagten ?Off-Target?-Effekte kann die zellsch?digende Wirkung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le durch bekannte Stressinduzierende Nukleotid-Sequenzabfolgen unterst?tzt werden (FEDOROV Y et. al., Offtarget effects by siRNA can induce toxic phenotype. RNA (2006), 12: 1188?1196.) Durch ein geeignetes Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel, Polyethylenimin oder Liposomen, k?nnen die Wirkstoffmolek?le in an sich bekannter Weise in die Zellen eingebracht werden.

Die Molek?lkonstrukte k?nnen zum besseren Transport in bzw. an die Zellen sowie zu ihrer Stabilisierung oder zu ihrer Detektion au?erdem an weitere Stoffe (beispielsweise Nanopartikel als Tr?gersystem oder Fluorochrome) gebunden werden.

Die biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le sind geeignet zur gezielten Abt?tung eukaryontischer Zellen, insbesondere tierischer, pflanzlicher oder Pilzzellen, sowie virus-infizierter und prokaryontischer Zellen.

Bei Verwendung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le k?nnen diese auch in Kombination mit Proteaseinhibitoren eingesetzt werden.

Vorteilhaft ist ein Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der biologisch wirksamen Nukleotid-Molek?le, bestehend zumindest aus

  • ? wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das biologisch wirksame Molek?l enth?lt und weiter enthalten kann:
  • ? mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide,
  • ? mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Molek?le oder das Transfektionssystem enth?lt,
  • ? Verd?nnungs- und Reaktionspuffer f?r die Inhalte der Ampullen A, B und C
  • ? eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kan?le und andere ben?tigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie
  • ? eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausf?hrungsbeispielen n?her erl?utert werden. Es zeigen:

1: Schematische Darstellung einer bekannten siRNA, welche in eine Zelle eingebracht wird, f?r eine mRNA spezifisch ist und die Expression eines Zielgens unterdr?ckt

2: Schematische Darstellung einer erfindungsgem??en siRNA, welche in eine Zelle eingebracht wird und dort so viel wie m?glich unspezifische RNAi Effekte (Off-Target Effekte) ausl?st

3: Schematische Darstellung einer siRNA, welche in eine Zelle eingebracht wird und dort keine Verminderung der Expression von Genen und den Abbau von mRNAs bezweckt, sondern den Zelltod mittels in der Zelle durch spezifische Sequenzabschnitte der siRNA hervorgerufene Stressreaktionen.

In 1 ist der Mechanismus einer herk?mmlichen und bekannten siRNA 1 dargestellt, welche in eine Zelle 2 eingebracht wird (siehe symbolisierte Pfeildarstellung) und eine spezielle f?r eine Anbindung an eine erste genspezifische mRNA 3 Nukleotidsequenz (nicht explizit dargestellt) besitzt. Darauf hin wird die siRNA 1 in den RNA Induced Silencing Complex (RISC) eingebaut (ebenfalls nicht explizit dargestellt), welcher die siRNA 1 in ihre zwei einzelnen Str?nge teilt und sich der Antisense-Strang der siRNA 1 zusammen mit dem RISC an die erste mRNA 3 anlagert. Darauf hin wird die genspezifische erste mRNA 3 zerschnitten und fragmentiert, wodurch die Expression eines Zielgens, basierend auf der ersten mRNA 3, unterdr?ckt wird (vgl. abgebaute erste mRNA 7 in 1). Die darauf hin frei gewordene und in den RISC eingebundene siRNA 1 lagert sich nun an die n?chste in der Zelle 2 vorhandene spezifische erste mRNA 3 an und baut diese ebenfalls ab. Dabei wird darauf abgezielt, dass jede siRNA 1 an nur eine spezifische erste mRNA 3 bindet und diese abbaut. Weitere in der Zelle 2 au?erdem vorhandene zweite andere mRNA 4, dritte andere mRNA 5 und vierte andere mRNA 6 bleiben im Gegensatz zur ersten mRNA 3 jeweils von der siRNA 1 bzw. deren nicht explizit dargesteller Nukleotidsequenz unber?hrt, so dass Gene zu den mRNA 4?6 keine ver?nderte Expression erfahren. Diese Methode ist hinreichend bekannt.

2 zeigt als Vergleich den Mechanismus einer erfindungsgem??en siRNA 8, welche in die Zelle 2 eingebracht wird (siehe ebenfalls symbolisierte Pfeildarstellung), in welcher sich wiederum beispielhaft die erste mRNA 3, die zweite mRNA 4, die dritte mRNA 5 sowie die vierte mRNA 6 befinden. Die vorgeschlagene siRNA 8 enth?lt (aus ?bersichtsgr?nden nicht explizit dargestellt) eine Kette aus einer oder mehreren der Nukleotidsequenzen GGUA, CGUC, CGUU, CCAA, AAGG, GGUG, CUCG, CUCC, CUCU, CUUA, GGUC, GGUU, AAAG, AAAC, AAAU, AAGA, AAGC, AAGU, AACA, AACG, AACC, AACU, AAUA, CUUU, AAUG, AAUC, AAUU, AGGA, AGUG, AGUC, AGUU, ACAA, ACAG, ACAC, ACAU, ACGA, ACGG, ACGC, ACGU, ACCA, CAUU, CGAA, ACCG, ACCC, ACCU, ACUA, ACUG, ACUC, ACUU, AUAA, GGAG, GGAC, GGAU, GGGA, GGGC, GGGU, GGCA, GGCG, GGCC, GGCU, GCAA, GCAG, GCAC, GCAU, AUAG, AUAC, AUAU, AUGA, AUGG, AUGC, AUGU, AUCA, CGCG, CGCC, CGCU, AUCG, AUCC, AUCU, AUUA, AUUG, AUUC, AUUU, GAAA, GAAG, GAAC, GAAU, GAGA, GAGG, GAGC, GAGU, GACA, GACG, GACC, GACU, GAUA, GAUG, GAUC, GAUU, GGAA, GCGA, GCGG, GCGC, GCGU, GCCA, GCCG, GCCC, GCCU, GCUA, GCUG, GCUC, GCUU, GUAA, GUAG, GUAC, GUAU, GUGA, GUGG, GUGC, GUGU, GUCA, GUCG, GUCC, GUCU, GUUA, GUUG, GUUC, GUUU, CAAA, CAAG, CAAC, CAAU, CAGA, CAGG, CAGC, CAGU, CACA, CACG, CACC, CACU, CAUA, CAUG, CAUC, CGAG, CGAC, CGAU, CGGA, CGGG, CGGC, CGGU, CGCA, CGUA, CGUG, CCAG, CCAC, CCAU, CCGA, CCGG, CCGC, CCGU, CCCA, AGAA, AGAG, AGAC, AGAU, CCCG, CCCU, AGGG, AGGC, AGGU, AGCA, CCUA, CCUG, CCUC, CCUU, CUAA, CUAG, CUAC, CUAU, AGCG, AGUA, CUGA, CUGG, CUGC, CUGU, CUCA, CUUG, CUUC, AGCC, AGCU so dass die Gesamtheit der in der Kette gebundenen Nukleotidsequenzen im Gegensatz zu 1 nicht nur auf eine einzige der mRNA 3?6 abbauend wirkt, sondern auf mehrere bzw. eine Vielzahl und damit alle in 2 dargestellten mRNA Molek?le (mRNA 3?6) bindet. Dabei ist es m?glich, dass zumindest eine ausgew?hlte Nukleotidsequenz auf mehrere oder alle der dargestellten mRNA Molek?le (mRNA 3?6) bindet oder jeweils eine ausgew?hlte Nukleotidsequenz wirkt jeweils selektiv auf eine spezifische mRNA 3?6. Wichtig ist, dass m?glichst viele (im besten Fall alle) der mRNA 3?6 durch die Kette (Gesamtheit aller Nukleotidsequenzen) der siRNA 8 gebunden und abgebaut werden (vgl. abgebaute erste bis vierte mRNA 7, 9, 10, 11 in 2).

Durch den Abbau der besagten Vielzahl von mRNA Molek?len (im vorliegenden Beispiel vereinfachend lediglich vier mRNA Molek?le dargestellt) werden mehrere bis zahlreiche unspezifische RNAi Effekte (Off-Target Effekte) ausgel?st, indem die siRNA 8 mit (im besten Falle) nur einer Nukleotidsequenz die Expression mehrerer bis vieler Gene unterdr?ckt (vgl. abgebaute mRNA 7, 9, 10, 11 in 2) mit dem Ziel, auf diese Weise die Zelle 2 abzut?ten, welche durch die massive Wirkung der siRNA 8 abstirbt.

Als Beispiel kann durch die siRNA 8 mit einer Nukleotidsequenz (5'-3') UUAACUGUAUCUGGAGCtt die mRNA der Gene Suppressor Of Cytokine Signaling-1 (SOCS1, NM_003745.1), N-acetylneuraminic acid phosphatase (NANP, NM_152667.2), Transmembrane Protein 215 (TMEM215, NM_212558.2) und des CD81-Molek?ls (CD81, NM_004356.3) abgebaut werden. Eine Nukleotidsequenz der siRNA 8 AACUGUAUCUGGAGCtt ist spezifisch wirksam f?r die mRNAs der Gene Suppressor Of Cytokine Signaling 1 (SOCS1, NM_003745.1) und N-Acetylneuraminic Acid Phosphatase (NANP, NM_152667.2). Eine Nukleotidsequenz GGCUGAACAAAGGAGAtt wirkt spezifisch auf den Major Histocompatibility Complex, Class-I, G (HLA-G, NM_002127.4), Glycerol Kinase 5 (putative) (GK5, NM_001039547.1) und DIP2 disco-interacting protein 2 homolog C (NM_014974.2). Entsprechend wirkt die siRNA 8 mit der Sequenz GCUCACCAAUGGAGAtt spezifisch auf den Complement Component (3b/4b) Receptor 1 (Knops blood group) (CR1, NM_000651.4), transcript variant S, Complement Component (3b/4b) Receptor 1 (Knops blood group) (CR1, NM_000573.3), transcript variant F und die Glutathione S-transferase alpha 4 (GSTA4, NM_001512.3). Als weitere Beispiele f?r die Nukleotidsequenz der siRNA 8 seien die Sequenz UGGCUGGCUGGCUGGCtt, vorteilhaft gegen die Pyroglutamyl-peptidase I (PGPEP1, NM_017712.2), Rap guanine nucleotide exchange factor (GEF) 3 (RAPGEF3, NM_006105.5), transcript variant 2 und den Retinoid X Receptor, alpha (RXRA, NM_002957.4) sowie die Sequenz GUCUAUCAGCACAAUtt gegen den Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (acute-phase response factor) (STAT3, NM_213662.1), transcript variant 3, Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (acute-phase response factor) (STAT3, NM_003150.3), transcript variant 2, Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (acute-phase response factor) (STAT3, NM_139276.2), transcript variant 1, Protocadherin alpha 9 (PCDHA9, NM_014005.3) und Secernin 3 (SCRN3, NM_024583.3) genannt.

Des Weiteren k?nnen die einzelnen Sequenzen der siRNA 8 auch in Kombination zeitgleich oder zeitlich getrennt verabreicht sowie in gleichen oder unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt werden, um eine Vielzahl von Genen effizient auszuschalten bzw. mRNAs abzubauen.

In 3 ist ein zus?tzlicher Effekt dargestellt, welcher die toxische Wirkung der vorbeschriebenen erfindungsgem??en siRNA 8 noch weiter unterst?tzen kann. Dabei werden zus?tzlich eine oder mehrere Nukleotidsequenzen (wie beispielsweise AAA, UUU GCCA, UGGC, GUCCUUCAA, UGUGU, AUUUG, GUUUU, AUUUU, CUUUU, UUUUU oder GUUUG) in eine siRNA 12 eingebunden, welche bekannterma?en solche Stressreaktionen in der Zelle 2 hervorrufen, die nicht auf die Bindung der siRNA 8 an eine oder mehrere mRNA zur?ckzuf?hren sind. Dabei vermindern diese Nukleotidsequenzen der siRNA 12 mit dieser Wirkung, nach Einbringung der siRNA 12 in die Zelle 2 nicht die Expression von Genen und den Abbau von mRNAs (vgl. in 3 die dargestellten und nicht mit diesen Nukleotidsequenzen abgebauten mRNA 3?6), sondern induzieren unspezifische Stressreaktionen in der Zelle, welche zus?tzlich zu der gem?? 2 beschriebenen Wirkung auftreten und damit noch verst?rkter zum Absterben der Zelle 2 f?hren.

Bezugszeichenliste

1, 8, 12
siRNA
2
Zelle
3, 4, 5, 6
genspezifische mRNA
7, 9, 10, 11
abgebaute genspezifische mRNA

Sequenzprotokoll

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgef?hrten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschlie?lich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA ?bernimmt keinerlei Haftung f?r etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • US 5898031 A [0004]
  • US 7056704 B2 [0004]
  • WO 2008/098569 A2 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Hsie AW, Brimer PA, Mitchell TJ, Gosslee DG. The dose-response relationship for ultraviolet-light-induced mutations at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase locus in Chinese hamster ovary cells. Somatic Cell Genet. 1975 Oct; 1(4): 383?9. [0002]
  • Gillespie EH, Gibbons SA. Autoclaves and their dangers and safety in laboratories. J Hyg (Lond). 1975 Dec; 75(3): 475?87. [0002]
  • National Toxicology Program. Final Report on Carcinogens Background Document for Formaldehyde. Rep Carcinog Backgr Doc. 2010 Jan; (10?5981): i-512. [0002]
  • Tanaka S, Arii S. Current status of molecularly targeted therapy for hepatocellular carcinoma: basic science. Int J Clin Oncol. 2010 Jun; 15(3): 235?41. Epub 2010 May 27. [0002]
  • Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494?8 [0004]
  • Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921?7 [0004]
  • Ikeda et. al.: ?Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA?, Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006 [0007]
  • FEDOROV Y et. al., Offtarget effects by siRNA can induce toxic phenotype. RNA (2006), 12: 1188?1196. [0021]