Title:
Aminoglykosid-spezifische Aptamere
Kind Code:
B3
Abstract:

Die Erfindung betrifft Aptamere, die an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside binden, Verwendungen der Aptamere sowie Verfahren zum Nachweis und Anreicherung von Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, in denen das Aptamer eingesetzt wird, sowie einen Biosensor, eine Lateralfluss-Assay-Vorrichtung und ein Messgerät, die ein solches Aptamer enthalten und in den genannten Verfahren einsetzbar sind.



Inventors:
Nikolaus, Nadia, Dr. (04179, Leipzig, DE)
Pragne, Anja (04277, Leipzig, DE)
Stoltenburg, Regina, Dr. (04157, Leipzig, DE)
Strehlitz, Beate, Dr. (04279, Leipzig, DE)
Application Number:
DE102011006612A
Publication Date:
04/12/2012
Filing Date:
03/31/2011
Assignee:
Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH - UFZ, 04318 (DE)
Foreign References:
200400185302004-01-29
Other References:
DE-LOS-SANTOS-ALVAREZ, N. u.a.: SPR sensing of small molecules with modified RNA aptamers: detection of neomycin B. Biosens. Bioelectron. (2009) 24 (8) 2547-53
SONG, K.M. u.a.: Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal. Biochem. (2011) 415(2):175-81 (gutachtlich)
Attorney, Agent or Firm:
Patentanwälte Bressel und Partner, 10785, Berlin, DE
Claims:
1. Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside bindet und das ausgew?hlt ist aus
a) einem Aptamer umfassend eine Nukleins?uresequenz, die ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist
c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert,
d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind
e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

2. Aptamersonde zur Detektion einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, umfassend ein oder mehrere verschiedene Aptamers wie in Anspruch 1 beschrieben und ein Markierungsmittel.

3. Biosensor, aufweisend ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in Anspruch 1 beschrieben.

4. Feste Phase, insbesondere zur Verwendung beim Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, an die ein oder mehrerere verschiedene Aptamere nach Anspruch 1 immobilisiert ist/sind.

5. Teststreifen, insbesondere zur Verwendung in Lateralfluss-Assays, der ein oder mehrerere verschiedene Aptamere nach Anspruch 1 enth?lt.

6. Lateralfluss-Assay-Vorrichtung, die einen Teststreifen nach Anspruch 5 aufweist.

7. Kit, umfassend ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in Anspruch 1 beschrieben.

8. Messger?t zum Nachweis von Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, aufweisend ein oder mehrere verschiedene Aptamere nach Anspruch 1, eine Aptamersonde nach Anspruch 2, einen Biosensor nach Anspruch 3 oder einen Teststreifen nach Anspruch 5.

9. Verwendung des Aptamers wie in Anspruch 1 beschrieben zum Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside.

10. Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, bei dem
a) ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in Anspruch 1 beschrieben mit einer Probe, die eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside enth?lt, in Kontakt gebracht wird/werden und
b) eine Bindung zwischen dem/den Aptamer(en) und der/den Verbindung(en) aus der Gruppe der Aminoglykoside nachgewiesen wird.

11. Verfahren zur Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, bei dem
a) ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie in einem der Anspruch 1 beschrieben mit einer Probe, die eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside enth?lt, in Kontakt gebracht wird/werden, wobei ein Komplex oder Komplexe aus dem/den Aptamer(en) und der/den Verbindung(en) aus der Gruppe der Aminoglykoside gebildet wird,
b) der/die Komplex(e) und die ?brige Probe voneinander getrennt werden, und
c) optional die Verbindung(en) aus der Gruppe der Aminoglykoside aus dem Komplex isoliert wird/werden.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, bindet, Verwendungen des Aptamers sowie Verfahren zum Nachweis und Anreicherung von Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, in denen das Aptamer eingesetzt wird.

Aminoglykoside sind Oligosaccharide, die einen Aminozucker enthaften. Bei einem Aminozucker ist eine oder mehrere Hydroxygruppen durch eine Aminogruppe ersetzt, wobei ein oder mehrere Wasserstoffatome der Aminogruppe durch einen Substituenten substituiert sein k?nnen. Die wichtigste Anwendung von Aminoglykosiden ist die Anwendung als Antibiotika.

Kanamycine sind strukturell eng verwandte Aminoglykoside. Kanamycin A geh?rt zur Gruppe der Kanamycine. Handels?bliches Kanamycin enth?lt hauptsachlich Kanamycin A, ist aber ein Gemisch aus den Kanamycinen A, B und C. Es ist ein verschreibungspflichtiges Aminoglykosid-Antibiotikum aus Streptomyceten (Streptomyces kanamyceticus). Des Weiteren geh?ren Tobramycin und Dibekacin zur Gruppe der Kanamycine. Weitere Aminoglykoside, die auch als Antibiotika eingesetzt werden, sind Streptomycin, Neomycin, Paromomycin, Gentamicin, Spectinomycin sowie die halbsynthetischen Aminogylcoside Amikacin und Netilmicin.

In Deutschland wird Kanamycin in der Humanmedizin als Sulfatsalz in Form von Augentropfen und -salben zur lokalen Behandlung bakterieller Infektionen des Auges (z. B. bei einer Bindehautentz?ndung) eingesetzt. In den USA sind von Kanamycin auch Darreichungsformen zur oralen und parenteralen Anwendung im Handel.

In der Veterin?rmedizin wird Kanamycin als Reserveantibiotikum zur Behandlung von Magen-Darm-Infektionen durch Kanamycin-empfindliche Erreger bei Hunden und Katzen sowie in Kombination mit Spiramycin bei akuten und chronischen, gegen andere Therapien resistente Mastitiden verwendet. In der Humanmedizin dient Kanamycin als Reserveantibiotikum unter anderem f?r die Behandlung multiresistenter Tuberkulose.

Weit verbreitet sind Kanamycine auch in der Molekularbiologie als Selektionsantibiotikum im Rahmen von Klonierungsexperimenten. Bei diesen gentechnischen Arbeiten werden Mikroorganismen, vornehmlich Escherichia coli, mit Plasmiden transformiert, die zus?tzlich zu den interessierenden Genen mit Resistenzgenen, beispielsweise gegen Kanamycin ausgestattet sind. Somit wird in Klonierungsexperimenten eine Auslese hinsichtlich positiver Transformanten (plasmidtragende E. coli) erlaubt, indem man diese in kanamycinhaltigen Medien kultiviert.

Im Gegensatz zu den meisten anderen Antibiotika wirkt Kanamycin auch auf Pflanzen toxisch. Entsprechend kann beim Arbeiten mit transgenen Pflanzen und einer entsprechenden Versuchsdurchf?hrung auch auf Kanamycin-Selektionsmedien zur?ckgegriffen werden. Aufgrund dieser vielf?ltigen Anwendungen gelangt Kanamycin ?ber das Abwasser in die Umwelt. Wird es in Kl?ranlagen nicht vollst?ndig abgebaut, oder gelangt es aus der Tierhaltung ?ber des Oberfl?chen- und Grundwasser in das Trinkwasser, kann es zu einer dauerhaften Belastung des Menschen mit dem Antibiotikum kommen, was wiederum die Ursache f?r Antibiotikaresistenzen sein kann.

Die Bestimmung oder Messung von Kanamycin und insbesondere Kanamycin A im Trinkwasser, in Oberfl?chen- und Grundwasser und in Kl?ranlagen ist daher sehr wichtig. Ein einfaches Testsystem f?r Kanamycin A w?rde die M?glichkeit bieten, Antibiotika aus der Gruppe der Kanamycine einfach und schnell vor Ort zu messen.

Die Messung der Antibiotika erfolgt bisher mit aufw?ndigen Methoden wie GC/MS oder HPLC im Labor, wof?r teure Messger?te und gut ausgebildetes Personal erforderlich sind, wodurch die Messungen teuer sind und den Transport der Proben in des Labor erfordern.

US 2004/0018530 A1 betrifft eine Kombination eines SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) Verfahrens mit Kapillar-Elektrophorese zur Selektion von Aptameren. Es wird angegeben, dass das Verfahren dazu verwendet werden kann, Aptamere gegen Kanamycin aufzufinden, ohne explizite Beispiele daf?r zu offenbaren.

De Los Santos Alvarez et al., ?SPR sensing of small molecules with modified RNA Aptamers: Detection of neomycin B?, Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 2547?2553, beschreiben RNA-Aptamere f?r Neomycin B. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, spezifische Substanzen zur Verf?gung zu stellen, die einen schnellen, einfachen und zuverl?ssigen Nachweis von Kanamycin A und anderer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine erm?glichen.

Die Aufgabe wird mit einem Aptemer nach Anspruch 1 gel?st, das das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside bindet, insbesondere an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromamycin. Insbesondere ist das erfindungsgem??e Aptamer spezifisch f?r Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere f?r eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin. Des erfindungsgem??e Aptamer ist ein Nukleins?ure-Aptamer, insbesondere ein einzelstr?ngiges DNA(ssDNA)- oder ein RNA-Aptamer.

Der Begriff ?Aminoglykoside? bezeichnet Oligosaccharide, die einen Aminozucker enthalten. Insbesondere umfasst sind Aminoglykoside, die als Antibiotika eingesetzt werden.

Bevorzugte Aminoglykoside, auf die sich die nachfolgende Offenbarung insbesondere bezieht, und die ein besonders bevorzugtes Target f?r die erfindungsgem??en Aptamere darstellen, sind die Gruppe der Kanamycine, Streptomycin, Neomycin, Paromomycin, Gentamicin, Spectinomycin, Amikacin, Netilmicin, Apramycin und Geneticin. Besonders bevorzugte Aminoglykoside sind die Gruppe der Kanamycine und Paromomycin. Die Gruppe der Kanamycine umfasst Kanamycin A, Kanamycin B, Kanamycin C, Tobramycin und Dibekacin.

Der allgemeine Begriff ?Aptamere? bezeichnet im Stand der Technik kurze einzelstr?ngige Nukleins?ure-Oligomere, auch bezeichnet als Oligonukleotide, die spezifisch an eine Zielstruktur oder ein Zielmolek?l, auch bezeichnet als Target, binden k?nnen, beispielsweise an ein Protein, an niedermolekulare Verbindungen, wie organische Substanzen, Aminos?uren und Antibiotika, Nukleins?uren, Viruspartikel oder (Mikro)Organismen. Die Aptamer-Target-Bindung erfolgt beispielsweise ?ber die Strukturkompatibilit?t, so genannte ?Stacking interactions? bei aromatischen Ringstrukturen (Stapelkr?fte durch Elektronenwechselwirkung mit Nachbarbasen), elektrostatische Wechselwirkungen (z. B. Van der Waals-, Ionen-, Dipolkr?fte) und Wasserstoffbr?ckenbindungen.

Auch Aptamere mit Peptidstruktur sind bekannt, wobei sich die vorliegende Erfindung ausschlie?lich auf Nukleins?ure-Aptamere bezieht. Somit bezeichnet der Begriff ?Aptamere? nachfolgend Nukleins?ure-Aptamere. Bei Nukleins?ure-Aptameren unterscheidet man beispielsweise DNA-Aptamere, gebildet aus einzelstr?ngiger DNA (ssDNA), und RNA-Aptamere. Aptamere zeichnen sich durch die Ausbildung einer spezifischen dreidimensionalen Struktur, die von der Nukleins?uresequenz abh?ngt, aus. Diese Struktur bef?higt Aptamere, analog einer Antigen-Antik?rper-Bindung Zielstrukturen passgenau zu binden. Eine bestimmte Nukleins?uresequenz eines Aptamers kann bei definierten Bedingungen eine dreidimensionale Struktur aufweisen, die spezifisch f?r eine definierte Zielstruktur (Target) ist. Die dreidimensionale Struktur eines Aptamers entsteht u. a. infolge von intramolekularen Basenpaarungen nach Watson und Crick und ?ber Hoogsteen-Basenpaarungen (Quadruplex).

Erfindungsgem??e Aptamere k?nnen beispielsweise mit dem SELEX-Verfahren (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) erhalten werden. Grundlegende Arbeiten zum SELEX-Verfahren stammen von Tuerk and Gold, Science 249 (1990) 505?510, sowie Ellington and Szostak, Nature 346 (1990) 818?822. SELEX Verfahren sind weiterhin offenbart in US 5,567,588 und US 5,270,163.

Im SELEX Verfahren wird zun?chst eine kombinatorische Zufallsbibliothek, bestehend aus einzelstr?ngigen DNA(ssDNA)-Oligonukleotiden erzeugt. Die Oligonukleotide weisen einen internen variablen Bereich auf, mit beispielsweise 40?60 Nukleotiden, der am 5' und 3' Ende von Primerregionen flankiert wird. Die Primerregionen dienen als Primerbindungsstellen f?r eine PCR Amplifikation. Kombinatorische Zufallsbibliotheken k?nnen von kommerziellen Anbietern bezogen werden. Die Variabilit?t einer Bibliothek liegt beispielsweise im Bereich von ca. 1015 verschiedenen Molek?len. Ausgehend von der einzelst?ngigen DNA-Oligonukleotid-Bibiothek werden ?ber verschiedene Selektions- und Amplifikationsschritte zyklusweise die Oligonukleotide angereichert, die am besten an das Target binden. Jeder Zyklus besteht aus folgenden Teilschritten:

  • a) Bindung der Oligonukleotide an das Target,
  • b) Waschen der Oligonukleotid-Target-Komplexe zur Entfernung von ungebundenen Oligonukleotiden,
  • c) Elution der am Target gebundenen Oligonukleotide,
  • d) Amplifikation der eluierten Oligonukleotide mittels PCR,
  • e) Reinigung der relevanten ssDNA-Oligonukleotide aus dem PCR-Produkt

Nach jedem Zyklus wird der selektierte und angereicherte Oligonukleotidpool als Ausgangsmaterial f?r einen n?chsten Zyklus genutzt. Vorteilhafterweise werden 8 bis 12 Zyklen durchlaufen.

Ein SELEX Verfahren zur Isolierung erfindungsgem??er Aptamere ist in den beigef?gten Beispielen genauer beschrieben. Ein beispielhaftes Verfahren zur Auffindung von erfindungsgem??en Aptameren ist das sogenannte Capture-SELEX Verfahren, das in den beigef?gten Beispielen beschrieben ist.

Nach Analyse der Sequenz k?nnen erfindungsgem??e Aptamere sowie Varianten, Mutanten, Fragmente und Derivate davon, welche nachfolgend noch beschrieben werden, mit ?blichen Techniken der chemischen DNA- und RNA-Synthese hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Ist die Sequenz eines DNA Aptamers bekannt, so kann ein RNA Aptamer mit der gleichen Sequenz hergestellt werden. Ferner k?nnen die Bindungseigenschaften einzelner Aptamere an das Target untersucht werden.

Vorzugsweise sind die erfindungsgem??en Aptamere synthetische Oligonukleotide, die vorzugsweise nach dem soeben beschriebenen SELEX Verfahren aus einer zugrunde gelegten synthetischen, kombinatorischen Oligonukleotid-Bibliothek selektiert wurden.

Die Erfindung betrifft am Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, die ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 54, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist
  • c) einem Aptamer, des mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

Die Funktionalit?t der Aptamere aus a)?f), also die Bindung an Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside kann mit einer Sekund?rstrukturanalyse der Aptamere, abgesch?tzt werden. Auch die Funktionalit?t sonstiger in dieser Beschreibung genannter Varianten kann so abgesch?tzt werden. Die Modellierung der m?glichen Sekund?rstruktur der Aptamere kann unter Nutzung des im Internet frei verf?gbaren Programms ?mfold? (Version 3.1 oder 3.5) erfolgen. Dieses Programm f?hrt eine Analyse der zweidimensionalen Struktur mit Hilfe einer Energieminimierungsmethode aus (Zuker M., 2003, Nucleic Acid Research 31, 3406?3415). Bei der Faltung der Aptamere kann es zu Stems (doppelstr?ngige Bereiche), Loops, d. h. Ausschleifungen von einzelstr?ngigen Bereichen, wie Haarnadel- oder interne Schleifen, und Bulbs, d. h. kleine einzelstr?ngige Ausbuchtungen in doppelstr?ngigen Bereichen, kommen. Mit dem Programm mfold wird f?r eine Aptamer-Nukleotidsequenz die hypothetische Sekund?rstruktur bei Standardbedingungen bestimmt (Bindungs-/Faltungstemperatur: 21?C, Ionenst?rke des Bindungspuffers: [Na+] 100 mM/[Mg2+] 2 mM). Bindungspufferzusammensetzung: 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2. Der Fachmann kann sehr leicht eine gro?e Anzahl Varianten der konkret mit Sequenzen beschriebenen erfindungsgem??en Aptamere entwerfen, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion einzelner Basen. Solche Varianten k?nnen per Computer, wie oben beschrieben, in gro?er Zahl und ohne experimentellen Aufwand auf ihre Sekund?rstruktur analysiert werden. Wenn eine ?bereinstimmung der Sekund?rstruktur einer Variante mit der Sekund?rstruktur eines konkret mit Sequenz beschriebenen Aptamers vorliegt, ist eine Funktionalit?t der Variante wahrscheinlich oder bisweilen sehr wahrscheinlich.

Varianten der Aptamere nach Anspruch 1a) werden nachfolgend erl?utert.

Von der Erfindung umfasst sind Aptamere, deren Sequenz eine Identit?t von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 93%, oder mindestens 95%, oder mindestens 96%, oder mindestens 97%, und am meisten bevorzugt mindestens 98%, mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58 aufweisen.

Unter dem Begriff ?Identit?t? soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Anzahl der ?bereinstimmenden Nukleotide (Identit?t), ausgedr?ckt in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identit?t zwischen zwei betreffenden Nukleins?uresequenzen mit Hilfe von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander verglichen werden, unterschiedliche L?ngen auf, ist die Identit?t so zu ermitteln, dass die Anzahl an Nukleotide, welche die k?rzere Sequenz mit der l?ngeren Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identit?t bestimmt. Vorzugsweise wird die Identit?t mittels des bekannten und der ?ffentlichkeit zur Verf?gung stehenden Computerprogramms ClustalW2 bestimmt. Auf die Definition von Identit?t in dem Programm ClustalW2 und die Methode zu ihrer Ermittlung, die ?ffentlich zug?nglich sind, wird in dieser Erfindung ausdr?cklich Bezug genommen.

ClustalW2 wird ?ffentlich zur Verf?gung gestellt vom European Bioinformatics Institute (EBI) des European Molecular Biology Laborstory (EMBL) und kann im Internet unter http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ abgerufen werden. Wenn das ClustalW2 Computerprogramm benutzt wird, um die Identit?t zwischen z. B. der Nukleotidsequenz der im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleins?uremolek?le und der Nukleotidsequenz von anderen Nukleins?uremolek?len zu bestimmen, werden folgende Parameter eingestellt: DNA Weight Matrix: IUB; GAP OPEN: 10; GAP EXTENSION: 0,20; GAP DISTANCES: 5; NO END GAPS: no; ITERATION: none; NUMITER: 1; CLUSTERING: NJ.

Gegenstand der Erfindung ist auch jedes Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines zuvor beschriebenen, erfindungsgem??en Aptamers hybridisiert, vorausgesetzt, dass ein solches Aptamer an Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet.

Der Begriff ?Hybridisierung? bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 3. Aufl. (2001) Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind.

Nukleins?uremolek?le, die mit den genannten Molek?len hybridisieren k?nnen beispielsweise aus DNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleins?uremolek?le kann dabei unter Verwendung der genannten Nukleins?uremolek?le (SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58) oder Teile dieser Molek?le bzw. der reversen Komplemente dieser Molek?le erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 3. Aufl. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY). Bei als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente oder Oligonukleotide handeln, die mit Hilfe g?ngiger Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im Wesentlichen mit der eines in Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Aptamers bzw. dessen komplement?ren Strangs ?bereinstimmt.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Aptamer, das von einem Aptamer mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58 dadurch abgeleitet ist, dass bei einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58 ein oder mehrere Nukleotide substituiert, entfernt (deletiert), innerhalb der Sequenz eingef?gt (insertiert) und/oder am 5'-Ende und/oder 3'-Ende angef?gt sind, wobei ein solches Aptamer an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet. Derart ver?nderte Aptamere weisen vorzugsweise eine Identit?t von mindestens 70%, oder mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 93%, oder mindestens 95%, oder mindestens 96%, oder mindestens 97%, und am meisten bevorzugt mindestens 98% mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58 auf. Der Begriff Identit?t wurde zuvor definiert. Eine Sequenz, bei der ein oder mehr Nukleotide substituiert sind, bezeichnet man auch als Substitutionsmutante, eine Sequenz, bei der ein oder mehr Nukleotide deletiert sind, als Deletionsmutante und eine Sequenz, bei der ein oder mehr Nukleotide insertiert sind, als Insertionsmutante. Vorzugsweise sind insgesamt, bezogen auf Substitution, Deletion und Insertion in einem Aptamermolek?l, bis zu 80 Nukleotide substituiert, deletiert, und/oder insertiert, mehr bevorzugt bis zu 60 Nukleotide, oder bis zu 50 Nukleotide, noch mehr bevorzugt bis zu 40 Nukleotide, oder bis zu 30 Nuleotide, insbesondere bevorzugt bis zu 10 Nukleotide oder bis zu 8 Nukleotide oder bis zu 5 Nukleotide, weiterhin bevorzugt bis zu 3 Nukleotide, und am meisten bevorzugt bis zu 2 Nukleotide. Selbstverst?ndlich h?ngt die Anzahl m?glicher Deletionen von der Gesamtzahl Nukleotide in einem Aptamer ab. Bei einem Aptamer mit einer der SEQ ID NO: 55 bis 58 sind bis zu 5, vorzugsweise bis zu 3 Nukleotide, am meisten bevorzugt bis zu 2 Nukleotide substituiert, deletiert und/oder insertiert.

Bei einer Anf?gung sind vorzugweise am 5' und/oder am 3' Ende des Aptamers bis zu 100 Nukleotide angef?gt, mehr bevorzugt bis zu 50 Nukleotide, noch mehr bevorzugt bis zu 40 Nukleotide, oder bis zu 20 Nuleotide, insbesondere bevorzugt bis zu 10 Nukleotide oder bis zu 8 Nukleotide, am meisten bevorzugt bis zu 5 Nukleotide.

In einer speziellen Ausf?hrungsform, die mit den vorigen kombiniert werden kann, weisen die in den Punkten b) bis f) beschriebenen Aptamer-Abwandlungen, insbesondere wenn eine der SEQ ID NO: 1?54 betroffen ist, eins oder mehrere der Motive ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 59), AGATAGTAAGTGCAATCT (SEQ ID NO: 60) und TGAGGCTCGATC (SEQ ID NO: 61) auf, entweder in unver?nderter Form oder in im Wesentlichen unver?nderter Form. Vorliegen k?nnen somit die oben erw?hnten Motive einzeln, oder das Motiv mit der SEQ ID NO: 59 und das Motiv mit der SEQ ID NO: 60, das Motiv mit der SEQ ID NO: 59 und das Motiv mit der SEQ ID NO: 61, das Motiv mit der SEQ ID NO: 60 und das Motiv mit der SEQ ID NO: 61, oder die Motive mit der SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 und SEQ ID NO: 61, entweder in unver?nderter Form oder in im Wesentlichen unver?nderter Form. Im Wesentlichen unver?ndert bedeutet, dass bis zu maximal 5 Nukleotide, vorzugsweise maximal 4 Nukleotide, am meisten bevorzugt maximal 3 Nukleotide, bei diesem Motiv substituiert, deletiert und/oder insertiert sind.

Bei einem Aptamer, bei dem gegen?ber einem Aptamer, welches eine Nukleins?uresequenz umfasst, die ausgew?hlt ist aus einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 58, ein oder mehrere Nukleotide angef?gt sind, k?nnen Anf?gungen am 5'-Ende des Aptamers und/oder am 3'-Ende des Aptamers erfolgen. Bei Anf?gungen kann es sich beispielsweise um Oligonukleotide handeln, die als Spacer zwischen der Aptamersequenz und einer Markierung dienen oder um ein Oligonukleotid das eine Sequenz aufweist, die komplement?r zu einem gelabelten Oligonukleotid ist, wie beschrieben in WO 2005113817. Verschiedene weitere anf?gbare Sequenzen, welche die Bindungseigenschaften des Aptamers an sein Target nicht beeintr?chtigen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der SELEX Verfahren bekannt, beispielsweise aus Conrad et al., ?In Vitro Selection of Nucleic Acid Aptamers That Bind Proteins, ?Methods in Enzymology, 267: 336?83 (1996); Ciesiolka et al., ?Affinity Selection-Amplification from Randomized Ribooligonucleotide Pools, ?Methods in Enzymology, 267: 315?35 (1996); and Fitzwater et al., ?A SELEX Primer, ?Methods in Enzymology, 267: 275?301 (1996).

Fragmente, auch bezeichnet als Teile oder Teilsequenzen, weisen die zuvor beschriebene Funktionalit?t der erfindungsgem??en Aptamere auf. Fragmente werden erhalten, indem man am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende eines erfindungsgem??en Aptamers eine oder mehrere Nukleins?uren entfernt. Fragmente haben vorzugsweise eine L?nge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 20 Nukleotiden, mehr bevorzugt mindestens 30 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt mindestens 40 Nukleotiden, weiterhin bevorzugt mindestens 50 Nukleotiden, und am meisten bevorzugt mindestens 60 Nukleotiden. Fragmente sind beispielsweise solche Aptamere, bei welchen die Motive ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 59) und AGATAGTAAGTGCAATCT (SEQ ID NO: 60) ganz oder teilweise entfernt sind.

Der Begriff ?Derivat? bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein Aptamer, das eine chemische Struktur aufweist, die in nat?rlicher DNA oder RNA nicht vorkommt.

Insbesondere bezeichnet der Begriff Derivat ein Aptamer, das eine chemische Struktur enth?lt, die von Desoxyribose, Ribose, Phosphat, Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Thymin (T), oder Uracil (U) abweichend ist. Ein Aptamer-Derivat kann an der Nukleobase, an der Pentose oder am Phosphat-R?ckgrat modifiziert sein.

Insbesondere bezeichnet der Begriff ?Derivat? ein Aptamer,

  • ? bei dem nat?rlich in DNA und RNA vorkommende Nukleotide teilweise oder vollst?ndig durch chemisch davon abweichende Nukleotide, sogenannte modifizierte Nukleotide, ersetzt sind und/oder
  • ? dessen molekulare Struktur anderweitig modifiziert ist, insbesondere durch Anbindung nicht nat?rlich in RNA oder DNA vorkommender Strukturen, und/oder
  • ? die ein modifiziertes R?ckgrat aufweisen

Spezielle Beispiele f?r Derivate sind, ohne darauf beschr?nkt zu sein,

? Aptamere, die an mindestens einem Nukleotid eine Alkylierung, Arylierung oder Acetylierung, Alkoxylierung, Halogenierung, eine Aminogruppe oder eine andere funktionelle Gruppe aufweisen. Beispiele f?r modifizierte Nukleotide sind 2'-Fluor-Ribonucleotide, 2'-NH2-, 2'-OCH3- und 2'-O-methoxyethyl-Ribonukleotide, die f?r RNA-Aptamere genutzt werden.

  • ? Aptamere, die eine Basenmodifikation aufweisen, wie Bromuridin,
  • ? Markierte Aptamere, auch bezeichnet als gelabelte Aptamere. Bevorzugte Markierungen (Label) sind visuell, optisch, photonisch, elektronisch, akustisch, opto-akustisch, nach Masse, elektrochemisch, elektrooptisch, spektrometrisch, enzymatisch, oder anderweitig chemisch, biochemisch oder physikalisch detektierbar. Label k?nnen beispielsweise angebundene Reporter-, Marker- oder Adaptermolek?le sein. Beispiele hierf?r sind markierte Aptamere, deren Markierung durch Lumineszenz, UV/VIS-Farbgebung, enzymatisch, elektrochemisch, immunologisch oder radioaktiv nachgewiesen werden kann. Beispiele f?r Markierungssubstanzen sind weiter unten bei der Erl?uterung von erfindungsgem??en Verfahren angegegeben, bei denen markierte Aptamere eingesetzt werden k?nnen.
  • ? Aptamere, die enantiomere Nukleotide aufweisen.
  • ? Aptamere, die ganz oder teilweise als Phosphorthioat-RNA oder -DNA, Phosphordithioat-RNA oder -DNA, Phosphorselenoat-RNA oder -DNA, Phosphordiselenoat-RNA oder -DNA, Phosphoroamidat-RNA oder -DNA, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), N3'-P5' Phosphoramidat RNA/DNA, Cyclohexennukleins?ure (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA) oder Spiegelmer vorliegen, oder die Phosphoramidatmorpholin (PMO) Komponenten aufweisen (siehe auch Chan et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2006) 33, 533?540).

Durch manche der Modifikationen k?nnen Aptamere gegen Nukleins?ure-spaltende Enzyme stabilisiert werden. Bei der Stabilisierung der Aptamere kann grunds?tzlich zwischen der nachtr?glichen Modifikation der Aptamere und der Selektion mit bereits modifizierter RNA/DNA unterschieden werden. Die Stabilisierung ber?hrt die Affinit?t der modifizierten RNA/DNA-Aptamere nicht, verhindert jedoch die schnelle Zersetzung der Aptamere in einem Organismus oder biologischen L?sungen durch RNasen/DNasen. Ein Aptamer wird im Rahmen der Erfindung als stabilisiert bezeichnet, wenn die Halbwertszeit in biologischen Seren gr?sser als eine Minute, vorzugsweise gr?sser als eine Stunde, besonders bevorzugt gr?sser als ein Tag ist. Die Aptamere k?nnen auch mit Reportermolek?len modifiziert sein, die neben der Detektion der markierten Aptamere auch zur Erh?hung der Stabilit?t beitragen k?nnen.

In einer weiteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 45, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 10,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 10,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 10
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

Zu den Punkten b)?f) gelten, auch f?r die noch folgenden Ausf?hrungsformen, analog die weiter oben ausgef?hrten Offenbarungen.

In einer weiteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 50, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 23 bis SEQ ID NO: 26,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 23 bis SEQ ID NO: 26,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 23 bis SEQ ID NO: 26
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

In einer weiteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 52, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 29 bis SEQ ID NO: 31,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 29 bis SEQ ID NO: 31,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 29 bis SEQ ID NO: 31,
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

In einer weiteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 45, 50 oder 52, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz die ausgew?hlt ist aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23 bis SEQ ID NO: 26, oder SEQ ID NO: 29 bis SEQ ID NO: 31,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz die ausgew?hlt ist aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23 bis SEQ ID NO: 26, oder SEQ ID NO: 29 bis SEQ ID NO: 31,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz die ausgew?hlt ist aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23 bis SEQ ID NO: 26, oder SEQ ID NO: 29 bis SEQ ID NO: 31,
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

Bei den obigen, Aptamere mit der SEQ ID NO: 45, 50 oder 52, betreffenden Ausf?hrungsformen, weisen die in den Punkten b) bis f) beschriebenen Aptamer-Abwandlungen eins oder mehrere der Motive ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 59), AGATAGTAAGTGCAATCT (SEQ ID NO: 60) und GKATX4X2GGCTYGRTY (SEQ ID NO: 58) auf. X2 bedeutet entweder A oder L, und X4 bedeutet G, A oder L, wobei L f?r kein Nukleotid (Deletion) steht) auf, wobei die Motive in unver?nderter Form oder in im Wesentlichen unver?nderter Form vorliegen k?nnen. Vorliegen k?nnen somit die oben erw?hnten Motive einzeln, oder das Motiv mit der SEQ ID NO: 58 und das Motiv mit der SEQ ID NO: 59, das Motiv mit der SEQ ID NO: 58 und das Motiv mit der SEQ ID NO: 60, das Motiv mit der SEQ ID NO: 59 und das Motiv mit der SEQ ID NO: 60, oder die Motive mit der SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60, entweder in unver?nderter Form oder in im Wesentlichen unver?nderter Form. Im Wesentlichen unver?ndert bedeutet, dass bis zu maximal 5 Nukleotide, vorzugsweise maximal 4 Nukleotide, am meisten bevorzugt maximal 3 Nukleotide, bei diesem Motiv substituiert, deletiert und/oder insertiert sind.

In einer weiteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 48, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 17 bis SEQ ID NO: 19,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 17 bis SEQ ID NO: 19,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 17 bis SEQ ID NO: 19,
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

In einer weiteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 51, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 27 bis SEQ ID NO: 28,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 27 bis SEQ ID NO: 28,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 27 bis SEQ ID NO: 28,
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

In einer werteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 53, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 32 bis SEQ ID NO: 33,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 32 bis SEQ ID NO: 33,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 32 bis SEQ ID NO: 33,
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

In noch einer weiteren speziellen Ausf?hrungsform betrifft die Erfindung ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, mit der SEQ ID NO: 58, mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 55 bis SEQ ID NO: 57,
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 55 bis SEQ ID NO: 57,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind, insbesondere ein Aptamer mit einer Sequenz nach SEQ ID NO: 55 bis SEQ ID NO: 57,
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

Eine spezielle Ausf?hrungsform der Erfindung betrifft ein Aptamer, das an eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere an eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bindet, und das ausgew?hlt ist aus

  • a) einem Aptamer umfassend, oder bestehend aus, eine(r) Nukleins?uresequenz, die ausgew?hlt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 54, wobei
    am 5'-Ende der Nukleins?uresequenz der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 54 ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' ATACCAGCTTATTCAATT 3' (SEQ ID NO: 59) deletiert ist und/oder
    am 3'-Ende der Nukleins?uresequenz der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 54 ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' AGATAGTAAGTGCAATCT 3' (SEQ ID NO: 60) deletiert ist,
    mit der Ma?gabe, dass Thymin durch Uracil ersetzt sein kann,
  • b) einem Aptamer, dessen Nukleins?uresequenz eine Identit?t von mindestens 70% mit der Nukleins?uresequenz eines Aptamers aus a) aufweist
  • c) einem Aptamer, das mit dem komplement?ren Strang eines Aptamers aus a) hybridisiert,
  • d) einem Aptamer bei dem gegen?ber einem Aptamer aus a) ein oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert, insertiert und/oder angef?gt sind,
  • e) einem Fragment eines Aptamers nach a), b), c) oder d),
  • f) einem Derivat eines Aptamers nach a), b), c), d) oder e).

Die Bindungsf?higkeit der erfindungsgem??en Aptamere wird durch die Affinit?t (Sensitivit?t) der Bindung (ausgedr?ckt durch die Dissoziationskonstante) beschrieben.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bei dem

  • a) ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie zuvor beschrieben mit einer Probe, die eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside enth?lt, in Kontakt gebracht wird/werden und
  • b) eine Bindung zwischen dem/den Aptamer(en) und der/den Verbindung(en) aus der Gruppe der Aminoglykoside nachgewiesen wird.

Das Verfahren kann sowohl ein qualitatives als auch ein quantitatives Nachweisverfahren sein. Die Verfahrenschritte a) und b) k?nnen je nach konkreter Verfahrensgestaltung gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig erfolgen.

Das Verfahren ist insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, der Diagnostik sowie zur Anwendung in Krankenh?usern und Pflegeeinrichtungen geeignet.

Das Verfahren eignet sich insbesondere zum Nachweis von einer Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere der Kanamycine oder Paromomycin, insbesondere Kanamycin A, B oder C, in beliebigen Medien und Umgebungen, insbesondere in Wasser und anderen Fl?ssigkeiten, wie beispielsweise in Trink- und Abwasserproben.

Eine Probe im Sinne des obigen Nachweisverfahrens ist ein bereitgestelltes oder durch Probenentnahme erhaltenes Material, von dem angenommen wird, dass es eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, (zusammenfassend bezeichnet als ?Target? oder im Rahmen dieses Nachweisverfahrens auch als ?Analyt?) umfasst, und das auf das Vorhandensein von Target gepr?ft werden soll.

Eine Probe kann eine Wasserprobe, insbesondere eine Trinkwasser-, Grundwasser-, Oberfl?chenwasser- oder Abwasserprobe, eine Probe von anderweitigem, aus der Umwelt entnommenem Material, eine klinische Probe oder eine Lebensmittelprobe sein.

Eine Probe k?nnen weiterhin alle biologischen Materialien sein, die von Individuen isoliert worden sind, beispielsweise biologische Gewebe und Fl?ssigkeiten, zu denen u. a. Blut, Haut, Plasma, Serum, Lymphe, Urin, Gehirnfl?ssigkeit, Tr?nen, Abstriche, Gewebeproben, Organe und Tumore z?hlen. Vorliegend sind in Proben auch Bestandteile von Zellkulturen eingeschlossen. Die Probenentnahme erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe erfassten Menge, die wiederum R?ckschl?sse auf die Gesamtmenge, beispielsweise das Blut bzw. die Lymphe in einem Organismus, zul?sst. F?r die Untersuchung k?nnen die Proben vorbehandelt, wie z. B. durch Mischen, Zugabe von Enzymen oder Markern, oder aufgereinigt werden.

Wird das Aptamer mit dem Target in Kontakt gebracht, so bildet sich ein Aptamer-Target-Komplex durch Bindung des Aptamers an das Target. Die Bindung bzw. das Bindungsereignis kann beispielsweise visuell, optisch, photonisch, elektronisch, akustisch, opto-akustisch, nach Masse, elektrochemisch, elektrooptisch, spektrometrisch, enzymatisch, oder anderweitig chemisch, biochemisch oder physikalisch nachgewiesen werden.

Bei einem markierungsfreien Nachweis wird das Aptamer beispielsweise auf einer Oberfl?che fixiert und die ?nderung der Schichtdicke nach Anlagerung des Targets mit einer der genannten Methoden bestimmt, wie z. B. ?ber eine ?nderung der optischen Eigenschaften der Sensorschicht (z. B. Brechungsindex). Ein weiteres Verfahren des markierungsfreien Nachweises ist die Messung des Masse?nderung nach Bindung des Aptamers an das Target mit einer Mikrowaage, oder die Messung einer Frequenz?nderung eines Schwingquarzes nach Bindung des Aptamers an das Target, welches auf der Oberfl?che des Schwingquarzes bereitgestellt wird.

In F?llen, in denen die Komplexierung nicht direkt detektierbar ist, kann der Komplex durch eine Markierung sichtbar gemacht werden, beispielsweise in einer Indikatorreaktion nach einer direkten oder indirekten Kopplung eines Komplexpartners mit einer Markierungssubstanz. Entweder kann das verwendete Aptamer oder das Target mit einer Markierung (Label) versehen sein. Bevorzugt ist das Aptamer markiert.

Bevorzugte Markierungen (Label) sind visuell, optisch, photonisch, elektronisch, akustisch, opto-akustisch, nach Masse, elektrochemisch, elektrooptisch, spektrometrisch, enzymatisch, oder anderweitig physikalisch, chemisch oder biochemisch detektierbar. In einer Ausf?hrungsform des Verfahrens wird die Markierung durch Lumineszenz, UV/VIS-Spektroskopie, enzymatisch, elektrochemisch oder radioaktiv nachgewiesen.

Lumineszenz betrifft die Emission von Licht. Im erfindungsgem??en Verfahren finden beispielsweise die Photolumineszenz, die Chemilumineszenz und die Biolumineszenz zum Nachweis der Markierung Anwendung. Bei der Photolumineszenz oder Fluoreszenz erfolgt die Anregung durch Absorption von Photonen. Beispielhafte Fluorophore sind, ohne Beschr?nkung, Bisbenzimidazol, Fluoreszein, Acridinorange, Cy5, Cy3 oder Propidiumiodid, die kovalent an Aptamere gekoppelt werden k?nnen, Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin (TAMRA), Texas Red (TR), Rhodamin, Alexa Fluor Farbstoffe (u. a. Fluoreszenzfarbstoffe verschiedener Wellenl?ngen von verschiedenen Firmen). Die Auswertung geschieht visuell oder mit entsprechenden Messger?ten, z. B. im Multilabel Counter, im Fluoreszenzmikroskop, oder durch Durchflusszytometrie, z. B. im Cytofluorimeter. Chemilumineszenz beschreibt die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer chemischen Reaktion. Biolumineszenz bezeichnet die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer Enzymreaktion, beispielsweise einer durch das Enzym Luciferase katalysierten Redoxreaktion.

Andere Markierungsstoffe sind Katalysatoren, kolloidale metallische Teilchen, z. B. Gold-Nanopartikel, kolloidale nicht metallische Teilchen, Quantum Dots, organische Polymere, Latexteilchen, oder Liposome mit signalerzeugenden Stoffen. Kolloidale Teilchen k?nnen kolorimetrisch nachgewiesen werden.

Auch einsetzbar sind visuell detektierbare Farbstoffe, wie beispielsweise interkalierende Farbstoffe.

Einsetzbar als Marker sind auch Enzyme, deren enzymatische Reaktion durch den Verbrauch oder die Entstehung detektierbarer Substrate oder Produkte gekennzeichnet ist, wobei ohne Beschr?nkung eine optische oder elektrochemische Detektion angewandt werden kann. Ein Nachweis kann z. B. mit Enzymen als Markierungssubstanzen gef?hrt werden, die Substrate zu farbigen Produkten umsetzen, vorzugsweise Peroxidase, Green Fluorescent Protein (GFP), Luciferase, [beta]-Galactosidase oder Alkalische Phosphatase. Beispielsweise wird das farblose Substrat X-Gal durch die Aktivit?t der [beta]-Galactosidase zu einem blauen Produkt umgesetzt, dessen Farbgebung visuell erfasst wird.

Ein oben genanntes enzymatisches Marker- und Nachweissystem verwendet Alkalische Phosphatase. Mit Alkalischer Phosphatase (APP) sind verschiedene Nachweise m?glich, wie nachfolgend beispielhaft dargestellt:

  • ? elektrochemischer Nachweis: Substrat Phenylphosphat, enzymatische Reaktion von APP bildet Phenol, wird an Phenolsensor (z. B. mit immobilisierter Tyrosinase) elektrochemisch detektiert
  • ? Messung der Farbreaktion: Substrat p-Nitrophenylphosphat, enzymatische Reaktion von APP bildet p-Nitrophenol, ist gelb gef?rbt
  • ? Fluoreszenz-Nachweis: Substrat 4-Methylumbelliferonylphosphat: enzymatische Reaktion von APP bildet Methylumbelliferonyl-Rest, der nach Anregung Fluoreszenz freisetzt
  • ? f?r Chemilumineszenz-Nachweis: Substrat AMPPD (3-(2'-Spiroadamantan)-4-Methoxy-4-(3''-Phosphoryloxy)phenyl-1,2-Dioxetan): enzymatische Reaktion von APP bildet AMP?D und setzt hv (Chemilumineszenz) frei

Ferner setzt APP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP oder X-Phosphat) und Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT) farbig um. Die Farbstoffe fallen dabei in unmittelbarer N?he der AP-Molek?le aus und f?rben die Umgebung der gebundenen Verbindungen dunkelviolett an.

Die Peroxidase katalysiert z. B. die Oxidation von ABTS (2,2'-Azino-bis-[3-ethylbenzthiazolin-6-sulfons?ure]) in Gegenwart von H2O2. Aufgrund der Enzymstabilit?t und einer Vielzahl an m?glichen Substraten ist die Meerettich-Peroxidase bevorzugt. Wertere Enymmarker, die die Erzeugung detektierbarer Produkte katalysieren sind Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) und Glutathion-S-Transferase (GST).

Der Nachweis kann auch mittels radioaktiver Isotope erfolgen, mit denen das Aptamer markiert ist, vorzugsweise 3H, 14C, 32P, 33P, 35S oder 125I, besonders bevorzugt 32P, 33P oder 125I. Bei der Szintillationsz?hlung wird die vom radioaktiv-markierten Aptamer-Target-Komplex abgegebene radioaktive Strahlung indirekt gemessen. Eine Szintillatorsubstanz wird durch die radioaktive Strahlung angeregt. Beim ?bergang in den Grundzustand wird die Anregungsenergie wieder als Lichtblitze freigesetzt, welche durch einen Photoelektronenvervielfacher (Photomultiplier) verst?rkt und gez?hlt werden.

Die Aptamere k?nnen auch mit Digoxigenin oder Biotin markiert sein, die beispielsweise durch Antik?rper oder Streptavidin gebunden werden, die wiederum eine Markierung tragen k?nnen, wie z. B. ein Enzymkonjugat. Die vorherige kovalente Verkn?pfung (Konjugation) eines Antik?rpers mit einem Enzym kann auf verschiedene bekannte Arten erfolgen. Der Nachweis der Antik?rper-Bindung kann auch radioaktiv in einem RIA (radioactive immunoassay) mit radioaktiven Isotopen, vorzugsweise mit 125I, oder durch Fluoreszenz in einem FIA (Fluoroimmunoassay) mit Fluorophoren, vorzugsweise mit Fluorescein oder FITC, erfolgen.

Die genannten Methoden schlie?en vorzugsweise Waschschritte ein, um ungebundene und/oder unspezifisch gebundene Aptamere und/oder Nachweisreagenzien abzutrennen. Die Durchf?hrung s?mtlicher Nachweisverfahren ist dem Fachmann bekannt. Der direkte Nachweis der Markierung ist im vorliegenden Verfahren der Erfindung bevorzugt, insbesondere der direkte Nachweis durch Fluoreszenz.

In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird der Nachweis in-situ durchgef?hrt. Diese Umsetzung erfordert einen geeigneten Inkubationsraum, auf dem der Nachweis einfach durchgef?hrt und sichtbar gemacht werden kann. Hierzu wird vorteilhaft ein fester Tr?ger verwendet, der es erm?glicht, Probe, Aptamere und ggf. Nachweisreagenzien der Komplexe zu fixieren. Die Aptamere k?nnen sowohl vor oder nach der Probe auf den festen Tr?ger aufgebracht werden. Methoden der Immobilisierung vorgenannter Aptamere sind dem Fachmann bekannt. Beispiele sind werter unten angegeben. F?r den Nachweis kommen alle Nachweise in Betracht, die zuvor bereits genannt sind, wie markierungsfreie Nachweise und Nachweise mit Verwendung einer Markierung. Bei einem Farbnachweis k?nnen die Aptamere so markiert sein, so dass direkt im Anschluss an die Inkubation ein Ablesen und Auswerten realisiert werden kann.

In den zuvor erl?uterten Verfahren und allen anderen von dieser Erfindung offenbarten Verfahren kann das erfindungsgem??e Aptamer allein, oder eine Mischung verschiedener erfindungsgem??er Aptamere eingesetzt werden. Erfindungsgem??e Aptamere k?nnen auch in Kombination mit anderen Aptameren angewendet werden. Eine Kombination mit anderen Aptameren f?r andere Targets (d. h. andere Targets als eine Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside) bietet den Vorteil, dass ein entsprechendes Verfahren gleichzeitig auch zum Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung anderer Targets anwendbar ist.

Wie bereits erw?hnt, k?nnen die Probe oder das Aptamer je nach Verfahrensgestaltung an eine feste Phase immobilisiert sein. In dem Verfahren k?nnen beispielsweise (Micro)-Arrays des erfindungsgem??en Aptamers, oder Mikrotiterplatten-Testsysteme eingesetzt werden.

Aptamere binden an das Target ?hnlich stark wie Antik?rper an ihr Target (Antigen). Daher ist das oben beschriebene Nachweisverfahren analog durchf?hrbar wie bekannte Immunoassays, wobei im Vergleich zu einem bekannten Immunoassay einer oder mehrere Antik?rper durch ein erfindungsgem??es Aptamer ersetzt sind.

Beispielsweise ist es m?glich, das Nachweisverfahrens in Form eines kompetitiven Assays oder eines Sandwich-Assays durchzuf?hren.

Bei einer Ausf?hrungsform eines kompetitiven Assays wird ein f?r das Target spezifisches erfindungsgem??es Aptamer an eine feste Phase gebunden. Anschlie?end erfolgt die Zugabe der Probenl?sung, die das zu messende Target enth?lt und gleichzeitig mit einer bekannten Konzentration an markiertem Target versetzt ist. Sowohl das in der Probenl?sung in unbekannter Konzentration vorliegende unmarkierte Target als auch das markierte Target konkurrieren um die Bindung an das gebundene Aptamer. Je h?her die Konzentration des Targets in der Probe ist, desto weniger markiertes Target wird demzufolge an das Aptamer gebunden. ?ber die Erkennung und gegebenenfalls eine quantitative Bestimmung der Markierung sind der Nachweis des Targets in der Probe und die Messung seiner Konzentration m?glich.

In einer anderen Ausf?hrungsform eines kompetetiven Assays wird ebenfalls zun?chst ein f?r das Target spezifisches erfindungsgem??es Aptamer an eine feste Phase gebunden. Daran wird markiertes Target gebunden. Die Messung der Markierung ergibt das Ausgangssignal. Die Zugabe von Probe mit unmarkiertem Target verdr?ngt gebundenes markiertes Target, und das abnehmende Messignal ist der Probenkonzentration proportional.

Bei einem klassischen immunologischen Sandwich-Assay werden mindestens zwei Antik?rper eingesetzt. Zun?chst wird einer der beiden Antik?rper an eine feste Phase immobilisiert. Dieser wird als Prim?rantik?rper oder auch als F?nger bezeichnet. Nach der Zugabe der Probe bindet das darin enthaltene Antigen an den Prim?rantik?rper. Anschlie?end wird die Probenl?sung entfernt und der als Sekund?rantik?rper oder Detektor bezeichnete zweite Antik?rper in gel?ster Form auf die feste Phase gegeben. Der Detektor bindet nun ebenfalls an das durch den Prim?rantik?rper gebundene Antigen. F?r den Nachweis und die Quantifizierung ist der Sekund?rantik?rper entweder selbst markiert, oder er wird ?ber ein markiertes Reagens nachgewiesen. In der vorliegenden Erfindung wird dieses Verfahren dahin gehend abgewandelt, dass entweder der Prim?rantik?rper oder der Sekund?rantik?rper, oder beide, durch ein erfindungsgem??es Aptamer ersetzt werden und dass das Antigen ein Target f?r das Aptamer, also eine Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere eine Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, ist. Der Assay kann mit allen bekannten festen Phasen durchgef?hrt werden, beispielsweise Mikrotiterplatten, Streifen, Membranen, K?vetten etc.

Die Erfindung stellt somit in einer speziellen Ausf?hrungsform ein Verfahren zum Nachweis von Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer Verbindung aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, zur Verf?gung, bei dem

  • a) ein erster Antik?rper oder ein erfindungsgem??es Aptamer, der/das f?r eine Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside spezifisch ist, an eine feste Phase immobilisiert wird,
  • b) die feste Phase mit daran immobilisiertem Antik?rper oder Aptamer mit einer Probe, die eine Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside enth?lt, inkubiert wird, und
  • c) die feste Phase mit einem zweiten Antik?rper oder einem erfindungsgem??en Aptamer, der/das f?r eine Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside spezifisch ist, inkubiert wird, und
  • d) eine Bindung zwischen dem zweiten Antik?rper oder dem Aptamer und der Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside nachgewiesen wird,
    unter der Bedingung, dass mindestens in einem der Schritte a) oder c) ein erfindungsgem??es Aptamer statt eines Antik?rpers eingesetzt wird.

Die Immobilisierung in Schritt a) kann mit allen ?blichen Techniken erfolgen, die auch aus immunologischen Assays bekannt sind. Der Nachweis in Schritt d) kann im Falle eines Antik?rpers durch die bekannten Methoden erfolgen, die aus immunologischen direkten und indirekten Sandwich-Assays bekannt sind. Entweder kann der Antik?rper selbst markiert sein, beispielsweise durch Anbindung eines Enzyms, das eine Farbreaktion zum Nachweis katalysieren kann, oder es kann ein dritter Antik?rper zugegeben werden, der seinerseits an den zweiten Antik?rper bindet und eine Markierung aufweist. Sofern in Schritt c) ein Aptamer eingesetzt wird, ist dieses vorzugsweise ein markiertes Aptamer, das mit geeigneten Nachweisreaktionen detektiert werden kann, wie zuvor bereits beschrieben. Zwischen den genannten Schritten a)?d) werden vorzugsweise Waschschritte durchgef?hrt, z. B. mit ?blichen und bekannten Waschpuffern. Der Begriff Immobilierung bedeutet bei diesem Verfahren, dass der in Schritt a) immobilisierte Antik?rper oder das Aptamer nicht durch einen Waschschritt von der festen Phase entfernt wird.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, bei dem

  • a) ein oder mehrere verschiedene Aptamere wie zuvor beschrieben mit einer Probe, die eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside enth?lt, in Kontakt gebracht wird/werden, wobei ein Komplex oder Komplexe aus dem/den Aptamer(en) und der/den Verbindung(en) aus der Gruppe der Aminoglykoside gebildet wird,
  • b) der/die Komplex(e) und die ?brige Probe voneinander getrennt werden, und
  • c) optional die Verbindung(en) aus der Gruppe der Aminoglykoside aus dem Komplex isoliert wird/werden.

Eine ?Probe? im Sinne dieses Verfahrens ist ebenso definiert wie eine Probe im Sinne des zuvor beschriebenen Nachweisverfahrens. Eine Probe ist insbesondere eine Wasserprobe, wie zum Beispiel eine Trinkwasser-, Grundwasser-, Oberfl?chenwasser- oder Abwasserprobe, eine Probe von anderweitigem aus der Umwelt entnommenem Material, oder eine Lebensmittelprobe.

Auch dieses Verfahren kommt insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, der Diagnostik sowie zur Anwendung in Krankenh?usern und Pflegeeinrichtungen.

Eine ?Abtrennung? von einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin (zusammengefasst bezeichnet als ?Target?) aus einer Probe kann, im Rahmen der analytischen Nachweisgrenze, vollst?ndig sein oder nicht vollst?ndig sein. Eine vollst?ndige Abtrennung wird hierin auch als ?Entfernung? bezeichnet.

Eine ?Anreicherung? wird in Schritt b) erzielt, wenn der gebildete Aptamer-Target-Komplex und die ?brige Probe voneinander getrennt werden. Es werden zwei Fraktionen erhalten, wobei in der Fraktion, die den Komplex enth?lt, der Komplex angereichert ist. Der Begriff ?Anreicherung? kann sich auf den Komplex beziehen, der aus Aptamer/en und einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside gebildet ist, oder auf die Verbindung/en aus der Gruppe der Aminoglykoside selbst, d. h. das Target ohne Aptamer. Zur Anreicherung des Targets kann der Verfahrensschritt c) durchgef?hrt werden. Eine Anreicherung bedeutet mit anderen Worten eine Erh?hung der Konzentration des Aptamer-Target-Komplexes oder des Targets selbst.

Der Begriff ?Isolierung? kann sich auf den Komplex beziehen, der aus Aptamer/en und einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside gebildet ist, oder auf die Verbindung/en aus der Gruppe der Aminoglykoside selbst. Daher ist der letzte Verfahrensschritt optional.

Die oben beschriebene Abtrennung, Anreicherung, und Isolierung k?nnen mit dem Verfahren gleichzeitig verwirklicht werden. Vorzugsweise wird das Verfahren aber zu einem dieser Zwecke durchgef?hrt.

Der Begriff ?Komplex? bezeichnet die Struktur, die bei der Bindung des Aptamers an sein Target gebildet wird. Somit bezeichnet der Begriff ?Komplex? eine Aptamer-Target-Struktur, bei der das Aptamer an das Target gebunden ist. Wie einleitend erl?utert, erfolgt die Aptamer-Target-Bindung vorwiegend, aber nicht unbedingt ausschlie?lich, ?ber die Strukturkompatibilit?t, so genannte ?Stacking interactions? bei aromatischen Ringstrukturen (Stapelkr?fte durch Elektronenwechselwirkung mit Nachbarbasen), elektrostatische Wechselwirkungen (z. B. Van der Waals-, Ionen-, Dipolkr?fte) und Wasserstoffbr?ckenbindungen.

Die genannten Verfahrensschritte a), b) und c) k?nnen je nach Verfahrensgestaltung gleichzeitig erfolgen, und insbesondere k?nnen die Verfahrensschritte a) und b) gleichzeitig erfolgen.

Bei der Kontaktierung von Target und Aptamer kann die Bildung des Aptamer-Target-Komplexes durch Temperierung auf die optimale Aptamer-Target-Bindungstemperatur, bevorzugt 20?25?C, und/oder R?hren der Probe bef?rdert werden. Nach einer Inkubationszeit werden die Aptamer-Target-Komplexe, von der restlichen Probenl?sung abgetrennt. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt, wie z. B. Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, Chromatographie, magnetische Trennung oder Waschschritte, sofern der Komplex immobilisiert vorliegt.

Durch Ver?nderungen der f?r die Aptamerbindung erforderlichen definierten Bedingungen wird im optionalen Schritt c) der Aptamer-Target-Komplex getrennt. Hierzu sind physiko-chemische Einwirkungen, wie z. B. eine Variation von Salzkonzentration oder pH oder eine hitzebedingte Denaturierung, denkbar. Abschlie?end ist eine weitere Reinigung des Targets m?glich, wobei das Aptamer zuvor abgebaut werden kann, z. B. durch saure (thermische) Hydrolyse oder DNasen. Sofern das Aptamer immobilisiert ist, kann das Target eluiert werden, wie z. B. von einer S?ule, die anschlie?end regeneriert und wiederverwendet wird.

Erfindungsgem?? k?nnen die Aptamere auch an einer festen Phase, genauer gesagt an der Oberfl?che einer festen Phase, immobilisiert sein, vorzugsweise ?ber ein Spacer-Molek?l, das beispielsweise eine Linker-Nukleins?ure sein kann. Geeignete Methoden der Immobilisierung sind dem Fachmann bekannt, die sowohl mit einer kovalenten Kopplung als auch einer nicht-kovalenten Kopplung mittels geeigneter Affinit?tspaare, wie z. B. Biotin/Streptavidin, einhergehen k?nnen. Die feste Phase k?nnen beispielsweise Platten, Streifen, Membranen, Filme, Gele, Perlen, Mikro- und Nanopartikel sein. Beispielhafte Tr?germaterialien sind anorganische und organische Polymere, Keramiken, Glaser, Metalle, insbesondere Edelmetalle. Hierzu zahlen Kunststoffe, beispielsweise auf Basis von Polystyrol. Des Weiteren sind Biopolymere, vorzugsweise Cellulose, Dextran, Agar, Agarose und Sephadex, die funktionalisiert sein k?nnen, insbesondere als Nitrocellulose oder Cyanbromid-Sephadex, als Polymere im erfindungsgem??en Verfahren einsetzbar. Aptamere k?nnen an Magnetic Beads gebunden werden, deren Oberfl?che z. B. mit Tosyl- oder Epoxy-Gruppen, mit Amino- oder Carboxyl-Gruppen oder mit Streptavidin funktionalisiert sind. Weiterhin ist eine Kopplung von Magnetic Beads an die Desoxyribose der Aptamere, wie z. B. ?ber eine Hydrazon-Bindung, m?glich. Die Beispiele f?r Polymere sind nicht limitierend und andere sind denkbar. Bevorzugte Kombinationen von geometrischer Form und Material sind Gele aus Biopolymeren, insbesondere Agarose, und Gelmatrices aus Dextran und Sephadex, die ? beispielsweise in S?ulen verpackt ? Hohlr?ume definierter Porengr??e ausbilden. In einer speziellen Ausgestaltung ist das soeben beschriebene Abtrennungs-, Anreicherungs-, und/oder Isolierungsverfahren ein Affinit?tschromatographie-Verfahren, bei dem ein erfindungsgem??es Aptamer an einer festen Phase immobilisiert ist, vorzugsweise an K?gelchen (Beads) oder einem anderweitigen chromatographischen S?ulenmaterial, wobei alle geometrische Formen einer festen Phase verwendbar und alle oben genannten Substanzen beispielhaft einsetzbar sind.

Mit Aptamer-modifizierten Oberfl?chen k?nnen die entsprechenden Targets ausgehend von geringen Konzentrationen angereichert werden.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des zuvor beschriebenen Aptamers zum Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin. Insbesondere kann das Aptamer in den zuvor erl?uterten Verfahren eingesetzt werden. Der Begriff Anreicherung schlie?t die Aufreinigung des Targets mit ein.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch eine Aptamersonde zur Detektion einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, wobei die Sonde ein erfindungsgem??es Aptamer und ein Markierungsmittel (Label) umfasst. Das Markierungsmittel kann auf verschiedene Art und Weise an das Aptamer gebunden sein, beispielsweise, und nicht beschr?nkend, durch kovalente Bindung, Komplexierung, DNA/RNA-Hybridisierung. Beispielsweise kann ein Markierungsmittel an ein erfindungsgem??es Aptamer gebunden werden, wie in WO 2005113817 beschreiben. WO 2005113817 beschreibt ein Aptamer mit einem angef?gten Oligonukleotidschwanz (oligonucleotide tail) und einem Linker-Oligonukleotid, der ein Label tr?gt, wobei die Sequenz des Linker-Oligonukleotid komplement?r zu der Sequenz des Oligonukleotidschwanzes des Aptamers ist, sodass das Linker-Oligonukleotid an den Oligonukleotidschwanz des Aptamers hybridisiert und das Aptamer mit dem Label markiert wird. Eine weitere M?glichkeit ist die Bindung von Biotin an das Aptamer und die Bindung von Markierungsmittel an Steptavidin. Durch eine Biotin-Streptavidin Bindung wird das Markierungsmittel an das Aptamer gebunden.

Alle Markierungsmittel sind grunds?tzlich einsetzbar, die sich an DNA oder RNA binden lassen. Konkrete Beispiele f?r Markierungssubstanzen wurden weiter oben bei der Erl?uterung von erfindungsgem??en Verfahren angegeben, bei denen markierte Aptamere eingesetzt werden k?nnen. Beispielsweise ist die Markierung ein Farbstoff. In einer speziellen Variante ist das Markierungsmittel eine Substanz, die eine Bilderzeugung durch das markierte Aptamer in einem bildgebenden Verfahren erm?glicht. Das Bild kann durch Strahlung erzeugt sein, die ein f?r das menschliche Auge direkt sichtbares Bild erzeugt, oder durch Strahlung, die nicht direkt sichtbar ist, beispielsweise R?ntgenstrahlung oder radioaktive Strahlung, die anderweitig sichtbar gemacht wird, beispielsweise auf einem Film. Markierungsmittel k?nnen beispielsweise Lumineszenz-, Phosphoreszenz, Fluoreszenz-, radioaktive, oder UV/VIS-Markierungssubstanzen sein. Die erfindungsgem??e Sonde ist besonders f?r die in dieser Beschreibung erl?uterten Nachweis-, Anreicherungs-, Abtrennungs- und/oder Isolierungsverfahren einsetzbar, insbesondere in Assays zur Detektion von Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside. Assays k?nnen z. B. direkte und indirekte Sandwich-Assays sein.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Biosensor, der ein erfindungsgem??es Aptamer aufweist.

Ein solcher Biosensor weist gem?? der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die folgenden Elemente auf:

  • ? einen Rezeptor, aufweisend oder bestehend aus einem erfindungsgem??en Aptamer, und
  • ? einen Transducer, der das Bindungsereignis zwischen Aptamer und Target in ein elektrisch quantifizierbares Signal wandelt.

Au?erdem k?nnen weitere Elemente, wie beispielsweise eine Signalverarbeitungseinrichtung, eine Ausgabeelektronik, eine Anzeigevorrichtung, eine Datenverarbeitungseinrichtung, ein Datenspeicher sowie Schnittstellen zu anderen Ger?ten vorhanden sein.

Der biologische Rezeptor des Aptamer-Biosensors weist das erfindungsgem??e Aptamer vorzugsweise in immobilisierter Form auf oder besteht nur aus dem Aptamer in immobilisierter Form. Die Funktion des Rezeptors ist die auf einem biochemischen Mechanismus beruhende Erkennung des Analyten, hier die Bindung des erfindungsgem??en Aptamers an sein Target. Aus einer Probe, die man mit dem Biosensor in Kontakt bringt, beispielsweise einem komplexen Gemisch, das Target enth?lt, kann das Target ?ber die spezifische Anbindung des Aptamers identifiziert werden.

Die Spezifit?t des Biosensors wird durch den Rezeptor vorgegeben, w?hrend die Sensitivit?t des Sensors vorwiegend durch den verwendeten Transducer beeinflusst wird. Die am Rezeptor stattfindende Aptamer-Target Bindung wird durch den Transducer in ein elektronisch verwertbares Signal umgesetzt. Der Transducer wandelt das Signal aus der selektiven Erkennungsreaktion des Rezeptors (Bindung Target an Aptamer), das der Konzentration des Targets in der Probe proportional ist, in ein elektrisch quantifizierbares Messsignal um. Die Signalbildung erfolgt auf Grund der molekularen Interaktion zwischen dem Target und dem Aptamer.

Mit einem erfindungsgem??en Biosensor k?nnen vorzugsweise qualitative, quantitative und/oder halb-quantitative analytische Informationen gewonnen werden. Er ist insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, in der Diagnostik sowie zur Verwendung in Krankenh?usern und Pflegeeinrichtungen geeignet.

Die Kopplung zwischen Rezeptor und Transducer erfolgt vorzugsweise durch die Immobilisierung des Aptamers auf der Transduceroberfl?che, beispielsweise ?ber eine Straptavidin-Biotin-Bindung, wobei vorzugsweise das Aptamer mit Biotin verbunden ist und die Oberfl?che des Transducers immobilisiertes Streptavidin aufweist.

Die Bindung des Targets an das erfindungsgem??e Aptamer kann beispielsweise ?ber optische, mikrogravimetrische, thermische oder akustische Transducer gemessen werden, vorzugsweise ?ber optische oder mikrogravimetrische Transducer.

Die Messung in optischen Transducer kann auf Prinzipien der Photometrie beruhen, wobei beispielsweise Farb- oder Lumineszenz-Intensit?ts?nderungen erfasst werden. Zu den optischen Methoden z?hlen die Messung von Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Biolumineszenz und Chemolumineszenz, Infrarotuberg?ngen und die Lichtstreuung. Zu den optischen Methoden z?hlt auch die Messung von Schichtdicken?nderungen wenn Target an Aptamer gebunden wird. Die Schichtdicken?nderung kann z. B. mittels Oberfl?chenplasmonenresonanz (SPR) oder reflektometrischer Interferenzspektroskopie (RIfS) durchgef?hrt werden. Ferner kann die Interferenz an d?nnen Schichten (reflektrometrische Interferenzspektroskopie) sowie die ?nderung des evaneszenten Feldes gemessen werden.

Mikrogravimetrische Transducer sind zum Beispiel QCM-Sensoren (Quartz Crystal Microbalance), die eine Masse?nderung detektieren, wenn Target an Aptamer gebunden wird.

Akustische Transducer nutzen die Frequenz?nderungen eines piezoelektrischen Schwingquarzes, der Masse?nderungen hochempfindlich nachweist, die auftreten wenn Target an Aptamer bindet. Der verwendete Quarzkristall wird in einem oszillierenden elektrischen Feld platziert und die Resonanzfrequenz des Kristalls gemessen. Eine Masse?nderung auf der Oberfl?che des Schwingquarzes, z. B. durch Reaktion des Analyten mit dem vorher auf der Kristalloberfl?che immobilisierten Rezeptor, bewirkt eine ?nderung der Resonanzfrequenz, welche quantifiziert werden kann.

Elektrochemische Transducer k?nnen z. B. die ?nderung der Konzentration redoxaktiver Marker an der Elektrodenoberfl?che messen, oder die ?nderung der Konzentration redoxaktiver Substrate oder Produkte, die z. B. in der enzymatischen Reaktion eines Enzym-Markers verbraucht werden oder entstehen.

Thermische Transducer messen die W?rmet?nung der Aptamer-Target-Bindungsreaktion.

Ein beispielhafter Biosensor ist im beigef?gten Ausf?hrungsbeispiel erl?utert. Anleitung zur Konstruktion weiterer Biosensoren findet der Fachmann in Cho, E. J., Lee, J.-W., Ellington, A. D. (2009): Applications of Aptamers as Sensors, Annual Review of Analytical Chemistry 2: 241?264; Mok, W and Li, Y. (2008): Recent Progress in Nucleic Acid Aptamer-Based Biosensors and Bioassays, Sensors 8: 7050?7084; Song, S., Wang, L., Li, J., Fan, C., Zhao, J. (2008): Aptamer-based biosensors, TrAC Trends in Analytical Chemistry 27: 108?117.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt eine feste Phase, auch bezeichnet als fester Tr?ger, insbesondere zur Verwendung beim Nachweis, Anreicherung, Abtrennung und/oder Isolierung einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin, an dem ein erfindungsgem??es Aptamer immobilisiert ist.

Feste Phasen sind in allen m?glichen geometrischen Formen denkbar. Beispiele f?r feste Tr?ger sind Platten, Streifen, Membranen, Mikrotiterplatten, Filme, Gele, Mikropartikel, Nanopartikel oder Perlen. Besonders geeignete Materialien, aus denen eine feste Phase hergestellt werden kann, sind anorganische Polymere, organische Polymere, Gl?ser, organische und anorganische Kristalle, Keramiken, Metalle, insbesondere Edelmetalle, und Halbleiter. Ein besonders geeignetes organisches Polymer ist ein Polymer auf Basis von Polystyrol. Desweiteren sind Biopolymere, vorzugsweise Cellulose, Dextran, Agar, Agarose und Sephadex, die funktionalisiert sein k?nnen, insbesondere als Nitrocellulose oder Cyanbromid-Sephadex, als Polymere einsetzbar. Aptamere k?nnen an magnetische K?gelchen (Magnetic Beads) gebunden sein, die z. B. Carboxy-terminierte oder Epoxyaktivierte Seitenketten tragen. Des Weiteren ist eine Kopplung von Magnetic Beads an die Ribose oder Desoxyribose der Aptamere, wie z. B. ?ber eine Hydrazon-Bindung, m?glich. Die Beispiele f?r Polymere sind nicht limitierend und andere Molek?le denkbar. Bevorzugte Kombinationen von geometrischer Form und Material sind Gele aus Biopolymeren, insbesondere Agarose, und Gelmatrices aus Dextran und Sephadex, die beispielsweise in S?ulen verpackt ? Hohlr?ume definierter Porengr??e ausbilden. In einer speziellen Ausf?hrungsform ist der feste Tr?ger mit immobilisiertem Aptamer eine station?re Phase f?r die Affinit?tschromatographie, wobei der Tr?ger vorzugsweise die Form von Kugeln oder anderweitig geformten Partikeln hat.

In einer speziellen Ausf?hrungsform ist die feste Phase ein Teststreifen, der ein oder mehrerere verschiedene erfindungsgem??e Aptamere enth?lt. Der Teststreifen ist insbesondere einsetzbar f?r qualitative, halb-quantitative und quantitative Assays, die mit visuellen Nachweisverfahren arbeiten, insbesondere f?r Lateralfluss-Assays.

Ein Lateralfluss-Assay arbeitet wie folgt: Eine fl?ssige Probe, die mutma?lich ein Target f?r das erfindungsgem??e Aptamer enth?lt, wird an einer Stelle auf den Streifen aufgebracht bzw. der Streifen an einer Stelle mit der Probe benetzt. Diese Stelle ist die sogenannte Probeauftragszone des Streifens. Der Streifen enth?lt ein Matrixmaterial, durch welches das fl?ssige Testmedium und das darin suspendierte oder gel?ste Target durch Kapillarwirkung aus einer Probeauftragszone in eine Nachweiszone str?men kann, wo ein nachweisbares Signal oder die Abwesenheit eines solchen Signals auf das Vorhandensein des Targets hinweist.

Der Streifen, der f?r Lateralfluss-Assays einsetzbar ist, enth?lt ein oder mehrere erfindungsgem??e Aptamere, beispielsweise in der Probeauftragszone oder zumindest noch ?rtlich vor der Nachweiszone. Wenn Target in der Testprobe vorhanden ist bildet es mit dem im Streifen vorhandenen Aptamer einen Komplex, der zur Nachweiszone str?mt und dort detektiert wird. Anders ausgedr?ckt str?mt das Target innerhalb des Streifens zu dem Aptamer, bildet mit diesem einen Komplex, welcher anschlie?end zur Nachweiszone str?mt.

Die Bindungsreaktion kann auch direkt auf der Auftragsstelle stattfinden, wenn z. B. der Teststreifen das Aptamer enth?lt und die Aptamer-Target-Bindung direkt mit einem entsprechenden Marker sichtbar gemacht wird.

Vorzugsweise wird ein markiertes Aptamer eingesetzt, wobei jede bereits weiter oben beschriebene Markierung einsetzbar ist. Vorzugsweise wird eine Markierung eingesetzt, die in der Nachweiszone des Teststreifens zu einem visuell detektierbaren Signal f?hrt. Grunds?tzlich kann das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Target in der Probe durch Nachweis oder fehlenden Nachweis eines markierten Aptamers in der Nachweiszone ermittelt werden.

In einer Ausf?hrungsform eines Teststreifens wird ein Enzym-markiertes Aptamer eingesetzt. In der Probe vorhandenes Target bildet mit dem Enzym-markierten Aptamer einen Komplex, der entlang des Streifens zu einer Nachweiszone str?mt, die ein Substrat f?r den Enzymmarker enth?lt, der in Anwesenheit des Enzymmarkers eine farbige Reaktion zu erzeugen vermag. Der Streifen enth?lt vorzugsweise eine weitere Zone, in der Target immobilisiert ist, so dass markiertes Aptamer, das sich aufgrund der Abwesenheit von ausreichendem Target in der Probe nicht mit dem Target vereinigt, erfasst wird und dadurch gehindert wird, die Nachweiszone zu erreichen.

In einer werteren Ausf?hrungsform funktioniert der Teststreifen nach dem Prinzip eines immunologischen Lateralfluss-Assays, beispielsweise eines Schwangerschaftsteststreifens, wobei ein dort verwendetes markiertes Immunglobulin durch ein erfindungsgem??es, vorzugsweise markiertes, Aptamer ersetzt ist.

Eine spezielle Variante funktioniert nach folgendem Prinzip: Ein Teststreifen wird mit Probe benetzt und in der Probe vorhandenes Target bindet an ein Farbstoff-markiertes Aptamer. Der Target-Aptamer-Farbstoff-Komplex wandert zur Nachweiszone, in der ein Antik?rper fixiert ist, welcher ebenfalls an das Target bindet. Der immobilisierte Antik?rper bindet den wandernden Target-Aptamer-Farbstoff-Komplex in der Nachweiszone und diese wird angef?rbt. ?bersch?ssiges Farbstoff-markiertes Aptamer wandert weiter zu einer Kontrollzone, in der eine Substanz fixiert ist, beispielsweise eine Verbindung aus der Gruppe der Aminoglykoside, die das Farbstoff-markierte Aptamer bindet, und dadurch angef?rbt wird.

Der Teststreifen ist aus jedem Material herstellbar, das mit einer Probe benetzbar ist und in das ein erfindungsgem??es Aptamer eingebracht werden kann. Insbesondere bevorzugt sind Materialien durch die eine Probe und ein darin enthaltenes Target durch Kapillarwirkung str?men k?nnen. Beispiele sind Nitrozellulose, Nitrozellulosemischungen mit Polyester oder Zellulose, unbeschichtetes Papier, por?ses Papier, Viskosefilament, Glasfaser, Acrylnitrilcopolymer oder Nylon, sowie alle weiteren Materialien, die bei Lateralfluss-Assays ?blich sind.

Der Teststreifen kann bereits als solcher verwendet werden, um das Vorhandensein von Target in einer Probe festzustellen. Zur Anwendung kann der Streiten in eine Probe eingetaucht werden, im Falle eines Lateralfluss-Assays beispielsweise mit nur einem Ende, das dann als Probeauftragszone dient.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Lateralfluss-Assay-Vorrichtung, die den oben beschriebenen Teststreifen aufweist. Die Vorrichtung kann neben dem Teststreifen beispielsweise ein Geh?use aufweisen, in das der Teststreifen eingebettet ist und das eine, vorzugsweise verschlie?bare, ?ffnung zur Probenauftragszone des Teststreifens aufweist, sowie Aussparungen zur Beobachtung einer Nachweis und ggf. Kontrollzone. Ein solcher Aufbau ist aus dem Gebiet der Schwangerschaftstests bekannt und entsprechend sind bekannte Aufbauten von Lateralfluss-Assay-Vorrichtung auch in der vorliegenden Erfindung verwendbar.

In einer anderen speziellen Ausf?hrungsform bilden der feste Tr?ger und das Aptamer ein Microarray oder einen sogenannten ?DNA oder RNA-Chip?, der einkanalig oder mehrkanalig sein kann. Im Microarray k?nnen auf mehreren Array-f?rmig angeordneten Messpunkten ein oder mehrere Aptamere sowie Referenzmaterialien zur Grundsignalkompensation bzw. Funktionstestung angeordnet sein. In einem Mehrkanal-Chip erfolgt diese Anordnung in den einzelnen Kan?len. Dadurch ist die parallele Mehrfachmessung einer Probe, oder bei verschiedenen Aptameren, die parallele Messung unterschiedlicher Analyte in einer Probe m?glich.

Die Immobilisierung von Aptamer an fester Phase kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen und auf jegliche Art und Weise, die dem Fachmann zur Immobilisierung von DNA oder RNA an Feststoffen bekannt ist. Bekannte M?glichkeiten wurden bereits zuvor in dieser Beschreibung genannt. Die Immobilisierung von Aptameren auf Nanopartikeln ist z. B. beschrieben in WO 2005/13817. Eine feste Phase aus Papier oder einem por?sen Material kann mit dem Aptamer in fl?ssiger Phase benetzt und die fl?ssige Phase anschlie?end verfl?chtigt werden, so dass das Aptamer in dem Papier bzw. dem por?sen Material zur?ckbleibt.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Kit umfassend ein erfindungsgem??es Aptamer.

Das Kit umfasst vorzugsweise ein erfindungsgema?es Aptamer, insbesondere ein markiertes erfindungsgem??es Aptamer bzw. eine erfindungsgem??e Aptamersonde, sowie weitere Komponenten f?r die mit dem Kit beabsichtigte Reaktion oder das mit dem durchzuf?hrende Verfahren, beispielsweise Komponenten f?r ein beabsichtigtes Nachweis Anreicherungs-, Abtrennungs- und/oder Isolierungsverfahren. Beispiele sind Pufferl?sungen, Substrate f?r eine Farbreaktion, Farbstoffe oder enzymatische Substrate. Das Aptamer und/oder weitere Komponenten k?nnen an einer festen Phase immobilisiert sein. Beispielhafte Formen und Materialien f?r feste Phasen wurden bereits an anderer Stelle in dieser Beschreibung genannt. Die feste Phase kann beispielsweise in Form eines (Micro)-Arrays oder einer Mikrotiterplatte-bereitgestellt werden. Die feste Phase kann im konkreten Fall eine immobilisierte F?ngersubstanz f?r das Target aufweisen, insbesondere einen immobilisierten Antik?rper, der zur Anbindung von Target dient. Die immobilisierte F?ngersubstanz ist vorzugsweise in Form eines (Micro)-Arrays, in einer Mikrotiterplatte oder in Chips angeordnet.

Das Kit dient vorzugsweise zur Durchf?hrung eines erfindungsgem??en Nachweis-, Anreicherungs, Abtrennungs- und/oder Isolierungsverfahrens, oder zur Durchf?hrung anderweitiger Assays unter Zuhilfenahme eines erfindungsgem??en Aptamers. Insofern wird auf die vorangehende Offenbarung Bezug genommen.

In dem Kit kann das Aptamer in verschiedensten Formen bereitgestellt werden, beispielsweise gefriergetrocknet oder in einem fl?ssigen Medium.

Die Erfindung betrifft auch ein Messger?t zum Nachweis einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Aminoglykoside, insbesondere einer oder mehrerer Verbindungen aus der Gruppe der Kanamycine oder Paromomycin. Das Messger?t weist ein oder mehrere verschiedene der zuvor beschriebenen Aptamere, eine Aptamersonde wie zuvor beschrieben oder einen Biosensor wie zuvor beschrieben auf. Dar?ber hinaus kann das Messger?t unter anderem eine Probeentnahmeeinrichtung, eine Signalverarbeitungseinrichtung, eine Anzeigevorrichtung zum Ablesen von Messergebnissen oder Messwerten, eine Datenverarbeitungseinrichtung, einen Datenspeichereinrichtung und Schnittstellen zur Verbindung mit externen Ger?ten oder Speichermedien aufweisen.

Mit dem Messger?t k?nnen je nach Ausgestaltung qualitative, quantitative und/oder halbquantitative analytische Informationen ?ber das zu messende Target gewonnen werden. Mit dem Messger?t k?nnen die zuvor erl?uterten Nachweisverfahren durchgef?hrt werden. Es ist insbesondere zum Einsatz in der Lebensmittel-, Wasser- und Umweltanalytik, der Wasserbehandlung und der Wasseraufbereitung, insbesondere von Trinkwasser und Abwasser, in der Diagnostik sowie zur Verwendung in Krankenh?usern und Pflegeeinrichtungen geeignet.

Das Messger?t ist insbesondere ein transportables Messger?t, das vor Ort eingesetzt werden kann, beispielsweise ein leichtes Messger?t im Taschenformat.

Die Probeentnahmeeinrichtung des Messger?ts kann auf verschiedene Art und Weise aufgebaut sein. In einer Variante ist die Probeentnahmeeinrichtung eine Kapillare oder ein por?ser Streifen, im dem Fl?ssigkeiten aufgesaugt werden k?nnen. Eine solche Probeentnahmevorrichtung wird zur Probeentnahme ?blicherweise in eine fl?ssige Probe eingetaucht. Durch Kapillarkraft wird die Probe zu dem gew?nschten Ort im Messger?t transportiert, an dem sich das Aptamer befindet und wo die Nachweisreaktion stattfinden kann. Beispielsweise wird die Probe zu einem das Aptamer aufweisenden Biosensor transportiert, welcher seinerseits ein Messsignal erzeugt.

In einer anderen Variante weist die Probeentnahmeeinrchtung einen Schlauch oder ein R?hrchen sowie eine Pumpe auf. Mit der Pumpe wird eine fl?ssige Probe angesaugt und die Probe zu dem gew?nschten Ort im Messger?t transportiert, an dem sich das Aptamer befindet und wo die Nachweisreaktion stattfinden kann. Beispielsweise wird die Probe zu einem das Aptamer ausweisenden Biosensor transportiert, welcher seinerseits ein Messsignal erzeugt.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht limitierenden Beispielen f?r konkrete Ausf?hrungsformen n?her erl?utert. In den Beispielexperimenten werden Standardreagenzien und Puffer verwendet, die frei von Kontaminationen sind.

BEISPIEL 1: Pr?paration der Magnetic Beads.

Dynabeads? M-280 Streptavidin Magnetic Beads (Dynal Biotech, Norwegen) wurden nach Herstellerangaben verwendet. Alle f?r die folgenden Schritte notwendigen 1,5 mL-Reaktionsgef??e wurden vor ihrer Verwendung gewaschen: 1 x mit Bindungspuffer mit Detergenz-Zusatz: (BB+(KC): 20 mmol L?1 Tris-HCl pH 7.6, 100 mmol L?1 NaCl, 2 mmol L?1 MgCl2, 5 mmol L?1 KCl, 1 mmol L?1 CaCl2, 0,02% Tween 20 sowie 2 ? mit Bindungspuffer ohne Zusatz von Tween (BB(KC)). 4 ? 109 Magnetic Beads wurden 1 h bei 21?C und leichtem Sch?tteln mit 600 pmol der F?ngersequenzen in 700 ?L Puffer inkubiert. Danach folgten Waschschritte: 3 ? in 10 mmol L?1 Tris-HCl pH 7.5, 1 mmol L?1 EDTA, 2 mol L?1 NaCl und 3 ? in BB(KC). Die Abtrennung der Beads von den Waschl?sungen erfolgte jeweils unter Verwendung eines Magnet-Separationsstandes (Promega, Deutschland). Die mit den F?ngersequenzen modifizierten Beads wurden dann in 4200 ?L BB(KC) resuspendiert und bei 4?C aufbewahrt.

BEISPIEL 2: In-vitro Selektion (Capture-SELEX).

Die DNA-Aptamer-Selektion wurde unter Anwendung des Capture-SELEX-Prozesses durchgef?hrt. Eingef?gte Fluoreszenz-Marker erlauben die Quantifizierung der DNA nach verschiedenen Schritten des Prozesses mittels Fluoreszenz-Messung. Die eine Bindung der ssDNA-Oligomeren aus der Ausgangsbibliothek bzw. ihrer Derivate an Magnetic Beads erfolgt ?ber die F?ngersequenz (Capture sequence). Die F?ngersequenz ist 12 Basen lang und zu einem Bereich in der ssDNA der Ausgangsbibliothek komplement?r. Mit Hilfe der F?ngersequenz findet eine reversible Bindung zwischen F?nger und ssDNA statt. An ihrem 5'-Ende tr?gt die F?ngersequenz ?ber einen Hexaethylenglycol(HEGL)-Rest gebundenes Biotin, welches f?r die Ankopplung der F?ngersequenz an die Streptavidin-modifizierten Magnetic Beads verantwortlich ist.

Die Targetsubstanzen (Kanamycin A-disulfat-dihydrat, Sulfacarbamid, Sulfamethoxazol, Sotalol HCl), f?r welche DNA-Aptamere selektiert werden sollten, lagen frei in L?sung in einer Mischung mit einer Konzentration von je 1 mM vor und standen f?r eine Bindung mit der ssDNA zur Verf?gung. Targetspezifische Oligomere sollten sich durch Ausbildung einer definierten zwei- oder dreidimensionalen Struktur von der F?ngersequenz abkoppeln und zusammen mit dem Target in L?sung zu finden sein.

Ausgangspunkt des Selektionsprozesses war eine ssDNA-Bibliothek mit der grunds?tzlichen Struktur: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N10-TGAGGCTCGATC-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3', wobei N f?r eine beliebige der vier Basen A, T, C oder G steht. Folgende modifizierte Primer wurden in der Amplifizierung der Oligomere mittels PCR eingesetzt: Sense-Primer AP60 mit der Sequenz: 5' Fluorescein-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (siehe SEQ ID NO: 59) und Antisense-Primer TER-AP20 mit der Sequenz: 5' dA20-HEGL-AGATTGCACTTACTATCT-3' (dA20 = 20 Nukleotide mit der Base Adenin, HEGL = Hexaethylenglycolspacer, Primersequenz SEQ ID 62) (Alle chemisch synthetisiert von Microsynth, Schweiz.). Die Bibliothek wurde mittels PAGE gereinigt. Primer wurden mit HPLC gereinigt. Die F?ngersequenz hatte folgende Struktur: 5' Bio-GTC-HEGL-GATCGAGCCTCA-3' (SEQ ID NO: 63) und wurde von IBA (Deutschland) hergestellt sowie HPLC gereinigt.

Es wurden aufeinanderfolgende Runden des SELEX-Prozesses durchgef?hrt, die sich aus den Schritten (i) Bindung der ssDNA-Bibliothek bzw. der in der vorhergehenden Runde selektierten ssDNA an die mit der F?ngersequenz modifizierten Beads, (ii) Abtrennen der ungebundenen ssDNA, (iii) Abl?sen von nur schwach gebundenen Oligomeren in einem Temperaturschritt (iv) Hintergrund-Elution in Puffer bei gleichen Bedingungen wie bei der nachfolgenden Target-Elution jedoch ohne Target (v) Target-Elution in Anwesenheit der Mischung der Targetsubstanzen, (vi) Vervielf?ltigung der eluierten ssDNA mittels PCR, (vii) Trennung des Doppelstranges aus der PCR und Gewinnung des relevanten Einzelstranges, zusammensetzten. In jeder Runde wurden 108 mit der F?ngersequenz modifizierten Magnetic Beads eingesetzt (Ausnahme: 1. Runde, 109 Beads). Nach der 12. Runde wurden die selektierten Oligonukleotide auf ihre Bindungsspezifit?t f?r die vier in der Mischung enthaltenen Targetsubstanzen getestet. Dabei wurde eine eindeutige Anreicherung von Kanamycin A-bindender ssDNA gefunden.

BEISPIEL 3: Klonierung and Sequenzierung.

In der 13. und letzten SELEX-Runde wurde die selektierte ssDNA in der PCR mit unmodifizierten Primern amplifiziert, um sie danach in den Vektor pCR2.1-TOPO zu klonieren. E. coli TOP10 Zellen (TOPO TA Cloning Kit; Invitrogen, U. K.) wurden durch Aufnahme dieses Vektor-Konstruktes transformiert. Unter Verwendung des QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (Qiagen, Deutschland) wurde die Plasmid-DNA aus 96 der erhaltenen Klone pr?pariert und zur Sequenzierung gegeben (Microsynth, Schweiz). Sequenz-Analysen und Alignments wurden unter Verwendung der Webseite ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) durchgef?hrt. Die Analyse der Sekund?rstruktur einiger Aptamere erfolgte mittels des im Internet verf?gbaren Faltungsprogramms mfold, das auf einem Energie-Minimierungs-Algorithmus beruht.

Eine ?bersicht der aus der Klonierung erhaltenen Aptamersequenzen ist in der Tabelle 1 angegeben. Die Primersequenz (Sense) am 5'-Ende ist ATACCAGCTTATTCAATT (SEQ ID NO: 59) und die Primerbindungsregion f?r den Antisense-Primer am 3'-Ende ist AGATAGTAAGTGCAATCT (SEQ ID NO: 60, komplement?r zur Antisense-Primersequenz). Der komplement?re Bereich f?r die F?ngersequenz (Docking-Sequenz) f?r den Capture-Selex Prozess ist TGAGGCTCGATC (SEQ ID NO: 61). Diese Sequenzen, und davon abgewandelte Sequenzen, sind jeweils in Fettschrift dargestellt. Die Sequenzen mit den SEQ ID Nos. 59?61 sind Bestandteil der Aptamere, vorbehaltlich verk?rzter Sequenzen, wie in der vorangehenden allgemeinen Beschreibung definiert.

Einige Aptamere lassen sich aufgrund ihrer Sequenzen in Gruppen einteilen. Innerhalb einer Gruppe im Vergleich zum Stellvertreter einer Gruppe abweichende Nukleotide sind unterstrichen gekennzeichnet. Die in einer Gruppe zusammengefassten Sequenzen sind bis auf Punktmutationen und Deletionen identisch bzw. vom Stellvertreter abzuleiten. Die Aptamernummer des Stellvertreters einer Gruppe ist unterstrichen gekennzeichnet (siehe z. B. Aptamer Nr. 3?7 f?r Gruppe 1). Unterstrichene Nukleotide oder Deletionen (?) innerhalb des komplement?ren Bereichs der F?ngersequenz bedeuten eine Abwandlung gegen?ber dem urspr?nglichen komplement?ren Bereich der F?ngersequenz TGAGGCTCGATC (SEQ ID NO: 61).

Die Spalte ?Anzahl? gibt die Anzahl Klone mit identischer Aptamersequenz an. Wenn mehrere Klone mit identischer Sequenz gefunden wurden, ist die Aptamerbezeichnung in Fettschrift markiert (siehe z. B. Aptamer Nr. 3?7).

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 45 fasst die Sequenzen der Gruppe 1 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 46 fasst die Sequenzen der Gruppe 2 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 47 fasst die Sequenzen der Gruppe 3 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 48 fasst die Sequenzen der Gruppe 4 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 49 fasst die Sequenzen der Gruppe 5 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 50 fasst die Sequenzen der Gruppe 6 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 51 fasst die Sequenzen der Gruppe 7 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 52 fasst die Sequenzen der Gruppe 8 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 53 fasst die Sequenzen der Gruppe 9 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

Die Sequenz mit der SEQ ID NO: 54 fasst die Sequenzen der Gruppe 10 zusammen und zeigt variable Nukleotide unterstrichen.

In der SEQ ID NO: 45 bedeutet X1 entweder G oder L, und X2 bedeutet entweder A oder L wobei L f?r kein Nukleotid (Deletion) steht.

In der SEQ ID NO: 52 bedeutet X3 entweder C oder L, wobei L f?r kein Nukleotid (Deletion) steht.

Die Tabelle 2 zeigt eine ?bersicht der Nukleotidsymbole, die f?r eines oder mehrere der Nukleotide A, G, C oder T stehen. Tabelle 2

SymbolBedeutungRG oder AYT/U oder CMA oder CKG oder T/USG oder CWA oder T/UBG oder C oder T/UDA oder G oder T/UHA oder C oder T/UVA oder G oder C

Die Tabelle 3 zeigt ?bereinstimmende Sequenzmotive beim Vergleich der Gruppen 1 und 6 der Tabelle 1. Die Stellvertreter der Gruppen 1 und 6 zeigen die beiden besten Bindungen bei einem Vergleich der Stellvertreter aller zehn Gruppen der Tabelle 1, festgestellt nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode. In der SEQ ID NO: 55 bedeutet X1 entweder G oder L, und X2 bedeutet entweder A oder L wobei L f?r kein Nukleotid (Deletion) steht. Positionen, an denen verschiedene Nukleotide stehen k?nnen, sind mit Unterstreichungen gekennzeichnet.

Die Tabelle 4 zeigt ?bereinstimmende Sequenzmotive beim Vergleich der Gruppen 1 und 8 der Tabelle 1. Die Stellvertreter der Gruppen 1 und 8 zeigen die besten (Gruppe 1) und drittbeste (Gruppe 8) Bindung bei einem Vergleich der Stellvertreter aller zehn Gruppen der Tabelle 1, festgestellt nach der in Beipspiel 4 beschriebenen Methode. In der SEQ ID NO: 56 bedeutet X2 entweder A oder L, und X4 bedeutet G, A (= R) oder L, wobei L f?r kein Nukleotid (Deletion) steht. Positionen, an denen verschiedene Nukleotide stehen k?nnen, sind mit Unterstreichungen gekennzeichnet.

Die Tabelle 5 zeigt ?bereinstimmende Sequenzmotive beim Vergleich der Gruppen 6 und 8 der Tabelle 1. Die Stellvertreter der Gruppen 6 und 8 zeigen die zweitbeste (Gruppe 6) und drittbeste (Gruppe 8) Bindung bei einem Vergleich der Stellvertreter aller zehn Gruppen der Tabelle 1. Positionen, an denen verschiedene Nukleotide stehen k?nnen, sind mit Unterstreichungen gekennzeichnet.

Die Tabelle 6 zeigt ?bereinstimmende Sequenzmotive beim Vergleich der Gruppen 1, 6 und 8 der Tabelle 1. Die Stellvertreter der Gruppen 1, 6 und 8 zeigen die beste, zweitbeste und drittbeste Bindung bei einem Vergleich der Stellvertreter aller zehn Gruppen der Tabelle 1. Positionen, an denen verschiedene Nukleotide stehen k?nnen sind mit Unterstreichungen gekennzeichnet. In der SEQ ID NO: 58 bedeutet X2 entweder A oder L, und X4 bedeutet G, A (= R) oder L, wobei L f?r kein Nukleotid (Deletion) steht. Tabelle 3: ?bereinstimmende Motive innerhalb der Aptamergruppen 1 und 6Tabelle 4: ?bereinstimmende Motive innerhalb der Aptamergruppen 1 und 8Tabelle 5: ?bereinstimmende Motive innerhalb der Aptamergruppen 6 und 8Tabelle 6: ?bereinstimmende Motive innerhalb der Aptamergruppen 1, 6 und 8

BEISPIEL 4: Bestimmung der Spezifit?t einzelner Aptamere.

Die erhaltenen Sequenzen der Aptamer-Klone konnten anhand ihrer ?hnlichkeit in zehn Gruppen eingeteilt werden. Aus jeder Gruppe wurde je ein Stellvertreter ausgew?hlt und bei Microsynth (Schweiz) chemisch hergestellt und PAGE gereinigt. Diese Stellvertreter wurden auf ihre individuelle Bindungsf?higkeit an jede der vier in der Targetmischung vorhandenen Einzelsubstanzen, sowie an die Mischung selbst, getestet. Als Negativkontrolle wurde parallel Puffer ohne enthaltene Targetsubstanz verwendet.

F?r jeden Bindungstest wurde ein frisches Aliquot von 3 ? 108 der mit der F?ngersequenz modifizierten Magnetic Beads (1 ? 107 Beads f?r jede Bindungsreaktion) zun?chst 3 ? in Bindungspufferl?sung (BB(KC): 20 mmol L?1 Tris-HCl pH 7.6, 100 mmol L?1 NaCl, 2 mmol L?1 MgCl2, 5 mmol L?1 KCl, 1 mmol L?1 CaCl2) gewaschen. Die Aptamer-ssDNA wurde vorbereitet, indem ca. 300 pmol in 500 ?L BB(KC) f?r 8 min bei 90?C inkubiert, danach 10 min auf Eis und 5?6 min bei Raumtemperatur ?quilibriert wurden. Das vorbereitete Aptamer wurde mit dem gewaschenen Aliquot F?ngersequenz-modifizierter Magnetic Beads ?ber Nacht bei 21?C unter leichtem Sch?tteln inkubiert. Nach der Bindungsreaktion wurden die ungebundenen Aptamere entfernt und wie alle folgenden Fraktionen gesammelt.

Der Bindungskomplex wurde 9 ? in jeweils 500 ?L BB(KC) gewaschen. Die Magnetic Beads mit den gebundenen Aptameren wurden nun einem Temperaturschritt wie w?hrend des Selektionsprozesses unterworfen: Inkubation in 500 ?L BB(KC) bei 28?C f?r 15 min bei leichtem Sch?tteln. Aptamere, die sich w?hrend dieses Schrittes von den Magnetic Beads gel?st hatten, wurden entfernt. Anschlie?end wurden die Magnetic Beads 7 ? mit je 500 ?L BB(KC) gewaschen. Im Hintergrund-Elutionsschritt wurden die Magnetic Beads in 300 ?L BB(KC) bei 21?C f?r 45 min leicht gesch?ttelt. Anschlie?end wurden gel?ste Aptamere entfernt. Die Beads wurden 6 ? in je 500 ?L BB(KC) gewaschen, dann in 600 ?L BB(KC) aufgenommen und auf 6 vorgesp?lte Reaktionsgef??e gleichm??ig verteilt.

Der ?berstand wurde abgenommen und die einzelnen Aliquots in je 300 ?L Targetsubstanz-L?sung, deren Mischung sowie Puffer ohne Targetsubstanz bei 21?C 45 min inkubiert. Anschlie?end wurde die L?sung abgenommen. In der so entstandenen Fraktion der Target-Elution sollten sich diejenigen Aptamere befinden, welche sich durch Trennung der F?ngersequenz-Aptamer-Bindung bei Anwesenheit der Targetsubstanz(en) von den Magnetic Beads gel?st hatten. Die danach noch an den Magnetic Beads gebundenen Aptamere wurden durch Hitze eluiert (2 ? 300 ?L BB(KC), 95?C, 10 min). Die DNA-Mengen in allen so gewonnenen Fraktionen (inklusive der Waschschritte) wurden mittels Fluorometrie (Wallac Victor2V Multilabel Counter; PerkinElmer life sciences, Deutschland) bei folgenden Bedingungen gemessen: Excitation 485 nm/Emission 535 nm; time 1 s; CW-lamp energy 22500. Das Messvolumen war 100 ?L/well in 96 well black Mikrotiterplatten (NUNC, Deutschland). Die Berechnung der ssDNA-Konzentration jeder Fraktion erfolgte unter Verwendung einer Kalibrierkurve, welche aus der jeweiligen Aptamer-DNA hergestellt wurde, die den gleichen thermischen Bedingungen bei ?quilibrierung und ?ber-Nacht-Inkubation ausgesetzt war wie die bei den Spezifit?tstests eingesetzte Aptamer-DNA.

BEISPIEL 5: Aufbau eines Biosensors und Durchf?hrung eines Nachweises auf Kanamycin ABezugszeichenliste

1
Sensorchip (Glaschip)
2
Goldfilm
3
Flusszelle
4
Probel?sung
5
Target
6
Lichtquelle
7
Prisma
8
Detektor
9
Aptamer
L
monochromatisches polarisiertes Licht
R
reflektiertes Licht

Das Biacore?-System ist ein kommerziell erh?ltliches Biosensor-System, welches den markierungsfreien Nachweis von biomolekularen Wechselwirkungen in Echtzeit erm?glicht und daf?r das physikalische Prinzip der Oberfl?chenplasmonenresonanz-Spektroskopie (Surface Plasmon Resonance, SPR) nutzt, wie in der 1 dargestellt. Der Biosensorchip des Biacore-Systems besteht aus einem Glas-Chip 1, der mit einem d?nnen Goldfilm 2 beschichtet ist und die Sensoroberfl?che darstellt. Eine spezielle Funktionalisierung dieser Sensoroberfl?che, beispielsweise mit Carboxymethyldextran (CM), erlaubt die kovalente Immobilisierung der biologischen Rezeptormolek?le. Im Falle der Aptamere 9 wird bevorzugt das Biotin-Streptavidin-Kopplungssystem genutzt, um die biotinylierten Aptamere auf die Streptavidin-beschichtete Sensoroberfl?che des Biosensorchips zu immobilisieren. Die anschlie?ende Interaktion zwischen Target und Aptamer findet in einer Flusszelle 3 statt, wobei durch ein integriertes, kontinuierliches Flusssystem die L?sung 4 mit Target 5 ?ber die Sensoroberfl?che geleitet wird. Die optische Detektionseinheit des Biacore-Systems besteht aus einer Lichtquelle 6 (Leuchtdioden), einem Prisma 7 und einem Detektor 8 (Diodenarray-Detektor). Monochromatisches, polarisiertes Licht L wird unter den Bedingungen der Totalreflexion von einem Medium mit hohem Brechungsindex (Sensorchip mit Goldfilm) in ein Medium mit niedrigem Brechungsindex (Sensorschicht, Pufferl?sung) eingestrahlt. Dabei tritt bei einem bestimmten Einfallswinkel eine Abschw?chung des reflektierten Lichtes auf. Dieser Winkel, der Resonanzwinkel, reagiert sehr sensitiv auf Ver?nderungen des Brechungsindexes der Sensorschicht. Die Anbindung des Targets 5 an das immobilisierte Aptamer 9 auf der Sensoroberfl?che resultiert in einem Massezuwachs in der Sensorschicht, welcher zu einer ?nderung des Brechungsindexes dieser Schicht und damit zu einer Verschiebung des Resonanzwinkels f?hrt. Diese ?nderungen werden als messbares Signal, ausgedruckt in Resonanz-Einheiten (RU), ausgegeben und sind proportional zu der Menge an gebundenem Target 5 auf der Sensoroberfl?che. W?hrend der Bindungsanalyse werden die ?nderungen des Resonanzwinkels kontinuierlich aufgezeichnet und aufgetragen gegen die Zeit als Sensorgramm dargestellt, das in der 2 schematisch dargestellt ist. Im Abschnitt II der Signalkurve ist eine Verschiebung des Resonanzwinkels und die Anbindung von Aptamer erkennbar. Die Verschiebung des Resonanzwinkels ist auch in der 1 gezeigt, anhand eines mit ?I? und eines mit ?II? bezeichneten reflektierten Lichtstrahles.

Der Aptamer-Target-Komplex kann unter geeigneten Pufferbedingungen wieder gel?st werden, so dass die Sensoroberfl?che regeneriert wird und f?r eine erneute Bindung mit Targetmolek?len zu Verf?gung steht.

An der Oberfl?che des oben beschriebenen Biosensors wird erfindungsm??es Aptamer immobilisiert. Eine L?sung von Kanamycin A wird ?ber die Sensoroberfl?che geleitet, wobei Kanamycin A an den Aptamer bindet. Die Anbindung von Kanamycin A wird als Verschiebung des Resonanzwinkels detektiert.