Title:
Verfahren zur Trennung/Reinigung von Biomolekühlen
Kind Code:
A1
Abstract:

Die Erfindung bezieht sich auf ein wässriges Zweiphasenextraktionsverfahren, wobei sich die zweite wässrige Phase in den Poren eines porösen Materials befindet.



Inventors:
Schembecker, Gerhard, Prof. (44357, Dortmund, DE)
Burghoff, Bernhard, Dr. (06132, Halle, DE)
van Winssen, Fatma Alexia (44229, Dortmund, DE)
Application Number:
DE102011001743A
Publication Date:
10/04/2012
Filing Date:
04/01/2011
Assignee:
Technische Universität Dortmund, 44227 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE602004006831T2N/A2008-02-14
DE102004003145A1N/A2005-08-11
DE10035953A1N/A2002-01-31
DE69125843T2N/A1997-12-18
DE3787445T2N/A1994-07-07
Foreign References:
AT40651T1989-02-15
EP01542461985-09-11
WO2010146599A12010-12-23
Other References:
W. Riedl, T. Raiser "Membrane-supported extraction of biomolecules with aqueous two-phase systems", Desalination, 224,(2008), 160-167
Attorney, Agent or Firm:
Michalski Hüttermann & Partner Patentanwälte, 40221, Düsseldorf, DE
Claims:
1. Verfahren zur Trennung bzw. Reinigung von Biomolek?len durch w?ssrige Zweiphasen-Extraktion mittels einer ersten w?ssrigen Phase und einer zweiten w?ssrigen Phase, wobei w?hrend der Trennung zumindest partielle ?berf?hrung der Biomolek?le in die zweite w?ssrige Phase erfolgt, wobei ein por?ses Material vorhanden ist, in dessen Poren zweite w?ssrige Phase vorhanden ist und w?hrend der Trennung eine L?sung von Biomolek?len in der in den Poren des por?sen Materials vorhandenen zweiten w?ssrigen Phase erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die durchschnittliche Porengr??e des por?sen Materials von ? 0,1 nm bis ? 5000 nm betr?gt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei w?hrend der Durchf?hrung der Trennung bzw. Reinigung die zweite w?ssrige Phase im Wesentlichen in den Poren des por?sen Materials vorhanden ist.

4. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 3, wobei vor und/oder nach der Trennung sich die erste w?ssrige Phase im Wesentlichen au?erhalb des por?sen Materials befindet.

5. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, wobei es sich bei dem por?sen Material im Wesentlichen um ein partikelf?rmiges Material handelt.

6. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 5, wobei die durchschnittliche Partikelgr??e des por?sen Materials ? 0,01 mm und ? 2 mm betr?gt.

7. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 6, wobei w?hrend der Trennung eine Adsorption von Biomolek?len an das por?se Material erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 7, wobei das por?se Material eine Schwellrate von ? 40% aufweist.

9. Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 8, wobei das por?se Material im Wesentlichen ausgew?hlt ist aus der Gruppe enthaltend
? Polymerpartikel auf Basis von Polystyrol-Divinylbenzol, Polypropylen, Melamin, Poly(methyl methacrylat), Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyacrylamid, Polybutylacrylat; diese Polymere ggf. in amorpher, semi-kristalliner und kristalliner Form
? Magnetische (Polymer)-Partikel
? Mikrokapseln
? Kohlenstoffhaltige Polymerpartikel, sog. Carbonaceous Resins
? Beschichtete Polymerpartikel, sog. Coated Particles, wobei die Beschichtung u. a. durch Polyvinylalkohol erreicht werden kann
? Polymere Anionen- und Kationenaustauscher
? Zeolite
? Silica
? Aktivkohle
? Anorganische Anionen- und Kationenaustauscher
? Metal Organic Frameworks
oder Mischungen daraus.

10. Verwendung eines Verfahrens gem?? der Anspr?che 1 bis 9 zur
? gro?technischen Gewinnung von Proteinen
? gro?technischen Gewinnung von Antibiotika, Aminos?uren, (Oligo-)Peptiden, Nukleins?uren, Lipiden, Kohlenhydraten, Metaboliten, Stoffwechselprodukten, Inclusion Bodies, Plasmiden
? analytischen Trennung von Biomolek?len
? gro?technischen Abtrennung unerw?nschter Komponenten wie Viren, Proteasen, Zelltr?mmer, etc. aus Biomolek?len enthaltenden Medien zwecks Vorreinigung der Biomolek?le enthaltenden Medien.

Description:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Trennung bzw. Reinigung von Biomolek?len, insbesondere auf das Gebiet der Trennung bzw. Reinigung von Biomolek?len mittels w?ssriger Zweiphasen-Extraktion.

Die w?ssrige Zweiphasen-Extraktion (engl. Aequous Two-Phase Extraction, ATPE) ist eine auf dem Gebiet der Analytik und Gewinnung von Biomolek?len weitverbreitete, jedoch bisher nicht gro?technisch eingesetzte Trennungsmethode. Dies liegt im Wesentlichen an der h?ufig nur sehr langsamen Phasentrennung der beiden w?ssrigen Phasen sowie an dem h?ufigen Ph?nomen, dass sich durch die Anwesenheit der Biomolek?le persistente Emulsionen bilden, die nur durch (starke) Zentrifugation getrennt werden k?nnen.

Es stellt sich somit die Aufgabe, ein verbessertes Zweiphasen-Extraktionsverfahren zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gem?? Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gel?st. Demgem?? wird ein Verfahren zur Trennung bzw. Reinigung von Biomolek?len durch w?ssrige Zweiphasen-Extraktion mittels einer ersten w?ssrigen Phase und einer zweiten w?ssrigen Phase vorgeschlagen, wobei w?hrend der Trennung zumindest partielle ?berf?hrung der Biomolek?le in die zweite w?ssrige Phase erfolgt, wobei ein por?ses Material vorhanden ist, in dessen Poren zweite w?ssrige Phase vorhanden ist und w?hrend der Trennung eine L?sung von Biomolek?len in der in den Poren des por?sen Materials vorhandenen zweiten w?ssrigen Phase erfolgt.

Unter der Bezeichnung ?Trennung? werden insbesondere alle Verfahren verstanden, bei denen

  • ? Biomolek?le aus Fermentationsbr?hen in Reinform durch L?sung in der zweiten w?ssrigen Phase isoliert werden (Capture)
  • ? Gruppen von zwei oder mehr der vorgenannten Biomolek?le aus dem Fermentationsmedium abgetrennt werden
  • ? Biomolek?le aus den bei der Biokatalyse anfallenden fl?ssigen Medien in Reinform isoliert werden (Capture)
  • ? Gruppen von zwei oder mehr der vorgenannten Biomolek?le aus Biokatalysemedien abgetrennt werden
  • ? Unerw?nschte Nebenkomponenten, wie z. B. alle Arten von unerw?nschten Proteinen (Proteasen, Membranproteine, etc.), Viren, DNA, Zellorganellen (Mitochondrien, etc.) und andere Zelltr?mmer, Lipide, Metaboliten und Stoffwechselprodukte aus Fermentationsbr?hen einzeln oder in Gruppen entfernt werden
  • ? Unerw?nschte Nebenkomponenten aus den bei der Biokatalyse anfallenden fl?ssigen Medien einzeln oder in Gruppen entfernt werden

Unter der Bezeichnung ?Reinigung? werden insbesondere alle Verfahren verstanden, bei denen

  • ? Biomolek?le aus Fermentationsbr?hen in Reinform durch L?sung in der zweiten w?ssrigen Phase isoliert werden (Polishing)
  • ? Biomolek?le aus den bei der Biokatalyse anfallenden fl?ssigen Medien in Reinform durch L?sung in der zweiten w?ssrigen Phase isoliert werden (Polishing)

Unter dem Term ?Biomolek?le? werden ? aber nicht darauf beschr?nkt ? im Sinne der vorliegenden Erfindung s?mtliche in biologischen Proben nat?rlicherweise vorkommende oder k?nstlich eingebrachte Molek?le verstanden. Insbesondere werden unter dem Term ?Biomolek?le? Nukleins?uren, Antibiotika, Aminos?uren, Lipide, Kohlenhydrate, Metabolite, Inclusion Bodies, Stoffwechselprodukte und insbesondere alle Arten von Proteinen verstanden, darunter (aber nicht darauf beschr?nkt)

  • ? Transportproteine
  • ? Antik?rper
  • ? Membranproteine
  • ? Hormone
  • ? Blutgerinnungsfaktoren
  • ? Enzyme
  • ? Kollagene
  • ? Endotoxine

Unter dem Term ?por?ses Material? werden insbesondere ? aber nicht darauf beschr?nkt ? alle Materialien verstanden, die ?ber eine offene Porosit?t von ? 50% verf?gen.

?berraschenderweise hat sich gezeigt, dass durch ein solches por?ses Material die w?ssrige Zweiphasen-Extraktion wesentlich verbessert werden kann. F?r viele Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindung erf?llt das erfindungsgem??e Verfahren mindestens einen oder mehrere der folgenden Vorteile:

  • ? Dadurch, dass zweite w?ssrige Phase in dem por?sen Material enthalten ist, kann eine Abtrennung der Biomolek?le, die nach erfolgter Trennung sich in dieser w?ssrigen Phase (und somit ?innerhalb? des por?sen Materials) aufhalten, auf einfache Weise erfolgen.
  • ? Durch die Vermeidung langwieriger Phasentrennung kommt es zu erheblicher Zeitersparnis; auf meist notwendige separate Zentrifugationsschritte kann ? zusammen mit dem damit verbundenen apparativen Aufwand ? verzichtet werden
  • ? Der Raumbedarf im Vergleich zur w?ssrigen Zweiphasenextraktion sinkt, da der Zentrifugationsschritt eingespart wird; hierdurch kommt es neben der Raumersparnis zu einer Investitionskostenersparnis
  • ? Einfaches Scale-Up durch Anwendung der in Adsorption und Chromatographie bekannten Heuristiken und Rechenmodelle

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung betr?gt die durchschnittliche Porengr??e des por?sen Materials von ? 0,1 nm bis ? 5000 nm. Dies hat sich in der Praxis bew?hrt. Besonders bevorzugt betr?gt die durchschnittliche Porengr??e des por?sen Materials von ? 2 nm bis ? 2000 nm, noch bevorzugt von ? 50 nm bis ? 1000 nm.

Der Term ?durchschnittlich? bedeutet dabei insbesondere, dass es sich um den mathematisch gemittelten Wert der gesamten ?ber ein Partikel bzw. eine Partikelcharge produktionsbedingt (in der Regel) gem?? einer Gau?verteilung gestreuten Durchmesser der Poren handelt. Da die Bestimmung der Porendurchmesser h?ufig unter Zuhilfenahme bildgebender Verfahren durchgef?hrt wird, wird unter Porendurchmesser im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere die auf der Partikeloberfl?che sichtbaren Durchmesser der Poren verstanden.

Wie sich in der Praxis bei vielen Anwendungen gezeigt hat, bedeutet eine hohe Porosit?t aufgrund gro?en konstanten Porendurchmessers bzw. sich ins Partikelinnere erweiternder Poren bzw. eines im Partikel vorhandenen zentralen Hohlraumes eine hohe Kapazit?t f?r die Aufnahme zweiter w?ssriger Phase und somit potentiell eine h?here Kapazit?t f?r die abzutrennende(n) Zielkomponente(n) als im Vergleich zu Partikeln mit geringerem konstanten Porendurchmesser bzw. sich im Querschnitt ins Partikelinnere verengenden Poren bzw. ohne zentralen Hohlraum.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung ist w?hrend der Durchf?hrung der Trennung bzw. Reinigung die zweite w?ssrige Phase im Wesentlichen in den Poren des por?sen Materials vorhanden.

?Im Wesentlichen? im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet dabei ? 90 Gew.-%, bevorzugt ? 95 Gew.-%, noch bevorzugt ? 97 Gew.-%, sowie am meisten bevorzugt ? 99 Gew.-%.

Dies hat sich als vorteilhaft herausgestellt, da so nach der durchgef?hrten Trennung die in der zweiten w?ssrigen Phase befindlichen Biomolek?le sich auch innerhalb des por?sen Materials aufhalten. Jedoch sei ausdr?cklich darauf hingewiesen, dass das vorliegende Verfahren nicht darauf beschr?nkt ist, je nach konkreter Ausgestaltung kann es auch von Vorteil sein, dass sich die zweite w?ssrige Phase auch ausserhalb des por?sen Materials befindet, dieses sozusagen eher ?unterst?tzend? eingesetzt wird.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung befindet sich vor und/oder nach der Trennung die erste w?ssrige Phase im Wesentlichen au?erhalb des por?sen Materials. Dies hat sich als vorteilhaft herausgestellt, da so die Trennung der Phasen erleichtert wird.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung handelt es sich bei dem por?sen Material im Wesentlichen um ein partikelf?rmiges Material. Dies hat sich bei vielen Anwendungen als besonders vorteilhaft herausgestellt, da dadurch oftmals einer oder mehrerer der folgenden Vorteile erreicht werden k?nnen:

  • ? Die Partikel k?nnen in eine S?ule gepackt und somit als pr?paratives ?quasi-chromatographisches? Festbett verwendet werden
  • ? Da die Poren der Partikel als ?Hohlraum? f?r die zweite w?ssrige Phase dienen k?nnen die Partikel leicht wiederverwertet werden, zudem ist eine schnelle Anpassung/Umstellung m?glich, sowie eine GMP konforme (Re-)Impr?gnierung in geschlossenen Apparaten.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform betr?gt die durchschnittliche Partikelgr??e des por?sen Materials von ? 0,01 mm und 2 mm, bevorzugt ? 0,05 mm und ? 1,5 mm sowie am meisten bevorzugt ? 0,1 mm und ? 1 mm.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung erfolgt w?hrend der Trennung eine Adsorption von Biomolek?len an das por?se Material. Dies ist oftmals ein willkommener ?Nebeneffekt? bei der Verwendung von bestimmten por?sen Materialien.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung hat das por?se Material eine Schwellrate von ? 40%. Dies hat sich in der Praxis als vorteilhaft herausgestellt, da so kein ?Lecken? der in dem por?sen Materials befindlichen zweiten w??rigen Phase erfolgt. F?r viele Anwendungen ist jedoch eine gewisse Schwellrate vorteilhaft, da so die Kapazit?t f?r die zweite w?ssrige Phase steigt. Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung hat das por?se Material eine Schwellrate von ? 20% und ? 35%.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung ist das por?se Material im Wesentlichen ausgew?hlt aus der Gruppe enthaltend:

  • ? Polymerpartikel auf Basis von Polystyrol-Divinylbenzol, Polypropylen, Melamin, Poly(methyl methacrylat), Polyvinylacetat, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyacrylamid, Polybutylacrylat; diese Polymere ggf. in amorpher, semi-kristalliner und kristalliner Form
  • ? Magnetische (Polymer)-Partikel
  • ? Mikrokapseln
  • ? Kohlenstoffhaltige Polymerpartikel, sog. Carbonaceous Resins
  • ? Beschichtete Polymerpartikel, sog. Coated Particles, wobei die Beschichtung u. a. durch Polyvinylalkohol erreicht werden kann
  • ? Polymere Anionen- und Kationenaustauscher
  • ? Zeolite
  • ? Silica
  • ? Aktivkohle
  • ? Anorganische Anionen- und Kationenaustauscher
  • ? Metal Organic Frameworks
oder Mischungen daraus.

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform wird als w?ssrige Zweiphasen-Extraktion die polymere Zweiphasen-Extraktion (ATPPE), die mizellare Zweiphasen-Extraktion (ATPME), die reverse mizellare Zweiphasen-Extraktion (ATPRME) und/oder die Zweiphasen-Extraktion unter der Verwendung ionischer Fl?ssigkeiten verwendet.

Im Folgenden wird auf die einzelnen Extraktionsverfahren genauer eingegangen:

Polymere Zweiphasen-Extraktion (ATPPE)

F?r den Fall, dass die polymere Zweiphasen-Extraktion (ATPPE) zum Einsatz kommt, sind insbesondere folgende Spezifikationen besonders bevorzugt:

  • ? Erste und zweite w?ssrige Phase enthalten nichtionische Polymere

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? Polyoxyverbindungen wie Polyethylenglykol/Polypropylenglykol einerseits, Polysaccharide wie z. B. Dextran andererseits
  • ? Polyoxyverbindungen wie Polyethylenglykol/Polypropylenglykol einerseits, Polyhydroxypolymere wie Polyvinylalkohol andererseits
  • ? Ein nichtionisches Polymer und ein Polyelektrolyt

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? Polyoxyverbindungen wie Polyethylenglykol/Polypropylenglykol einerseits, sulfonierte Polysaccharide wie z. B. Natriumdextransulfat andererseits
  • ? Polyoxyverbindungen wie Polyethylenglykol/Polypropylenglykol einerseits, Polyimine wie Polyethylenimin andererseits
  • ? modifizierte Polysaccharide wie Methylcellulose einserseits, sulfonierte Polysaccharide wie z. B. Natriumdextransulfat andererseits
  • ? Erste und zweite w?ssrige Phase enthalten Elektrolyte

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? sulfonierte Polysaccharide wie z. B. Natriumdextransulfat einerseits, modifizierte Polysaccharide wie Natriumcarboxydextran andererseits
  • ? modifizierte Polysaccharide wie Natriumcarboxycellulose einserseits, anders modifizierte Polysaccharide wie Natriumcarboxydextran andererseits
  • ? Ein nichtionisches Polymer und eine hochkonzentrierte L?sung eines niedermolekularen Stoffes

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? Polyoxyverbindungen wie Polyethylenglykol/Polypropylenglykol einerseits, niedermolekulare Saccharide wie Glucose andererseits
  • ? Polyoxyverbindungen wie Polyethylenglykol/Polypropylenglykol einerseits, niedermolekulare Salze wie Citrat oder Phosphat andererseits.

Die oben genannten Polymere und Polyelektrolyten k?nnen zur weiteren Verbesserung der Trennleistung mit Affinit?tsliganden gekoppelt werden, z. B. glutars?ure-, amino-, mercaptoethylpyridin-, pyrimidin-, benzyl- and triazin-basierte Gruppen.

Mizellare Zweiphasen-Extraktion (ATPME)

F?r den Fall, dass die mizellare Zweiphasen-Extraktion (ATPME) zum Einsatz kommt, sind insbesondere folgende Spezifikationen besonders bevorzugt:

  • ? Das System enth?lt nichtionische Tenside

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? Eine w?ssrige L?sung bestehend aus polyethylenoxidbasierten nichtionischen Tensiden wie n-Decyltetraethylenoxid (C10E4) und Octylphenolethoxylat (Triton X-114), die sich in Abh?ngigkeit von der Temperatur in eine mizellenreiche Phase und eine mizellenarme Phase trennen l?sst
  • ? Das System enth?lt nichtionische und kationische Tenside

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? Eine w?ssrige L?sung bestehend aus polyethylenoxidbasierten nichtionischen Tensiden wie n-Decyltetraethylenoxid (C10E4) und kationischen Tensiden wie Alkyltrimethylammoniumbromid, die sich in Abh?ngigkeit von der Temperatur in eine mizellenreiche Phase und eine mizellenarme Phase trennen l?sst
  • ? Das System enth?lt eine Mischung anionischer und kationischer Tenside

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? Eine w?ssrige L?sung bestehend aus anionischen Tensiden wie Dodecyltriammoniumbromid (C12NE) und kationischen Tensiden wie Natriumperfluorooctanoat (SPFO)

Reverse mizellare Zweiphasen-Extraktion (ATPRME)

F?r den Fall, dass die reverse mizellare Zweiphasen-Extraktion (ATPRME) zum Einsatz kommt, sind insbesondere folgende Spezifikationen besonders bevorzugt:

  • ? Erste Phase enth?lt kationische Tenside und zweite Phase enth?lt organische L?sungsmittel

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? n-Benzyl-n-dodecyl-n-bis(2?hydroxyethyl)ammoniumchlorid (BDBAC)/Isooctan/Hexanol
  • ? Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)/Isooktan/Hexanol/Butanol

Zweiphasen-Extraktion unter der Verwendung ionischer Fl?ssigkeiten

F?r den Fall, dass die Zweiphasen-Extraktion unter der Verwendung ionischer Fl?ssigkeiten zum Einsatz kommt, sind insbesondere folgende Spezifikationen besonders bevorzugt:

  • ? Erste w?ssrige Phase enth?lt ionische Fl?ssigkeit und zweite w?ssrige Phase enth?lt Elektrolyte

In diesem Fall sind folgende Systeme besonders bevorzugt:

  • ? Ionische Fl?ssigkeiten wie AmmoengTM 110 einerseits, Salze wie Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4/KH2PO4) andererseits
  • ? Ionische Fl?ssigkeiten wie 1-butyl-3-methylimidazoliumchlorid ([Bmim][Cl]), Salze wie Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) andererseits
  • ? Ionische Fl?ssigkeiten wie 1-butyl-3-methylimidazoliumtertafluoroborat ([Bmim][BF4]), Salze wie Natriumhydrogenphosphat (NaH2PO4) andererseits

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform der Erfindung umfasst das erfindungsgem??e Verfahren zur Trennung bzw. Reinigung von Biomolek?len folgende Schritte

  • a) ?Bef?llen? bzw. ?Impr?gnieren? des por?sen Materials mit der zweiten w?ssrigen Phase
  • b) Suspendieren des por?sen Materials in der ersten w?ssrigen Phase
  • c) Hinzugeben der die zu trennenden bzw. reinigenden Biomolek?le enthaltenden Mischung
  • d) Durchf?hrung der Trennung
  • e) Abtrennen des por?sen Materials
  • f) Gewinnen der abgetrennten Biomolek?le aus der in den Poren des por?sen Materials enthaltenden zweiten w?ssrigen Phase

Gem?? einer bevorzugten Ausf?hrungsform wird die zweite w?ssrige Phase vor oder w?hrend Schritt a) mit der ersten w?ssrigen Phase ges?ttigt. Dies hat den Vorteil, dass w?hrend der Trennung keine (oder nur sehr wenig) erste w?ssrige in die Poren des por?sen Materials eindringt.

F?r den Fachmann ist einsichtig, dass die Schritte b) und c) in beliebiger Reihenfolge bzw. auch simultan erfolgen k?nnen. Bei einigen Ausf?hrungen der Erfindung geschieht die Abtrennung der gew?nschten Biomolek?le auch direkt aus der ?Reaktionsl?sung? (z. B. bei Fermenterprozessen), d. h. die erste w?ssrige Phase und die zu trennenden bzw. reinigenden Biomolek?le enthaltende Mischung sind (teil)-identisch.

Schritt d) kann entweder durch reines Abwarten (d. h. durch Diffusion) erfolgen, meist wird aber eine aktive Durchmischung erfolgen, diese kann z. B. durch R?hren z. B. mittels eines Impellers, durch Anstr?mung im Festbett ?hnlich chromatographischer Methoden oder durch Dispersion im Wirbelbett mittels Durchstr?mung einer losen Sch?ttung geschehen.

Schritt e) kann im einfachsten Fall dadurch geschehen, dass das por?se Material abfiltriert wird.

Die Filtration kann durch dynamische Filtration (z. B. Cross-Flow-Filtration) sowie durch statische Filtration (z. B. Druck- oder Membranfiltration) erreicht werden.

Bei Verwendung eines magnetischen por?sen Materials kann die Abtrennung des por?sen Materials durch Anlegen eines (elektro-)magnetischen Feldes erzielt werden. Des Weiteren kann die Abtrennung des por?sen Materials durch gravimetrische Setzung erreicht werden. Zudem kann zur Abtrennung des por?sen Materials eine Zentrifuge bzw. ein Dekanter verwendet werden.

Schritt t) kann z. B. durch R?ckextraktion der Biomolek?le aus der zweiten Phase mittels konzentrierter Salzl?sungen bzw. durch ?nderung der Prozessparameter, wie z. B. pH-Wert, Ionenst?rke, Zugabe eines zus?tzlichen Salzes geschehen.

Eine weitere Ausf?hrungsform der Erfindung bezieht sich auf eine Verwendung eines erfindungsgem??en Verfahrens zur

  • ? gro?technischen Gewinnung von Proteinen
  • ? gro?technischen Gewinnung von Antibiotika, Aminos?uren, (Oligo-)Peptiden, Nukleins?uren, Lipiden, Kohlenhydraten, Metaboliten, Stoffwechselprodukten, Inclusion Bodies, Plasmiden
  • ? analytischen Trennung von Biomolek?len
  • ? gro?technischen Abtrennung unerw?nschter Komponenten wie Viren, Proteasen, Zelltr?mmer, etc. aus Biomolek?len enthaltenden Medien zwecks Vorreinigung der Biomolek?le enthaltenden Medien

Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausf?hrungsbeispielen beschriebenen erfindungsgem?? zu verwendenden Bauteile unterliegen in ihrer Gr??e, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschr?nkt Anwendung finden k?nnen.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteranspr?chen sowie aus den nachfolgenden Beschreibungen der zugeh?rigen Beispiele, die rein illustrativ zu verstehen sind.

Beispiel I: Abtrennung von BSA-Protein

Folgende Spezifikationen wurden gew?hlt:

  • ? Erste w?ssrige Phase: 20% w/w Trinatriumcitratl?sung
  • ? Zweite w?ssrige Phase: 20% (w/w) Polyethylenglykoll?sung
  • ? Por?ses Material: Amberlite XAD16-Partikel (Quervernetztes Polystyrol-Divinylbenzol, Porosit?t 0,55, Porengr??e 10 nm, Partikelgr??e 0,56?0,71 mm)
  • ? Abzutrennende/reinigende Biomolek?le: BSA(Bovine Serum Albumin)-Protein

a) ?Bef?llen? bzw. Impr?gnieren des por?sen Materials.

Hierzu wurde im Wesentlichen die Methode nach J. L. Cortina und A. Warshawsky, Developments in solid-liquid extraction by solvent-impregnated-resins, Ion Exch. Solvent Extr. 13, 195?293, 1997 verwendet: Zun?chst wurde die zweite w?ssrige Phase mit erster w?ssriger Phase vor?quilibriert. Anschlie?end wurden 2 g por?ses Material in der zweiten w?ssrigen Phase komplett dispergiert. Die Dispersion wurde f?r die Dauer von 30 min. in ein Ultraschallbad gestellt, anschlie?end wurde filtriert und die an den Partikeln haftenden ?berreste an w?ssriger Phase mit Zellstoff entfernt.

b) Abtrennung der Biomolek?le

Im zweiten Schritt wurde die erste w?ssrige Phase mit BSA-Proteinl?sung versetzt, so dass sich eine Konzentration von 0,5 mg/ml Protein ergab. Anschlie?end wurden 2 g des por?sen Materials mit 10 ml erster w?ssriger Phase versetzt und 180 min. durch Sch?tteln mit einem ?berkopfsch?ttler dispergiert. Anschlie?end lie? man zentrifugieren. Aus dem ?berstand wurde eine Probe entnommen und die verbliebene Proteinkonzentration bestimmt.

c) Vergleichsversuche

Parallel wurde eine Zweiphasenextraktion ohne Zusatz von por?sem Material durchgef?hrt; hierzu wurden 5 ml der vor?quilibrierten zweiten Phase mit 10 ml der proteinhaltigen ersten Phase versetzt und unter R?hren f?r 180 min. emulgiert. Nach erfolgter Phasentrennung wurde die verbliebene Proteinkonzentration in der ersten w?ssrigen Phase bestimmt.

Als weiterer Vergleichsversuch wurde die Adsorption des Proteins an das por?se Material bestimmt; hierzu wurde eine 0,5 mg/ml Proteinl?sung mit por?sem Material versetzt; man lie? (analog zu Schritt b) dispergieren und bestimmte anschlie?end die verbliebene Proteinkonzentration.

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle I aufgef?hrt:

MethodeAbreicherung des Proteins (in %)Erfindungsgem??e Methode22,22%Zweiphasenextraktion ohne por?ses Material12,26%Adsorption aus Wasser8,65%

Man sieht somit klar, dass ? neben der schnelleren Durchf?hrbarkeit des erfindungsgem??en Verfahrens ? auch die Abreicherung des Proteins deutlich gesteigert werden konnte.

d) Untersuchung des por?sen Materials

Um den Grad der Adsorption des Proteins an das por?se Material (im Unterschied zur L?sung in der zweiten w?ssrigen Phase, die sich in den Poren befindet) festzustellen wurde folgende Untersuchung vorgenommen.

Das die zweite Phase (PEG-L?sung) enthaltende por?se Material wurde mittels einer Vakuumpumpe und Filterpapier von dem das Zielprotein enthaltenden ?berstand der ersten Phase (Salzl?sung) getrennt. Danach werden auf das por?se Material 20 mL der mit der ersten Phase (Salzl?sung) vorges?ttigten zweiten Phase (PEG-L?sung) gegeben. Diese Dispersion wird f?r 180 min. im ?berkopfsch?ttler bei 10 rpm vermischt. Hiernach wurde der ?berstand der das por?se Material umgebenden PEG-L?sung mittels einer Pipette abgenommen, zenrtifugiert (5000 rpm) und sterilfiltriert. Von der filtrierten PEG-L?sung wurden 5 mL zwecks R?ckextraktion des Proteins mit 5 mL (mit PEG-L?sung) vorges?ttigter Salzl?sung f?r 180 min im ?berkopfsch?ttler emulgiert. Im Anschluss daran wurden die Phasen durch Zentrifugation (1500 rpm) getrennt und eine Probe der Salzl?sung entnommen. Diese wurde mittels eines UV/VIS-Spektrophotometers bei 280 nm auf ihren Proteingehalt untersucht. Diese Messungen haben ergeben, dass mindestens ca. 50% des Proteins in gel?ster Form, d. h. nicht adsorbiert, innerhalb der in den Poren des por?sen Materials vorhandenen zweiten Phase vorhanden ist.

Beispiel II

Folgende Spezifikationen wurden gew?hlt:

  • ? Erste w?ssrige Phase: 20% w/w Dikaliumhydrogenphosphatl?sung
  • ? Zweite w?ssrige Phase: 20% (w/w) Polyethylenglykoll?sung
  • ? Por?ses Material: Amberlite XAD16-Partikel
  • ? Abzutrennende/reinigende Biomolek?le: BSA(Bovine Serum Albumin)-Protein

Die Vorgehensweise entsprach Beispiel I. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle II aufgef?hrt:

MethodeAbreicherung des Proteins (in %)Erfindungsgem??e Methode32,03%Zweiphasenextraktion ohne por?ses Material15,48%Adsorption aus Wasser8,65%

Beispiele III bis V

Die Spezifikationen der Beispiele III und V entsprechen denen aus Beispiel I, nur das jeweils ein anderes por?ses Material gew?hlt wurde. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III aufgef?hrt.

BeispielAbreicherung des Proteins (in %)Beispiel III: Lewatit VPOC 106442,55%Beispiel IV: Amberlite XAD1848,85%Beispiel V: Lewatit CNP 10595,11%

Die Eigenschaften der verwendeten por?sen Materialien sind in Tabelle IV zusammengefasst.

MaterialChemische ZusammensetzungPorengr??e (in nm)Porenvolumen (in mg/L)Partikeldurchmesser (in mm)Lewatit VPOC 1064Quervernetztes Polystyrol5?101,020,44?0,54Amberlite XAD18Quervernetztes Polystyrol-Divinylbenzol15k. A.0,375?0,475Lewatit CNP 105Methacrylat-Polymer~ 27k. A.0,1?0,4

Die einzelnen Kombinationen der Bestandteile und der Merkmale von den bereits erw?hnten Ausf?hrungen sind exemplarisch; der Austausch und die Substitution dieser Lehren mit anderen Lehren, die in dieser Druckschrift enthalten sind mit den zitierten Druckschriften werden ebenfalls ausdr?cklich erwogen. Der Fachmann erkennt, dass Variationen, Modifikationen und andere Ausf?hrungen, die hier beschrieben werden, ebenfalls auftreten k?nnen ohne von dem Erfindungsgedanken und dem Umfang der Erfindung abzuweichen. Entsprechend ist die obengenannte Beschreibung beispielhaft und nicht als beschr?nkend anzusehen. Das in den Anspr?chen verwendetet Wort umfassen schlie?t nicht andere Bestandteile oder Schritte aus. Der unbstimmte Artikel ?ein? schlie?t nicht die Bedeutung eines Plurals aus. Die blo?e Tatsache, dass bestimmte Ma?e in gegenseitig verschiedenen Anspr?chen rezitiert werden, verdeutlicht nicht, dass eine Kombination von diesen Ma?en nicht zum Vorteil benutzt werde kann. Der Umfang der Erfindung ist in den folgenden Anspr?chen definiert und den dazugeh?rigen ?quivalenten.