Title:
New compounds conjugating gyrase-inhibiting substances with catechol structural units, are gyrase inhibitors, useful as biologically active substances, and for treating bacterial infection
Kind Code:
A1
Abstract:
Compounds (Q) conjugating gyrase-inhibiting substances with catechol structural units, are new. An independent claim is included for the preparation of (Q). ACTIVITY : Antibacterial. MECHANISM OF ACTION : Gyrase inhibitor.


Inventors:
Heide, Lutz, Prof. Dr. (72070, Tübingen, DE)
Alt, Silke (72144, Dußlingen, DE)
Application Number:
DE102010055566A
Publication Date:
06/21/2012
Filing Date:
12/21/2010
Assignee:
Eberhard-Karls-Universität Tübingen, 72074 (DE)
Domestic Patent References:
DE10111160A1N/A2002-09-05
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Claims:
1. Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie Konjugate der Gyrasehemmenden Substanzen mit Catechol-Struktureinheiten darstellen.

2. Verbindungen gem?? Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Konjugate der Aminocoumarine mit Catechol-Struktureinheiten darstellen.

3. Verbindungen gem?? einem der Anspr?che 1 bis 2, mit der Strukturformel (I): wobei zwei benachbarte Reste R1 und R2, oder R2 und R3 gleichzeitig f?r je eine OH-Gruppe und der ?brige Rest f?r ein Wasserstoffatom stehen,
R4 f?r H, Cl oder CH3 steht,
und R5 f?r H,steht.

4. Verbindungen gem?? einem der Anspr?che 1 bis 3, mit der Strukturformel (II): wobei die Reste R1 bis R4 die Bedeutungen gem?? Anspruch 3 haben und einer der Reste R6 oder R7 f?r eine der Gruppen w?hrend der andere Rest f?r H steht.

5. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gem?? einem der Anspr?che 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Catechol-Struktureinheiten an einen Aminocoumarinring mittels einer Amidsynthetase gekoppelt wird, so dass eine Aminocoumarins?ure entsteht.

6. Verfahren gem?? Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Amidsynthetase die Amidsynthetase CloL ist.

7. Verfahren gem?? einem der Anspr?che 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die an einen Aminocoumarinring zu koppelnde Catechol-Struktureinheiten eine 2,3-Dihydroxybenzoes?ure oder eine 3,4-Dihydroxybenzoes?ure ist.

8. Verfahren gem?? einem der Anspr?che 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Deoxyzucker-Einheit mittels einer Glycosyltransferase auf die Aminocoumarins?ure ?bertragen wird.

9. Verfahren gem?? Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Carbamoyl-Rest oder mindestens ein 5-Methylpyrrol-2-carboxyl-Rest an die Deoxyzucker-Einheit angeh?ngt wird.

10. Verwendung der Verbindungen gem?? einem der Anspr?che 1 bis 4 als biologisch wirksame Stoffe.

11. Verwendung der Verbindungen gem?? einem der Anspr?che 1 bis 4 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von bakteriellen Infektionen.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate zwischen Gyrase-Hemmer, die insbesondere zur Aminocoumarin-Antibiotika geh?ren, und einer Catechol-Struktureinheit, das Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre pharmazeutische Verwendung. Diese Verbindungen wirken antibakteriell, wobei ihre Aufnahme in die bakterielle Zelle aktiv ?ber Eisen-Siderophor-Transportproteine erfolgt. Dadurch weisen die neuen Catechol-Konjugate eine bessere antibakterielle Wirkung auf als die herk?mmlichen Antibiotika der Gyrase-Hemmer-Klasse.

Gyrase-Hemmer sind chemische Verbindungen, die die Aktivit?t von Gyrase-Enzymen verhindern, und damit die lebensnotwendige Replikation der bakteriellen DNA beeintr?chtigen. Die bakterielle Gyrase stellt eine geeignete Zielstruktur dar, an der Antibiotika angreifen k?nnen, da dieses Target in eukaryotischen Zellen fehlt.

Aminocoumarine, wie z. B. Novobiocin und Clorobiocin (), bilden eine Gruppe von Gyrase-Hemmern, die von verschiedenen St?mmen der Gattung Streptomyces synthetisiert werden. Im Gegensatz zu Chinolon-Antibiotika, die an der A-Untereinheit der bakteriellen Gyrase angreifen, ist das zellul?re Traget der Aminocoumarine ihre B-Untereinheit [1]. Das therapeutische Potential der Aminocoumarine liegt in ihrer hohen Affinit?t zur bakteriellen Gyrase mit Inhibierungskonzentrationen im 10 nm Bereich; d. h. die Hemmkonzentrationen sind erheblich geringer als die der Chinolone [1, 2].

Obwohl Clorobiocin der potentere Wirkstoff gegen die bakterielle Gyrase ist, ist aus der Klasse der Aminocoumarine einzig Novobiocin in den USA als humantherapeutisches Antiinfektivum unter dem Handelsnamen Albamycin? (Pharmacia & Upjohn) [3] zugelassen und wird zur Behandlung multiresistenter Gram-positiver Pathogene wie Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis eingesetzt. Wegen der schlechten L?slichkeit in Wasser und der geringen Aktivit?t gegen Gram-negative Bakterien wird Novobiocin nur als Reserveantibiotikum verwendet.

Bestimmte Catechole spielen in den nat?rlich vorkommenden Siderophoren bei der Eisenaufnahme in die Bakterienzelle eine wichtige Rolle. Siderophore (z. B. Enterobactin von Escherichia coli oder Petrobactin von Bacillus anthracis) werden von Bakterien ins umgebende Medium ausgeschieden, um lebensnotwendige Eisenionen mit Hilfe der benachbarten Hydroxylgruppen der Catechol-Verbindung zu komplexieren [4]. ?ber spezifische Siderophor-Rezeptor- bzw. Siderophor-Transportproteine in der Membran [5, 6], denen die Catechol-Struktur als Erkennungsmerkmal dient, werden die Siderophore wieder in die Bakterienzelle aufgenommen.

Verschiedene Catechol-Verbindungen wurden bereits mit Antibiotika verkn?pft, z. B. mit ?-Laktamen, wodurch eine erhebliche Steigerung der antibakteriellen Wirksamkeit der Antibiotika erreicht wurde, die durch eine verbesserte Aufnahme ?ber bakterielle Eisentransportwege in die Zelle zustande kommt (Arisawa, M., Sekine, Y., Shimizu, S., Takano, H., Angehrn, P., Then, R. L., Antimicrob. Agents Chemother. 32 (1991), 653; DE10111160). Konjugate von Gyrase-Hemmern mit Catechol-Struktureinheiten sind in der Literatur bisher nicht beschrieben.

In den letzten Jahren kam es zu einer rasanten Resistenzentwicklung bei pathogenen Bakterien z. B. multiresistenten Staphylococcus aureus St?mmen (MRSA). Deshalb w?chst die dringende Notwendigkeit, neue Antibiotika mit verbesserten Eigenschaften zu finden und herzustellen. Die Verbindungsgruppe der Gyrase-Hemmer, insbesondere die Substanzklasse der Aminocoumarine, bietet hierf?r einen guten Ansatzpunkt f?r die Herstellung neuer Derivate mit interessanten antimikrobiellen Eigenschaften.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Gyrase-hemmende Antibiotika mit einer verbesserten Wirksamkeit als die herk?mmlichen Antibiotika dieser Substanzklasse bereitzustellen und in Hinblick auf Ihre Verwendung als pharmazeutische Wirkstoffe zu charakterisieren. Hierzu soll au?erdem ein Verfahren entwickelt werden, mit dem die neuen Substanzen herstellbar sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgem?? gel?st, indem neue Antibiotika-Konjugate von Gyrase-Hemmern und Catecholverbindungen bereitgestellt werden.

Insbesondere handelt es sich bei der Erfindung um Konjugate von Aminocoumarinen und Catechol-Verbindungen, welche die allgemeine Formel I aufweisen: wobei zwei benachbarte Reste R1 und R2, oder R2 und R3 gleichzeitig f?r je eine OH-Gruppe und der ?brige Rest f?r ein Wasserstoffatom stehen,
R4 f?r H, Cl oder CH3 steht,
und R5 f?r H,steht.

In einer bevorzugten Ausf?hrung der Erfindung weisen die Verbindungen die allgemeine Formel II auf: wobei die Reste R1 bis R4 die o. g. Bedeutungen annehmen k?nnen und einer der Reste R6 oder R7 f?r eine der Gruppen w?hrend der andere Rest f?r H steht.

Da die Catechol-Struktureinheit der erfindungsgem??en Verbindungen eine Siderophor-Struktur imitiert, bieten diese Substanzen die M?glichkeit, den lebensnotwendigen Mechanismus der bakteriellen Eisenaufnahme zu nutzen, um Membran-assoziierte Resistenzmechanismen von Bakterien zu ?berwinden. Einige der erfindungsgem??en Konjugate zeigen deswegen st?rkere Wirksamkeit gegen Bakterien als die herk?mmlichen Antibiotika ( und Ausf?hrungsbeispiele).

Ein weiterer Vorteil dieser Verbindungen ist, dass die erfindungsgem?? eingef?hrte Catechol-Einheit, welche die Erkennungsstruktur f?r die Siderophor-Transporter darstellt, einen Teil der urspr?nglichen Aminocoumarin-Struktur ersetzt und direkt ohne einen zus?tzlichen Linker an die restliche Antibiotika-Struktureinheit gekoppelt ist. Die chemische Struktur wird dadurch nicht vergr??ert und die erfindungsgem??en Verbindungen b?ssen somit nicht ihre antibiotische Wirkung ein, wohingegen eine Vergr??erung der Struktur oftmals erheblich die Aktivit?t des Antibiotikums beeintr?chtigen kann [7].

Die erfindungsgem??en Verbindungen k?nnen insbesondere in einem enzymatischen Verfahren synthetisiert werden. In einem speziell daf?r entwickelten Verfahren werden nat?rliche und synthetische Gene aus unterschiedlichen Grampositiver und Gram-negativen Mikroorganismen in vivo eingesetzt.

Beim erfindungsgem??en Verfahren werden der Aminocoumarinring und die Catechol-Struktureinheiten (z. B. 2,3-Dihydroxybenzoes?ure oder 3,4-Dihydroxybenzoes?ure) mit einer Amidsynthetase, insbesondere der Amidsynthetase CloL, in einem Reaktionsschritt zu einer Aminocoumarins?ure umgesetzt (). In mehreren anschlie?enden Reaktionsschritten wird die Deoxyzuckereinheit mit Hilfe einer Glycosyltransferase auf die Aminocoumarins?ure ?bertragen. Im Fall von Novobiocin findet eine anschlie?ende Carbamoylierung statt, bei Clorobiocin wird indessen ein 5-Methylpyrrol-2-carboxylteil angeh?ngt.

Des Weiteren umfasst die Erfindung die pharmazeutische Verwendung der neuen Konjugate. Die erfindungsgem??en Verbindungen eigenen sich aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften zur Verwendung als Arzneimittel bei bakteriellen Infektionen. Die Verbindungen k?nnen entweder allein oder mit physiologisch vertr?glichen Hilfs- oder Tr?gerstoffen verwendet werden. Dabei sind prinzipiell alle ?blichen pharmakologischen Anwendungsformen und physiologisch vertr?glichen Dosierungen m?glich.

In der vorliegenden Erfindung ist es zum ersten Mal gelungen, Konjugate der Gyrase-hemmenden Aminocoumarin-Antibiotika und Catechol-Struktureinheiten herzustellen. Durch die gezielte aktive Aufnahme der Substanzen in die bakterielle Zelle mittels Siderophor-Transporter wird ein neuer Aufnahmemechanismus in die Zelle bereitgestellt und die Gyrase-hemmenden Eigenschaften k?nnen effektiver genutzt werden.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsm?glichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der unten beschriebenen Ausf?hrungsbeispiele mit Bezug auf die Figuren beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:

: Chemische Strukturen der aus dem Stand der Technik bekannten Aminocoumarine Novobiocin und Clorobiocin;

: Beispiel f?r die chemische Struktur eines erfindungsgem??en Aminocoumarin-Antibiotikums mit Catechol-Struktur;

: Nukleotidsequenz des synthetischen ubiC/pobA-DNA Fragments. Die unterstrichenen Buchstaben zeigen die flankierenden HindIII und SpeI Restriktionsschnittstellen. Die hervorgehobenen Buchstaben representieren Start- und Stop-Codons der synthetischen Gene ubiC und pobA. Die Gene sind translational gekoppelt, wobei das Stop-Codon von ubiC mit dem Start-Codon von pobA ?berlappt;

: Beispiel f?r das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgem??en Clorobiocin-Derivates mit 3,4-Dihydroxybenzoes?ure (Novclobiocin 401) anstelle des nat?rlichen Ring A;

: Massenspektrometrische Fragmentierung der erfindungsgem??en Verbindung Novclobiocin 401. LC-ESI-MS Massen-Scans wurden im Negativ-Modus f?r m/z 643 durchgef?hrt. Das Fragmentierungsmuster der erfindungsgem??en Verbindung Novclobiocin 401 ist dargestellt;

: Agardiffusionstests zur Bestimmung der antibakteriellen Aktivit?t der erfindungsgem??en Verbindung Novclobiocin 401 im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen Clorobiocin, Novobiocin in E. coli Mutanten mit aktiven und inaktivierten TonB.

Ausf?hrungsbeispiele1) HerstellungsverfahrenHerstellung von Novclobiocin 401, ein Clorobiocin-Derivat mit Catechol-Struktureinheit 3,4-Dihydroxybenzoes?ure (3,4-DHBS) anstelle des nat?rlichen Ring A

Um einen alternativen bzw. zus?tzlichen Aufnahmemechanismus von Aminocoumarinen durch die ?u?ere Membran bereitzustellen, wurde am Beispiel von Novclobiocin 401 eine Teilstruktur (Ring A) von Clorobiocin durch eine Catechol-Struktur (3,4-Dihydroxybenzoes?ure) ersetzt ( und ). Die Catechol-Struktur des neuen Derivates wird von E. coli Siderophor-Transportern der ?u?eren Membran erkannt und das Derivat aktiv in die Bakterienzelle aufgenommen.

Allgemeine Methoden

Escherichia coli XL1 Blue MRF' (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), BW25113 [8] und ET12567 [9] wurden f?r die Klonierungen benutzt. Standardmethoden f?r DNA Isolation und Manipulation wurden nach Sambrook et al. [10] und Kieser et al. [11] durchgef?hrt. Die RED/ET-vermittelte Rekombination zur Inaktivierung von Genen wurde wie bei Gust et al. [12] beschrieben durchgef?hrt.

Synthese der Catechol-Struktureinheit 3,4-DHBS

3,4-DHBS kann unter Katalyse von zwei Enzymen, der 4-Hydroxybenzoe-3-Hydroxylase PobA (GenBank AB210281) [13] aus Gram-positivem Bakterium Corynebacterium cyclohexanicum und der Chorismate-Pyruvate-Lyase UbiC (GenBank NC_008253) [14, 15] aus Gram-negativem Bakterium Escherichia coli gebildet werden. Das Edukt von PobA, die 4-Hydroxybenzoes?ure, kann weder C. cyclohexanicum noch Streptomyces sp. in einer in vivo Biosynthese herstellen; E. coli hingegen besitzt das Enzym UbiC, das Chorismins?ure zu 4-Hydroxybenzoes?ure in vivo katalysiert. Da der GC-Gehalt (insbesondere von ubiC) dieser Gene viel geringer als der durchschnittliche Gehalt in Genen der Gattung Streptomyces ist [16], wurden die Nukleotidsequenzen von ubiC und pobA and die Codon Preferenz von S. coelicolor, dem heterologen Wirtsstamm, angepasst (Gen Designer Software; DNA2.0 company, Menlo Park, California, USA). Au?erdem wurden die Gene translational gekoppelt, um eine Co-Regulation zu gew?hrleisten. Die Nukleotidsequenz des synthetischen ubiC/pobA-Konstruktes ist in aufgef?hrt.

Konstruktion des Plasmids pSA11

Nach der Herstellung bei der DNA2.0 Company (California, USA) wurde das synthetische DNA-Fragment ?ber die beiden HindIII und SpeI Restriktionsschnittstellen in den Streptomyceten Expressionsvector pUWL201 unter den konstitutiven Promotor ermE* kloniert [17]. Das resultierende Plasmid pSA11 wurde mittels Protoplasten-Transformation in den heterologen Wirtsstamm Streptomyces coelicolor M512 (clo-SA2) mit integriertem Clorobiocin Biosynthesegencluster (siehe unten) transformiert, resultierend in Stamm S. coelicolor M512 (clo-SA2)/pSA11.

Herstellung des heterologen Wirtsstamms Streptomyces coelicolor M512 (clo-SA2): Inaktivierung von cloQ im Cosmid clo-BG1 und heterologe Expression in S. coelicolor M512

F?r die Herstellung wurde als Erstes eine Ring A-Deletionsmutante des heterologen Clorobiocin-Produzenten durch RED/ET-vermittelte Rekombination bereitgestellt. Durch Inaktivierung des Gens cloQ bleibt die Bildung von Ring A aus [18]; dies gew?hrleistet, dass einzig das neue Derivat mit Catechol-Struktur und nicht das nat?rliche Clorobiocin gebildet wird.

Im Cosmid clo-BG1 [19] wurde das Gen cloQ durch eine Apramycin-Resistenzkassette (aac(3)IV), flankiert durch XbaI und SpeI Restriktionsstellen, mittels RED/ET-vermittelte Rekombination ersetzt. Zum Ersetzen von cloQ wurde die Apramycin-Resistenzkassette durch PCR Amplifikation mit pUG019 als Template und den Primern cloQ_f(5'-GGC GCG CCC ATT GCT CAC CGT CTT ACC GAC ACC GTC CTT ATT CCG GGG ATC TCT AGA TC-3') and cloQ_r (5'-TCC CAT GGT CGA TTC CGT GTG TTG GTG AAG TGC GCG CAG ACT AGT CTG GAG CTG CTT C-3') hergestellt [20]. Die unterstrichenen Buchstaben kennzeichnen die XbaI und SpeI Restriktionsschnittstellen.

Die PCR-Amplifikation wurde in 50 ?l Volumen mit 100 ng Template, 0,25 mM dNTPs, 50 pmol jedes Primers und 5% (v/v) DMSO mit dem Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals) durchgef?hrt: Denaturierung bei 94?C f?r 2 min, 10 Zyklen mit Denaturierung bei 94?C f?r 45 s, Annealing bei 50?C f?r 45 s und Elongation bei 72?C f?r 90 s, gefolgt von 15 Zyklen mit Annealing bei 55?C f?r 45 s, und dem letzten Elongationsschritt bei 72?C f?r 5 min. Das PCR-Produkt wurde durch Elektroporation in E. coli BW25113/plJ790 eingebracht, der das Cosmid clo-BG1 beinhaltete. Das modifizierte Cosmid wurde isoliert und zur Entfernung der Apramycin-Resistenzkassette in E. coli ET12567 eingebracht. Nach anschlie?ender Isolation wurde es mit XbaI und SpeI verdaut und religiert, resultierend in Cosmid clo-SA2.

Das aus E. coli ET12567 isolierte Cosmid clo-SA2 wurde in S. coelicolor M512 durch PEG-vermittelte Protoplasten-Transformation eingebracht, resultierend in Stamm S. coelicolor M512 (clo-SA2).

Eine Herstellung durch Mutasynthese, wie bereits f?r Aminocoumarin-Antibiotika beschrieben [21, 22], ist f?r die Herstellung catecholierter Verbindungen nicht m?glich, da gef?tterte Catechole schnell im Medium oxidiert oder als Kohlenstoffquelle metabolisiert werden [23]. Aus diesem Grund wurde eine kontinuierliche in vivo Biosynthese der Catechols?uren bereitgestellt, um sie konstant der Aminocoumarin Biosynthese zur Verf?gung zu stellen.

Eine Zusammenfassung des Herstellungsprozesses von Novclobiocin 401 ist in dargestellt.

Produktion, Extraktion und Isolation von Novclobiocin 401

Die Pre-Kultivierung von S. coelicolor M512(clo-SA2)/pSA11 wurde in TSB-Medium (BD Bioscience) mit 50 ?g/ml Thiostrepton f?r 3 Tage bei 30?C und 210 rpm durchgef?hrt, gefolgt von einer Kultivierung im CDM-Produktionsmedium [24] (50 ml je Erlenmayerkolben) f?r 5 Tage unter den genannten Bedingungen. F?r die Extraktion wurden insgesamt 2 l Kultur auf pH 4,0 mit Salzs?ure eingestellt und zweimal mit dem gleichen Volumen Ethylacetat ausgesch?ttelt. Die organische Phase wurde bis zur Trockenheit einrotiert und der R?ckstand in Methanol aufgenommen.

Der Methanolextrakt wurde mittels preparativer HPLC (Agilent, USA) mit einer Multosphere S?ule 120 RP18-5 (250 ? 20 mm, 5 ?m; C&S Chromatographie Service D?ren, Germany) unter einer Flu?rate von 2 ml/min aufgetrennt. F?r die Isolation von Novclobiocin 401 wurde ein linearer Gradient von 70% zu 100% Flie?mittel B (Flie?mittel A: H2O/HCOOH 99:1; Flie?mittel B: Methanol: HCOOH 99:1) ?ber 36 min verwendet. Novclobiocin 401 eluiert bei ca. 12,5 min Retentionszeit. Die UV-Detektion wurde bei 280 nm durchgef?hrt.

Strukturaufkl?rung von Novclobiocin 401 mittels LC-MS, 1H NMR und 13C NMR

Die Struktur von Novclobiocin 401 wurde durch eine LC-MS Analyse, sowie 1H NMR und 13C NMR Spektroskopie nachgewiesen.

LC-MS Analyse:

F?r die LC-MS Analyse wurde ein ESI Massenspektrometer (LC/MSD Ultra Trap System XCT 6330; Agilent Technology) verwendet. Der Methanolextrakt wurde ?ber eine Nucleosil 100-C18 S?ule (100 ? 2 mm, 3 ?m) mit einer Temperatur von 40?C und einer Flu?rate von 400 ?l/min analysiert. Ein linearer Gradient von 60% zu 100% Flie?mittel D (Flie?mittel C: H2O/HCOOH 99.9:0.1; Flie?mittel D: Methanol/HCOOH 99.94:0.06) ?ber 20 min wurde benutzt. Die UV-Detektion wurde bei 280 nm durchgef?hrt. Die Elektrospray Ionisation wurde im Negativ-Modus vollzogen ().

NMR-Spektroskopie:

F?r die NMR Analyse wurden 3 mg Novclobiocin 401 in CD3OD gel?st und an einem Varian Inova Spektrometer vermessen. 1H NMR Spektren wurden mit 600 MHz and 13C NMR Spektren mit 125.7 MHz aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen in CD3OD sind als ?-Werte aufgelistet (Tabelle 1):

Position1H-NMR (150.8 MHz, CD3OD), ?H [ppm], Intensit?t, m, J [Hz]13C-NMR (125.7 MHz, CD3OD), ?C [ppm]1125.627.42, 1H, br s116.13146.24150.856.80, 1H, d (6.9)115.867.39, 1H, d (6.9)121.77 in 1, 12 in 2169.62'161.83'102.54'161.75'7.82, 1H, d (7.1)124.16'7.22, 1H, d (7.1)111.97'150.08'110.29'156.110'110.51''5.72, 1H, d (2.0)100.22''4.38, 1H, br m71.03''5.70, 1H, dd (11.1, 2.0)71.64''3.72, 1H, d (11.1)82.75''80.46''1.17, 3H, s22.97''1.35, 3H, s29.38''3.52, 3H, s62.02'''121.53'''6.89, 1H, d (3.4)118.24'''5.93, 1H, d (3.4)109.75'''136.16'''2.29, 3H, s13.07'''161.8
Tabelle 1:1H NMR und 13C NMR Spektroskopie Daten von Novclobiocin 401. Chemische Verschiebungen sind als ?-Werte dargestellt; CD3OD wurde als L?sungsmittel und interner Standard verwendet.

2) TestungTestung der inhibitorischen Aktivit?t von Novclobiocin 401 in Gyrase-Aktivit?ts-Assays

Novclobiocin 401 wurde in vitro unter Verwendung des Gyrase Supercoiling-Assay auf seine inhibitorische Aktivit?t auf E. coli und S. aureus Gyrase im Vergleich zu Clorobiocin und Novobiocin getestet. Die Enzyme und Komponenten des Supercoiling-Assay wurde von Inspiralis (Norwich, UK) bezogen und die Assays mit der auf der Inspiralis Hompage beschriebenen Methode unter Zus?tzlicher Zugabe von 700 mM Ka-Glutamat (Roth) durchgef?hrt (www.inspiralis.com).

Die Inhibierungs Konzentrationen (IC50s) von Novclobiocin 401 wurden mit 0,006 ?M f?r S. aureus Gyrase und 0,03 ?M f?r E. coli Gyrase bestimmt. Diese Hemmkonzentration entsprechen denen von Clorobiocin und sind geringer als die, die f?r Novobiocin gegen?ber beiden Gyrasen beobachtet wurden (Inhibierungs-Konzentrationen: 0,01 ?M bzw. 0,08 ?M). Dies beweist, dass die Ersetzung des nat?rlichen Ring A mit 3,4-Dihydroxybenzoes?ure die Aktivit?t der Verbindung als Gyrase-Inhibitor nicht herabsetzt bzw. sogar erh?ht.

Testung der antibakteriellen Aktivit?t in Agardiffusions-Tests

Wie eben beschrieben hemmt Novclobiocin 401 mit der gleichen Konzentration wie Clorobiocin die Gyrase von E. coli. Ein Unterschied in der antibakteriellen Aktivit?t dieser beiden Verbindungen kann demnach an einem verst?rktem Influx oder einem verringertem Efflux liegen. Um Unterschiede im Influxverhalten der beiden Verbindungen bestimmen zu k?nnen, wurde das Gen tolC, codierend f?r einen wesentlichen Teil der AcrABTolC-Effluxpumpe, inaktiviert [25].

E. coli besitzt drei ?u?ere Membran-Transporter f?r den aktiven Transport von Siderophoren des Catecholat-Typs (Fiu, Cir oder FepA) [26]. Alle drei Transporter beziehen ihre Energie vom periplasmatischen Bindeprotein TonB. Die Expression dieser Proteine wird unter Eisen-Mangel-Bedingungen aktiviert, wie sie auch im menschlichen K?rper w?hrend einer bakteriellen Infektion vorherrschen [27]. Um diese Bedingungen nachzuempfinden, wurde dem Medium der Eisenchelator 2,2'-Bipyridyl zugesetzt [5, 28], sowie das Gen entC inaktiviert, um die Bildung der E. coli eigenen Siderophore Enterobactin zu verhindern [29].

F?r die Untersuchungen zur aktiven Aufnahme der neuen Verbindung durch Siderophortransporter, wurde eine E. coli ?tolCl?entC sowie eine E. coli ?tonBl?tolCl?entC Mutante durch RED/ET-vermittelte Rekombination hergestellt (basierend auf E. coli Mutanten der Keio-Kollektion [30]).

Die antibakterielle Aktivit?t von Novclobiocin 401 im Vergleich zu Clorobiocin und Novobiocin wurde in Agardiffusionstests mit den genannten E. coli Mutanten bestimmt.

Bei der Mutante mit intaktem TonB zeigt Novclobiocin 401 ca. 2-fach bessere Aktivit?t als Clorobiocin und 4-fach bessere Aktivit?t als Novobiocin. Im Gegensatz hierzu zeigt Novclobiocin 401 bei der Mutante mit inaktiviertem TonB ca. 10-fach weniger Aktivit?t als Clorobiocin (). Diese Ergebnisse zeigen, dass der TonB-abh?ngige Transport eine entscheidende Rolle in der antibakteriellen Aktivit?t von Novclobiocin 401, hingegen aber nicht von Clorobiocin oder Novobiocin spielt. Die Bestimmungen der Minimalen Hemmkonzentration in Fl?ssigkultur zeigen ?bereinstimmende Ergebnisse zu den Agardiffusionstests.

F?r die Agardiffusionstests wurden 40 ml M?ller-Hinton-Agar (Roth) mit 1 ml ?bernacht-Kultur (OD600 1,2) der jeweiligen E. coli Mutante und 50 ?M 2,2'-Bipyridyl versetzt. Filterpl?ttchen wurden mit 15 ?l der methanolischen Antibiotikal?sungen getr?nkt und auf dem Agar platziert. Nach 16 h Inkubation bei 37?C wurden die lebenden Zellen durch ?berschichtung mit einer w?ssrigen 0.5%igen 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid-L?sung (Roth) angef?rbt und die Hemmzonen ausgewertet.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • DE 10111160 [0006]

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  • Sambrook et al. [0026]
  • Kieser et al. [0026]
  • Gust et al. [0026]