Title:
Vorrichtung und Verfahren zur Sauerstoffmessung
Kind Code:
B4


Abstract:

Bioreaktor-Anordnung für Zellen enthaltend:
(a) einen abgeschlossenen Bioreaktor (10);
(b) einen Zellpelletträger (12) zur Aufnahme eines Zellpellets; und
(c) Mittel zum Zuführen von Nährlösung in das Zellpellet;
gekennzeichnet durch
(d) optische, den Zellen in dem Zellpellet beigemischte, Sauerstoffsonden;
(e) einen auf die Sauerstoffsonden gerichteten Laser (14);
(f) einen Detektor (20) zur Aufnahme eines von den Sauerstoffsonden emittierten Phosphoreszenzsignals; und
(g) eine Steuer- und Signalauswerteelektronik (18) zur Erzeugung eines den Sauerstoffgehalt in dem Zellpellet repräsentierenden Wertes.




Inventors:
Schmälzlin, Elmar, Dr. (14473, Potsdam, DE)
Löhmannsröben, Hans-Gerd, Prof. (14476, Potsdam, DE)
Application Number:
DE102010037923A
Publication Date:
08/27/2015
Filing Date:
10/01/2010
Assignee:
Schmälzlin, Elmar, 14473 (DE)
Stolz, Marvin, 10629 (DE)
International Classes:



Foreign References:
63955552002-05-28
WO2007084655A22007-07-26
WO2010022391A92010-04-15
Attorney, Agent or Firm:
Weisse, Renate, Dipl.-Phys. Dr.-Ing., 10623, Berlin, DE
Claims:
1. Bioreaktor-Anordnung für Zellen enthaltend:
(a) einen abgeschlossenen Bioreaktor (10);
(b) einen Zellpelletträger (12) zur Aufnahme eines Zellpellets; und
(c) Mittel zum Zuführen von Nährlösung in das Zellpellet;
gekennzeichnet durch
(d) optische, den Zellen in dem Zellpellet beigemischte, Sauerstoffsonden;
(e) einen auf die Sauerstoffsonden gerichteten Laser (14);
(f) einen Detektor (20) zur Aufnahme eines von den Sauerstoffsonden emittierten Phosphoreszenzsignals; und
(g) eine Steuer- und Signalauswerteelektronik (18) zur Erzeugung eines den Sauerstoffgehalt in dem Zellpellet repräsentierenden Wertes.

2. Bioreaktor-Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor lichtdurchlässige Fenster (22) aufweist und der Laser (14) und der Detektor (20) außerhalb des Bioreaktors (10) angeordnet sind.

3. Bioreaktor-Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von dem Laser (14) emittierte Strahlung simultan mit zwei verschiedenen Frequenzen moduliert ist.

4. Bioreaktor-Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulationsfrequenzen oberhalb von 1 kHz liegen.

5. Bioreaktor-Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Erzeugung von mechanischem Druck auf die Zellen in dem Bioreaktor (10) vorgesehen sind.

6. Bioreaktor-Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sauerstoffsonden von Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 10 bis 150 Mikrometer gebildet sind, die mit Pt-Prophyrin, Ruthenium-Phenanthrolin oder deren Derivaten gefärbt sind.

7. Bioreaktor-Anordnung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser (14) von einem Diodenlaser gebildet ist.

Description:
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft eine Bioreaktor-Anordnung für Zellen enthaltend:

  • (a) einen abgeschlossenen Bioreaktor;
  • (b) ein Zellpelletträger zur Aufnahme eines Zellpellets; und
  • (c) Mittel zum Zuführen von Nährlösung in das Zellpellet.

Derartige Bioreaktoren dienen der Kultivierung von Zellen, insbesondere der Kultivierung von Stammzellen. Die Zellen bilden ein Zellpellet und befinden sich mit einer Nährlösung auf einem Zellpelletträger. Der Zellpelletträger ist schalenförmig und innerhalb eines Flaschen-ähnlichen Bioreaktors angeordnet. Je nach Zellart ist es wichtig, dass die Umweltbedingungen der Zellart angepasst sind. So können Knieknorpel-Zellen am besten kultiviert werden, wenn ein erhöhter mechanischer Druck auf die Zellen ausgeübt wird.

Die Zellentwicklung, insbesondere die Stammzellenentwicklung in mehrdimensionalem Gewebe hängt vom Sauerstoffgehalt in der unmittelbaren Umgebung ab. Dabei unterscheidet sich der Sauerstoffgehalt in dem Zellpelletträger von dem Sauerstoffgehalt in dem Nährmedium. Es ist daher wünschenswert, den Sauerstoffgehalt im Bereich der Zellen zu messen.

Stand der Technik

Es sind Bioreaktoren bekannt, welche eine Laminarströmung durch einen Bioreaktor leiten und so einen erhöhten mechanischen Druck erzeugen.

Es sind Anordnungen zur Messung des Sauerstoffgehalts mittels optischer Sauerstoffsonden bekannt. Aus den Veröffentlichungen Elmar Schmälzlin, Joost T. van Dongen, Ingo Klimant, Bettina Marmodée, Martin Steup, Joachim Fisahn, Peter Geigenberger und Hans-Gerd Löhmannsröben: ”An Optical Multifrequency Phase-Modulation Method Using Microbeads for Measuring Intracellular Oxygen Concentrations in Plants”; Biopysical Journal Volume 89, August 2005, S. 1339–1345; Agnieszka Grzelak, Blazej Rychlik und Grzegorz Bartosz: ”Light-Dependent Generation of Reactive Oxygen Species in Cell Culture Media”; Free Radical Biology & Medicine, Vol 30, No. 12, S. 1418–1425 und Elmar Schmälzlin, Bernd Walz, Ingo Klimant, Bettina Schewe, Hans-Gerd Löhmansröben: ”Monitoring hormone-induced oxygen consumption in the salivary glands of the blowfly, Calliphora vicina, by use of luminescent microbeads” in Sensors and Actuators B 119 (2006) 251–254 ist die Bestimmung von Sauerstoff in organischen Medien bekannt. Laserlicht wird mit einem Messfühler mit einem Lichtleiter in ein Material einführt. In dem Material sind phosphoreszierende Mikrokugeln angeordnet, deren Phosphoreszenzeigenschaften vom Sauerstoffgehalt abhängen. Nachteilig bei dieser Technik ist es, dass die Messfühler die Zellen schädigen und die Strömungsverhältnisse beeinflussen.

Offenbarung der Erfindung

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Bioreaktor-Anordnung der eingangs genannten Art zu schaffen, bei welcher der Sauerstoffgehalt in unmittelbarer Umgebung der Zellen überwacht werden kann ohne die Zellen und Zellpelletträger zu schädigen und ohne die Strömungsverhältnisse zu beeinflussen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch:

  • (d) optische, den Zellen in dem Zellpellet beigemischte, Sauerstoffsonden;
  • (e) einen auf die Sauerstoffsonden gerichteten Laser;
  • (f) einen Detektor zur Aufnahme eines von den Sauerstoffsonden emittierten Phosphoreszenzsignals; und
  • (g) eine Steuer- und Signalauswerteelektronik zur Erzeugung eines den Sauerstoffgehalt in dem Zellpellet repräsentierenden Wertes.

Die Anordnung erlaubt die kontaktlose Messung des Sauerstoffgehalts. Die Zellen und Zellträger werden nicht geschädigt und die Strömungsverhältnisse bleiben unverändert. Mit dem Laser werden die Sauerstoffsonden zur Phosphoreszenz angeregt. Das emittierte Phosphoreszenzsignal wird mit dem Detektor aufgenommen und an eine Auswerteelektronik geleitet. Aus dem Phosphoreszenzsignal kann der Sauerstoffgehalt ermittelt werden.

Vorzugsweise weist der Bioreaktor lichtdurchlässige Fenster auf und der Laser und der Detektor sind außerhalb des Bioreaktors angeordnet. Die Kultur bleibt dann vollständig ungestört. Die Fenster haben vorzugsweise eine geringe Absorption im Bereich der Wellenlängen des Laserlichtes und des Phosphoreszenzsignals.

Die optischen Sauerstoffsonden basieren insbesondere auf phosphoreszierenden Farbstoffen. Bei Anregung mit beispielsweise violettem oder blauem Licht strahlen sie eine intensive, längerwellige, insbesondere rote oder orange Phosphoreszenz aus. Diese wird von molekularem Sauerstoff (O2) in der Umgebung gelöscht. Der Prozess wird auch als „Quenching” bezeichnet. Mit zunehmendem Sauerstoffgehalt verringern sich sowohl die Intensität als auch die Abklingzeit des Phosphoreszenzsignals. Unter Abklingzeit wird hier die Dauer des Nachleuchtens bezeichnet. In der Praxis ist es vorteilhaft, die Abklingzeit als Messgröße zu bestimmen, da Intensitäten vielfältigen Störeinflüssen unterliegen. Solche Störeinflüsse sind beispielsweise Absorption und Streuung durch die Probe selber. Zur Messung der Abklingzeit kann die Probe mit einem beispielsweise rechteckförmigen Lichtpuls angeregt werden. Das Nachleuchten wird mit einem geeigneten Detektor, beispielsweise einem Photodetektor erfasst. Das Signal wird dann mit einer geeigneten Auswerteelektronik mit einem Computer und geeigneter Einsteckkarte oder einem Oszillographen ausgewertet. Die Abklingzeit liegt häufig im Bereich von Mikrosekunden. Aus ihr kann über eine Kalibrierkurve der Sauerstoffgehalt bestimmt werden. Diese Kalibrierkurven sind temperaturabhängig, was bei der Auswertung berücksichtigt wird.

Kommerzielle optische Sauerstoffmessgeräte mit Messfühler benutzen zumeist ein Messverfahren, bei dem der optische Sensor mit sinusförmig moduliertem Licht angeregt wird. Die Abklingzeit wird über die Messung der Phasenverschiebung ermittelt. Dabei wird das kurzwellige, blaue Anregungslicht sinusförmig intensitätsmoduliert. Die phosphoreszierende Sonde sendet längerwelliges, rotes ebenfalls sinusförmig moduliertes Licht aus. Je nach Sauerstoffgehalt erfolgt die Aussendung des Phosphoreszenzsignals mehr oder weniger zeitverzögert, also mit einer Phasenverschiebung. Aus der Phasenverschiebung lässt sich bekanntermaßen eine mittlere Abklingzeit ausrechnen und so über eine Kalibrierkurve der Sauerstoffgehalt ermitteln.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die von dem Laser emittierte Strahlung simultan mit zwei verschiedenen Frequenzen moduliert. Die Modulationsfrequenzen können oberhalb von 1 kHz liegen.

Anders als bei bekannten Anordnungen wird bei der vorliegenden Erfindung der Laserstrahl mit zwei unterschiedlichen Frequenzen gleichzeitig moduliert. Dadurch wird erreicht, dass Stör- und Untergrundsignale korrigiert werden können. Wenn nämlich zusätzlich zum Phosphoreszenzsignal auch eine Fluoreszenz im gleichen Wellenlängenbereich vorliegt überlagern sich die Signale mit einer neuen, kleineren Phasenverschiebung. Störsignale mit kleinen Intensitäten reichen aus um erhebliche Messfehler zu verursachen. Derartige Störsignale werden beispielsweise von optischen Komponenten im Strahlengang, gefärbten Nährlösungen oder anderen Zellen hervorgerufen. Die Modulierung mit zwei Frequenzen erlaubt die Berechnung und Korrektur der Untergrundsignale. Dies beruht auf der Erkenntnis, dass Fluoreszenzsignale praktisch ohne Zeitverzögerung in Phase emittiert werden. Die Modulation mit zwei Frequenzen ist in weiten Bereichen unabhängig von der Amplitude.

Bei der vorliegenden Erfindung erlaubt die Modulation des anregenden Laserlichts mit zwei Frequenzen die Messung unabhängig von der geometrischen Position von Laser und Detektor. Das hat den weiteren Vorteil, dass sich die Signalanteile und Signalstärken während des Wachstumsprozesses der Zellen ändern dürfen ohne dass die Messergebnisse verfälscht werden. Auch können Teile des Reaktors zur Steuerung der Strömung ohne Einfluss auf das Messergebnis mechanisch bewegt werden.

Vorzugsweise sind in der Bioreaktor-Anordnung Mittel zur Erzeugung von mechanischem Druck auf die Zellmasse in dem Bioreaktor vorgesehen. Bei derartigen Bioreaktoren ist eine kontaktlose Sauerstoffmessung von besonderem Vorteil.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die Sauerstoffsonden von Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 10 bis 150 Mikrometer gebildet, die mit Pt-Prophyrin, Ruthenium-Phenanthrolin oder deren Derivaten gefärbt sind.

Bei einer besonders einfachen Bioreaktor-Anordnung ist der Laser von einem Diodenlaser gebildet.

Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Ein Ausführungsbeispiel ist nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine schematische Darstellung eines Bioreaktors mit Sauerstoff-Messung.

2 zeigt den Farbstoff PT(II)-tetrapentafluorophenylporphyrin

3 illustriert die Energiezustände des Farbstoffs aus 2

4 ist ein typischer Verlauf der Abklingzeit in Abhängigkeit des Sauerstoffgehalts für den Farbstoff aus 2 in einer festen Matrix

5 zeigt Abklingkurven bei verschiedenem Sauerstoffgehalt.

6 illustriert die Bestimmung der Abklingzeit mittels Phasenmodulation

7 illustriert die Interferenz durch Fluoreszenz

8 illustriert die Maskierung des Fluoreszenzsignals durch Zweifrequenz-Phasenmodulation mit Messung bei Frequenz ω1 und Messung bei Frequenz ω2, wobei gezeigt wird ein Untergrundsignal (keine Phasenverschiebung, τ2 << τ1 ⇒ τ2 ≈ 0), Sensorsignal Abklingzeit τ1 und Gesamtsignal (Untergrund + Sensor) mit auftretenden Phasenverschiebungen. Die Messungen erfolgen bei jeweils ΦApp und φApp bei ω1 und ω2, ⇒ Auswertung des unveränderten τ1. Es gilt

Beschreibung des Ausführungsbeispiels

1 zeigt einen allgemein mit 10 bezeichneten Bioreaktor. Der Bioreaktor 10 ist etwa flaschenförmig. Innerhalb des Bioreaktors 10 wird eine Laminarströmung und somit ein erhöhter mechanischer Druck erzeugt. Im mittleren Bereich des Bioreaktors 10 ist ein Zellpellet 12 mit Zellkulturen angeordnet. Die Zellkulturen sind mit phosphoreszierenden Sensorpartikeln versetzt. Die Sensorpartikel haben die Form von Mikrokügelchen mit einem Durchmesser im Bereich von 100 Mikrometer. Die Mikrokügelchen sind mit phosphoreszierenden Farbstoffen, beispielsweise Pt-tetrapentafluorophenylporphyrin gefärbt. Die Strukturformel dieses Farbstoffes ist in 2 dargestellt.

Auf dem oberen Bereich des Bioreaktors ist eine Haltevorrichtung installiert. In der Haltevorrichtung ist ein Diodenlaser 14 mit einer Wellenlänge von 450 nm gehaltert. In einem alternativen Ausführungsbeispiel wird ein blu-ray-Laser mit einer Wellenlänge von 405 nm verwendet. Der Diodenlaser 14 ist auf das Zellpellet 12 gerichtet. Hierzu ist der Einlass des Bioreaktors mit einem Fenster aus Quarzglass versehen. Man erkennt, dass der von dem Diodenlaser emittierte Laserstrahl 16 frei durch den Raum geht. Der Diodenlaser 14 wird von einer Lasersteuerung gesteuert. Insbesondere erfolgt die Steuerung derart, dass das Laserlicht mit zwei unterschiedlichen, bekannten Frequenzen von 63 kHz und 33 kHz moduliert werden, wie dies in 7 und 8 dargestellt ist. Die Größenordnung richtet sich nach der Abklingzeit des verwendeten Farbstoffs.

Anhand von 3 wird schematisch dargestellt, wie der Farbstoff zur Phosphoreszenz angeregt wird. Das Laserlicht versetzt den Farbstoff der Mikrokügelchen aus dem Grundzustand 26 in einen angeregten Singulett-Zustand 28. Dies ist durch einen Pfeil 30 repräsentiert. Aus dem angeregten Zustand 28 gehen die Farbstoffpartikel zurück in den Grundzustand unter Emission von Strahlung. Die Strahlung wird in alle Richtungen ausgesendet. Ein Teil der Strahlung wird durch Fluoreszenz erzeugt. Dies ist durch einen Pfeil 32 repräsentiert. Die Fluoreszenz-Strahlung klingt sehr schnell ab. Ein anderer Teil der Strahlung wird von Farbstoff-Atomen erzeugt, die über einen längeren Zeitraum phosphoreszieren. Hierzu erfolgt zunächst ein strahlungsloser Übergang in den angeregten Triplett-Zustand 34. Dieser hat eine längere Lebensdauer als der Singulett-Zustand. Entsprechend gelangen die Atome langsamer aus dem Triplett-Zustand 34 unter Emission von phosphoreszierender Strahlung 36 zurück in den Grundzustand. Nur die phosphoreszierende Strahlung 36 wird gemessen.

Die durch ein Fenster 22 aus dem Bioreaktor austretende Strahlung wird mit einem Objektiv gebündelt, durch ein optisches Filter von gestreutem Anregungslicht getrennt und mit einem Detektor 20 detektiert. Das Detektorsignal wird an eine Signalauswertung geleitet. Das ist durch einen Pfeil 24 repräsentiert. Ein Beispiel für die gemessenen Signale ist in 4 und 5 dargestellt. 5 zeigt die Intensität eines Phosphoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Zeit (Abklingkurve) für verschiedene Proben mit unterschiedlichem Sauerstoffgehalt. 4 zeigt die Abklingzeit in Abhängigkeit des Sauerstoffgehalts.

Die Signalauswertung misst die Phasenverschiebungen 40 bei beiden Modulationsfrequenzen ω, wie sie in 6 dargestellt ist. Anschließend wird eine Untergrundkorrektur durchgeführt, die Abklingzeit ermittelt und der Sauerstoffgehalt durch Vergleich mit gespeicherten Kalibrierkurven bestimmt. Die Phasenverschiebung ϕ hängt dabei mit der Abklingzeit τ zusammen nach τ = (tanϕ)/ω.

Die Untergrundkorrektur ist in 8 illustriert. Unter der Annahme, dass die Abklingzeit τ2 des Untergrundsignals wesentlich kleiner ist, als die Abklingzeit τ1 der Phosphoreszenz und dass somit auch die Phasenverschiebung des Untergrund- und Sensorsignals φApp kleiner ist als die Phasenverschiebung φ durch die Phosphoreszenz, erhält man aus dem gemessenen Signal eine gesamte Phasenverschiebung ϕ. Zusammen mit den Modulationsfrequenzen ω1 und ω2 lässt sich die Untergrund-korrigierte Phasenverschiebung nach der in 8 dargestellten Formel ermitteln.

Die so ausgewerteten Signale liefern ein Maß für den Sauerstoffgehalt in unmittelbarer Umgebung der Zellen ohne dass diese bei ihrer Entwicklung beeinträchtigt werden.

Weitere, alternative Ausführungsbeispiele verwenden Laser mit einer längeren Wellenlänge im Bereich von 532 nm. Diese streuen weniger und dringen daher tiefer in den Zellträger ein. Zudem erzeugen längerwellige Laser weniger störende, photochemische Reaktionen, da das in Nährmedien enthaltene Rivoflavin im kurzwelligen blauen oder violetten Wellenlängenbereich absorbiert. Dabei wird aktivierter Sauerstoff erzeugt. Dieser verfälscht das Ergebnis und kann die Zellen schädigen. Eine Anregungslichtquelle bei 532 nm liegt außerhalb der Absorptionsbande von Riboflavin und ist schonend bezüglich des Detektors.