Title:
Determining a locus change i.e. single nucleotide polymorphism on male cattle, comprises determining the weight and/or the proportions of a fetus by molecular markers
Kind Code:
A1


Abstract:
Determining a locus change on male cattle, comprises determining the weight and/or the proportions of a fetus by molecular markers. Independent claims are included for: (1) primers for detection of a single nucleotide polymorphism in male cattle, where the single nucleotide polymorphism determines the size and/or the proportion of a fetus; and (2) a kit comprising the primer, where the kit determines the size and/or the proportion of a fetus.



Inventors:
Fries, Hans-Rudolf (85354, Freising, DE)
Pausch, Hubert (85354, Freising, DE)
Application Number:
DE102010033102A
Publication Date:
02/02/2012
Filing Date:
08/02/2010
Assignee:
Technische Universität München, 80333 (DE)
International Classes:



Attorney, Agent or Firm:
Hermann, Bettina Celia, Dipl.-Biol. (Univ.) Dr. rer. nat., 80331, München, DE
Claims:
1. Verfahren zur Bestimmung einer Genortveränderung bei männlichen Rindern, die das Gewicht und/oder die Proportionen eines Föten bestimmt, durch molekulare Marker.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Genortveränderung auf den Chromosomen 14 und/oder 21 lokalisiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Genortveränderung auf Chromosom 14 die Veränderung einer Nukleotidsequenz eines oder mehrerer der Gene LYN, PLAG1, RPS20, SOX17 und TGS1 umfasst.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Genortveränderung ein Einzelnukleotid-Polymorphismus ausgewählt aus der Liste von Tabelle 2 ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Genortveränderung durch Polymerasekettenreaktion und einen aus 15 bis 25 Nukleotiden bestehenden Primer detektiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei mindestens ein Primer ausgewählt ist aus der Liste von Tabelle 1 (SEQ ID No. 1 bis 108).

7. Primer zur Detektion eines Einzelnukleotid-Polymorphismus bei männlichen Rindern, wobei der Einzelnukleotid-Polymorphismus die Größe und/oder die Proportion eines Föten bestimmt.

8. Primer nach Anspruch 7, wobei der Primer aus einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Liste von Tabelle 1 (SEQ ID No. 1 bis 108) besteht.

9. Verwendung eines Primers nach Anspruch 7 oder 8 zum Nachweis eines Einzelnukleotid-Polymorphismus bei männlichen Rindern, der die Größe und/oder die Proportion eines Föten bestimmt.

10. Kit umfassend einen Primer nach Anspruch 7 oder 8 zum Nachweis eines Einzelnukleotid-Polymorphismus bei männlichen Rindern, der die Größe und/oder die Proportion eines Föten bestimmt.

Description:

Die vorliegende Erfindung ist auf den Nachweis von Allelen zweier Genorte vor allem bei männlichen Rinden (Bullen), die mit der Schwerabkalbung verbunden sind, durch molekulare Marker gerichtet. Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Testsysteme (Kits) zum Nachweis solcher Genorte.

Die Sterblichkeit neugeborener Kälber beträgt ca. 10%. Der Ausfall des Kalbes bedeutet vor allem Bei Doppelnutzungs- und Mastrassen einen wirtschaftlichen Verlust von mehreren hundert Euro. Die perinatale Sterblichkeit von Kälbern steht in einem engen Zusammenhang mit dem Geburtsverlauf. Eine Schwergeburt führt zu einer Beeinträchtigung der Vitalität des Kalbes. Eine schwierige Abkalbung hat gleichzeitig nachteilige Folgen für die Kuh. So ist die Milchleistung in der sich an die Abkalbung anschließenden Laktation oft vermindert und es treten vermehrt Fruchtbarkeitsstörungen auf.

Der Kalbeverlauf wird einerseits wesentlich durch das Gewicht und die Proportionen des Föten und andererseits durch die Ausprägung des Beckens der Kuh bestimmt. Der so genannte paternale Kalbeverlauf basiert auf dem genetischen Effekt des Bullen auf die Abmessungen des Föten.

Im Rahmen eines Testeinsatzes eines Bullen in der künstlichen Besamung wird eine Zuchtwertschätzung auf Grund von Erhebungen der Landwirte zum Geburtsverlauf und auf der Basis der ermittelten Totgeburtenrate durchgeführt. Der Zuchtwert dient dann als Selektionsgrundlage. Bullen, deren Zuchtwert ein erhöhtes Risiko für Schwerabkalbungen und Totgeburten anzeigt, werden von der Zucht ausgeschlossen oder zumindest nicht für die Besamung erstgebärender Kühe eingesetzt, bei denen sich Abkalbeprobleme in einem besonderen Maße manifestieren.

Das der Erfindung zugrunde liegende Problem ist die einfachere und gleichzeitig zuverlässigere Vorhersage von Geburtsrisiken bei Säugern, insbesondere des paternalen Kalbeverlaufs beim Rind.

Dieses Problem wird durch den Gegenstand des Anspruchs 1 gerichtet auf ein Verfahren zur Bestimmung einer Genortveränderung bei männlichen Rindern, die das Gewicht und/oder die Proportionen eines Föten bestimmt, mittels molekularer Marker gelöst.

Die Erfindung ist jedoch nicht auf Rinder begrenzt, sondern bei Säugern allgemein anwendbar einschließlich des Menschen. Die assoziierte Region des bovinen Chromosoms 14 ist beispielsweise im humanen Chromosom 8q21 konserviert, das mit der Körpergröße des Menschen assoziiert ist.

Die Erfindung bezieht sich auf die Identifizierung von Genorten (quantitaive trait loci, QTL), insbesondere zweier Genorte, die bevorzugt auf den Chromosomen 14 und/oder 21 lokalisiert sind und die bei Rindern, insbesondere bei Mast- oder Milchrassen bzw. -populationen wie Bos taurus taurus, z. B. Fleckvieh oder Holstein-Friesian, oder Bos taurus indicus, einen Teil der Varianz, z. B. 10% der Varianz bei der Rasse Fleckvieh, des Zuchtwerts „paternaler Kalbeverlauf” erklären. Der Zuchtwert beschreibt, welche Wirkung die Gene eines Tieres auf ein einzelnes Phänotyp-Merkmal haben, wenn diese mit den Genen anderer Tiere kombiniert werden und durchschnittliche Umweltverhältnisse herrschen. Ein Zuchtwert von 100 beschreibt eine durchschnittliche Vererbung des bewerteten Merkmals, höhere Zuchtwerte stehen für eine Vererbung, bei der das Merkmal verstärkt wird, niedrigere Zuchtwerte für eine Merkmalsabschwächung. Vergleicht man den Zuchtwert eines Tieres mit dem durchschnittlichen Zuchtwert der gesamten Population, wird ersichtlich, ob dieses Tier in der Zucht verwendet werden sollte und welcher Zuchtwert bei seinen potentiellen Partner tolerierbar ist. So bedeutet ein höherer Zuchtwert eine Tendenz für leichteres Abkalben.

Die vorliegende Erfindung erleichtert die Identifizierung von für die Zucht weniger oder nicht geeigneter Tiere, insbesondere Rinder, signifikant. Die Allele der Genorte, die zu einer Prädisposition für Schwerabkalbungen führen, werden mit Hilfe von molekularen Markern erkannt. Die Gentypisierung dieser Markerloci erlaubt es Bullen vor ihrem Testeinsatz auf das Vorhandensein von Allelen zu überprüfen, die vermehrt zu Schwerabkalbungen führen. Bullen, bei denen eines oder mehrere solcher Allele vorhanden sind, können dann bereits vor einem Testeinsatz ausgeschlossen und Schwerabkalbungen sowie damit einhergehende Totgeburten vermindert werden. Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Abbildungen beispielhaft dargestellt, wobei die Erfindung nicht auf diese Darstellungen beschränkt ist.

zeigt die Assoziation von 43.863 Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphism, SNP) der Chromosomen 1 bis 30 mit der Zuchtwert für paternalen Kalbeverlauf mittels Manhatten Blot; Quadrate bei Chromosomen 14 und 21 zeigen Einzelnukleotid-Polymorphismen mit P < 1.14 × 106 (Bonferroni korrigierte Signifikanz).

zeigt den Effekt der am signifikantesten mit den Zuchtwerten für paternales Abkalbeverhalten verbundenen Markern bei Fleckvieh. Die Boxplots zeigen die am signifikantesten mit Chromosom 14 und 21 verbundenen Einzelnukleotid-Polymorphismen (A) und Haplotypen (B), wobei die Effekte für Chromosom 14 und 21 getrennt und kombiniert dargestellt werden.

ist eine detaillierte Darstellung einer Region des Chromosoms 14 beschrieben durch den Haplotype, die einen Einfluss auf Zuchtwerte für den paternalen Kalbeverlauf. Hat. (A) zeigt die in dieser Region vorhandenen Gene und (B) P-Werte von 27 Einzelnukleotid-Polymorphismen bezogen auf die Zuchtwert für paternalen Kalbeverlauf, wobei die Kreise die Ergebnisse der Genotypisierung der gesamten Studienpopulation darstellen und die Dreiecke die P-Werte basierend auf der Berechnung von 810 genotypisierten Tieren. (C) zeigt eine Darstellung eines paarweisen Kopplungsgleichgewichts (r2), wobei das Dreieck einen Bereich eines Kopplungsgleichgewichts abgrenzt, der die am signifikantesten assoziierten Einzelnukleotid-Polymorphismen umfasst und die funktionelle TUM-3095 Variante von RPS20 einschließt.

Überraschend wurde festgestellt, dass die Genortveränderungen, insbesondere auf den Chromosomen 14 und/oder 21, stark mit den Zuchtwerten für den paternalen Kalbeverlauf korrelieren. Die Genortveränderungen sind Veränderungen der Nukleotidsequenz eines oder mehrerer Allele, die insbesondere auf Einzelnukleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP) basieren und als molekulare Marker dienen. Diese Veränderungen führen zu verändertem paternalem Kalbeverlauf, so dass ein Nachweis dieser Veränderungen die Vorhersage paternalem Kalbeverlaufs ermöglicht.

Die in der vorliegenden Erfindung Einzelnukleotid-Polymorphismus aufweisenden Allele beim männlichen Rind, die beispielsweise die Größe und/oder die Proportionen eines Föten bestimmen und damit den paternalen Kalbeverlauf beeinflussen, sind bevorzugt die Gene LYN, PLAG1, SOX17 und TGS1, besonders bevorzugt RPS20 (siehe ), insbesondere auf Chromosom 14. in einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist RPS20 zusätzliche Adenylierungsstellen auf wie z. B. in der TUM-3095 Variante von RPS20. Ein oder mehrere Einzelnukleotid-Polymorphismen sind in einem oder mehreren Allelen, z. B. LYN, PLAG1, RPS20, SOX17 und/oder TGS1 nachweisbar.

Der Nachweis eines Einzelnukleotid-Polymorphismus erfolgt durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Primern, die mit der RNA oder DNA im Bereich der Genortveränderng, d. h. nahe dem Einzelnukleotid-Polymorphismus hybridisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen bzw. bestehen die Primer aus 15 bis 25 Nukleotide, wobei die Primer vorwärts und rückwärts Primer umfassen. Besonders bevorzugte Primer, die mit den bovinen Genen LYN, PLAG1, RPS20, SOX17 und/oder TGS1 hybridisieren, sind beispielsweise in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1: Primer

Der Einzelnukleotid-Polymorphismus führt zu einem Austausch eines Nukleotides wie z. B. A nach T, A nach G, A nach C, C nach T, C nach G und/oder G nach T, wobei mit dem Austausch eines Nukleotides kein oder ein Austausch einer Animosäure verbunden ist. Tabelle 2 zeigt beispielsweise Einzelnukleotid-Polymorphismen der Gene LYN, PLAG1, RPS20, SOX17 und TGS, die teilweise mit einem Austausch einer Aminosäure verbunden sind. Tabelle 2: Einzelnukleotid-Polymorphismen

GeneSNP_IDLokalisierungSNPAminosäurePLAG13084INT2AT3096PROMCTRPS203085EX3CTG423094INT3CT30953'UTRAG31283'UTRAG3144PROMAC3145PROMAG3146PROMAG3147PROMCGLYN3086INT11CG3087INT11CT3088EX12CTT4543089EX12AGT48930903'UTRCT3091INT10CT3092INT4CT3093INT5AG3097INT1AG3098INT2GT3148INT11AG3149EX6CTG1773150EX6CTS205SOX1732803'ENDAG3448EX1AGA50TTGS13061EX3CTS903062INT3CT3063INT3AT3064EX4CTS297T3065INT4CT3066INT2AG3067INT5CT3068INT6AG3069INT6AG3070INT6CT30713'UTRCG3072INT11GT3073INT12INS T3074INT10CG3075EX9DEL GAAK626-3076INT10GT3077INT7CT3078EX11ATI7333079EX11CTV7583080EX8AGP5613081EX8GTP594S3082INT8CT3083PROMCG

Einzelnukleotid-Polymorphismus, der mit dem Zuchtwert für paternalen Kalbeverlauf korreliert, ist jedoch nicht auf Genortveränderungen auf Chromosom 14 oder 21 beschränkt wie Tabelle 3 zeigt. Weitere erfindungsgemäße Einzelnukleotid-Polymorphismen sind beispielsweise auf Chromosom 1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 17, 18, 20, 24, 25, 26 und/oder 29 lokalisiert. pCE (paternal calving ease) bezeichnet den paternalen Kalbeverlauf. Tabelle 3: Korrelation Zuchtwert mit Genortveränderungen

SNPChromosomMinor Allel und MAF (Minor Allel Frequenz)Physikalische Position (BP)MerkmalEigenstrat StatistikP-WertαARS-BFGL-NGS-934551A (0.24)109,649,036pCE12.105.10 × 10–40.17BTA-49059-no-rs2A (0.02)112,990,834pCE12.045.22 × 10–40.47ARS-BFGL-NGS-193734G (0.4)119,924,805pCE16.185.75 × 10–50.18ARS-BFGL-NGS-326125A (0.42)110,671,789pCE11.497.00 × 10–40.15ARS-BFGL-NGS-137485A (0.42)110,704,158pCE11.327.66 × 10–40.15Hapmap26308-BTC-0577616G (0.22)38,576,012pCE11.815.91 × 10–40.18BTB-002510596G (0.06)42,190,501pCE15.091.02 × 10–40.35Hapmap47224-BTA-246146G (0.44)43,303,952pCE11.297.81 × 10–4–0.15Hapmap23217-BTA-1520077A (0.42)28,940,286pCE10.949.40 × 10–4–0.17ARS-BFGL-NGS-10476710A (0.17)1,361,856pCE11.148.45 × 10–4–0.21BTA-70225-no-rs10G (0.39)56,285,758pCE12.753.57 × 10–4–0.16ARS-BFGL-NGS-5553910A (0.31)58,488,593pCE10.869.82 × 10–40.18BTB-0151848514G (0.14)58,203,661pCE13.402.52 × 10–40.26BTB-0151848614A (0.1)58,262,807pCE15.339.03 × 10–50.28BTB-0128998414G (0.2)58,491,253pCE13.792.04 × 10–40.18BTB-0057455514A (0.1)59,225,067pCE13.782.05 × 10–40.28UA-IFASA-789714A (0.12)59,280,392pCE16.963.81 × 10–50.29ARS-BFGL-NGS-2701715A (0.18)57,333,896pCE12.543.97 × 10–40.20ARS-BFGL-NGS-9465717G (0.47)74,234,279pCE13.482.42 × 10–4–0.13UA-IFASA-685017G (0.34)74,256,192pCE11.516.91 × 10–4–0.13Hapmap51998-BTA-4305318G (0.27)36,985,552pCE11.158.39 × 10–4–0.17BTB-0139381620A (0.21)2,754,521pCE11.626.52 × 10–4–0.19Hapmap40409-BTA-2609720G (0.27)11,576,011pCE16.285.47 × 10–50.21ARS-BFGL-NGS-4240024A (0.47)47,413,118pCE11.905.61 × 10–40.15BTB-0171053825G (0.1)29,635,262pCE10.989.23 × 10–40.23BTB-0092032226C (0.47)3,930,593pCE16.335.33 × 10–5–0.14ARS-BFGL-NGS-1633626A (0.35)34,398,368pCE11.925.54 × 10–4–0.59Hapmap42269-BTA-6159726A (0.29)41,041,883pCE15.807.06 × 10–5–0.42UA-IFASA-612029G (0.27)37,014,709pCE13.382.54 × 10–4–0.19ARS-BFGL-NGS-10421329G (0.02)37,152,168pCE15.647.68 × 10–5–0.59

In einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf Testsysteme (Kits) gerichtet, die einen oder mehrere Primer umfassen, die mit RNA oder DNA im Bereich eines Einzelnukleotid-Polymorphismus bei männlichen Rindern hybridiseren, wobei der Einzelnukleotid-Polymorphismus die Größe und/oder die Proportion eines Föten bestimmt. Bevorzugt hybridisieren die Primer mit RNA oder DNA des Chromosoms 14 und/oder 21, insbesondere mit RNA oder DNA der Gene LYN, PLAG1, RPS20, SOX17 und/oder TGS1. Besonders bevorzugt umfasst das Kit Primer der Tabelle 1.

BeispieleBeispiel 1

In einem Versuch mit 1800 Fleckvieh-Bullen wurde die Korrelation von Einzelnukleotid-Polymorphismen mit Zuchtwerten für paternalem Kalbeverlauf (pCE), Inzidenz paternaler Totgeburt (pSB), täglicher Gewichtszunahme (DG) und/oder Körpergröße (BS) untersucht. Tabelle 4a zeigt die Ergebnisse von Einzelnukleotid-Polymorphismen auf Chromosom 14 bzw. 21, Tabelle 4b die Charakteristika der Zuchtwerten und Tabelle 4c die Korrelation der verschiedenen Zuchtwerten. Tabelle 4a: Einzelnukleotide-Polymorphismen auf Chromosom 14 bzw. 21

SNPChromosomMinor Allel und MAF (Minor Allel Frequenz)Physical position (bp)EBVEigenstrat statisticP valueαARS-BFGL-NGS-10426814A (0.12)24,057,354pCE60.995.72 × 10–15–0.58pSB47.126.69 × 10–12–0.54BTA-91250-no-rs14A (0.10)24,145,838pCE59.321.34 × 10–14–0.62pSB47.515.47 × 10–120.58BS26.892.15 × 10–170.45BTB-0141792414G (0.13)24,182,406pCE43.544.15 × 10–11–0.46pSB33.796.13 × 10–9–0.42Hapmap59686-rs2902068914A (0.14)24,365,162pCE39.074.08 × 10–10–0.40pSB38.276.18 × 10–10–0.42ARS-BFGL-NGS-2886714G (0.10)20,323,857pCE38.036.96 × 10–10–0.50pSB33.786.17 × 10–9–0.49DG25.504.42 × 10–70.41UA-IFASA-711214G (0.09)16,109,986pCE36.941.22 × 10–9–0.51pSB32.091.47 × 10–8–0.49Hapmap46735-BTA-8665314G (0.20)25,401,722pCE34.404.48 × 10–9–0.36pSB28.897.65 × 10–8–0.34ARS-BFGL-NGS-5397521G (0.27)2,151,256pCE31.252.27 × 10–80.24BTB-0153223914A (0.28)24,437,778pCE28.051.19 × 10–7–0.26pSB26.942.10 × 10–7–0.27ARS-BFGL-NGS-11437221C (0.22)2,381,941pCE25.654.09 × 10–70.24Hapmap52072-rs2901892021A (0.22)2,333,804pCE24.129.01 × 10–70.23

SNPs zeigen signifikante Association mit dem paternalem Kalbeverlauf (pCE), der Inzidenz paternalen Totgeburt (pSB), der täglicher Gewichtszunahme (DG) und der Körpergröße (BS) EBVs in 1800 Fleckvieh Tieren. Tabelle 4b: Charakteristika der Zuchtwerte

ZuchtwertMittelwert (μ)Standard Abweichung (σ)Durchschnittliche Reliabilität (r2)Tägliche Gewichtszunahme (DG)101.0711.680.92Paternaler Kalbeverlauf (pCE)101.0910.070.92Paternale Totgeburt (pSB)100.559.390.83Körpergröße (BS)100.869.970.90
Tabelle 4c: Korrelation der ZuchtwertepCEpSBBSDG–0.21–0.180.39pCE0.86–0.36pSB–0.23

BeispieleBeispiel 2

In einem weiteren Versuch wurde an 1800 Fleckvieh-Bullen die Korrelation von Einzelnukleotid-Polymorphismen innerhalb eines Haplotyps mit der Zuchtwert für paternalen Kalbeverlauf, lokalisiert auf dem bovinen Chromosom 14, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5: Korrelation von Einzelnukleotid-Polymorphismen innerhalb eines Haplotypes

SNPPhysikalische Position (bp)HaplotypalleleMinor Allel und MAFEigenstrat StatistikP-WertαBTB-0195381923,817,572AG (0.26)0.370.540.03Hapmap45796-BTA-2527123,853,811TA (0.07)5.390.02–0.18TUM-3448 *23,884,989GA (0.09)1.060.30.06ARS-BFGL-BAC-805223,893,220GA (0.01)6.729.55 × 10–3–0.45ARS-BFGL-NGS-9782123,946,436GA (0.1)0.980.320.07ARS-BFGL-NGS-10426824,057,354AA (0.12)61.005.71 × 10–15–0.58BTA-91250-no-rs24,145,838AA (0.1)59.321.34 × 10–14–0.62BTB-0141792424,182,406GG (0.13)43.544.15 × 10–11–0.46ARS-BFGL-NGS-11042724,326,513AG (0.11)0.020.89–0.01Hapmap59686-rs2902068924,365,162AA (0.14)36.941.22 × 10–9–0.40ARS-BFGL-NGS-10235124,407,125GG (0.25)18.341.85 × 10–5–0.21BTB-0153223924,437,778AA (0.28)28.041.19 × 10–7–0.26BTB-0153078824,524,205AG (0.34)8.653.27 × 10–30.12BTB-0153083624,573,257GA (0.35)4.300.040.07BTB-0055758524,607,527AG (0.35)4.750.040.08BTB-0055753224,643,266AG (0.35)4.530.030.07TUM-3081 *24,759,177GT (0.01)1.000.32–0.14Hapmap40120-BTA-3428824,787,245CA (0.09)0.280.6–0.05TUM-3095 *24,954,981AA (0.16)58.571.96 × 10–14–0.47TUM-3094 *24,955,318TC (0.32)3.560.060.06Hapmap41234-BTA-3428525,107,556GA (0.04)13.891.94 × 10–4–0.42BTB-0205670925,175,950AG (0.18)2.550.11–0.08BTB-0055912825,215,027AG (0.21)0.010.920.00BTB-0055735425,254,540GA (0.12)1.630.20.09Hapmap46986-BTA-3428225,307,116AG (0.46)9.621.93 × 10–30.13BTB-0177979925,351,733GA (0.44)19.001,30 × 10–50.19Hapmap46735-BTA-8665325,401,722GG (0.2)34.404.48 × 10–9–0.36