Title:
Detecting microorganisms in sample comprises adding two complementary probes marked, respectively, with fluorescent dye and quencher to the sample, stimulating fluorescent dye and determining emission of fluorescence by the fluorescent dye
Kind Code:
A1


Abstract:
Detecting microorganisms in a sample comprises: (a) providing the sample; (b) adding a first probe marked with a fluorescent dye to the sample, where the probe is specific for detecting the microorganism; (c) adding a first probe marked with a quencher, where the first probe marked with the quencher is complementary to the first probe marked with the fluorescent dye and the quencher is in a position to quench the fluorescence of the fluorescently marked probe; (d) stimulating the fluorescent dye; and (e) determining the emission or discharge of fluorescence caused by the fluorescent dye. Detecting microorganisms in a sample comprises: (a) providing the sample; (b) adding a first probe marked with a fluorescent dye to the sample, where the probe is specific for detecting the microorganism; (c) adding a first probe marked with a quencher, where the first probe marked with the quencher is complementary, preferably reverse complementary, to the first probe marked with the fluorescent dye and the quencher is in a position to quench the fluorescence of the fluorescently marked probe; (d) stimulating the fluorescent dye; and (e) determining the emission or discharge of fluorescence caused by the fluorescent dye. An independent claim is included for a kit, for use in the above method, comprising the first probe provided with the fluorescent dye and the first probe provided with the quencher.



Inventors:
Beimfohr, Claudia (München, 80995, DE)
Thelen, Karin (Gräfelfing, 82166, DE)
Snaidr, Jiri (Röhrmoos, 85244, DE)
Application Number:
DE102010012421
Publication Date:
09/30/2010
Filing Date:
03/23/2010
Assignee:
Vermicon AG (München, 80992, DE)
International Classes:



Foreign References:
EP0931109
WO2007104318A2
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Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
Bohmann, A., Dipl.-Biol.Univ. Dr.rer.nat., Pat.-Anw. (München, 80335)
Claims:
1. Verfahren zum Nachweis eines Mikroorganismus in einer Probe umfassend die folgenden Schritte
a) Bereitstellen der Probe
b) Zugabe einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde zu der Probe, wobei die Sonde spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist;
c) Zugabe einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde, wobei die mit einem Quencher markierte erste Sonde im wesentlichen komplementär, bevorzugterweise revers komplementär zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde ist und der Quencher in der Lage ist, die Fluoreszenz der fluoreszenzmarkierten Sonde zu löschen;
d) Anregen des Fluroreszenzfarbstoffes; und
e) Bestimmen des Auftretens oder Löschens von durch den Fluoreszenzfarbstoff bedingter Fluroreszenz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der nachzuweisende Mikroorganismus in Lösung vorliegt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass der nachzuweisende Mikroorganismus in der Probe fixiert ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der nachzuweisende Mikroorganismus vor Schritt b) und/oder Schritt c) und/oder vor Schritt d) fixiert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixieren die Permeabilität der Zellwand und/oder der Zellmembran für die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und/oder der mit einem Quencher markierten Sonde erhöht.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixieren des nachzuweisenden Mikroorganismus durch Behandeln der Zellen mit einem Alkohol erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die für den nachzuweisenden Mikroorganismus spezifische Sonde eine Nukleinsäure ist, die aus der Gruppen ausgewählt ist, die DNS, RNS, PNS und LNS umfasst.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die für den nachzuweisenden Mikroorganismus spezifische Sonde im wesentlichen aus Desoxyribonukleotiden besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die für den nachzuweisenden Mirkoorganismus spezifische Sonde eine Sequenz umfasst, die
a) im wesentlichen identisch oder
b) im wesentlichen revers komplementär
zu einer Zielsequenz des nachzuweisenden Mikroorganismus ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend 16S rRNS, 23S rRNS, 18S rRNS, tRNS, EF-Tu, mRNS 16S–23S rRNA-Spacer und 23S–5S rRNA-Spacer.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Länge von etwa 15 bis 31 Nukleotiden, oder etwa von 17 bis 25 Nukleotide, oder etwa von 17 bis 23 oder etwa eine Länge von etwa 17 oder 18 Nukleotiden aufweist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die mit einem Quencher markierten Sonde im wesentlichen revers komplementär zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mit einem Quencher markierten Sonde eine Länge von etwa 15 bis 31 Nukleotiden, oder etwa von 17 bis 25 Nukleotide, oder etwa von 17 bis 23 oder etwa eine Länge von etwa 17 oder 18 Nukleotiden aufweist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonde und die mit einem Quencher markierten Sonde in etwa die gleiche Länge aufweisen.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend FAM, TAMRA, CY3, Alexa 350, Pacific Blue, Coumarin, Cy2, Alexa 488, TET, Alexa 532, HEX, Alexa 546, TMR, Cy3.5, Alexa 568, Texas red, Alexa 594, Alexa 633, Cy5, Cy5.5 Alexa 660, Alexa 680, Rox und Vic.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Quencher ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Dabcyl, BHQ-1, TMR, BHQ-2, QSY-7, TAMRA, QSY-9, QSY-21, BHQ-3 und BBQ 650.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Löschen durch statisches Löschen erfolgt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bevorzugt Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und der Quencher auf der mit dem Quencher markierten Sonde so angeordnet sind, dass der Fluoreszenzfarbstoff und der Quencher in einem Komplex aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und der mit einem Quencher markierten Sonde in räumlicher Nähe angeordnet sind, dass sich ein nicht-fluoreszenter Komplex aus dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Quencher ausbildet.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und der Quencher auf der mit dem Quencher markierten Sonde so angeordnet sind, dass der Abstand zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Quencher in einem Komplex aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und der mit einem Quencher markierten Sonde etwa 20 Angström oder weniger beträgt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass
a) der Fluroreszenzfarbstoff auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde am 3'-Ende oder nahe am 3'-Ende und der Quencher auf der mit dem Quencher markierten Sonde am 5'-Ende oder nahe am 5'-Ende angeordnet ist, oder
b) der Fluroreszenzfarbstoff auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde am 5'-Ende oder nahe am 5'-Ende und der Quencher auf der mit dem Quencher markierten Sonde am 3'-Ende oder nahe am 3'-Ende angeordnet ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, insbesondere 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Löschen durch ein dynamisches Löschen erfolgt

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, insbesondere Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Fluoreszenzspektrum des Fluoreszenzfarbstoffes und das Absorptionsspektrum des Quenchers zumindest teilweise überlappen.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, insbesondere einem der Ansprüche 21 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und der Quencher auf der mit dem Quencher markierten Sonde so angeordnet sind, dass der Abstand zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und dem Quencher in einem Komplex aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und der mit einem Quencher markierten Sonde etwa 40 bis 100 Angström oder weniger beträgt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass
a) der Fluroreszenzfarbstoff auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde am 3'-Ende oder nahe am 3'-Ende und der Quencher auf der mit dem Quencher markierten Sonde am 5'-Ende oder nahe am 5'-Ende angeordnet ist, oder
b) der Fluroreszenzfarbstoff auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde am 5'-Ende oder nahe am 5'-Ende und der Quencher auf der mit dem Quencher markierten Sonde am 3'-Ende oder nahe am 3'-Ende angeordnet ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und die mit einem Quencher markierten Sonde gleichzeitig zu der Probe zugegeben werden.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und die mit einem Quencher markierten Sonde als Komplex, bevorzugterweise als hybridisierter Komplex zu der Probe zugegeben werden.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis der zu der Probe hinzu gegebenen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und der zu der Probe hinzu gegebenen mit einem Quencher markierten Sonde etwa 1:1 bis 1:5, bevorzugterweise etwa 1:3 beträgt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des in der Probe vorhandenen Mikroorganismus auf einer Oberfläche immobilisiert werden oder immobilisiert sind.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass als Schritt e) das Ausmaß des Löschens von durch den Fluoreszenzfarbstoff bedingter Fluoreszenz bestimmt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausmaß des Löschens ein Maß für die Anzahl der Zellen des in der Probe vorhandenen Mikroorganismus ist.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonde spezifisch ist für eine Domäne/Königreich, Division/Phylum, Klasse, Subklasse, Ordnung, Subordnung, Familie, Subfamilie, Gattung, Untergattung, Art, Unterart, Stamm, Unterstamm oder eine künstlich zusammengestellte Gruppe.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Sonden in Schritt b) zugegeben werden, wobei die Sonden spezifisch für verschiedene nachzuweisende Mikroorganismen sind und den gleichen Fluoreszenzfarbstoff tragen.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Sonden in Schritt b) zugegeben werden, wobei die Sonden spezifisch für verschiedene nachzuweisende Mikroorganismen sind und verschiedene Fluoreszenzfarbstoff tragen.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Sonden in Schritt c) zugegeben werden, wobei eine jede Sonde einen Quencher trägt und dieser Quencher die Fluoreszenz desjenigen Fluoreszenzfarbstoffes löscht, der von der Sonde getragen wird, die zu der Sequenz des den Quenscher tragenden Sonde komplementär ist.

35. Kit umfassend wenigstens eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehene erste Sonde und eine mit einem Quencher versehene erste Sonde, jeweils wie in einem der vorausgehenden Ansprüche beschrieben, zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mirkoorganismen, sowie einen Kit hierzu.

Die mikrobielle Routineanalytik in der Lebensmittelindustrie ist in vielen Bereichen mit einem hohen Probenaufkommen (> 100 Proben pro Tag) konfrontiert, welches schnell und möglichst parallel abgearbeitet werden muss. Um die Verarbeitung eines derartig großen Probendurchsatzes (High-throughput) mit einem spezifischen, molekularbiologischen Schnellnachweissystem zu realisieren, bietet sich als Reaktionsformat die Mikrotiterplatte an. In der Standardausführung können hiermit bis zu 96 Analysen parallel durchgeführt werden. Die Voraussetzung zum Einsatz dieses Reaktionsformats ist, dass die Analysen in Suspension durchführbar sind.

Protokolle zur Fluoreszenz in situ Hybridisierung in flüssiger Phase wurden bereits für eine Detektion mittels Durchflusszytometer etabliert (Wallner et al., 1995 und Thelen, 2002). Diese basieren auf dem Reaktionsmechanismus der Standard-FISH-Technik. Alle Schritte der Hybridisierungsreaktion wurden dabei nahezu unverändert vom Format Objektträger auf das Format Reaktionsgefäß übertragen und die verschiedenen Lösungen via Zentrifugation entfernt. Konzeptionell sind diese Protokolle für die Bearbeitung von einzelnen Analysen ausgerichtet.

Obgleich die Standard-FISH-Technik auch für die mikrobielle Routineanalytik mit klaren Vorteilen verbunden ist, stellt deren Adaptation an Fragestellungen, die mit einem großen Probendurchsatz verbunden sind, eine Herausforderung dar. Insbesondere ist der bei Ganzzellhybridisierung erforderliche Wachschritt zur Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses in der Routineanalytik sehr arbeitsintensiv. Weiterhin stellt der Waschschritt einen weiteren Prozessparameter dar, der bei der Würdigung des beobachteten Ergebnisses und der erforderlichen Standardisierung des Verfahrens zu beachten ist.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen allgemein und eines Mikroorganismus, im Folgenden auch als MO bezeichnet, im speziellen bereitzustellen, welches die vorstehenden Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt den schnellen und spezifischen Nachweis von Mikroorganismen, ohne dass es dabei eines Wachschrittes wie bei der Standard-FISH-Technik bedarf.

Weiterhin wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die bei der Standard-FISH-Technik und insbesondere der klassischen FISH Technik auftretende und bei der Auswertung nicht unproblematische Autofluoreszenz vermieden. Schließlich kann das vorliegende Verfahren zumindest und auch hinsichtlich der Auswertung automatisiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für eine Analytik mit hohem Probendurchsatzes (High-throughput). Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, in einem Format durchgeführt zu werden, das einen hohen Probendurchsatz erlaubt. Ein derartiges Format stellt das Mikrotiterplattenformat dar. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine einfache Durchführung, die auch ohne komplexe Geräteausstattung wie z. B. Mikrotiterplatten-Zentrifuge mit objektiver automatischer Auswertung, z. B. mittels eines Mikrotiterplatten-Fluorometers, möglich ist.

Ohne im Folgenden darauf festgelegt zu sein wollen, gehen die vorliegenden Erfinder derzeit von einem der erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegenden Mechanismus aus, wie er im Folgenden beschrieben ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt der spezifische Nachweis eines Mikroorganismus mittels einer ersten fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure, genauer mittels einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten erste Sonde, bevorzugterweise in flüssiger Phase, wobei der Mikroorganismus als ganze Zelle im Rahmen einer Ganzzellhybridisierung spezifisch und direkt nachgewiesen und gegebenenfalls quantifiziert wird. Der Nachweis des Mikroorganismus wird dabei durch ein Fluoreszenzquenching ermöglicht bzw. beruht auf diesem. Dabei tragen nur diejenigen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonden, die am Zielorganismus gebunden sind, zum Fluoreszenzsignal bei. Das Signal der nicht am Zielorganismus hybridisierten und damit freien Sonden wird hingegen durch Hybridisierung mit einer Quenchersonde, d. h. einer mit einem Quencher markierten oder versehenen ersten Sonde weitestgehend ausgelöscht. Durch diesen Reaktionsmechanismus wird ein einstufiges Testsystem möglich. Bei diesem einstufigen Testsystem wird bevorzugterweise nach einer erfolgenden Überführung der mikrobiellen Zellen einer Probe in ein entsprechendes Reaktionsgefäß bevorzugterweise eine oder maximal zwei verschiedene Lösungen angewandt werden und nach einer anschließenden Inkubation direkt der Nachweis (oder Detektion) der Mikroorganismen erfolgen.

Hinsichtlich des Reaktionsmechanismus der in dem Verfahren verwendeten mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde sind im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens grundsätzlich zwei Ausführungsformen zu unterscheiden. Bei einer ersten Ausführungsform diffundiert die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde nach deren Zugabe zu der zu untersuchenden Probe innerhalb des Mikroorganismus zu ihrer Zielsequenz und bindet daran. Ungebundene und überschüssige mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde wird im Gegensatz zum Stand der Technik und insbesondere der Standard-FISH-Technik, bei dem diese mit einem stringenten Waschschritt entfernt wird, durch Zugabe einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde hybridisiert und bildet so ein nicht mehr fluoreszierendes Nukleinsäurehybrid aus. Hatte die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde zuvor an eine geeignete Zielsequenz gebunden, so geht diese Sonde kein Hybrid mit einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde ein. Infolgedessen wird nach Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde eine Fluoreszenz beobachtet werden, die im Falle der Nichthybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde mit der Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus infolge Hybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde mit der mit einem Quencher markierten ersten Sonde nicht auftritt. Infolgedessen ist die beobachtete Fluoreszenz ein direktes qualitatives und auch quantifizierbares Signal für den Mikroorganismus bzw. dessen Menge, für den die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde spezifisch ist.

Bei einer zweiten Ausführungsform werden die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde und die mit einem Quencher markierte erste Sonde gleichzeitig zu der zu analysierenden Probe hinzugegeben. Dabei kommt es selbst bei Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes auf der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten. Sonde zu keiner Fluoreszenz, da die Fluoreszenz durch die Anwesenheit des Quenchers auf der mit dem Quencher markierten ersten Sonde gelöscht wird. Ohne darauf festgelegt zu sein wollen, gehen die vorliegenden Erfinder davon aus, dass dies dadurch erfolgt, dass die den Fluoreszenzfarbstoff tragende oder versehene, d. h. mit diesem markierte erste Sonde mit der den Quencher tragenden oder versehenen, d. h. mit diesem markierten ersten Sonde in einem Komplex, insbesondere einem Nukleinsäurehybrid vorliegen. Für den Fall, dass der nachzuweisende Mikroorganismus in der Probe vorhanden ist, dissoziiert das Nukleinsäurehybrid in die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde, die bevorzugterweise einzelsträngig ausgebildet ist, und die den Quencher tragende erste Sonde, die bevorzugterweise auch einzelsträngig ausgebildet ist. Die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde bindet an die Zielsequenzen innerhalb des nachzuweisenden Mirkoorganismen, für den die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde spezifisch ist, während die den Quencher tragende erste Sonde aufgrund des Fehlens einer komplementären Zielsequenz ungebunden in Lösung bleibt. Infolgedessen kommt es bei Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes der den Fluoreszenzfarbstoff tragenden ersten Sonde zu einer Fluoreszenz. Ist der nachzuweisende Mikroorganismus mit einer geeigneten Sondenbindungsstelle, d. h. einer Bindungsstelle für die den Fluoreszenzfarbstoff tragende erste Sonde nicht in der Lösung vorhanden, dann verbleibt das Nukleinsäurehybrid im nicht fluoreszierenden, bevorzugterweise doppelsträngigen Zustand in der Lösung. Wie auch bei der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform wird das Fluoreszenzsignal mittels eines Fluoreszenzdetektors wie z. B. mit einem Mikrotiterplatten-Fluorometer nachgewiesen.

Der dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrunde liegende Reaktionsmechanismus lässt sich somit, ohne darauf beschränkt zu sein, durch zwei verschiedene, konkurrierenden Hybridisierungsreaktionen beschreiben. Zum einen bilden die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde und die mit einem Quencher markierte erste Sonde über eine DNS:DNS-Hybridisierung ein nicht fluoreszentes Nukleinsäurehybrid in Lösung aus. Dieses Hybrid steht im thermodynamischen Gleichgewicht zu den dissoziierten Bestandteilen des Hybrides, also dissoziierter, mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierter ersten Sonde und dissoziierter, mit einem Quencher markierter erster Sonde. Zum anderen hybridisiert die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde nach Dissoziation dieses Hybrides über ein DNS:RNS-Hybridisierung an ihre Zielstelle auf der Zielsequenz innerhalb des nachzuweisenden Mikroorganismus. Zwischen diesen beiden Gleichgewichten fungiert das Zellhüllsystem, bevorzugt die Zellmembran/Zellwand des Mikroorganismus als semipermeable Barriere. Ein steigendes Fluoreszenzsignal indiziert eine Zuwachsrate an DNS:RNS Hybrid an den/der Zielstelle(n), d. h. Zielsequenz(en) des nachzuweisenden MO. In diesem Zusammenhang ist beachtlich, dass die vorbeschriebenen Reaktionen bzgl. des Transportes über das Zellhüllsystem auch bei einem nicht nachzuweisenden Mikroorganismus auftreten, dort es infolge des Fehlens der Zielsequenz(en) jedoch zu einer Reassoziation und demzufolge zu keiner Auflösung des DNS-DNS-Hybrides aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierter ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde kommt, so dass dort auch keine Fluoreszenzsignal nach Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes der mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde beobachtet werden kann. Vorstehend wurde das erfindungsgemäße Verfahren anhand von Sonden beschrieben, die aus Desoxyribonukleotiden bestehen und daher auch als DNS-Sonden hierin bezeichnet werden. Es wird jedoch von den Fachleuten anerkannt werden, dass grundsätzlich auch andere Sonden verwendet werden können, sofern diese Sonden das vorstehend beschriebene Verhalten bzgl. der Ausbildung verschiedener Hybride und insbesondere eine Dissoziation zugunsten der Ausbildung eines Komplexes aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde und einer Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus zeigen.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist eine Sonde wie hierin verwendet allgemein ein Molekül, welches mit einer Zielnukleinsäure spezifisch in Wechselwirkung treten kann. Bevorzugterweise handelt es sich bei den Sonden um Nukleinsäuresonden. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff, dass ein Molekül spezifisch mit einer Zielnukleinsäure in Wechselwirkung treten kann, dass damit eine Zielnukleinsäure von einer Nicht-Zielnukleinsäure unterschieden werden kann. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den Sonden um einzelsträngige Nukleinsäuresonden oder um zumindest teilweise einzelsträngige Nukleinsäuresonden. In der Ausführungsform, wo die Sonden zumindest teilweise einzelsträngige Sonden sind, ist vorgesehen das entweder die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert erste Sonde, die mit einem Quencher markierte erste Sonde oder beiden Sonden zumindest teilweise doppelsträngig sind. Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass bevorzugterweise die mit dem Quencher versehene erste Sonde teilweise doppelsträngig ausgebildet ist. In der Ausführungsform, wo zumindest eine der beiden Sonden doppelsträngig ausgebildet ist, ist vorgesehen, dass die teilweise doppelsträngige Sonde erlaubt, dass der Nukleinsäurehybrid ausgebildet werden kann.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein Mikroorganismus nachgewiesen wird. Wie hierin verwendet bezeichnet dabei der Begriff „ein Mikroorganismus” bevorzugterweise lediglich eine oder mehrere taxonomische Einheiten und/oder eine Gruppe von Mikroorganismen, die aufgrund bestimmter Kriterien künstlich zusammengestellt ist/sind. Es versteht sich dabei, dass beim Nachweis eines derartigen Mikroorganismus mehr als nur eine einzelne Zelle nachgewiesen wird. In der Regel erfolgt der Nachweis einer oder mehrerer Zellen, wobei der Nachweis auf dem Nachweis der von einer Einzelzellen ausgehenden Fluoreszenz beruht.

Eine taxonomische Einheit, zu deren Nachweis das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann ist dabei eine solche, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Domänen/Königreiche, Divisionen/Phyla, Klassen, Subklassen, Ordnungen, Subordnungen, Familien, Subfamilien, Gattungen, Untergattungen, Arten, Unterarten, Stämme und Unterstämme umfasst. Beispielhafte Domänen sind z. B. Eubacteria, Archae und Eukarya.

Eine künstlich zusammengestellte Gruppe sind beispielsweise solche Mikroorganismen, die in einer Probe kursorisch erfasst werden sollen, ohne dass es der Differenzierung der einzelnen taxonomischen Einheit bedarf. Derartig künstlich zusammengestellte Gruppen können bspw. solche der Gattung Lactobacillus und Art Megasphaera cerevisiae oder andere Kombinationen sein wie bspw. Coliforme Bakterien oder sog. „Schadorganismen” für bestimmte Lebensmittel wie z. B. Schadorganismen für Bier, Käse etc.

Die Probe, wie sie im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, ist bevorzugterweise eine flüssige Probe, in der die nachzuweisenden Mikroorganismen in der flüssigen Phase vorliegen. Dabei ist ausreichend, wenn zumindest ein Teil der einzelnen Zellen des nachzuweisenden Mikroorganismus in der flüssigen Phase vorliegt. Insoweit ist die Probe bevorzugterweise eine flüssige Probe, wobei insbesondere unter der vorstehenden Voraussetzung auch eine nur teilweise flüssige Probe oder eine Suspension oder eine Dispersion verwendet werden kann.

Die im Rahmen der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu analysierende Probe kann dabei eine jegliche Primärprobe sein, von der eine Sekundärprobe erzeugt wird, die dann als flüssige Probe in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. Eine Primärprobe kann eine feste, pastöse, flüssige oder gasförmige Probe sein. Typischerweise wird von der Primärprobe eine repräsentative Mischung von Mikroorganismen erhalten, die dann in die flüssige Probe, wie sie im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, überführt wird.

Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass das Löschen in Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht notwendigerweise vollständig ist. Für die Zwecke des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es ausreichend, wenn ein signifikanter und unter Verwendung des jeweiligen Nachweissystems, d. h. Detektors, ausreichender Signalunterschied zwischen dem Vorliegen einer nicht mit einer/der mit einem Quencher markierten ersten Sonde hybridisierten mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einem Komplex, d. h. Nukleinsäurehybrid aus einer/der mit einem Quencher markierten ersten Sonde und einer/der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde vorliegt. Dabei kann das Ausmaß des Löschens von etwa 10 bis 90%, bevorzugterweise etwa 50% und mehr betragen.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung und insbesondere des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Mikroorganismen einer Probe und damit auch der in der Probe enthaltene nachzuweisende Mikroorganismus „fixiert” wird oder in der Probe bereits fixiert vorliegt. Dabei wird unter dem Begriff des Fixierens hierin bevorzugterweise ein Fixieren verstanden, wie es auch im Rahmen von Standard-FISH-Techniken zur Anwendung gelangt und beispielsweise beschrieben ist in Amann R., und Fuchs B. (2008): Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6: 339–350.

Ziel des Fixierens ist es, das Zellhüllsystem, d. h. Zellwand und/oder Zellmembran so zu modifizieren, dass das Zellhüllsystem einen Transportwiderstand für die Passage eines doppelsträngigen Komplexes, insbesondere eines Nukleinsäurehybrides, das aus einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde besteht, aufbaut, so dass ein derartige Komplex aus der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde nicht oder zumindest deutlich schlechter oder langsamer über das Zellhüllsystem gelangt als die nicht als Komplex, d. h. Nukleinsäurehybrid, oder in einem derartigen Komplex, insbesondere einem derartigen doppelsträngigen Komplex vorliegende mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde oder mit einem Quencher markierten erste Sonde.

Entsprechend erfolgt die Fixierung unter Verwendung von einem Alkohol, insbesondere eines kurzkettigen Alkohols wie bspw. Ethanol, Methanol oder Isopropylalkohol. Anstelle eines Alkohols kann auch Formaldehyd oder para-Formaldehyd verwendet werden. Die genauen Reaktionsbedingungen eines derartigen Fixierverfahrens können durch einfache Standardversuche und Routineexperimente bestimmt werden und sind im Rahmen des durchschnittlichen Könnens eines Fachmannes auf dem Gebiet der mikrobiellen Diagnostik.

Neben der Behandlung mittels Alkohol oder Formaldehyd und deren entsprechenden Derivaten zum Zwecke des Fixierens, ist es auch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Zelle bzw. das Zellhüllsystem wie bspw. die Zellwand, insbesondere bei Gram-positiven einer enzymatischen Behandlung unterzogen wird. Im Rahmen der enzymatischen Behandlung wird das Passage-Verhalten des doppelsträngigen Komplexes aus mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und einer mit einem Quencher markierten ersten Sonde, und/oder der nicht im Komplex vorliegenden mit dem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und/oder der nicht im Komplex vorliegenden mit dem Quencher markierten ersten Sonde geändert. Vorteilhafterweise wird die Durchgängigkeit der nicht in dem doppelsträngigen Komplex vorliegenden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der nicht in dem doppelsträngigen Komplex vorliegenden mit einem Quencher versehenen ersten Sonde erhöht.

Bevorzugterweise erfolgt die Fixierung des Mikroorganismus vor der Hybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde mit der Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus. Dabei gilt es, bevorzugterweise, zum einen die Integrität und, in einem gewissen Umfang, auch die Form der nachzuweisenden Zellen beizubehalten sowie einen Verlust an Zellen des nachzuweisenden Mikroorganismus insbesondere durch Lyse zu vermeiden. Andererseits gilt es so viele Zellen wie möglich des nachzuweisenden Mikroorganismus durch das Fixieren zu permeabilisieren, so dass die mit einem Fluoreszenzfarbstoff und/oder mit einem Quencher markierten Sonden, insbesondere einzeln bzw. als Einzelstrang in die Zellen eindringen können, um dort an die Zielsequenz(en), sofern dort vorhanden, zu hybridisieren.

Infolge der Diversität der Zellhüllsysteme und insbesondere auch der Zellwände der verschiedenen nachzuweisenden Mikroorganismus erfolgt bevorzugterweise eine Adaptierung der Reaktionsbedingungen für die Fixierung des im Einzelfalle nachzuweisenden Mikroorganismus. Es wird jedoch anerkannt werden, dass mit der hierin vermittelten technischen Lehre der Fachmann in der Lage sein wird, eine derartige Adaptierung durch Routineversuche vorzunehmen. Bevorzugterweise wird eine Fixierung durch niedere Alkohole, insbesondere Ethanol, oder Formaldehyd oder para-Formaldehyd erfolgen. Die Fixierung kann dabei auch eine enzymatische Behandlung umfassen. Eine enzymatische Behandlung kann in Abhängigkeit von der Art der Zellwand oder deren Modifizierung bspw. mittels Lysozym erfolgen, für den Fall, dass ein dickes Peptidoglycan vorliegt, oder mittels Proteasen, für den Fall, dass eine Proteinzellwand vorliegt. Weitere Behandlungen können bspw. die kurzzeitige Behandlung der Zellen mittels Lösungsmitteln oder Salzsäure zur Entfernung von insbesondere Wachsschichten umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Schritt des Fixierens in dem erfindungsgemäßen Verfahren dazu führt, dass die fixierten Zellen nicht mehr lebensfähig sind und bevorzugtererweise dennoch intakt, bevorzugt morphologisch intakt vorliegen.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde und/oder die mit einem Quencher markierte erste Sonde eine einzelsträngige Nukleinsäure ist. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die besagten Sonden einzeln und unabhängig voneinander auch doppelsträngig ausgebildet sein können, wobei eine derartige doppelsträngige Struktur bspw. durch Rückfaltung oder Ausbildung eines sog. hair-pins ausgebildet werden kann. Alternative kann eine derartige doppelsträngige Struktur auch aus zwei einzelnen, d. h. separaten Strängen ausgebildet werden.

Bevorzugterweise ist in dem Fall, dass die Sonde doppelsträngig ausgebildet ist, lediglich ein Teil der Sequenz, die, im Falle der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde, spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist, bzw. im Falle der mit einem Quencher markierten ersten Sonde im wesentlichen komplementär zu der fluoreszenzmarkierten Sonde, d. h. der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde, ist, doppelsträngig ausgebildet. Das Ausmaß der Ausbildung eines Doppelstranges in den jeweiligen Sonden ist von den Erfordernissen der Hybridisierung mit der Zielsequenz und insbesondere der Hybridisierung mit der jeweils komplementären Sonde abhängig.

Eine jede der im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Sonde kann dabei als DNS, RNS, PNS oder LNS, oder Kombinationen von zwei oder mehreren davon ausgebildet sein.

Sonden, die vollständig oder zumindest teilweise aus PNS oder PNA („peptide nucleic acid”), oder LNS oder LNA („locked nucleic acid”) bestehen, weisen eine höhere Affinität für komplementäre Nukleinsäuren auf. Fluoreszenzmarkierte PNS wurden bereits für den Einzellnachweis von marinen Cyanobakterien verwendet. Nukleinsäuresonden mit 2 bis 4 LNS wurden als 16S rRNA-Sonden verwendet, wobei deren Bindungsstärke um den Faktor 16 erhöht war. PNS- und/oder LNS-haltige Sonden sind besonders für solche Zielsequenzen geeignet, die eine starke Sekundärstruktur aufweisen.

Die Ausgestaltung bzw. Auswahl der die jeweiligen Sonden ausbildenden Nukleotide ist im Rahmen des Könnens des Durchschnittsfachmannes auf dem Gebiet der Erfindung und kann durch Routineverfahren und -überlegungen im Lichte der hierin gegebenen Offenbarung und insbesondere des der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden mutmaßlichen Mechanismus erfolgen.

Die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde ist spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus. Die Erzeugung entsprechender spezifischer Sonden ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Spezifität wird bevorzugterweise über den Homologiegrad zwischen der Sonde und der Zielsequenz der Sonde bestimmt. Bevorzugterweise ist der Homologiegrad mindestens 70%, bevorzugterweise mindestens 80%, bevorzugtererweise mindestens 95% und am bevorzugtesten mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder 100%. In einer Ausführungsform ist die Sonde damit innerhalb der vorgegebenen Homologiewerte im Wesentlichen identisch mit der Zielsequenz. Alternativ kann die Nukleotidsequenz der Sonde im wesentlichen revers komplementär zu der Zielsequenz sein. Auch dann gelten die vorstehend genannten Homologiewerte als Ausmaß der Identität bzw. Komplementarität der Nukleotidsequenz der Sonde mit bzw. zu der Zielsequenz. Alternative kann, insbesondere im Falle einer revers komplementären Sequenz, das Ausmaß der Homologie durch die Bedingungen, unter denen noch eine Hybridisierung der Sonde und der Zielsequenz erfolgt, definiert werden. Die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde ist bevorzugterweise revers komplementär zu der Zielsequenz, bevorzugterweise wenn sie mit der Zielsequenz unter moderaten oder stringenten Bedingungen hybridisiert. Entsprechende Bedingungen sind in der europäischen Patenanmeldung EP 00 931 109.3 beschrieben

Das hierin zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde Gesagte gilt auch für die mit einem Quencher markierte erste Sonde, wobei es für den Fachmann offenkundig ist, dass die mit einem Quencher markierte erste Sonde im wesentlichen revers komplementär zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde ist und das Ausmaß der Komplementarität zwischen dieser, mit einem Quencher markierten ersten Sonde und der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde im gleichen Maße definiert werden kann, wie im Falle der Komplementarität zwischen der Zielsequenz in dem nachzuweisenden Mirkoorganismus und der der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde, was hierin durch Bezugnahme zur Vermeidung von Wiederholungen aufgenommen wird.

Zielsequenzen, die den spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus erlauben, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Bevorzugte Zielsequenzen sind insbesondere 16S rRNS, 23S rRNS, 18S rRNS, tRNS, EF-Tu, mRNS 16S–23S rRNA-Spacer und 23S–5S rRNA-Spacer. Siehe hierzu insbesondere beispielhaft „Archaeal diversity in naturally occurring and impacted environments from a tropical region.” Clementino MM, Fernandes CC, Vieira RP, Cardoso AM, Polycargo CR, Martins OB. J Appl Microbiol. 2007 Jul; 103(1): 141–51; ”Inter- and intraspecific genomic variability of the 16S–23S intergenic spacer regions (ISR) in representatives of Acidithiobacillus thiooxidans and Acidithiobacillus ferrooxidans.” Ni YQ, Yang Y, Bao JT, He KY, Li HY. FEMS Microbiol Lett. 2007 May; 270(1): 58–66. Epub 2007 Feb 16.;”Identification of medically important Candida and non-Candida yeast species by an oligonucleotide array.” Leaw SN, Chang HC, Barton R, Bouchara JP, Chang TC. J Clin Microbiol. 2007 Jul; 45(7): 2220–9. Epub 2007 May 16; oder ”PCR-based identification and strain typing of Pichia anomala using the ribosomal intergenic spacer region IGS1.” Bhardwaj S, Sutar R, Bachhawat AK, Singhi S, Chakrabarti A. J Med Microbiol. 2007 Feb; 56 (Pt 2): 185–9.

Die Länge der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde beträgt unabhängig von einander etwa 15 bis 31 Nukleotide, bevorzugterweise etwa 17 bis 25 Nukleotide, bevorzugtererweise etwa 17 bis 23 Nukleotide und am bevorzugtesten 17 oder 18 Nukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die beiden Sonden im Wesentlichen gleich lang. Beide Sonden können weitere Nukleotide umfassen, als es zur Ausbildung der vorstehend genannten Längen erforderlich ist, wobei diese weiteren Nukleotide jedoch bevorzugterweise dann nicht zur Ausbildung einer doppelsträngigen Struktur beitragen oder an dieser beteiligt sind, wenn sich die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde mit der mit einem Quencher markierten ersten Sonde basenpaart, wobei die Basenpaarung bevorzugterweise eine Watson-Crick-Basenpaarung ist, und einen hybridisierten Komplex ausbildet. In einer Ausführungsform ist die Länge der Sonden und der zueinander komplementäre Bereich der Sonden gleich lang und bevorzugterweise identisch.

Für die Auswahl der Länge der Sonden kann der hierin offenbarte Reaktionsmechanismus herangezogen werden, gemäß dessen die Dissoziation der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde, die, im Falle der Ausgestaltung der beiden Sonden als DNS-Sonden, im Gleichgewicht als DNS:DNS-Hybrid in Lösung vorliegen. Je länger die beiden Sonden sind, desto stärker liegt das Gleichgewicht der Dissoziation wegen der höheren thermischen Stabilität auf der Seite des DNS:DNS-Hybrides. Eine Verschiebung des Gleichgewichts hin zum DNS:RNS-Hybrid an die Zielnukleinsäure des Mikroorganismus ist dann nur mehr durch überhöhte Hybridisierungstemperaturen oder durch DNS destabilisierende Agenzien erreichbar. Gleiches gilt für die Ausgestaltung der Sonden, die andere als Desoxyribonukleotide verwenden.

Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind insbesondere solche, wie sie auch im Rahmen der Standard-FISH-Technik verwendet werden können. Der Fluoreszenzfarbstoff kann beispielsweise aus der Gruppe ausgewählt sein, die FAM, TAMRA, CY3, Alexa 350, Pacific Blue, Coumarin, Cy2, Alexa 488, TET, Alexa 532, HEX, Alexa 546, TMR, Cy3.5, Alexa 568, Texas red, Alexa 594, Alexa 633, Cy5, Cy5.5 Alexa 660, Alexa 680, Rox und Vic umfasst. Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet anerkannt werden, dass es grundsätzlich keine Beschränkung hinsichtlich der Eignung von Fluoreszenzfarbstoffen gibt, jedoch solche Fluoreszenzfarbstoffe bevorzugt sind, für die es einen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbaren Quencher gibt.

Hinsichtlich der Ausgestaltung bzw. der Auswahl des Quenchers bestehen ebenfalls grundsätzlich keine Beschränkungen. Es wird jedoch anerkannt werden, dass die Auswahl des Fluoreszenzfarbstoffes und des Quenchers so erfolgen muss, dass eine ausreichende Löschung des Fluoreszenzsignals des Fluoreszenzfarbstoffes nach dessen Anregung entweder direkt oder indirekt erfolgt. Eine ausreichende Löschung ist wie hierin bereits festgestellt eine solche, welche einen Unterschied bzw. Unterscheidung zwischen dem gelöschten und dem ungelöschten Zustand erlaubt.

Es ist dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung und Gegenstand einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass der Quencher wiederum selbst ein Fluoreszenzfarbstoff ist.

Einige exemplarische Kombinationen von Fluoreszenzfarbstoff und Quencher sind in der folgenden Tabelle angegeben.

FluoreszenzfarbstoffKorrespondierende Quenching-FarbstoffeFAMDabcyl, BHQ-1, TAMRATAMRABHQ-2CY3BHQ-2

Weitere Kombinationen finden sich im Stand der Technik, so z. B. bei Marras et al. (Marras S. A. E., Kramer F. R., and Tyagi S. (2002): Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide grobes. Nuc. Acids Res. 30: e122). sowie bei Marras et al, 2006 (aaO).

Bei der Auswahl eines geeigneten Paares aus Fluoreszenzfarbstoff und Quencher kann dabei unterschieden werden, ob es sich bei dem beobachteten bzw. zugrundeliegenden Löschen entweder um ein statisches Löschen oder ein dynamisches Löschen handelt. Die Positionierung des Fluoreszenzfarbstoffes und des Quenchers kann in Abhängigkeit davon erfolgen, ob es sich um ein statisches oder ein dynamisches Löschen handelt.

Generell wird als Fluoreszenzquenching die Abschwächung oder die Auslöschung eines Fluoreszenzsignals bezeichnet. Für eine optimale Quenchingeffizienz ist dabei eine genaue Abstimmung von Fluoreszenzfarbstoff und korrespondierendem Quencher entscheidend (Marras, 2006; Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Design and Protocols. Methods in Molecular Biology. 335: 3–16).

Ein Fluoreszenzfarbstoff, hierin auch als Fluorophor bezeichnet, ist ein Molekül, das Licht bei einer charakteristischen Wellenlänge, idealerweise an seinem Absorbtionsmaximum, absorbiert bzw. davon energetisch angeregt wird. Dieses Licht (Photon) wird nach einer bestimmten Zeit z. B. wieder in Form von Fluoreszenz oder als Schwingungsenergie (Wärme) emittiert. Das Fluorophor kehrt dabei in den energetisch günstigeren nicht angeregten Ausgangszustand zurück. Ein Quencher (Akzeptor) ist ein Molekül, das Energie von einem angeregten Fluorophor (Donator oder Donor) absorbiert und damit dessen Fluoreszenzemission auslöscht. Beim sogenannten statischen Quenching bzw. Kontaktquenching bildet sich im angeregten Zustand ein nicht-fluoreszenter Komplex zwischen Fluorophor und Quencher. Donator und Akzeptor befinden sich beim statischen Quenching räumlich sehr nahe (< oder gleich 20 Å). Die Moleküle interagieren dabei direkt durch einen Protonen-gekoppelten Elektronentransfer mittels der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen (Förster, 1948, Intermolecular energy transference and fluorescence. Ann. Phys. 2: 55–75; Lakowicz, 1999, Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.; Marras, 2006, aaO).

Infolgedessen wird beim Vorliegen eines statischen Löschens oder Quenches der Fluoreszenzfarbstoff in einer räumlichen Nähe von typischweise < oder gleich 20 Angström vorliegen.

Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Methode des dynamischen Quenchings, dem sogenannten FREI-Quenching (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zur Anwendung gelangt. Bei dem das angeregte Fluorophor seine Energie auf den Quencher überträgt und danach strahlungslos in den Grundzustand zurückkehrt. Donator und Akzeptor befinden sich in einem räumlichen Abstand von 40–100 Å (was ca. 3 bis 30 Nukleotiden innerhalb einer doppelsträngigen DNS entspricht). Eine Voraussetzung für FREI-Quenching ist zudem, dass das Fluoreszenzemissionsspektrum des Donators mit dem Absorbtionsspektrum des Akzeptors überlappt.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Sonde, die spezifisch ist für den nachzuweisenden Organismus, sowohl den Fluoreszenzfarbstoff trägt als auch den Quencher. Derartige Konstrukte sind in der Technik bekannt und unter anderem beschrieben in der internationalen Patentanmeldung WO 2007/104318 und wird in der Technik auch als „molekularer Leuchtturm” (engl. „molecular beacon”) bezeichnet.

In einer derartigen Ausführungsform erfolgt somit die Zugabe von lediglich einer entsprechend markierten und für den Nachweis des nachzuweisenden Mikroorganismus spezifischen Sonde.

Das Verhältnis der beiden in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten ersten Sonden, d. h. der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde und der mit einem Quencher markierten ersten Sonde hängt von den Bedingungen der konkreten einzelnen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ab und kann im Rahmen von Routineuntersuchungen leicht von den Fachleuten auf dem Gebiet bestimmt werden. Dabei ist beachtlich, dass sich aufgrund des angenommenen Mechanismus über zwei konkurrierende Gleichgewichte von DNS:DNS und DNS:RNS die Anpassungen der Parameter Temperatur und Salzgehalt in sehr engen Grenzen bewegt, so dass sich als in Frage kommender Temperaturbereich unter Beibehaltung der hierin angegebenen Sondenlängen dieser in den Grenzen 30–45°C bei 0–100mM NaCl oder eines anderen monovalenten Kations (z. B. K+, Li+ etc) bewegen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verwendenden Kompetitorsonden werden in ähnlicher Weise wie bei der Standard-FISH-Technologie weitestgehend vom Zielorganismus und dessen nächsten Verwandten abhängig ausgestaltet, was im Rahmen der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmannes ist.

Es ist im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass der nachzuweisende Mikroorganismus und/oder die in der Probe enthaltenen Mikroorganismen an eine Oberfläche immobilisiert werden oder sind. Die Oberfläche kann dabei eine von dem Reaktionsgefäß, in dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, bereitgestellte Oberfläche sein. Dabei sind grundsätzlich für das erfindungsgemäße Verfahren alle Formate denkbar, die eine Hybridisierung in Suspension und/oder Lösung, aber auch an einer Oberfläche ermöglichen, so dass neben Mikrotiterplatten z. B. auch Küvetten, Reaktionsgefäße jeglicher Art und Größe usw. in Frage kommen und verwendet werden können.

In analoger Weise zu der Standard-FISH-Technik kann eine Quantifizierung des Fluoreszenzsignals zur Quantifizierung der Anzahl der Zellen, insbesondere der Ganzzellen, des nachzuweisenden Mikroorganismus verwendet werden. Die entsprechenden Verfahren sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.

Zur Erhöhung der Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens können neben den beiden in Schritt a) und b) zugegebenen Sonden unabhängig davon, ob die beiden Sonden separat oder gemeinsam zu der Probe hinzugegeben werden, in der ein Mikroorganismus nachgewiesen werden soll bzw. die auf die Anwesenheit eines Mikroorganismus hin untersucht werden soll, noch so genannte Kompetitorsonden der Reaktion zugegeben werden.

Unter dem Begriff ”Kompetitorsonden” werden insbesondere Oligonukleotide verstanden, die eventuell auftretende ungewollte Bindungen, d. h. insbesondere Bindungsstellen, der Nukleinsäuresonden, insbesondere der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde abdecken und dabei eine höhere Sequenzähnlichkeit zu einem nicht nachzuweisenden Mikroorganismus aufweisen als zu dem/den nachzuweisenden Mikroorganismus/Mikroorganismen. Durch den Einsatz von Kompetitorsonden kann verhindert werden, dass die besagte mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde an die Nukleinsäuresequenz des/der nicht nachzuweisenden Mikroorganismus/Mikroorganismen bindet und somit zu falschen Signalen führt. Die Kompetitorsonde ist typischerweise unmarkiert und wird bevorzugterweise vor der entsprechenden mit einem Fluoreszenzfarbstoff bzw. Quencher markierten ersten Sonde bzw. einem daraus bestehenden Hybrid eingesetzt. Die Kompetitorsonde sollte im Wesentlichen komplementär sein zu einer Zielsequenz von einer oder mehreren nicht nachzuweisenden Mikroorganismen.

Bei der Kompetitorsonde, wie sie im Rahmen der Erfindung verwendet werden kann, kann es sich um eine DNA- oder RNA-Sequenz handeln, die in der Regel zwischen 12 und 100 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 15 und 50, besonders bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide. Durch die Auswahl einer definierten Sequenz kann die Hybridisierung der mit einem Fluoreszenzfarbstoff bzw. Quencher markierten ersten Sonden an die Nukleinsäuresequenz einer taxonomischen Einheit oder künstlich zusammengestellten Gruppe abgeblockt werden. Komplementarität zu der abzublockenden Nukleinsäuresequenz, d. h. Zielsequenz sollte bei einer Kompetitorsonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Kompetitorsonden mit mehr als 15 Nukleotiden sind je nach Länge ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt. Derartige Kompetitorsonden sind bspw. in der europäischen Patentanmeldung EP 04786995.3 beschrieben.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass neben dem Paar aus einer einen Fluoreszenzfarbstoff tragenden ersten Sonde und einer mit einem – darauf abgestimmten – Quencher markierten ersten Sonde noch ein zweites Paar aus einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten zweiten Sonde und einer mit einem auf den zweiten Fluoreszenzfarbstoff abgestimmten Quencher markierten zweiten Sonde verwendet wird. Die Ausgestaltung der zweiten Sonden erfolgt entsprechend dem ersten Paar, wie es detailliert hierin beschrieben ist. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Spezifität der zweiten Sonde(n) auf eine andere Zielsequenz des durch das erste Sondenpaar adressierten und damit nachzuweisenden Mikroorganismus gerichtet ist. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Spezifität der zweiten Sonde(n) auf einen anderen nachzuweisenden Mikroorganismus gerichtet ist. Damit würde es ermöglicht, dass in einer Reaktion zwei verschiedene nachzuweisende Mikroorganismen nachgewiesen werden können.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Kit. Der erfindungsgemäße Kit umfasst mindestens eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde, wobei die Sonde spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist und/oder eine mit einem Quencher markierte erste Sonde, wobei die mit dem Quencher markierte erste Sonde im wesentlichen komplementär, bevorzugterweise revers komplementär zu der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde ist, die für den nachzuweisenden Mikroorganismus spezifisch. Insoweit entsprechen bevorzugterweise die in dem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Sonden den in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sonden, und umgekehrt. In einer Ausführungsform des Kits ist vorgesehen, dass die Sonde(n) in aliquotierter Form vorliegen. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Kit eine oder mehrere Positiv- und/oder Negativkontrollen enthält.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele und Figuren weiter veranschaulicht, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt:

1 schematisch das dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegende Reaktionsgeschehen.

2 schematisch eine Ausführungsform der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Hybridisierung in Lösung kombiniert mit Fluoreszenzquenching, das hierin auch als Strategie A bezeichnet wird.

3 schematisch eine Ausführungsform der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Hybridisierung in Lösung kombiniert mit Fluoreszenzquenching, das hierin auch als Strategie B bezeichnet wird.

4 die Wirkung einer Verdünnungsreihe der Sonden EUB338 und Esak997-3 auf das Fluoreszenzverhalten, dargestellt als Balkendiagramm, das die Fluoreszenzintensität als Funktion der Sondenkonzentration bei verschiedenen Reaktionsbedingungen ohne Quencher darstellt.

5 das Ergebnis zur Bestimmung des optimales Sonden/Quenchersonden Verhältnisses, dargestellt als Balkendiagramm, das die Fluoreszenzintensität als Funktion der Konzentration der mit einem Quencher versehenen Sonde bei verschiedenen Reaktionsbedingungen darstellt.

6 die Reaktionskinetik von Strategie A in modifiziertem PCR-Puffer, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer.

7 die Reaktionskinetik von Strategie A in Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer.

8 die Reaktionskinetik von Strategie B in modifiziertem PCR-Puffer, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer.

9 die Reaktionskinetik von Strategie B in Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer.

10 das Ergebnis einer Untersuchung von künstlich mit C. sakazakii kontaminierten Milchpulverproben, dargestellt als Funktion der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit der Hybridisierungsdauer.

1 veranschaulicht schematisch das dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegende Reaktionsgeschehen, wobei in dem konkreten Beispiel sowohl die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte erste Sonde als auch die mit einem Quencher markierte erste Sonde als einzelsträngiges DNA-Molekül vorliegt. Als Zielmolekül in dem nachzuweisenden Mikroorganismus fungiert eine rRNA, wobei die von der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde targetierte Sequenz der rRNA spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist.

Basierend auf experimentellen Daten sind in 1 die hypothetisch angenommenen Abhängigkeiten der DNS:DNS- und DNS:RNS-Hybridisierungen zueinander schematisch als Gleichgewichtsreaktionen dargestellt. Die beiden möglichen Hybridisierungsziele (Quenchersonde (DNS) und Bindungsstellen auf der rRNS (RNS)) stehen in dieser Reaktion in direkter Kompetition um die Sonde (DNS).

Zu Beginn der Reaktion oder in Abwesenheit von rRNS-Bindungsstellen liegen die den Quencher tragende bzw. mit diesem markierte Nukleinsäuresonde (Quenchersonde) und die den Fluoreszenzfarbstoff tragende bzw. mit diesem markierte Nukleinsäuresonde (Fluoreszenzsonde) als DNS:DNS-Hybrid vor. Da Quenchersonden und Fluoreszenzsonden nicht in gleichen Teilen sondern im Verhältnis 3:1 in die Reaktion eingesetzt wurden, wird das Sondensignal in der Lösung nahezu vollständig ausgelöscht (98% bis 99%) und das Reaktionsgleichgewicht verschiebt sich anfänglich zu Gunsten der DNS:DNS-Hybridisierung. In dem Fall, dass potentielle Zielstellen auf der rRNS für die Fluoreszenzsonden verfügbar sind, verschieben sich die Gleichgewichte der Reaktionen in Abhängigkeit von der Hybridisierungsdauer vom DNS:DNS-Hybrid in Richtung DNS:RNS-Hybrid. Die Fluoreszenzsonden werden dabei durch die Bindung an die rRNS stetig aus der Gleichgewichtsreaktion entzogen und forcieren auf diese Weise eine weitere Dissoziation der Quenchersonden/Fluoreszenzsonden-Hybride.

Dieser Verlauf setzt sich so lange fort bis keine freien Fluoreszenzsonden-Moleküle für die Hybridisierung an die rRNS aus der Dissoziation der Quenchersonden/Fluoreszenzsonden-Hybride zur Verfügung stehen oder alle potentiellen Zielstellen durch eine Fluoreszenzsonden-Bindung abgedeckt wurden. Zu diesem Zeitpunkt wird die maximale Fluoreszenzintensität in der Lösung erhalten und die Reaktion erreicht einen stabilen gesättigten Zustand.

BEISPIELEBeispiel 1: In silico und in situ Überprüfung der Spezifität der Sonde Esak997

Die Sonde Esak997 wurde 2004 von der vermicon AG zum spezifischen Nachweis von Enterobacter sakazakii entwickelt. Um deren Spezifität nach der Re-Klassifizierung von Enterobacter sakazakii als Cronobacter spp. zu evaluieren, wurde ein in silico und ein in situ Abgleich auf allen zur Verfügung stehenden Cronobacter Arten mit dieser Sonde durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die Sonde Esak997 in silico und in situ alle bis dato beschriebenen Cronobacter Arten als Gattungs-spezifische Sonde nachweist.

Beispiel 2: Theoretische Konzeptionierung der Hybridisierungsstrategien

Zur Kombination der Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit einem statischen Fluoreszenzquenching-Verfahren, wurden theoretisch zwei mögliche Strategien für eine Hybridisierung in Lösung definiert, und experimentell überprüft. Strategie A ist in 2 dargestellt und wird im Folgenden unter Verweis auf 2 näher dargestellt.

Strategie A (2) basierte auf der typischen Reaktionskinetik der Standard-FISH-Technologie. In einem ersten Schritt diffundiert die mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelte erste Sonde zu ihren Bindungsstelle(n) auf der rRNS und bindet an diese (2, Bild 1). (Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass dieser Vorgang für eine Vielzahl von Sondenmolekülen und einer Vielzahl von Bindungsstellen parallel ablaufen wird.) Ungebundene und überschüssige Sonde wird bei der Standard-FISH-Technologie über einen stringenten Waschschritt entfernt. Dieser Waschschritt soll in Strategie A durch das Fluoreszenzquenching ersetzt werden. Dazu wird eine Quenchersonde, die mit einem nicht fluoreszierenden Quencher markiert wurde, zugegeben. Diese hybridisiert mit der ungebundenen, für den nachzuweisenden Mikroorganismus spezifischen Sonde und bildet ein nicht fluoreszierendes Hybrid aus (2, Bild 2). Hatte die Sonde zuvor an eine oder mehrere passende Zielstellen gebunden, emittiert diese bei Anregung mit für den Fluoreszenzfarbstoff geeigneter Wellenlänge Fluoreszenzlicht und damit ein Signal, welches mittels eines Mikrotiterplatten-Fluorometers gemessen wird. Ist/sind keine entsprechenden Zielstelle(n) für die Sonde vorhanden, wird die Sonde von der Quenchersonde gebunden und ihr Fluoreszenzsignal in der Lösung ausgelöscht (2, Bild 3).

Demgegenüber verfolgt die in 3 schematisch dargestellte Strategie B ein anderes Modell zur Hybridisierung in Lösung. In einem ersten Schritt wird ein nicht fluoreszierendes Hybrid aus einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten ersten Sonde (Fluoreszenzsonde) und einer mit einem Quencher gekoppelten ersten Sonde (Quenchersonde) zugegeben (3, Bild 1). In dem Fall, dass Zellen mit einer oder mehreren Bindungsstelle(n) für die entsprechende Sonde vorhanden sind, dissoziiert das Hybrid in Fluoreszenzsonde und Quenchersonde. Die Fluoreszenzsonde bindet an die Zielstelle(n) auf der rRNS innerhalb der Zellen und die Quenchersonde verbleibt ungebunden in der Lösung. Sofern keine Zellen mit passender/passenden Sondenbindungsstelle(n) vorhanden sind, verbleibt das Hybrid im nicht fluoreszierenden Ausgangszustand in der Lösung. Die Fluoreszenzsignale werden bei Strategie B ebenfalls mittels Mikrotiterplatten-Fluorometer detektiert (3, Bild 2).

Beispiel 3: Evaluierung des Sonden/Quenchersonden Verhältnisses

Die folgende Tabelle C.9 zeigt eine Übersicht der verwendeten Fluoreszenzsonden („Sonden”) und der korrespondierenden Quenchersonden Tabelle C.9: Übersicht verwendete Sonden und korrespondierende Quenchersonden

  • Legende: 1) Sonde, 2) Quenchersonde, 3) Markierungsposition des Farbstoffes oder Quenchers
Verwendete Puffersysteme:HP0%SubstanzMenge5 M NaCl360 μl1 M Tris/HCl pH 8,040 μlFormamidx μl10% (w/v) SDS2 μlH2Obidest.ad 2 ml

Modifizierter PCR-Puffer:

  • 5 M NaCl 50 mM
  • 1 M Tris/HCl (pH 8,0) 10 mM
  • TritonX100 0,1%

Die Sonden wurden in den entsprechenden Puffer in die Endkonzentrationen 5 ng/μl, 500 pg/μl, 50 pg/μl, 5 pg/μl, 500 fg/μl sowie 50 fg/μl verdünnt und im Anschluss daran vermessen.

Die niedrigste, mittels Mikrotiterplatten Fluorometer (Gain 80), messbare Sondenkonzentration, sollte für die Sonden EUB338-TAMRA und Esak977-3-TAMRA gelöst in Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid (HP 0%) und modifiziertem PCR-Puffer bestimmt werden.

Wie in 4 dargestellt zeigen die erhaltenen Messergebnisse, dass die niedrigste Sondenkonzentration, insbesondere die niedrigste Konzentration der Fluoreszenzsonde, die bei einem Gain von 80 mittels F1×800 Mikrotiterplatten Fluorometer nachgewiesen werden konnte, 5 ng/μl ist. Die Fluoreszenzintensitäten aller niedrigeren Sondenkonzentrationen näherten sich der Nulllinie.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Sondenkonzentration, insbesondere die niedrigste Konzentration der Fluoreszenzsonde, für alle weiteren Hybridisierungen auf 5 ng/μl fixiert.

In einem weiteren Versuch wurde für diese Konzentration der Fluoreszenzsonde das optimale Verhältnis der korrespondierenden Quenchersonde ermittelt, bei dem > 95% des Fluoreszenzsignals der Fluoreszenzsonde ausgelöscht werden. Dazu wurden die korrespondierenden Quenchersonden in den Endkonzentrationen 5 ng/μl, 7,5 ng/μl, 10 ng/μl, 12,5 ng/μl sowie 15 ng/μl in Kombination mit der entsprechenden Sonde (5 ng/μl) eingesetzt.

Das optimale Verhältnis von Fluoreszenzsonde zu Quenchersonde wurde exemplarisch für die Fluoreszenzsonden/Quenchersonden Kombinationen EUB338-TAMRA/Quen-EUB338-BHQ2 und Esak977-3-TAMRA/Quen2-Esak997-3-BHQ2 in HP0% und modifiziertem PCR-Puffer bestimmt und ist im Ergebnis in 5 dargestellt.

Tabelle C.12 weist die prozentuale Effizienz des Fluoreszenzquenchings pro entsprechender Konzentration der Quenchersonde aus. Tabelle C.12: Prozentuale Quenchingeffizienz

Endkonzentration der Quenchingsonde:0 ng/μl2,5 ng/μl5 ng/μl7,5 ng/μl10 ng/μl12,5 ng/μl15 ng/μlHP 0% EUB-338-TAMRA [5 ng/μl]0,0%61,5%97,1%97,6%98,5%98,6%98,8%mod. 1-fach PCR-Puffer EUB-338-TAMRA [5 ng/μl]0,0%53,8%96,5%97,2%98,3%98,4%98,8%HP 0% Esak997-3-TAMRA (5 ng/μl]0,0%48,4%98,1%98,7%99,1%99,2%99,2%mod. 1-fach PCR-Puffer Esak-997-TAMRA [5 ng/μl]0,0%55,6%97,8%98,3%98,3%98,5%98,6%
  • Legende: Die prozentuale Quenchingeffizienz bezieht sich auf die Auslöschung des Sondensignals pro Quenchersondenkonzentration. Spalten 5–10 ng/μl markiert eine Quenchingeffizienz > 95%

Bei einer Sondenkonzentration von 5 ng/μl wurden ab einer Quenchersondenkonzentration von 5 ng/μl für alle untersuchten Kombinationen aus Fluoreszenzsonden und Quenchersonden eine Quenchingeffizienz von > 95% erzielt (siehe hierzu Tabelle C.12, Spalten mit 5 ng/μl, 7,5 ng/μl, 10 ng/μl, 12,5 ng/μl und 15 ng/μl). Unter Verwendung von 10 ng/μl Quenchersonde wurde die Quenchingeffizienz auf > 98% gesteigert.

Quenchersondenkonzentrationen von > 10 ng/μl führten zu keiner weiteren signifikanten Steigerung in der Signalauslöschung.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurde für alle weiteren Hybridisierungen 10 ng/μl als Standardkonzentration für Quenchersonden definiert.

Beispiel 4: Experimentelle Verifizierung der Hybridisierungsstrategien

Auf Basis der vorstehend beschriebenen Experimente wurde im Folgenden ein Versuchsaufbau spezifiziert, über den die generelle Eignung von Strategie A und B zur Hybridisierung in Lösung experimentell überprüft werden konnte.

Als Hybridisierungstemperatur wurde, angelehnt an die zur Fluoreszenz in situ Hybridisierung auf Objektträgern und Membranfiltern verwendete Temperatur von 46°C, 45°C ± 2°C ausgewählt.

Es wurden zwei Puffer mit unterschiedlicher NaCl-Konzentration für die Hybridisierung ausgewählt. Zum einen wurde modifizierter PCR-Puffer (siehe Beispiel 3, NaCl-Konzentration: 50 mM) und zum anderen Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid (siehe Beispiel 3, NaCl-Konzentration: 800 mM) als Puffersystem definiert. Diese Puffer wurden im Verhältnis 9:1 mit der Fluoreszenzsonde (Endkonzentration: 5 ng/μl) und der Quenchersonde (Endkonzentration: 10 ng/μl) kombiniert.

Für die Reaktion wurde ein Gesamtvolumen (Reaktionspuffer/Fluoreszenzsonde/Quenchersonde) von 100 μl pro well in die Mikrotiterplatte eingesetzt.

Als Zielorganismus wurde eine EtOH-Fixierung von Cronobacter sakazakii LMG 2760 verwendet. Als Nichtzielorganismen wurden EtOH-Fixierungen von Citrobacter freundii DSM 30039 (4 Rasenunterschiede (MM) zur Sondenbindungsstelle), Enterobacter cloacae DSM 30054 (4 MM zur Sonden-bindungsstelle), Erwinia chrysanthemii DSM 4610 (1 MM zur Sondenbindungsstelle) und Edwardsiella tarda DSM 30052 (2 MM zur Sondenbindungsstelle) in diesem Versuch mitgeführt.

Im ersten Schritt wurden die fixierten Zellen in der Mikrotiterplatte dehydratisiert (60°C, 30 min). Für Strategie A wurden 90 μl Reaktionspuffer inkl. Fluoreszenzsondenlösung (Endkonzentration Fluoreszenzsonde: 5 ng/μl) auf die dehydratisierten Zellen gegeben und die Mikrotiterplatte bei 45°C für 1,5 h im Hybridisierungsofen (Memmert) inkubiert.

Nach Ablauf dieser Inkubationszeit wurden 10 μl Reaktionspuffer inkl. Quenchersondenlösung (Endkonzentration Quenchersonde: 10 ng/μl) in die Suspension pipettiert und die Inkubation im Hybridisierungsofen fortgesetzt (45°C für 2,5 h).

Die Fluoreszenzmessung im Mikrotiterplatten-Fluorometer erfolgte direkt nach Zugabe der Fluoreszenzsondenlösung (Messpunkt 0 h) sowie nach 0,5 h und 1 h Inkubation. Eine weitere Messung wurden direkt nach Zugabe der Quenchersonde (Messpunkt: 1,5 h) durchgeführt.

Die Kinetik des Fluoreszenzquenchings wurde zusätzlich auch nach 2 h, 2,5 h, 3 h und 4 h Inkubation über weitere Messungen bestimmt.

Der gesamte Reaktionsverlauf der Strategie A ist für den modifizierten PCR-Puffer in 6 und für Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid (HP 0%) in 7 für C. sakazakii und die evaluierten Nichtzielorganismen zusammengefasst.

Für Strategie B wurden 100 μl Reaktionspuffer inkl. Fluoreszenzsonden- und Quenchersondenlösung (Endkonzentration Fluoreszenzsonde: 5 ng/μl/Quenchersonde: 10 ng/μl) auf die dehydratisierten Zellen pipettiert und die Mikrotiterplatte bei 46°C für 4 h im Hybridisierungsofen inkubiert. Die Fluoreszenzmessung im Mikrotiterplatten-Fluorometer erfolgte nach Zugabe der Fluoreszenzsonden-/Quencherlösung (Messpunkt 0 h) sowie nach 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h und 4 h Inkubation.

Die Reaktionskinetik der Hybridisierung in Lösung ist für Strategie B für modifizierten PCR-Puffer in 8 und für Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid in 9 dargestellt.

Dem Verlauf der Kurven in den 6 und 8 ist zu entnehmen, dass ein Nachweis von C. sakazakii mittels Strategie A und B in modifiziertem PCR-Puffer prinzipiell möglich ist.

Nach Zugabe der Quenchersonden in den modifizierten PCR-Puffer wurden im Reaktionsverlauf von Strategie A (6, schwarze Kurve) für C. sakazakii je nach Messpunkt, Fluoreszenzintensitäten zwischen 40000 und 50000 RFU gemessen. Die Fluoreszenzintensitäten der mitgeführten Nichtzielorganismen lagen im Vergleich < 15000 RFU.

C. sakazakii erreichte nach Strategie B (8, schwarze Kurve) im gleichen Puffersystem Fluoreszenzintensitäten von > 45000 RFU. Die Signale der Nichtzielorganismen verblieben im Bezug dazu < 25000 RFU.

Im Gegensatz dazu schlug eine Hybridisierung in Standardhybridisierungspuffer mit 0% Formamid für beide Strategien fehl (7 und 9).

Nach Zugabe der Quenchersonden wurden die Signale von Zielorganismus und Nichtzielorganismen in Strategie A gleichermaßen ausgelöscht (7).

Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten aller Fixierungen fielen von ihrem Ausgangswert von > 40000 RFU auf ein Niveau von < 1000 RFU.

Für Strategie B verblieben die Fluoreszenzsignale in HP0% über die gesamte Hybridisierungsdauer für Zielorganismus und Nichtzielorganismen < 1000 RFU.

Als Schlussfolgerung bleibt festzuhalten, dass diese experimentellen Untersuchungen generell die Erwartungen, die aufgrund der vorangegangenen theoretischen Überlegungen an das erfindungsgemäße Verfahren gestellt wurden, erfüllten.

Eine erste Unterscheidung von Zielorganismus und Nichtzielorganismen konnte in modifiziertem PCR-Puffer gezeigt werden und ein erster funktioneller „proof of concept” wurde für beide Strategien erbracht.

Basierend auf dem Reaktionsmechanismus wird das der Erfindung zugrundeliegende Prinzip auch als „quenching induzierte Kontakt Verdrängungs”-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (quenching induced contact competition) oder abgekürzt als Quick-FISH bezeichnet.

Beispiel 5: Nachweis von C. sakazakii in Milchpulverproben

Angelehnt an die ISO-Vornorm ISO/TS 22964: 2006-02 wurde eine Vorkultivierungsstrategie etabliert, mit der C. sakazakii in Milchpulverproben mittels Quick-FISH und Mikrotiterplatten Fluorometer-Detektion nachgewiesen werden kann. Als Vorkultivierungsdauer wird die Zeit definiert, die für das Wachstum von C. sakazakii benötigt wird, damit dieser über Kultivierung eine Konzentration erreicht, die im Nachweisbereich des Detektionssystems liegt.

Dazu wurde analog zu den Kultivierungsbedingungen gemäß ISO-Vornorm eine zweistufige Anreicherungsstrategie bestehend aus einer Voranreicherung und einer Selektivanreicherung implementiert.

Die Milchpulverproben wurden künstlich mit C. sakazakii Zellen kontaminiert (10 Zellen/100 g) und bis zur Verarbeitung vier Wochen bei 4°C gelagert. Die eingesetzte Zellzahl wurde mittels Plattierung auf Trypton-Soja-Agar bestätigt.

100 g künstlich kontaminiertes Milchpulver wurde für die Voranreicherung in gepuffertem Peptonwasser (BPW) und destilliertem Wasser (H2Odest.) resuspendiert und für 24 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Zur Selektivanreicherung wurden jeweils 0,1 ml Voranreicherung in Mossel-Anreicherungsmedium (EE-Broth) und in modifizierte Lauryl-Sulfat-Tryptose Bouillon (mLSTB) überführt und für weitere 24 h unter Schütteln bei 37°C inkubiert.

Ein Aliquot (2 ml) wurde aus jeder Selektivanreicherung entnommen, abzentrifugiert (5 min, 5000 rpm) und das Zellpellet in 100 μl EtOHabs. aufgenommen und fixiert.

Diese Fixierungen wurden für die Hybridisierung in Lösung verwendet und über eine maximale Inkubationsdauer von 4 h bei den Inkubationstemperaturen 30°C und 45°C sowie einer NaCl-Konzentration von 50 mM in modifiziertem PCR-Puffer hybridisiert (Esak997-3-TAMRA/Quen1-Esak997-3-BHQ2).

10 zeigt die erhaltenen Reaktionskinetiken für die hybridisierten Fixierungen in Abhängigkeit von der Hybridisierungstemperatur und -dauer.

Den Kurvenverläufen ist zu entnehmen, dass sowohl mittels Vorkultivierungsstrategie 1 (10, schwarze Kurven: mLSTB (Voranreicherung) und EE-Broth (Selektivanreicherung)), als auch mittels Vorkultivierungsstrategie 2 (10, graue Kurven: H2Odest. (Voranreicherung) und EE-Broth (Selektivanreicherung)), C. sakazakii in Milchpulverproben eindeutig nachweisbar war.

Bei einer Hybridisierungstemperatur von 45°C wurde die maximale Fluoreszenzintensität nach 1 h und bei 30°C nach ca. 3 h Hybridisierung erreicht.

Literaturstellen

Die folgenden Literaturstellen werden ebenso wie die in der vorstehenden Beschreibung angeführten Literaturstellen hierein durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

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  • Clementino MM, Fernandes CC, Vieira RP, Cardoso AM, Polycarpo CR, Martins OB. J: Archaeal diversity in naturally occurring and impacted environments from a tropical region Appl Microbiol. 2007 Jul; 103(1): 141–51.
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  • Bhardwaj S, Sutar R, Bachhawat AK, Singhi S, Chakrabarti A.: PCR-based identification and strain typing of Pichia anomala using the ribosomal intergenic spacer region IGS1. J Med Microbiol. 2007 Feb; 56(Pt 2): 185–9.
  • WO 2007104318 20070920 Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, Stemless Beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids
  • Thelen, K. (2002): Entwicklung eines routinetauglichen Schnellnachweises für bierschädliche Milchsäurebakterien basierend auf der FISH-Technik. Diplomarbeit an der Technischen Universität München.
  • Lakowicz J. R. (1999): Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.
  • Förster T. (1948): Intermolecular energy transference and fluorescence. Ann. Phys. 2: 55–75.
  • Marras S. A. E. (2006): Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Design and Protocols. Methods in Molecular Biology. 335: 3–16.
  • Thompson Robert C., Deo Monika and Turnerac David L. Analysis of microRNA expression by in situ hybridization with RNA oligonucleotide probes, Methods. 2007 October; 43(2): 153–161.
  • Schmid M., Schmitz-Esser S., Jetten M., and Wagner M. (2001): 16S–23S rDNA intergenic spacer and 23S rDNA of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria: implications for phylogeny and in situ detection. Environ. Microbiol. 3: 450–459.
  • Pilhofer Martin, Pavlekovic Marko, Lee Natuschka M., Ludwig Wolfgang and Schleifer Karl-Heinz. Fluorescence in situ hybridization for intracellular localization of nifH mRNA, Systematic and Applied Microbiology Sept 2008, in Press
  • Wagner M., Rath G, Amann R., Koops H. -P., and Schleifer K. -H. (1995): In situ identification of ammonia-oxidizing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 18: 251–264.

Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • - EP 00931109 [0033]
  • - WO 2007/104318 [0048]
  • - EP 04786995 [0055]
  • - WO 2007104318 [0119]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • - Wallner et al., 1995 [0003]
  • - Thelen, 2002 [0003]
  • - Amann R., und Fuchs B. (2008): Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6: 339–350 [0022]
  • - „Archaeal diversity in naturally occurring and impacted environments from a tropical region.” Clementino MM, Fernandes CC, Vieira RP, Cardoso AM, Polycargo CR, Martins OB. J Appl Microbiol. 2007 Jul; 103(1): 141–51 [0035]
  • - ”Inter- and intraspecific genomic variability of the 16S–23S intergenic spacer regions (ISR) in representatives of Acidithiobacillus thiooxidans and Acidithiobacillus ferrooxidans.” Ni YQ, Yang Y, Bao JT, He KY, Li HY. FEMS Microbiol Lett. 2007 May; 270(1): 58–66. Epub 2007 Feb 16.; [0035]
  • - ”Identification of medically important Candida and non-Candida yeast species by an oligonucleotide array.” Leaw SN, Chang HC, Barton R, Bouchara JP, Chang TC. J Clin Microbiol. 2007 Jul; 45(7): 2220–9. Epub 2007 May 16 [0035]
  • - ”PCR-based identification and strain typing of Pichia anomala using the ribosomal intergenic spacer region IGS1.” Bhardwaj S, Sutar R, Bachhawat AK, Singhi S, Chakrabarti A. J Med Microbiol. 2007 Feb; 56 (Pt 2): 185–9 [0035]
  • - Marras S. A. E., Kramer F. R., and Tyagi S. (2002): Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide grobes. Nuc. Acids Res. 30: e122 [0042]
  • - Marras et al, 2006 (aaO) [0042]
  • - Marras, 2006; Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Design and Protocols. Methods in Molecular Biology. 335: 3–16 [0044]
  • - Förster, 1948, Intermolecular energy transference and fluorescence. Ann. Phys. 2: 55–75 [0045]
  • - Lakowicz, 1999, Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY. [0045]
  • - Marras, 2006, aaO [0045]
  • - ISO-Vornorm ISO/TS 22964: 2006-02 [0110]
  • - Amann R., and Fuchs B. (2008): Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6: 339–350 [0119]
  • - Clementino MM, Fernandes CC, Vieira RP, Cardoso AM, Polycarpo CR, Martins OB. J: Archaeal diversity in naturally occurring and impacted environments from a tropical region Appl Microbiol. 2007 Jul; 103(1): 141–51 [0119]
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  • - Bhardwaj S, Sutar R, Bachhawat AK, Singhi S, Chakrabarti A.: PCR-based identification and strain typing of Pichia anomala using the ribosomal intergenic spacer region IGS1. J Med Microbiol. 2007 Feb; 56(Pt 2): 185–9 [0119]
  • - Thelen, K. (2002): Entwicklung eines routinetauglichen Schnellnachweises für bierschädliche Milchsäurebakterien basierend auf der FISH-Technik. Diplomarbeit an der Technischen Universität München [0119]
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  • - Marras S. A. E. (2006): Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes. In: Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes: Design and Protocols. Methods in Molecular Biology. 335: 3–16 [0119]
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  • - Pilhofer Martin, Pavlekovic Marko, Lee Natuschka M., Ludwig Wolfgang and Schleifer Karl-Heinz. Fluorescence in situ hybridization for intracellular localization of nifH mRNA, Systematic and Applied Microbiology Sept 2008, in Press [0119]
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