Title:
Microarray consisting of spots, at which mixture of polymerase and sequence specific primers is immobilized and coated with substrate, in which enzyme enabling sequence specific amplification is added, useful to genotype and quantify DNA
Kind Code:
A1


Abstract:
Microarray consisting of spots, at which a mixture of polymerase and sequence-specific primers is immobilized using a method and is additionally coated with a precipitation efficient substrate, in which an enzyme that enables a sequence-specific amplification e.g. MutS is added, is claimed. An independent claim is included for sequence-specific primers for recombinase polymerase amplification (RPA)-method, comprising 2A wild type sequences comprising: (a1) 2A wild type sequences comprising Cys-Ala-Gly-Ala-Cys-Ala-Ala-Cys-Gly-Thr-Ala-Ala-Gly-Thr-Gly-Thr-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Ala; (a2) 2A mutant type sequences comprising Cys-Ala-Gly-Ala-Cys-Ala-Ala-Cys-Ala-Thr-Ala-Ala-Gly-Thr-Gly-Thr-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr; (a3) 3 wild type sequences Thr-Gly-Thr-Cys-Thr-Gly-Gly-Ala-Ala-Ala-Gly-Thr-Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Thr-Thr-Thr-Ala-Gly; (a4) 3 mutant type sequences comprising Thr-Thr-Gly-Thr-Cys-Thr-Gly-Ala-Ala-Ala-Gly-Thr-Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Thr-Thr-Thr-Thr-Gly-Thr-Cys-Thr-Gly-Ala-Ala-Ala-Gly-Thr-Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Thr; (b1) 4 wild type sequences comprising Cys-Cys-Ala-Thr-Thr-Thr-Cys-Thr-Ala-Cys-Ala-Cys-Thr-Ala-Ala-Thr-Gly-Thr-Cys-Cys-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Cys-Thr-Ala-Cys-Ala-Cys-Thr-Ala-Ala-Thr-Gly-Thr-Cys-Cys-Ala-Cys; (b2) 4 mutant type sequences comprising Cys-Ala-Thr-Thr-Ala-Ala-Thr-Gly-Thr-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Cys-Cys-Gly; (b3) 5 wild type sequences comprising Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Ala-Thr-Ala-Ala-Ala-Cys-Thr-Thr-Cys-Ala-Ala-Thr-Cys-Cys-Gly-Ala-Cys-Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Ala-Thr-Ala-Ala-Ala-Cys-Thr-Thr-Cys-Ala-Ala-Thr-Cys; (b4) 5 mutant type sequences comprising Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Ala-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-Thr-Thr-Cys-Ala-Ala-Thr; (c1) 6 wild type sequences comprising Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Cys-Gly-Thr-Thr-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Ala-Cys-Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Cys-Gly-Thr-Thr-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Ala-Cys-Cys-Ala; (c2) 6 mutant type sequences comprising Ala-Thr-Gly-Gly-Cys-Ala-Thr-Thr-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Ala-Cys-Cys-Ala-Ala-Cys; (c3) 7 wild type sequences comprising Gly-Cys-Ala-Ala-Thr-Ala-Cys-Thr-Thr-Gly-Thr-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Ala-Thr-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Thr; (c4) 7 mutant type sequences comprising Thr-Thr-Gly-Cys-Ala-Ala-Thr-Ala-Cys-Thr-Thr-Gly-Thr-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Ala-Ala-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Ala-Gly; (d1) 8 wild type sequences comprising Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Gly-Gly-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-Ala-Gys-Gys-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Cys-Ala-Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Gly-Gly-Ala-Ala-Cys-Thr-GGly-Ala-Gly-Gly-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Cys; (d2) 8 mutant type sequences comprising Cys-Ala-Gly-Cys-Cys-Ala-Gly-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-Ala-Gly-Gly-Ala-Ala-Thr-Thr-Thr-Cys; (d3) 10 wild type sequences comprising Ala-Thr-Ala-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-Ala-Cys-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Cys-Cys-Ala-Ala-Thr-Ala-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Ala-Ala-Cys-Ala-Cys-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Cys; (d4) 10 mutant type sequences comprising Ala-Ala-Thr-Ala-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Cys-Ala-Cys-Ala-Thr-Ala-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-Ala-Gly-Ala-Cys-Ala-Cys-Ala; (e1) 13 wild type sequences comprising Thr-Cys-Thr-Thr-Cys-Gly-Ala-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Thr-Gly-Ala-Thr-Gly-Thr-Gly; (e2) 13 mutant type sequences comprising Ala-Ala-Thr-Gly-Ala-Gly-Thr-Cys-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Gly-Cys-Thr-Thr-Thr-Thr-Gly-Thr-Cys-Thr-Thr-Cys-Gly-Ala-Cys-Thr-Cys-Ala-Thr-Thr-Gly-Ala-Thr-Gly-Thr-Gly; (e3) A551T wild type sequences comprising Thr-Gly-Gly-Thr-Cys-Thr-Thr-Gly-Cys-Thr-Ala-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-Ala-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala-Thr-Thr-Thr-Gly-Gly-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-Cys-Thr-Ala-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-Ala-Cys-Thr-Cys-Cys; (e4) A551T mutant type sequences comprising Thr-Gly-Gly-Thr-Cys-Thr-Thr-Gly-Cys-Thr-Ala-Gly-Cys-Ala-Cys-Ala-Ala-Cys-Thr; (f1) M166C wild type sequences comprising Thr-Ala-Thr-Thr-Cys-Ala-Ala-Ala-Gly-Cys-Ala-Ala-Thr-Gly-Ala-Gly-Thr-Ala-Thr-Cys-Cys-Cys-Thr-Ala-Thr-Thr-Cys-Ala-Ala-Ala-Gly-Cys-Ala-Ala-Thr-Gly-Ala-Gly-Thr-Ala-Thr-Cys; (f2) M166V mutant type sequences comprising Thr-Ala-Thr-Thr-Cys-Ala-Ala-Ala-Gly-Cys-Ala-Gly-Thr-Gly-Ala-Gly-Thr-Ala-Thr-Cys; (f3) D949V wild type sequences comprising Thr-Ala-Cys-Ala-Cys-Ala-Thr-Thr-Thr-Cys-Thr-Thr-Cys-Ala-Thr-Cys-Ala-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Ala; and (f4) D949V mutant type sequences comprising Gly-Cys-Thr-Ala-Thr-Gly-Ala-Thr-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly.



Inventors:
Prause, Stefan, M.Sc. (55116, Mainz, DE)
Eidens, Moritz, M.Sc. (55116, Mainz, DE)
Weise, Alexander, Dipl.-Ing. (55116, Mainz, DE)
Pfützner, Andreas, Prof. Dr. med. Dr. rer.nat. (55116, Mainz, DE)
Application Number:
DE102010007548
Publication Date:
08/11/2011
Filing Date:
02/11/2010
Assignee:
PharmGenomics GmbH, 55116 (DE)
International Classes:



Claims:
1. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Polymerase und sequenz-spezifische Primer immobilisiert wurde.

2. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Polymerase und sequenz-spezifische Primer immobilisiert wurde, zusätzlich mit einem Präzipitationsfähigen Substrat beschichtet ist und bei dem eine Enzym dazugeben wurde, dass eine Sequenzspezifische Amplfikation förder, wie z. B. MutS

3. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Polymerase und sequenz-spezifische Primer immobilisiert wurde und zusätzlich mit einem PEI beschichtet ist.

4. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Aac Polymerase und sequenz-spezifische Primer designt nach der SMAP-Methode immobilisiert wurde.

5. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Bst Polymerase und Sequenz-spezifische Primer designt nach der LAMP-Methode immobilisiert wurde.

6. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Polymerase und sequenz-spezifische Primer designt nach der Helicase dependent amplification-Methode immobilisiert wurde.

7. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Recombinase Polymerase und sequenz-spezifische Primer designt nach der RPA-Methode immobilisiert wurde.

8. Microarray bestehend aus Spots, an denen mit einer Methode ein Gemisch aus Recombinase Polymerase und sequenz-spezifische Primer designt nach der RPA-Methode mit einem Ammino-Link immobilisiert wurde und mit PEI beschichtet ist.

9. Microarray nach Claim 8), welches mit einem zusätzlichen Glassslide bedeckt wird und einer Öffnung versehen ist, so dass eine Flüssigkeit (z. B. Blut) durch Kappilarkräfte eingezogen werden kann.

10. Sequenz-spezifische Primer für die RPA-Methode:

Description:

Ein Recombinase Polymerase(RP)-Primer Komplex wird auf einem Glasslide (7 × 4 cm) über einen Amminolink immobilisiert (Bild 1). Jeder Spot hat einen Abstand von 0,3 cm und beinhaltet eine unterschiedliche Sequenz für Mutationen im DPYD-Gen. Dabei beinhaltet jeweils ein Spot die Primer-Sequenz des Wild-Type-Alleles und ein anderer Spot die Sequenz des mutierten Alleles (Bild 2). Zusätzlich wird die Oberfläche des Microarrays mit PEI (Polyethyleneimine) beschichtet. Darüber hinaus kommt auf diesen Chip ein weiterer Slide (z. B. Glass), um die Aufsaugung der Reaktionslösung durch Kappilarkräfte zu ermöglichen.

Bild 1:

Bild 2:

Protokoll

Mische 20 μl Blut mit 40 μl NaOH (150 mmol/l) und 0,3 μg MutS (USB Corporation aus Cleveland, Ohio USA)+
Mische dann mit den folgenden Substanzen, um eine Lösung mit folgenden Konzentrationen zu erhalten: 100 mM Potassium acetate, 50 mM Trisacetate pH 8,3, 14 mM Magensium acetate, 5 mM dTT, 200 mM dNTPs, 50 mM Creatine phosphate (calbiochem), 2,5 mM ATP, 50 ng/μl Creatinge Kinase (Roche), 5% PEG 35,000 43 ng/μl S.au Polymerase, 600 ng/μl UvsY,.
Lass das Gemisch vom Chip aufsaugen
Inkubiere den Chip bei 37°C auf einem Heizblock für 40 min.

Auswertung

Die Auswertung erfolgt nach folgendem Schema:

a1) Präzipitation ja
a2) Präzipitation nein
→ *2A wt homozygous

a1) Präzipitation ja
a2) Präzipitation ja
→ *2A wt/mut heterzygous

a1) Präzipitation nein
a2) Präzipitation ja
→ *2A mut homozygous

Die weiteren Variationen werden nachdem Gleichen Schema ausgewertet.

g1) Präzipitation ja
g2) Präzipitation ja
→ Test valide

g1) Präzipitation ja
g2) Präzipitation nein
→ Test nicht valide

g1) Präzipitation nein
g2) Präzipitation ja
→ Test nicht valide
g1) Präzipitation nein
g2) Präzipitation nein
→ Test nicht valide Sequence Listing