Title:
Herstellung und Verwendung antibakterieller, antiproliferativer und antiphytopathogener Benzanthrine
Kind Code:
A1


Abstract:

Verbindung der allgemeinen Struktur wobei
R ein Wasserstoff-Atom (H) oder ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C20-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt, zyklisch oder teilweise ungesättigt sein kann, oder ein unsubstituierter, monosubstituierter oder mehrfach substituierter Phenylrest ist.




Inventors:
Imhoff, Johannes, Prof. Dr. (24211, Preetz, DE)
Wiese, Jutta, Dr. (23701, Eutin, DE)
Zinecker, Heidi, Dr. (24105, Kiel, DE)
Kajahn, Inga, Dr. (24214, Gettorf, DE)
Nagel, Kerstin (24357, Fleckeby, DE)
Schneemann, Imke (24105, Kiel, DE)
Application Number:
DE102010006245
Publication Date:
09/15/2011
Filing Date:
01/28/2010
Assignee:
Leibniz-Institut für Meereswissenschaften, 24148 (DE)



Foreign References:
EP01800451986-05-07
Other References:
Rasmussen et al. 1986 Benzanthrins A and B, a new class of quinine antibiotics. Journal of Antibiotics 39: 1515-6
Theriault et al. 1986 Benzanthrins A and B, a new class of quinine antibiotics. Journal of Antibiotics 39: 1509-14
DSM 347
DSM 6672
ATCC 12600
ATCC 33593
ATCC 700603
ATCC 10145
DSM 1897
DSM 2405
Mitova et al. (2008 Subinhibitory concentrations of antibiotics induce phenazine production in an marine Streptomyces sp. Journal of Natural Products 71: 824-7
Lang et al. (2007 New pentaenes from sponge-derived marine fungus Penicillium rugulosum: structure determination and biosynthetic studies. Tetrahedron 63: 11844-9)
Sahly et al. (2003 Burkholderia is highly resistent to human Beta-defensin 3. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 1739-41)
O'Brien et al. (2000 Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry 267: 5421-6)
Dengler et al. (1995 Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytoxicity assay. Anti-Cancer Drugs 6: 522-32)
Attorney, Agent or Firm:
BOEHMERT & BOEHMERT, 24105, Kiel, DE
Claims:
1. Verbindung der allgemeinen Struktur wobei
R ein Wasserstoff-Atom (H) oder ein unsubstituiertes, manosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C20-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt, zyklisch oder teilweise ungesättigt sein kann, oder ein unsubstituierter, monosubstituierter oder mehrfach substituierter Phenylrest ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten des Alkyl- oder Phenylrests ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem linearen oder verzweigten Alkylrest, einer Acylgruppe, einem Halogenrest, einer unsubstituierten oder alkylsubstituierten Aminogruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Ethergruppe und freie, sowie einer mit einer Alkylgruppe veresterten oder amidierten Carboxylgruppe.

3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Acylgruppe eine Formyl-, Acetyl-, Trichloracetyl-, Fumaryl-, Maleyl-, Succinyl-, Benzoyl-, oder eine verzweigte oder heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppe ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel (Mayamycin)einschließlich deren Diastereomere.

5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Schritte:
– Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Streptomyces auf an sich bekannte Weise und
– Isolieren der Verbindung aus dem Kulturmedium und/oder dem Bakterium.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium Streptomyces sp. HB202 ist.

7. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Antitumormittel.

8. Verwendung der Substanz nach Anspruch 7 zur Behandlung und zur Vorbeugung von Lebertumor-, Darmtumor-, Magentumor-, Lungentumor-, Brustkrebs-, Melanom-, Pankreastumor-, Nierentumorerkrankungen.

9. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Antibiotikum.

10. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Pflanzenschutzmittel.

11. Kosmetisches Produkt mit einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Benzanthrine, die Mayamycine, die zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Infektions- und Tumorkrankheiten geeignet sind. Ein weiteres Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Herstellung von Pflanzenschutzmitteln. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Produktion dieser Verbindungen durch Fermentation eines Bakteriums und chromatographische Aufreinigung aus dem Bakterienextrakt, sowie deren Verwendung als Arzneimittel, Kosmetikprodukt und Pflanzenschutzmittel.

Die Antibiotika Benzanthrin A und B wurden aus dem Bakterium Nocardia lurida isoliert (Rasmussen et al. 1986 Benzanthrins A and B, a new class of quinine antibiotics. Journal of Antibiotics 39: 1515-6) und weisen eine Wirkung gegen einige Gram-positive Bakterien jedoch nicht gegen Gram-negative Bakterien auf (Theriault et al. 1986 Benzanthrins A and B, a new class of quinine antibiotics. Journal of Antibiotics 39: 1509-14). Zusätzlich zur antimikrobiellen Wirkung ist auch die zytotoxische Wirkung dieser Substanzen aus der EP 0180045 bekannt.

Weltweit besteht ein zunehmender Bedarf an neuen Wirkstoffen für die Behandlung von Infektions- und Tumorerkrankungen. Ferner besteht ein Bedarf an neuen Verbindungen für kosmetische Produkte. Des Weiteren besteht ein Bedarf an neuen Substanzen, die als Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden können.

Damit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Benzanthrine bereitzustellen, die antibiotisch, antiproliferativ oder gegen Erreger von Pflanzenkrankheiten wirksam sind, sowie einen Weg zu ihrer Produktion aufzuzeigen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verbindung mit den Merkmalen des Hauptanspruchs gelöst. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausführungen der Erfindung wieder.

Innerhalb eines wissenschaftlichen Programms zur Isolierung von biologisch aktiven natürlichen Produkten aus Mikroorganismen haben die Erfinder das Bakterium Streptomyces sp. HB202 aus dem Schwamm Halichondria panicea isoliert und untersucht.

Durch eine Ethylacetat-Extraktion und präparative HPLC wurden aus Kulturen des Bakteriums Streptomyces sp. HB202 (Beispiele 1, 2) das erfindungsgemäße Benzanthrin Mayamycin isoliert: Mayamycin

Das erfindungsgemäße Mayamycin weist Strukturähnlichkeit mit den Benzanthrinen A und B auf. Allerdings befindet sich beim Mayamycin an Position C-1 eine Hydroxylgruppe, während bei den beiden Benzanthrinen dort ein O-glycosidisch gebundener Aminozucker lokalisiert ist. Des Weiteren sitzt der zweite Aminozucker bei den Benzanthrinen glycosylisch gebunden an C-2, während er beim Mayamycin an C-5 glycosylisch gebunden ist. Es handelt sich also beim Mayamycin um eine neue Verbindung, bei der lediglich das Grundgerüst mit den bekannten Benzanthrinen identisch ist. Mayamycin gehört somit zu einer Gruppe von Verbindungen, den Mayamycinen, der allgemeinen Struktur:

Die physikalischen Daten von Mayamycin sind in der beigefügten Tabelle 1 dargestellt, wobei diese die NMR-Daten (600 MHz, MeOD) von Mayamycin zeigt.

Die erfindungsgemäßen Substanzen haben in der spezifischen Ausführungsform Mayamycin die Fähigkeit, das Wachstum von Bacillus subtilis (DSM 347) und Staphylococcus lentus (DSM 6672) zu hemmen. Ferner weist Mayamycin eine signifikante Hemmwirkung gegen klinisch relevante Bakterienstämme wie Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Staphylococcus aureus (ATCC 33593, Methicillin-resistent), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603, ausgeweitete β-Lactamase Resistenz) sowie gegen die Biofilmbildner Staphylococcus epidermidis und Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145) (Beispiel 3; Tabelle 2). Zudem wird das Wachstum sowohl des Erregers der Akne vulgaris, Propionibacterium acnes (DSM 1897) (Beispiel 4; Tabelle 2) als auch des phytopathogenen Bakteriums Xanthomonas campestris (DSM 2405), u. a. Erreger der Adernschwärze bei Kohl, und des phytopathogenen Pilzes Phytophthora infestans, dem Erreger der Kraut- und Knollenfäule, von Mayamycin inhibiert (Beispiel 5; Tabelle 2).

Die erfindungsgemäße Substanz Mayamycin zeigt außerdem unterschiedliche, signifikante Hemmwirkungen gegen Tumorzelllinien, insbesondere gegen humanen Lebertumor-, Darmtumor-, Magentumor-, Lungentumor-, Brustkrebs-, Melanom-, Pankreastumor-, Nierentumorzelllinien (Beispiel 6; Tabelle 3).

Die Anzucht von Streptomyces sp. HB202, so wie Aufreinigung von Mayamycin aus Kulturen des Bakteriums und die Bestimmung der biologischen Aktivität werden in folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1: Biotechnologische Produktion von Mayamycin aus Streptomyces sp. HB202

Der Stamm Streptomyces sp. HB202 wurde nach Mitova et al. (2008 Subinhibitory concentrations of antibiotics induce phenazine production in an marine Streptomyces sp. Journal of Natural Products 71: 824-7) aus dem Schwamm Halichondria panicea isoliert und identifiziert. Die Kultivierung erfolgte für 7 Tage in 2 L-Penicillinkolben bei 28°C. Die Kultivierung und Produktion von Mayamycin ist gleichfalls in üblichen Fermentersystemen möglich.

Beispiel 2: Isolierung von Mayamycin aus der Bakterienkultur

Die Kulturlösung (3 L) wurde geerntet und mit dem Ultra Turrax T25 basic (IKA-Werke GmbH and Co., Staufen, Germany) mit 16000 rpm für 30 Sekunden homogenisiert und anschließend mit Ethylacetat (660 mL pro Liter Kulturlösung) extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde getrocknet, in Methanol resuspendiert und durch präparative HPLC weiter aufgereinigt:
Trennsäule: Phenomenex Gemini-NX C18 110A, 100 × 50,00 mm
Lösungsmittel: Wasser + 0,1% Ameisensäure (A), Acetonitril + 0,1% Ameisensäure (B)
Gradient: 0 min – 10% B, 17 min – 60% B, 22 min – 100% B
Flussrate: 100 mL/min.
Mayamycin (11,6 mg) eluierte nach 8,4–9,0 min.

Beispiel 3: Antibakterielle Wirkung von Mayamycin

Mayamycin inhibierte das Wachstum sowohl von Bacillus subtilis (DSM 347) als auch von Staphylococcus lentus (DSM 6672) mit einem IC50-Wert von 8 μM. Die Durchführung erfolgte nach Lang et al. (2007 New pentaenes from sponge-derived marine fungus Penicillium rugulosum: structure determination and biosynthetic studies. Tetrahedron 63: 11844-9). Die IC50-Werte für klinisch relevante Bakterienstämme betrugen 2,5 μM für Staphylococcus aureus (ATCC 12600), 1,25 μM für Staphylococcus aureus (ATCC 33593, Methicillin-resistent), 2,5 μM für Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603, ausgeweitete β-Lactamase Resistenz) sowie 0,31 μM bzw. 2,5 μM für die Biofilmbildner Staphylococcus epidermidis und Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145). Die Testungen wurden gemäß Sahly et al. (2003 Burkholderia is highly resistent to human Beta-defensin 3. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 1739-41) durchgeführt.

Beispiel 4: Antibakterielle Wirkung von Mayamycin gegen den Erreger der Akne vulgaris

Der Erreger der Akne vulgaris, Propionibacterium acnes (DSM 1897), wurde von Mayamycin mit einem IC50-Wert von 31,2 μM gehemmt. Der Test erfolgte nach Lang et al. (2007 New pentaenes from sponge-derived marine fungus Penicillium rugulosum: structure determination and biosynthetic studies. Tetrahedron 63: 11844-9).

Beispiel 5: Antibakterielle und fungizide Wirkung von Mayamycin gegen Erreger von Pflanzenkrankheiten

Das phytopathogene Bakterium Xanthomonas campestris (DSM 2405), u. a. Erreger der Adernschwärze bei Kohl, wurde von Mayamycin mit einem IC50-Wert von 30 μM inhibiert. Der Test erfolgte nach Lang et al. (2007 New pentaenes from sponge-derived marine fungus Penicillium rugulosum: structure determination and biosynthetic studies. Tetrahedron 63: 11844-9). Darüber hinaus wurde der phytopathogene Pilz Phytophthora infestans – der Erreger der Kraut- und Knollenfäule – von Mayamycin mit einem IC50-Wert von 15,2 μM gehemmmt. Der Nachweis der inhibitorischen Aktivität erfolgte in der Mikrotiterplatte. Pro Kavität wurden 190 μl einer Sporensuspension von Phytophthora infestans mit einer Konzentration von 1 × 104 Sporen/mL ausgesät. Aus einer 10 mM Mayamycin-Stammlösung in Dimethylsulfoxid wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt. Pro Kavität, wurden 10 μL eingesetzt. Die Inkubation erfolgte für 48 Stunden bei 20°C im Dunkeln. Die Messung der Absorption wurde bei 600 nm durchgeführt. Als Positivkontrolle wurden 10 μM Cycloheximid eingesetzt.

Beispiel 6: Antiproliferative Wirkung von Mayamycin

Für die Proliferations- und Zytotoxizitätsbestimmung bezüglich der Lebertumorzelllinie HepG2 und der Darmtumorzelllinie HT29 wurde die Beeinflussung der metabolischen Aktivität der Zellen mittels des CellTiter-Blue® Cell viability Assays nach O'Brien et al. (2000 Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry 267: 5421-6) untersucht. Ferner wurde die antiproliferative Wirkung auf die Zelllinien GXF251L (Magentumor), LXF529L (Lungentumor), MAXF401NL (Brustkrebs), MEXF462NL (Melanom), PAXF1657L (Pankreastumor) und RXF486L (Nierentumor) nach Dengler et al. (1995 Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytoxicity assay. Anti-Cancer Drugs 6: 522-32) ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 1: NMR-Daten (600 MHz, MeOD) von Mayamycin

Dunkelbrauner amorpher Feststoff.
Optische Aktivität: [α]25D 0° (c 0.25, MeOH)
HRESIMS: m/z 464.17072 [M + H]+ (berechnet für C26H26NO7, 464.17038)
Positionδc, mult.δH(J in Hz)COSYHMBCNOESY1156.6, qC2114.7, CH6.74, s4, 3-CH3, 12b3143.4, qC3-CH322.6, CH32.45, s2, 3, 444117.6, CH8.00, s2, 3-CH3, 4a, 5, 12b3-CH3, 2'4a139.9, qC5126.5, qCb6154.4, qCb6a119.4/138.4, qC7194.2, qC7a116.3, qC8162.9, qC9124.9, CH7.29, dd (1.2, 8.5)a107a, 111010138.8, CH7.75, dd (7.5, 8.5)a9, 118, 11, 11a9, 1111120.4, CH7.58, dd (1.2, 7.5)a107a, 9, 121011a137.9, qC12188.0, qCb12a119.4/138.4, qC12b117.8, qC2'72.8, CH5.70, dd (10.7, 2.0)3'a, 3'b4a, 5, 64, 3'b, 4', 6'3'a32.9, CH22.35, q (12.0)2', 4'2', 4', 5'4', 4'-N-CH33'b32.9, CH22.27, ddd (12.9, 2.0, 4.4)2', 4'2', 4', 5'2', 4', 4'-N-CH34'63.0, CH3.22, br, m3', 5'2', 3'a, 3'b, 4'-NCH34'-N-CH331.4, CH32.63, s4'3'a, 3'b, 4'5'74.5, CH3.41, t (9.5)4', 6'4', 6', 6'-CH34', 6', 6'-CH36'79.2, CH3.56, dq (9.5, 6.1)5', 6'-CH34', 5', 6'-CH32', 5', 6'-CH36'-CH318.7, CH31.42, d (6.1)6'5', 6'5', 6'
a J-Werte wurden in CD2Cl2 bestimmt, da die 1H-Signale in MeOD sehr breit waren
b durch HMBC-Korrelationen bestimmt Tabelle 2: IC50-Werte von Mayamycin gegen verschiedene TeststämmeTeststammIC50 [μM]Bacillus subtilis (DSM 347)8,0Staphylococcus lentus (DSM 6672)8,0Staphylococcus aureus (ATCC 12600)2,5Staphylococcus aureus (ATCC 33593)*1,25Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603)**2,5Staphylococcus epidermidis (Isolat)***0,31Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145)***2,5Propionibacterium acnes (DSM 1897)31,2Xanthomonas campestris (DSM 2405)30,0Phytophthora infestans (Isolat)15,2
* Methicillin-resistent
** ausgeweitete β-Lactamase Resistenz
*** Biofilmbildner Tabelle 3: IC50-Werte von Mayamycin gegen TumorzelllinienZelllinieIC50 [μM]HepG2Lebertumor0,2HT29Darmtumor0,3GXF251LMagentumor0,2LXF529LLungentumor0,16MAXF401NLBrustkrebs0,29MEXF462NLMelanom0,13PAXF1657LPankreastumor0,15RXF486LNierentumor0,33

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 0180045 [0002]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Rasmussen et al. 1986 Benzanthrins A and B, a new class of quinine antibiotics. Journal of Antibiotics 39: 1515-6 [0002]
  • Theriault et al. 1986 Benzanthrins A and B, a new class of quinine antibiotics. Journal of Antibiotics 39: 1509-14 [0002]
  • DSM 347 [0010]
  • DSM 6672 [0010]
  • ATCC 12600 [0010]
  • ATCC 33593 [0010]
  • ATCC 700603 [0010]
  • ATCC 10145 [0010]
  • DSM 1897 [0010]
  • DSM 2405 [0010]
  • Mitova et al. (2008 Subinhibitory concentrations of antibiotics induce phenazine production in an marine Streptomyces sp. Journal of Natural Products 71: 824-7 [0013]
  • DSM 347 [0015]
  • DSM 6672 [0015]
  • Lang et al. (2007 New pentaenes from sponge-derived marine fungus Penicillium rugulosum: structure determination and biosynthetic studies. Tetrahedron 63: 11844-9) [0015]
  • ATCC 12600 [0015]
  • ATCC 33593 [0015]
  • ATCC 700603 [0015]
  • ATCC 10145 [0015]
  • Sahly et al. (2003 Burkholderia is highly resistent to human Beta-defensin 3. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 1739-41) [0015]
  • DSM 1897 [0016]
  • Lang et al. (2007 New pentaenes from sponge-derived marine fungus Penicillium rugulosum: structure determination and biosynthetic studies. Tetrahedron 63: 11844-9) [0016]
  • DSM 2405 [0017]
  • Lang et al. (2007 New pentaenes from sponge-derived marine fungus Penicillium rugulosum: structure determination and biosynthetic studies. Tetrahedron 63: 11844-9) [0017]
  • O'Brien et al. (2000 Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry 267: 5421-6) [0018]
  • Dengler et al. (1995 Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytoxicity assay. Anti-Cancer Drugs 6: 522-32) [0018]
  • DSM 347 [0018]
  • DSM 6672 [0018]
  • ATCC 12600 [0018]
  • ATCC 33593 [0018]
  • ATCC 700603 [0018]
  • ATCC 10145 [0018]
  • DSM 1897 [0018]
  • DSM 2405 [0018]