Title:
System und Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen
Kind Code:
B4


Abstract:

System zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfassend
i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A enthaltend die zu testende Kandidatenverbindung in einem Medium;
ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B enthaltend Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung;
iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung,
wobei die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Kanalproteinkomplexe amen verbindenden Kanal ausbilden können, durch den die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B gelangen können oder umgekehrt und zumindest die Lipidmembranvesikel A synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel sind.




Inventors:
Zeilinger, Carsten, PD Dr. rer. nat. (30167, Hannover, DE)
Application Number:
DE102009052404A
Publication Date:
05/12/2011
Filing Date:
11/10/2009
Assignee:
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover, 30167 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE10339597A1N/A2005-03-31



Foreign References:
200803115782008-12-18
Attorney, Agent or Firm:
Gramm, Lins & Partner GbR, 30173, Hannover, DE
Claims:
1. System zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfassend
i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A enthaltend die zu testende Kandidatenverbindung in einem Medium;
ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B enthaltend Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung;
iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung,
wobei die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Kanalproteinkomplexe amen verbindenden Kanal ausbilden können, durch den die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B gelangen können oder umgekehrt und zumindest die Lipidmembranvesikel A synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel sind.

2. System zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfassend:
i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge eines funktionalen Kanalproteinkomplexes in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A einen Reaktionspartner I in einem Medium;
ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalprotienkomplexe in den Lipidmembranen und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvisikel B einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I zu einer nachweisbaren Reaktion führt;
iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I aus dem Lipidmembranvesikel A und dem Reaktionspartner II aus dem Lipidmembranvesikel B, wobei die Lipidmembranvesikel A und Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Proteinkomplexe einen Kanal ausbilden können, durch die die Reaktionspartner in das Innenvolumen des jeweiligen anderen Lipidmembranvesikels gelangen können;
iv) Mittel zum Einbringen der zu testenden Kandidatenverbindungen, um die Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembranen vorhandenen Kanalproteinkomplexe zu modulieren und zumindest die Lipidmembranvesikel A synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel sind.

3. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die zweite Art von Lipidmembranvesikel B eine Zelle ist, bevorzugt eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle.

4. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der funktionale Kanalproteinkomplex einer ist gebildet aus Connexinen, Pannexinen und/oder Innexinen, bevorzugt Connexine.

5. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Kanalproteinkomplexe in den Lipidmembranvesikeln A und B identisch sind.

6. System nach einem der vorherigen Ansprüche geeignet zum „high throughput Screening” von Kandidatenverbindungen.

7. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Lipidmembranvesikel A und/oder B in Form von Nanosvesikeln, bevorzugt in einer Größe von 40 bis 80 nM, vorliegen.

8. System nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel außer dem Puffer oder dem Medium nur die zu testenden Kandidatenverbindungen, die Mittel zur Bestimmung der gewünschten Wirkung beziehungsweise die Reaktionspartner vorliegen.

9. Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfassend
a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenraum die zu testenden Kandidatenverbindungen in einem Medium;
b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen;
c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A und der Lipidmembranvesikel B derart, dass die in den Lipidmembranvesikeln vorhandenen Kanalproteinkomplexe einen Kanal ausbilden, durch die die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel A gelangen können;
d) Bestimmen der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung,
wobei zumindest die Lipidmembranvesikel A synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel sind.

10. Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen zur Bestimmung der Fähigkeit dieser Kandidatenverbindungen ein Binden und gegebenenfalls Ausbilden von Kanälen (gap junctions) zu modulieren umfassend
a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und enthaltend weiterhin im Innenvolumen einen Reaktionspartner I in einem Medium;
b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I eine Reaktion eingehen kann;
c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A mit den Lipidmembranvesikein B in Anwesenheit und Abwesenheit der zu testenden Kandidatenverbindungen; und
d) Bestimmen der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, zur Bestimmung der Fähigkeit der zu testenden Kandidatenverbindungen, die Ausbildung einer Bindung und gegebenenfalls von Kanälen durch die vorhandenen im Lipidmembranvesikeln A und dem Lipidmembranvesikeil B Kanalproteinkomplexe, zu modulieren,
wobei zumindest die Lipidmembranvesikel A synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei dieses mit einem System nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Kandidatenverbindungen eine Größe von maximal 1800 Dalton aufweisen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Kanalproteinkomplexe Innexine sind und die Kandidatenverbindungen Kandidatenverbindungen für Insektizide darstellen.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Ausbildung der Kanäle zwischen den Vesikeln aufgrund der Änderung des pH-Werts und/oder der Temperatur erfolgt.

15. Lipidmembranvesikel bestehend aus Lipiden zur Ausbildung der Lipidmembran, Kanalproteinkomplexen, bevorzugt Connexonen, Innexonen oder Pannexonen, die in der Lipidmembran vorliegen und im Innenvolumen der Vesikel mindestens einen pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff, gegebenenfalls in Form seines Salzes, in einem geeigneten Medium, wobei die Lipidmembranvesikel synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel sind.

16. Lipidmembranvesikel nach Anspruch 15 in Form von Nanovesikeln, bevorzugt in einer Größe von kleiner 100 nm.

17. Verwendung der Lipidmembranvesikel nach Anspruch 15 oder 16 in pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere solchen für neurologische Anwendungen.

Description:

Die vorliegende Anmeldung betrifft in einem ersten Aspekt ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen. Genauer richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen mit Hilfe von Lipidmembranvesikeln in die die zu testenden Kandidatenverbindungen im Innenvolumen integriert sind und einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln, die in ihrem Innenvolumen Reaktionspartner zu diesen zu testenden Kandidatenverbindungen aufweisen sowie eine Einrichtung zur Bestimmung einer möglichen Reaktion der Kandidatenverbindung. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen, sowie auf Lipidmembranvesikel und ihre Anwendung auf dem medizinisch-pharmazeutischen Gebiet.

Hintergrund der Erfindung

Das Screenen und die Identifizierung von Verbindungen, sogenannten Kandidatenverbindungen, die als mögliche Wirkstoffe pharmakologisch eingesetzt werden können bzw. Leitstrukturen für solche Wirkstoffe darstellen, aber auch die Identifizierung von Targetsubstanzen, die an der Aufnahme von Wirkstoffen beteiligt sind, ist für medizinische und pharmakologische Anwendungen und medizinische Therapieansätze von hochrangigem Interesse. Dabei werden mit Hilfe von Datenbänken von chemischen oder biologischen Entitäten meist durch „high throughput Verfahren” diese Entitäten mit bekannter Struktur auf eine mögliche Wirkung im Testsystem untersucht. Insbesondere das Einbringen von Wirkstoffen in Zellen als auch die Identifizierung von Zielstrukturen, die an der Aufnahme von Wirkstoffen in die Zellen beteiligt sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Wirksamkeit von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen. Zum Einschleusen der Wirkstoffe in Zellen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Meist werden gängige Transportmechanismen der Zellen genutzt, um die Wirkstoffe in diese einzubringen, alternativ gelangen die Wirkstoffe auch selbständig über die zellulären Barrieren in die Zelle. Zu unterscheiden ist hierbei zwischen einem gerichteten und ungerichteten Einbringen der Wirkstoffe in die Zellen. Während bei ungerichteten Verfahren solche Transportmechanismen genutzt werden, die den Wirkstoff im wesentlichen in jede Zelle einbringen, finden bei der zielgerichteten Anwendung spezifische Andockmoleküle oder spezifische Targetsubstanzen Anwendung, die den Wirkstoff zielgerichtet in eine ausgewählte Gruppe von Zellen einbringen. Beispielhaft seien hier solche Hilfsmittel wie Liposomen etc. genannt. Diese werden üblicherweise für ein ungerichtetes Einbringen verwendet. Gleiches gilt für bekannte Targetmoleküle, zum Beispiel die Tat-Sequenz des HIV, Lysinsequenzen etc. Auch virale Transportmechanismen zum Einbringen von Wirkstoffen in Zellen wurden vorgeschlagen. Bei dem gerichteten Einbringen von Wirkstoffen in eine vorbestimmte Zellart wird die Tatsache ausgenutzt, dass diese spezifische Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren. Diese Moleküle werden dann zum Beispiel als Andockstationen der Transportmechanismen an die Zielzellen genutzt, um den Wirkstoff in die Zellen gezielt einzubringen.

Unterschiedliche Hüllformen oder Behälter werden derzeit verwendet, um den Inhalt in die Zelle oder in bzw. an den Zielort zu dirigieren. In den letzten Jahren wurde zum Beispiel Einschlussverfahren in Lipidmembranvesikel (Liposomen) genutzt. Diese Lipidvesikel werden zum Beispiel in Form einer Emulsion angewendet. In der Literatur sind für die oben beschriebenen Transportmechanismen zahlreiche Beispiele beschrieben, um Wirkstoffe in Zellen einzubringen. Dieses schließt auch das Gebiet der Gentherapie ein. Wie bereits oben angemerkt, sind in den meisten Fällen die Zielobjekte unbestimmt, das heißt aufgrund des ungerichteten Targetings kann der Wirkstoff in jede beliebige Zelle gelangen. Aufgrund der ungerichteten Applikation ist häufig eine sehr hohe Konzentration des Wirkstoffes notwendig beziehungsweise der Wirkstoff muss sehr lange im Körper verweilen, damit die gewünschte Wirkung erreicht wird. In den letzten Jahren werden auch Vesikelandocksysteme entwickelt, die ein gezieltes Targeting mit den Transportmechanismen ermöglichen sollen. Bisher gibt es aber ein entsprechendes zielspezifisches Perzeptionssystem nicht.

Lipidmembranvesikel sind seit langem aus der Literatur bekannt. In der EP 2 054 729 A1 werden zum Beispiel Lipidmembranvesikel beschrieben, die in ihrem Innenvolumen eine Ionenart enthalten, deren Freisetzung in dem dort beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Diese Lipidmembranvesikel weisen in ihrer Lipidmembran Ionenkanalmembranproteine auf. Solche Vesikel werden auch von Steffens M. et al., Biochemica et Biophysica Acta 1778 (2008), 1206–1212 beschrieben. Diese Veröffentlichung beschreibt Lipidmembranvesikel mit Connexin 26 Kanalmembrankomplexen. Solche Lipidmembranvesikel können zum Beispiel temperaturabhängig Markermoleküle freisetzen, die sich ansonsten im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel befinden.

Vor kurzem wurde von Kaneda M., et al., Biomaterials 30 (2009), 3971–3977 eine direkte Bildung von Proteoliposomen durch in vitro Synthese beschrieben. Weiterhin wird in dieser Veröffentlichung die zelluläre zytosolische Zufuhr mit Connexin exprimierenden Liposomen hergestellt durch in vitro Synthese ausgeführt. Dort beschriebene Liposomen enthalten eine unbestimmte Zahl von Membranproteinen, wie zum Beispiel Connexine. Diese verwendeten Liposomen werden dadurch gewonnen, dass eine in vitro Translation durchgeführt und dabei die Connexine bei Ausbildung der Liposomen in situ in diese eingebaut werden. Die Zusammensetzung des Innenvolumens der Liposomen ist dabei nicht definiert und weist unter anderem die zur in vitro Translation notwendigen Bestandteile auf. insbesondere im pharmakologischen Bereich sind die dort beschriebenen Liposomen nicht einsetzbar, da die Reinheit und die Zusammensetzung dieser so hergestellten Liposomen nicht im wünschenswerten Umfang gegeben ist. Insbesondere können die Liposomen nicht wünschenswerte DNA und RNA Komponenten aber auch andere Komponenten der in vitro Translation enthalten.

Solche Liposomen sind auch nicht für Verfahren zum Screenen und Identifizieren von Leitstrukturen, zum Beispiel im „high throughput Screening” von Bibliotheken chemischer und biologischer Entitäten, geeignet, da ihre Zusammensetzung nicht eindeutig und definiert ist. Solche Screening-Verfahren und Systeme hierfür erfordern aber die Verwendung von entsprechenden Mitteln bekannter Zusammensetzung, um die spezifische Wirkung der einzelnen Kandidatenverbindungen bestimmen zu können.

Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf, Systeme und Verfahren bereit zu stellen, die als in vitro Testsysteme beziehungsweise Verfahren geeignet sind, Kandidatenverbindungen, insbesondere in „high throughput Verfahren” zu testen. Des Weiteren besteht ein Bedarf an hochreinen Transportmechanismen zur medizinischen und pharmazeutischen Anwendung.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die Erfinder waren erfolgreich in der Bereitstellung von Verfahren und Systemen, die ein Screenen von Kandidatenverbindungen auf ihre gewünschten Wirkungen ermöglichen. Diese Kandidatenverbindungen können einerseits solche sein, die Wirkungen auf bestimmte Targetstrukturen (Zielstrukturen) aufzeigen. Andererseits können diese Kandidatenverbindungen solche sein, die zum Beispiel ein Andocken von Transportmechanismen an Zielstrukturen verhindern, Mit Hilfe der Verfahren und des Systems können zum Beispiel Leitstrukturen für pharmazeutisch wirksame Verbindungen identifiziert werden.

In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereit, umfassend

  • i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikeln A enthaltend die zu testende Kandidatenverbindung in einem Medium;
  • ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B enthaltend Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung;
  • iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung,
wobei die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Kanalproteinkomplexe einen verbindenden Kanal ausbilden können, durch den die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder umgekehrt gelangen können.

In einer alternativen Ausführungsform wird ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereitgestellt umfassend

  • i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge eines funktionalen Kanalproteinkomplexes in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A einen Reaktionspartner I in einem Medium;
  • ii) eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Bindungspartner in den Lipidmembranen und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvisikel B einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I, vorhanden im Innenvolumen der Lipidmembranvisikel A, zu einer nachweisbaren Reaktion führt;
  • iii) eine Einrichtung zur Bestimmung der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, wobei die Lipidmembranvesikel A und Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt bringen durch die Proteinkomplexe einen Kanal ausbilden können, durch die die Reaktionspartner in das Innenvolumen des jeweiligen anderen Lipidmembranvesikels gelangen können;
  • iv) Mittel zum Einbringen der zu testenden Kandidatenverbindungen, um die Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembranen vorhandenen Kanalproteinkomplexe zu modulieren.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Screenen von Kandidantenverbindungen bereitgestellt umfassend die folgenden Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenraum die zu testenden Kandidatenverbindungen in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikel B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen;
  • c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A und der Lipidmembranvesikel B derart, dass die in den Lipidmembranvesikeln vorhandenen Kanalproteinkomplexe einen Kanal ausbilden, durch die die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel A gelangen können;
  • d) Bestimmen der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung.

In einer alternativen Ausführungsform dieses Verfahrens zum Screenen von Kandidatenverbindungen erlaubt dieses Kandidatenverbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit besitzen, ein Binden von Lipidmembranvesikeln an Zielstrukturen und gegebenenfalls ein Ausbilden von Kanalkomplexen, zum Beispiel gab junctions, zu modulieren. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und enthaltend weiterhin im Innenvolumen einen Reaktionspartner I in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Proteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I eine Reaktion eingehen kann;
  • c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A mit den Lipidmembranvesikeln B in Anwesenheit und Abwesenheit der zu testenden Kandidatenverbindungen; und
  • d) Bestimmen der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, zur Bestimmung der Fähigkeit der zu testenden Kandidatenverbindungen, die Ausbildung einer Bindung und gegebenenfalls von Kanälen durch die vorhandenen im Lipidmembranvesikeln A und dem Lipidmembranvesikeln B Kanalproteinkomplexe, zu modulieren.

Weiterhin werden Liposomen enthaltend pharmazeutisch oder kosmetisch wirksame Inhaltsstoffe bereitgestellt.

Kurze Beschreibung der Abbildung

1 zeigt den funktionalen Nachweis der Ausbildung von gap junctions. Um die Docking Reaktion zu verfolgen, enthielten die Lipidmembranvesikel mit Connexin hCx26 100 mM ATP, ein Lipidmembranvesikel mit hCx26 einer zweiten Art enthielt Luciferin und Firefly-Luciferase. Bei Ausbildung von hCx26 gap junctions kommen ATP mit dem Luciferin und Luciferase in Kontakt, als Ergebnis dieser Reaktion zwischen ATP und dem Luciferin und Luciferase ist ein Biolumineszenzsignal messbar. Dargestellt in der 1 sind die verschiedenen Ansätze und das bestimmte Biolumineszenzsignal bei Ausbildung der gap junctions beziehungsweise der Kontrollansätze, in denen keine gap junctions ausgebildet wurden. Als Kontrolle wurden Liposomen ohne eingebautes hCx26 verwendet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In einem ersten Aspekt wird ein System zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereitgestellt, Dieses System erlaubt ein Screenen von Kandidatenverbindungen, zum Beispiel aus entsprechenden, chemische und/oder biologische Entitäten umfassende Bibliotheken auf eine gewünschte Wirkung. Diese gewünschte Wirkung kann zum Beispiel ein Modulieren einer Enzymaktivität sein, eine Bindung und/oder Aktivierung oder Hemmung einer Zielstruktur usw. Weiterhin sind solche Kandidatenverbindungen interessant, die durch die Kanäle (gap junctions) transportierbar sind und die gap junctions nicht beeinflussen. Solche Verbindungen, die in den Zielstrukturen eine gewünschte pharmazeutische Wirkung aufzeigen und den Transport nicht beeinflussen, sind insbesondere von Interesse, da sie für therapeutische Anwendungen mit Hilfe der erfindugnsgemäßen Lipidmembranvesikel transportiert werden können, ohne diese Transportvehikel selbst zu beeinflussen. Es können z. B. therapeutische Connexin-enthaltende Lipidmembranvesikel (therapeutische Connexosomen) bereitgestellt werden. Das erfindungsgemäße System umfasst i) eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A enthaltend die zu testende Kandidatenverbindung in einem Medium. Weiterhin umfasst das System eine zweite Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B enthaltend Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung. Das System umfasst schließlich eine Einrichtung zur Bestimmung der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung. Die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B zeichnen sich dadurch aus, dass sie bei in Kontakt bringen miteinander durch die Kanalproteinkomplexe einen verbindenden Kanal ausbilden können, durch den die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B gelangen können beziehungsweise umgekehrt die Mittel zur Bestimmung der gewünschten Wirkung in das Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A gelangen.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Medium” auf geeignete flüssige Medien und Puffer, zum Beispiel wässrige Medien oder Puffer, geeignet zur Aufnahme der Kandidatenverbindungen beziehungsweise der Wirkstoffe.

Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Systems zum Screenen von Kandidatenverbindungen umfasst eine erste Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge eines funktionalen Kanalproteinkomplexes in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel einen Reaktionspartner I in einem Medium. Weiterhin umfasst das System als zweite Art von Lipidmembranvesikel B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in den Lipidmembranen und weiterhin enthaltend im Volumen der Lipidmembranvesikel B einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I vorhanden im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel A zu einer nachweisbaren Reaktion führt. Das erfindungsgemäße System weist weiterhin eine Einrichtung zur Bestimmung der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I mit dem Reaktionspartner II aus dem Lipidmembranvesikeln auf. Diese Reaktion kann erfolgen, wenn die Lipidmembranvesikel A und die Lipidmembranvesikel B bei in Kontakt kommen durch die Membranproteinkomplexe einen Kanal ausbilden können, durch die die Reaktionspartner in das Innenvolumen des jeweiligen anderen Lipidmembranvesikels gelangen können. Das System umfasst weiterhin Mittel zum Einbringen der zu testenden Kandidatenverbindungen, um die Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembranen vorhandenen Kanalproteinkomplexe zu modulieren. Diese Kandidatenverbindungen können die Ausbildung des Kanalproteinkomplexes modulieren, indem sie ein Anbinden der Lipidmembranvesikel A an die Lipidmembranvesikel B durch die Kanalmembrankomplexe verhindern, also einen Inhibitor der Bindung darstellen, oder, andererseits, die Bindung und gegebenenfalls Ausbildung des Kanals durch die in den Lipidmembran vorhandenen Kanalproteinkomplexe fördern, also ein Verstärker der Bindung beziehungsweise Ausbildung der Kanäle. Solche Modulatoren der Bindung, wie Inhibitoren, sind z. B. Antikörper, Peptide oder chemische Entitäten.

Mit dem Ausdruck „Kandidatenverbindungen” sind alle Arten von chemischen oder biologischen Entitäten gemeint. Das heißt es kann sich sowohl um sogenannte „small molecules” handeln, also chemische Verbindungen die synthetisch hergestellt wurden, als auch um biologische Entitäten, zum Beispiel um DNA, RNA, Peptid oder Proteinmoleküle, aber auch um natürlich vorkommende Moleküle wie Steroide etc.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Systems können insbesondere Verbindungen auf ihre Fähigkeit gescreent werden, eine Bindung über das in der Lipidmembran der Lipidmembranvesikel vorhandenen Kanalproteinkomplexe an einen Bindungspartner zu hemmen oder zu fördern.

Das erfindungsgemäße System erlaubt ein entsprechendes Identifizieren von geeigneten Kandidatenverbindungen, zum Beispiel von Leitstrukturen. Diese Kandidatenverbindungen können dann entsprechend weiterentwickelt werden, um gegebenenfalls pharmazeutische Wirkstoffe herzustellen.

In einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenraum die zu testenden Kandidatenverbindungen in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikel B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen;
  • c) in Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A und der Lipidmembranvesikel B derart, dass die in den Lipidmembranvesikeln vorhandenen Kanalproteinkomplexe einen Kanal ausbilden, durch die die zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel B oder die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen in die Lipidmembranvesikel A gelangen können;
  • d) Bestimmen der gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindung.

In einer alternativen Ausführungsform zum erfindungsgemäßen Verfahren eignet sich dieses Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen zur Bestimmung der Fähigkeit dieser Kandidatenverbindungen ein Binden und gegebenenfalls ein Ausbilden von Kanälen, insbesondere von gap junctions, zu modulieren, das heißt zu hemmen oder fördern. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

  • a) Bereitstellen einer ersten Art von Lipidmembranvesikeln A enthaltend eine gegebenenfalls vorbestimmte Menge an funktionalen Kanalproteinkomplexen in der Lipidmembran und enthaltend weiterhin im Innenvolumen einen Reaktionspartner I in einem Medium;
  • b) Bereitstellen einer zweiten Art von Lipidmembranvesikeln B enthaltend funktionale Kanalproteinkomplexe in der Lipidmembran und weiterhin enthaltend im Innenvolumen einen Reaktionspartner II, der mit dem Reaktionspartner I eine Reaktion eingehen kann;
  • c) In Kontakt bringen der Lipidmembranvesikel A mit den Lipidmembranvesikeln B in Anwesenheit und Abwesenheit der zu testenden Kandidatenverbindungen; und
  • d) Bestimmen der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner I und dem Reaktionspartner II, zur Bestimmung der Fähigkeit der zu testenden Kandidatenverbindungen, die Ausbildung einer Bindung und gegebenenfalls von Kanälen durch die vorhandenen im Lipidmembranvesikeln A und dem Lipidmembranvesikeln B Kanalproteinkomplexe, zu modulieren.

Bei den Kanalproteinkomplexen, wie sie in den Lipidmembranvesikel A beziehungsweise B der Lipidmembran vorliegen, handelt es sich bevorzugt um solche gebildet aus Connexinen, Pannexinen und/oder Innexinen. Insbesondere bevorzugt sind solche gebildet aus Connexinen.

Connexine verbinden Zellen miteinander durch Ausbildung von gap junctions, die aus zwei Halbzellkanälen, den hexameren Connexonen gebildet werden, und erlauben so eine Kopplung der Zeilen. Es ist unter anderem bekannt, dass Connexine nicht nur Ionen, Nukleotide und Farbstoffe, sondern auch Peptide durchleiten können. Das heißt, die Kandidatenverbindungen, chemische oder biologische Entitäten, können vielfältiger Natur sein. Bevorzugt handelt es sich bei den Verbindungen um solche mit einer Größe bis zu 1800 Dalton, wie bis zu 1000 Dalton.

Das heißt, die vorliegende Erfindung beruht darauf, gereinigte Connexonen, Pannexonen oder Innexonen in Lipidmembranen von Lipidmembranvesikeln bereitzustellen, im Folgenden auch als Connexosomen, Pannexosomen und Innexosomen bezeichnet. Die Lipidmembranvesikel A zeichnen sich insoweit aus, dass sie eine vorbestimmte Anzahl von Kanalmembranproteinen, insbesondere hexameren Connexonen, aufweisen um dann mit einem entsprechenden Partner die gap junctions auszubilden. Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Lipidmembranvesikeln handelt es sich um synthetisch hergestellte Lipidmembranvesikel.

Bevorzugt weisen diese Lipidmembranvesikel neben dem notwendigen Puffer beziehungsweise Medium nur die Reaktionspartner, zu testenden Kandidatenverbindungen beziehungsweise die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel auf. Das heißt es liegen keine weiterem gegebenenfalls störenden Komponenten im Innenvolumen aber auch in der Lipidmembran selbst vor. Die Vesikel werden aus definierten membranbildenden Lipiden gebildet. Anschließend werden die Kanalproteine, die in einem Schritt vorher isoliert und aufgereinigt wurden, in die Lipidmembran der Vesikel eingeführt. Vor Einfügen der Kanalproteinkomplexe liegen die zu testenden Kandidatenverbindungen, die Mittel zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung beziehungsweise die Reaktionspartner im Innenvolumen der synthetisch gebildeten Lipidmembranvesikel vor. Somit können nicht definierte Komponente aus dem erfindungsgemäßen System beziehungsweise bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgeschlossen werden.

Vorteile der erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel sind u. a. die definierte Zusammensetzung und die vorbestimmte Größe. Dieses erlaubt den Einsatz im medizinischen und pharmazeutischen Bereich. Die Lipidmembranvesikel sind damit sowohl für die erfindungsgemäßen Verfahren als auch für die erfindungsgemäßen Systeme geeignet, insbesondere bei Anwendung in „high throughput Screening”. Die Connexosomen können aber auch direkt zur medizinischen Applikation von Wirkstoffen in Individuen eingesetzt werden. Dazu enthalten diese Connexosomen gegebenenfalls weitere Bestandteile, zum Beispiel Rezeptoren oder Liganden dieser Rezeptoren, die die Spezifität der Connexosomen weiter erhöht. Dadurch können Substanzen, mit denen vorher die Lipidmembranvesikel beladen wurden und Wirkstoffeigenschaften aufweisen, gezielt in andere Lipidmembranvesikel, insbesondere in Zellen, eingebracht werden.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Lipidmembranvesikel B bevorzugt um Zellen, insbesondere Säugetierzellen, wie menschliche Zellen. Bei Bindung und Ausbildung des Kanals können die in dem Lipidmembranvesikel A vorhandenen Moleküle in des Innenvolumen des zweiten Lipidmembranvesikels eingebracht werden. Handelt es sich bei diesem zweiten Membranvesikel um Zellen, so erlauben die Lipidmembranvesikel A erfindungsgemäß das Einbringen von Molekülen in das Zytoplasma der Zelle.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Kanalproteinkomplexe in den Lipidmembranvesikeln A und B identisch. Es können aber auch unterschiedliche Kanalproteinkomplexe vorliegen, die eine Ausbildung von heteromeren Kanälen erlaubt.

Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei den eingesetzten Kanalproteinkomplexen um Hexamere der Connexine, wie Connexin 26, Connexin 32 oder Connexin 43. Derzeit umfasst die Genfamilie der Connexine 21 Gene.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Lipidmembranvesikeln A und/oder B um solche in Form von Nanovesikeln, bevorzugt in einer Größe von 40 bis 80 nm. In diesen Nanovesikeln liegen die Connexone in vorbestimmter Mengen zum Beispiel in einer Menge von 2 bis 4 Connexonen vor. Dadurch ist es möglich definierte Lipidmembranvesikel bereitzustellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen erlaubt eine Bestimmung der gewünschten Wirkung dieser auf die Zielstrukturen. Diese Zielstrukturen können zellinterne Targets aller Art, wie Enzyme, Rezeptoren, Nukleinsäuren, Zucker, Lipide, Peptide, Toxine etc. sein.

Des Weiteren können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aus den Kandidatenverbindungen solche Verbindungen identifiziert werden, die die Ausbildung der Kanäle verhindern oder ein Binden der Vesikel (Andocken) verhindern. Bevorzugt dient das Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen, die ein Ausbilden von gap junctions verhindern oder fördern. Es können des Weiteren Verbindungen identifiziert werden, die besonders für das vorliegende therapeutische System der Connexosomen geeignet sind, da sie gut durch die gap junctions transportierbar sind und die Ausbildung der gap junctions nicht blocken.

Bei den Mitteln zur Bestimmung einer gewünschten Wirkung der zu testenden Kandidatenverbindungen, die im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel B vorliegen kann es sich um verschiedene Mittel handeln. Geeignete Mittel sind zum Beispiel Enzyme und deren Substrate aber auch Bindungspartner etc., wie bereits ausgeführt. Wenn es sich bei dem Lipidmembranvesikel B um Zellen handelt, können diese Mittel Zellkomponenten sein. Erfindungsgemäß können diese Kandidatenverbindungen in diesen Zellen die gewünschte Wirkung hervorrufen, zum Beispiel Zellproliferation, Zelltot, Zelldifferenzierung etc.

Alternativ können die Lipidmembranvesikel A und/oder B Reaktionspartner enthalten. Diese Reaktionspartner führen bei in Kontakt bringen miteinander eine Reaktion durch. Das sich daraus bildende Reaktionsprodukt beziehungsweise zum Beispiel die Abnahme von Reaktionspartnern kann dann mit entsprechenden Einrichtungen bestimmt werden und erlauben somit einen Nachweis für die Ausbildung von entsprechenden Bindungen beziehungsweise Ausbildung von Kanälen.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den Kanalproteinkomplexen um Innexine. Innexine werden von Invertebraten exprimiert. Die Kandidatenverbindungen sind solche, die Leitstrukturen für zum Beispiel Insektizide darstellen. Das heißt erfindungsgemäß wird ein System ein Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen als Leitstrukturen für Insektizide bereitgestellt.

Die erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel bestehen aus Lipidmembranausbildenden Lipiden, mit in die Lipidmembran integrierten Kanalproteinkomplexen, bei denen es sich bevorzugt um Connexonen, Innexonen oder Pannexonen handelt, wobei die Lipidmembranvesikel im Innenvolumen mindestens einen pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff gegebenenfalls in Form seines Salzes oder Solvates, enthalten. Diese Lipidmembranvesikel sind besonders gut in pharmazeutischen und medizinischen Anwendungen verwendbar. Aufgrund der definierten Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel können diese an Individuen verabreicht werden. Solche Lipidmembranvesikel eignen sich unter anderem auch in der Gentherapie und stellen eine hervorragende Alternative zu derzeit verwendeten Liposomen oder Transportsystemen auf viraler Basis dar. Ein Vorteil dieser erfindungsgemäßen Lipidmembranvesikel ist die definierte Zusammensetzung und insbesondere die aufgrund der definierten Zusammensetzung vorliegende geringe Immunsystem-aktivierende Wirkung. Das heißt die Abwehrreaktionen des Individuums bei einer Gentherapie können stark verringert werden. Die Lipidmembranvesikel können auch gezielt Substanzen in neoplastische Zellen einschleusen indem ungekoppelte Halbzellkanäle in den neoplastischen Zellen für das Andocken genutzt werden und dann die im Innenvolumen der Lipidmembranvesikel vorliegenden Wirkstoffe gezielt in die Zielzellen eingebracht werden können. Entsprechend können hochaktive Wirkstoffe auch in andere Zielzellen eingebracht werden, um zum Beispiel Zellproliferation, Zelltot, Zelldifferenzierung, etc auszulösen. Eine Wirkung als Kontrazeptiva ist ebenfalls möglich. Vorteil der vorliegenden Lipidmembranvesikel Ist, dass nicht nur einfache chemische Entitäten im Innenvolumen vorliegen können, sondern auch Peptid- oder Nukleotidmoleküle, wie siRNA, miRNA etc.

Die Lipidmembranvesikel eignen sich insbesondere bei dem Zuführen von neurologisch wirksamen Inhaltstoffen. Da die Lipidmembranvesikel, insbesondere wenn Sie eine Grüße von < 100 nM aufweisen, die entsprechenden Barrieren passieren können, können diese Lipidmembranvesikel gezielt pharmazeutisch aktive Wirkstoff in Bereiche einbringen, wie cerebrale Bereiche, die ansonsten nur schwer zugänglich sind.

BeispieleHerstellung von Connexonen

Als allgemeines Beispiel dient hier das humane Connexin 26, es kann aber auch jedes andere Connexin gewählt werden. Rekombinantes Connexin hCx26 wird in E. coli Zellen gemäß bekannten Verfahren als Kanalmonomer erzeugt, Steffens et al, supra. Nach Affinitätsreinigung der Proteinuntereinheiten des Connexins werden die vorhandenen Tags mittels einer Protease entfernt, so dass das entsprechende Connexinprotein als korrekt kodiertes Proteinmonomer vorliegt, Steffens et al., supra. in Gegenwart von dem Lipid POPC wird das Kanalmonomer in Kanalhexamere gefaltet. Hierbei wird ein Protein-Lipidverhältnis von 1:1 (w/w) gewählt. Als Beispiel dient 1 mg gereinigtes Kanalprotein, das von dem Tag befreit wurde und in 30 mM Octylglucosid, 150 mM NaCl und 10 mM Tris pH 8 vorliegt. Das Protein wird mit 1 mg POPC auf Eis inkubiert und anschließend gegen ein 10-faches Volumen gegen 1xPBs über Nacht bei 4°C dialysiert. Anschließend wird dieser Ansatz 5-fach verdünnt mit einem Puffer, der 30 mM OG und 1x PBS enthält, verdünnt und mittels 100 K Konzentratoren auf 1–2 mg ml–1 Kanalprotein konzentriert. Geformte Kanalhexamere lassen sich über SDS-PAGE nachweisen. Connexinhexamere werden dann über einen Zentrifugationsfilter (Amicon Y100) abgetrennt.

Herstellung von Connexosomen

Hierzu werden 10 mg ml–1 Lipid (hier POPC) in 0.2 ml Chloroform gelöst und der Lipidfilm unter N2 Gasstrom in einem Glaskolben unter Schwenken getrocknet, eventuell verbleibende Chloroformreste werden durch Anlegen eines Vakuums bei 50°C über Nach entfernt. Der getrocknete Lipidfilm wird in 1 ml Puffer, der Farbstoffe, Wirkstoffe, Nukleinsäuren oder Peptide, sowie Puffer und Salze enthält, gelöst.

Als Testsystem wird hier eine 1%ige Lucifer Yellow mit 150 mM NaCl und 10 mM Tris pH 8 verwendet. Die Lipidsuspension wird 20 Minuten in einem Ultraschallbad beschallt oder mit einer Ultraschallsonde bis die Suspension nicht mehr milchig erscheint. Anschließend wird der Ansatz über eine Sepharose 4B getrennt oder mittels einem 0.1 μm Filter filtriert. Hierbei entstehen vorwiegend kleine unilamellare Vesikel (SUV's) mit 35–80 nm Durchmesser. Die Vesikelsuspensionen (10 mg ml–1) wird anschließend mit gereinigten Connexonen inkubiert, hier 0,1 mg Connexone (–0,65 μmol), die in 30 mM Octylglucosid sowie einer entsprechenden Salz und Pufferlösungen vorliegen. Die Ansätze werden über Nacht auf Eis geschüttelt und nach Überführung in einen Dialyseschlauch 48 h gegen 21 Puffervolumen (10 mM Tris pH 8, 150 NaCl, 5 mM CaCl2) unter dreimaligem Wechsel dialysiert. Alle Arbeiten sind gekühlt bei 4°C durchzuführen. Anschließend werden die Vesikel auf Eis gekühlt bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Für Aktivitätsmessungen wurden Liposomen mit rekonstituierten Connexonen genutzt, die mit 1% Lucifer Yellow Farbstoff gefüllt sind. Die externe Messlösung enthält keinen Farbstoff. Als Messpuffer dient der entsprechende Dialysepuffer mit dem die Vesikel hergestellt wurden einschließlich 5 mM CaCl2. In die Messlösung (95 μl) werden 5 μl Vesikellösung appliziert und sofort vermischt. Die Messung wird bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt, Obwohl bei höheren Temperaturen die Kanäle aktiv sind, verhindert die Anwesenheit von Ca2+, dass Connexine mit physiologischer Orientierung Farbstoff freisetzen können. Erst unter Erniedrigung der freien Ca2+-Konzentration durch Zugabe von EDTA und Einstellung der Ca2+ Konzentration unter 100 μM, werden die Connexone aktiviert und die Kanalöffnung wird provoziert und ermöglichen einen Ionentransport (hier Farbstoff) gefolgt von einer Änderung des optischen Signals. Die Messungen werden in einem Fluorimeter entsprechend den Farbstoffeigenschaften mit Temperaturregelung in einer Mikrotiterplatte durchgeführt.

Kopplungsnachweis

Connexone sind in der Lage, Nukleotide wie ATP zu transportieren. Dies wird in dem Luciferase-Testsystem ausgenutzt, den ATP-Transport von dem einen Vesikel in das über Gap-Junction gekoppelte Nachbarvesikel nachzuweisen. Um die Kopplungsfähigkeit nachzuweisen werden zwei getrennte Liposomenpopulation hergestellt. Die eine Liposomenpopulation enthält 0,1 mM ATP, die andere Luciferin und Luciferase in entsprechenden Puffer des Herstellers, (hier Biafin). Entsprechend wird die Vesikelsuspension über eine Sepharose 4 B Säule getrennt und die Vesikelsuspension mittels eines 01, μm Filters filtriert. Nachfolgend werden die Vesikelpopulation für 20 min bei unterschiedlichen Bedingungen bei RT inkubiert. Luciferin und Luciferase enthaltende Lösungen werden auch während der Verarbeitung vor Belichtung geschützt. Die Ausbildung von Gap Junctions kann anhand des ATP-Transportes und der entstehenden Bioluminiszens in einem geeigneten Gerät (Berthold) nachgewiesen werden.

Ergebnisse

Connexin 26 wurde rekombinant in E. coli hergestellt und nach Reinigung zu einem Connexon (ein Hexamer) in Gegenwart von Lipid rekonstituiert. Um nachzuweisen, dass diese Kanalhexamere funktionell sind wurde durch die Freisetzung von Lucifer Yellow (LY) aus Connexon-haltigen Lipidvesikeln überprüft. Da Kalzium Connexone blockiert, kann die Herabsetzung der freien Kalziumkonzentration über EDTA die Connexonaktivität steuern. Dies wird ausgenutzt, um die temperaturabhängige Freisetzung von LY aus den Vesikeln über Connexone zu steuern. Befindet sich LY in den Vesikeln eingeschlossen, erhält man ein niedrigeres Floureszenssignal gegenüber freigesetzten LY. Wird eine konzentrierte EDTA-Lösung zur Vesikellösung gegeben, kann eine Freisetzung von LY und ein damit verbundener Anstieg des Fluoreszenzsignals dann detektiert werden, wenn dies auch gleichzeitig mit einer Temperaturerhöhung verbunden ist. Die Temperaturerhöhung ist der eigentliche Trigger für die Freisetzung, die Sensitivität gegenüber Ca2+ bleibt aber davon unbetroffen, so dass Inhibitoren auf diese Weise analysiert werden können. Dies zeigt, dass die gereinigten Connexone als Halbzellkanäle aktiv sind.

Um in einem Funktionstest die Kopplung zwischen zwei verschiedenen Lipidmembranvesikeln unterschiedlicher Art nachzuweisen, wurde der ATP-Transport durch ausgebildete Gap Junctions untersucht, was dann mittels Luciferin/Luciferasesystem als entstehende Bioluminiszenz beobachtet werden kann. Hierzu wurden zwei Vesikelpopulationen, die ATP und Luciferin/Luciferase enthielten in einem Kopplungspuffer gemischt. Ausgebildete Gap-Junctions ermöglichen den Transport von ATP in das benachbarte Vesikel, das zu einem Bioluminiszenzsignal führt, wenn ATP von dem Luciferin/Luciferasesystem detektiert wird.

In ist das ermittelte Biolumineszenzsignal als Funktion unterschiedlicher Inkubationsbedingungen dargestellt. Es ist zu erkennen, dass ein Absenken des pHs auf 5.5 zu einem erhöhten Biolumineszenzsignal führt, was mit der Ausbildung von Gap-Junctions einhergeht. Dagegen wurden keine Gap-Junctions ausgebildet, wenn der pH erhöht wurde oder DTT oder Mercaptoethanol zugesetzt wurde. Eine Absenkung des pH-Werts erlaubt die Ausbildung der Gap-Junctions.