Title:
Fluoreszenzfarbstoffe
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, als Fluoreszenzfarbstoffe geeignete Verbindungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von mit Chromophoren derivatisierten, pharmakologisch aktiven Verbindungen. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Anwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen.




Inventors:
Tietze, Lutz F., Prof. Dr. Dr. h.c. (Göttingen, 37077, DE)
Krewer, Birgit, Dr. (Hannover, 30519, DE)
Mitkovski, Miso, Dr. (Kaufungen, 34260, DE)
Application Number:
DE102009051438
Publication Date:
05/05/2011
Filing Date:
10/30/2009
Assignee:
Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts (Göttingen, 37073, DE)
Domestic Patent References:
DE10025329A1N/A2001-12-06



Foreign References:
WO2009017394A12009-02-05
WO2007089149A22007-08-09
WO1998011101A21998-03-19
WO1997012862A11997-04-10
WO2002059122A12002-08-01
WO2001083448A22001-11-08
Other References:
L.F. Tietze et al., Eur. J. Org. Chem. 2002, 1634-1645
Attorney, Agent or Firm:
Gramm, Lins & Partner GbR (Hannover, 30173)
Claims:
1. Verbindungen der allgemeinen Formel I oder II: mit R1 ausgewählt aus einem Halogen und OSO2Ru, wobei Ru ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituierten C1-C6 alkyl, C1-6 Perhaloalkyl, Benzyl und Phenyl;
R2 ist ausgewählt aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl; R3, R3', R4 und R4' sind unabhängig voneinander ausgewählt aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl, wobei zwei oder mehrere von R2, R3, R3', R4 und R4' gegebenenfalls miteinander verbunden sind, um ein oder mehrere gegebenenfalls substituierte Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen auszubilden;
X2 ist ausgewählt aus O, C(R14)(R14') und NR14', wobei R14 ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl und wobei R14' nicht vorhanden ist oder ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
R5 und R5', R6, R6', R7 und R7' sind unabhängig voneinander ausgewählt aus H, OH, SH, NH2, N3NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, Halogen, Rk, SRk, S(O)Rk, S(O)2Rk, S(O)ORk, S(O)2ORk, OS(O)Rk, OS(O)2Rk, OS(O)ORk, OS(O)2Rk, ORk, NHRk, N(Rk)RL, +N(Rk)(RL)Rm, P(O)(ORk)(ORL), OP(O)(ORk)(ORL), SiRkRLRm, C(O)Rk, C(O)ORk, C(O)N(RL)Rk, OC(O)Rk, OC(O)Rk, OC(O)ORk, OC(O)N(Rk)RL, N(RL)C(O)Rk, N(RL)C(O)ORk, und N(RL)C(O)N(Rm)Rk, wobei Rk, RL und Rm unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H und gegebenenfalls substituierte C1-4 Alkyl, C1-4 Heteroalkyl, C3-7 Cycloalkyl, C3-7 Heterocycloalkyl, C4-12 Aryl oder C4-12 Heteroaryl Gruppen, zwei oder mehr von Rk, RL und Rm bilden gegebenenfalls miteinander ein oder mehrere gegebenenfalls substituierte aliphatische oder aromatische Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen aus;
und/oder R5' und R6' und/oder R6' und R7' und/oder R7' und R14' sind nicht vorhanden, d. h., sie bilden eine im Ring vorhandene Doppelbildung zwischen den mit den entsprechenden substituierten Atomen aus, nämlich R5' und R6', und/oder R6' und R7', und/oder R7' und R14';
zwei oder mehrere von R5, R5', R6', R7', R14, und R14' können gegebenenfalls miteinander verbunden sein, um ein oder mehrere gegebenenfalls substituierte aliphatische oder aromatische Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen auszubilden;
und/oder R5 + R5', und/oder R6 + R6' und/oder R7 + R7' sind unabhängig voneinander =O, =S oder =NR12, wobei R12 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-6 Alkyl;
unter der Voraussetzung, dass entweder R6 und/oder R7 unabhängig voneinander eine Gruppe-(C(RCH)2)1-6-X7-Chromophor darstellt,
wobei X7 ausgewählt ist aus C=O, O, NRCH, wobei RCH ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
X6 ist ausgewählt aus C oder N;
RDB ist ausgewählt aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
X1 ist ausgewählt aus O, S, und NR13, wobei R13 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl;
R ist ausgewählt aus Wasserstoff oder ein enzymatisch abspaltbares Substrat;
a und b sind unabhängig voneinander ausgewählt aus 0 und 1;
c ist ausgewählt aus 0, 1 und 2;
d ist ausgewählt aus 0 oder 1;
DB ist Wasserstoff oder eine mit DNA in Wechselwirkung tretende Verbindung, insbesondere eine der allgemeinen Formel III wobei X3 ausgewählt ist aus O, S, und NR15, wobei R15 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl; oder -X3- ist X3a und X3b, wobei X3a verbunden ist mit dem Kohlenstoff mit dem X4 verbunden ist und X3b ist verbunden mit dem Phenylring in ortho-Position zu R10, wobei X3a ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder Acylrest und X3b ist aus der gleichen Gruppe ausgewählt wie die Reste definiert für R8, wobei X3a und X3b keine kovalente Verbindung untereinander ausbilden;
X4 ist ausgewählt aus N und CR16, wobei R16 ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
X5 ist ausgewählt aus O, S, und NR17, wobei R17 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl; R8, R9, R10, und R11 werden unabhängig ausgesucht aus H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, Halogen, Rx, SRx, S(O)Rx, S(O)2Rx, S(O)ORx, S(O)2ORx, OS(O)Rx, OS(O)2Rx, OS(O)ORx, OS(O)2ORx, ORx, NHRx, N(Rx)Ry, +N(Rx)(Ry)Rz, P(O)(ORx)(ORy), OP(O)(ORx)(ORy), SiRxRyRz, C(O)R, C(O)ORx, C(O)N(Ry)Rx, OC(O)Rx, OC(O)ORx, OC(O)N(Rx)Ry, N(Ry)C(O)Rx, N(Ry)C(O)ORx, N(Ry)C(O)N(Rz)Rx, und einer Wasser-Gruppe, wobei Rx, Ry, und Rz unabhängig ausgewählt sind aus H und optional substituierten C1-15 Alkyl-, C1-15 Heteroalkyl-, C3-15 Cycloalkyl-, C3-15 Heterocycloalkyl-, C4-15 Aryl-, oder C4-15 Heteroaryl-Resten, wobei einer oder mehrere der optionalen Substituenten in Rx, Ry, und Rz optional eine wasserlösliche Gruppe ist, und zwei oder mehr der Rx, Ry, und Rz können optional verbunden sein, um einen oder mehrere optional substituierte Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen zu bilden, und mindestens einer der Reste von R8, R9, R10, und R11 umfasst eine wasserlösliche Gruppe, zwei oder mehr der R8, R9, R10, R11, oder X3b sind optional verbunden um einen oder mehrere optional substituierte aliphatische oder aromatische Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen zu bilden;
oder pharmazeutische annehmbare Salze oder Solvate hiervon.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R ausgewählt ist aus einem Substrat, das durch proteolytische Enzyme, Plasmin, Cathepsin, Cathepsin B, beta-Glucuronidase, Galactosidase, Mannosidase, Glucosidase, Neuramidase, Saccharosidase, Maltase, Fructosidase, Glycosylasen, Prostate-specific Antigen (PSA), urokinase-Typ Plasminogen-Aktivator (u-PA), Metalloproteinase, oder ein Enzym, das gezielt mit Hilfe von gerichteter Enzym Prodrug Therapie, wie ADEPT, VDEPT, MDEPT, GDEPT, oder PDEPT gespalten werden kann; oder ein Substituent, der unter hypoxischen Bedingungen oder durch Reduktion durch Nitroreduktase abgespalten oder transformiert werden kann.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R ausgewählt ist aus einem Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid, insbesondere Hexosen, Pentosen oder Heptosen gegebenenfalls als Desoxy-Derivat oder Amino-Derivat und gegebenenfalls substituiert mit Halogen, C1-8 Alkyl, C1-8 Acyl, C1-8 Heteroalkyl, C3-7 Cycloalkyl, C3-7 Heterocycloalkyl, C4-12 Aryl oder C4-12 Heteroaryl, Amino- oder Amidgruppen, oder mit Amino-, Amido- oder Carboxyleinheiten, die gegebenenfalls substituiert sein können mit Halogen, C1-8 Alkyl, C1-8 Acyl, C1-8 Heteroalkyl, C3-7 Cycloalkyl, C3-7 Heterocycloalkyl, C4-12 Aryl oder C4-12 Heteroaryl, Amino- oder Amidresten; Dextran, Dipeptid, Tripeptid, Tetrapeptid, Oligopeptid, Peptidomimetika, oder einem Antikörper, oder Kombinationen hiervon.

4. Verbindungen nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei diese eine der allgemeinen Formeln I ist, wobei DB ausgewählt ist aus einem Rest der allgemeinen Formel III, wobei R8, R9, R10, oder R11 ausgewählt sind aus 2-(morpholino-4-yl)ethoxy, (1-methylpiperidin-4-yl)methoxy, 2-(N,N-dimethylamino)ethoxy, 2-(N,N-dimethylamino)acetylamino, 2-(methylamino)ethoxy, 2-(methylamino)acetylamino, 2-aminoethoxy, 2-aminoacetylamino, (piperidin-4-yl)methoxy, 2-(N-methyl-N-(carboxymethyl)amino)ethoxy, und 2-(N-methyl-N-(2-methoxy-2-oxoethyl)amino)ethoxy oder Wasserstoff und das in R6 und/oder R7 vorhandene Chromophor ist ein Dapoxyl-Derivat.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei diese eine Verbindung der allgemeinen Formel II ist, wobei das Chromophor von R6 und/oder R7 ein Dapoxyl-Derivat ist und wobei DB ein Rest der allgemeinen Formel III ist mit R8, R9, R10, oder R11 ausgewählt aus 2-(morpholino-4-yl)ethoxy, (1-methylpiperidin-4-yl)methoxy, 2-(N,N-dimethylamino)ethoxy, 2-(N,N-dimethylamino)acetylamino, 2-(methylamino)ethoxy, 2-(methylamino)acetylamino, 2-aminoethoxy, 2-aminoacetylamino, (piperidin-4-yl)methoxy, 2-(N-methyl-N-(carboxymethyl)amino)ethoxy, und 2-(N-methyl-N-(2-methoxy-2-oxoethyl)amino)ethoxy oder Wasserstoff.

6. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei diese sind:

7. Verbindung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei R6 und/oder R7 , wenn sie ein Chromophor-enthaltende Gruppe darstellen, ausgewählt sind aus Dapoxyl-3-Sulfonamidpropionat, Dapoxyl-3-Sulfonamidbutyrat, Dapoxyl-3-sulfonamide, 4',6-diamidino-2-phenylindol, bisbenzimid, 2,5'-Bi-1H-benzimidazole, 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl).

8. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere als Marker in bildgebenden Verfahren.

9. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kombination mit mindestens einem zweiten Farbstoff in Fluoreszenz-basierten Methoden.

10. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Fluoreszenz-basierten Methoden im Dualexitations- und Dualemmissionmodus.

11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Unterscheidung von lebenden, apoptotischen und toten Zellen sowie zur Zellsortierung und Zelltrennung.

12. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur selektiven Markierung von Organellen in Zellen, insbesondere Organellen der Endo- und Exozytose, bevorzugt Lysosomen, Endosomen; sowie von Mitochondrien.

13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in der bildgebenden Diagnose, Prognose, Verlauf und Wirkstoffeffektivitätsbestimmung von Mitochondrien-assoziierten Krankheiten oder von Therapien mit Wirkstoffen.

14. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngigen Nukleinsäuren.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, als Fluoreszenzfarbstoffe geeignete Verbindungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von mit Chromophoren derivatisierten, pharmakologisch aktiven Verbindungen. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Anwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Stand der Technik

Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe stellen ein wichtiges Werkzeug zur Darstellung und Nachweis von Strukturen, Zuständen und Veränderungen gerade im Life-Science-Bereich dar. Es wurden bereits eine Vielzahl von Farbstoffen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen, beschrieben, die in bildgebenden Methoden und zur Darstellung von Strukturen, zur Markierung von Molekülen usw. eingesetzt werden.

Diese Farbstoffe können an weitere Strukturen, wie Proteine, Nukleinsäuren oder andere chemische oder biologische Entitäten kovalent gekoppelt sein. Solche Verbindungen werden z. B. dann in diagnostischen Anwendungen eingesetzt. Viele Fluoreszenzfarbstoffe bauen dabei z. B. auf Fluorescein- oder Rhodamin-Strukturen auf. Es sind mittlerweile aber auch eine Vielzahl anderer Fluoreszenzfarbstoffe mit fluorophoren Gruppen beschrieben. Hierzu wird z. B. auf das Buch: The Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes – Invitrogen, 10th Edition, verwiesen. Dieses Werk stellt umfassend die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe und deren Konjugation an gewünschte chemische oder biologische Entitäten dar.

Die Farbstoffe Hoechst 33342 oder Hoechst 33258 sind bekannte Verbindungen, die an DNA binden bzw. mit der DNA interkalieren. In der Literatur sind viele weitere DNA-bindende Entitäten beschrieben. Diese als DNA-Binder oder DNA-interkalierende Verbindungen bezeichneten Verbindungen finden sich z. B. in der WO 02/059122, WO 98/11101, WO 97/12862, WO 01/83448 oder WO 2007/089149. Die dort beschriebenen Moleküle, z. B. in der WO 2007/089149, auf die hiermit vollständig Bezug genommen wird, umfassen entsprechende DNA-bindende Einheiten in Verbindung mit pharmakophoren Bestandteilen.

So zeigte sich, dass Pyrroloindol-Derivate als Analoga des pharmakologischen Wirkstoffs CC-1065 in Kombination mit dem DNA-bindenden Rest DMAI, 5'[2'(N,N-dimethylamino)ethoxy]-indol, hervorragende zytotoxische Eigenschaften aufzeigen, wobei der DMAI-Anteil eine hervorragende DNA-interkalierende Wirkung bzw. DNA-bindende Wirkung zeigt. Entsprechende Verbindungen sind z. B. in der WO 01/83448 und der WO 2007/089149 beschrieben. Diese Dokumente beschreiben weiterhin entsprechende seco-Verbindungen und Prodrugs dieser CC-1065-Analoga. Prodrugs sind insbesondere notwendig, um die pharmakologische Aktivität des Pharmakophors nur im Zielbereich wirken zu lassen. Es ist seit langem bekannt, entsprechende Prodrugs einzusetzen, die dann am Zielort in pharmakologisch wirksame Verbindungen umgewandelt werden. Diese Umwandlung kann z. B. säurekatalysiert sein oder enzymatisch oder in anderer Weise erfolgen. Solche Prodrugs und Wirkstoffe auf Basis von Grundkörpern verschiedener CC-1065 Analoga sind beschrieben, siehe z. B. WO 2007/089149 und WO 01/83448, WO 98/11101.

Zur Markierung von einzelnen Bereichen einer Zelle, z. B. zellulären Organellen der Endo- und Exozytose, sind verschiedene Farbstoffe bekannt. Diese werden z. B. in dem oben genannten Handbuch für Fluoreszenzproben und Labelling Technologien beschrieben. Eine Vielzahl unterschiedlichster Moleküle sind dargestellt. Diese werden z. B. als Lyso-Tracker, ER-Tracker usw. von der Firma Invitrogen, USA, kommerziell vertrieben. Alternativ hierzu gibt es molekularbiologische Verfahren, z. B. Plasmide oder Vektoren, die entsprechende auf Fluorosenz-basierende Marker in die Zielbereiche einbringen.

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf neue als Farbstoffe geeignete Verbindungen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, zur Markierung von Zellstrukturen, Zellveränderungen und Zellzuständen.

Beschreibung der vorliegenden Erfindung

In einem ersten Aspekt werden Verbindungen der allgemeinen Formeln I oder II bereitgestellt: mit R1 ausgewählt aus einem Halogen und OSO2Ru, wobei Ru ausgewählt ist aus gegebenenfalls substituierten C1-C6 alkyl, C1-6 Perhaloalkyl, Benzyl und Phenyl;
R2 ist ausgewählt aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl; R3, R3', R4 und R4' sind unabhängig voneinander ausgewählt aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl, wobei zwei oder mehrere von R2, R3, R3', R4 und R4' gegebenenfalls miteinander verbunden sind, um ein oder mehrere gegebenenfalls substituierte Kohlenstoffzyklen oder Heterozykien auszubilden;
X2 ist ausgewählt aus O, C(R14)(R14') und NR14', wobei R14 ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl und wobei R14' nicht vorhanden ist oder ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
R5, R5', R6, R6', R7 und R7' sind unabhängig voneinander ausgewählt aus H, OH, SH, NH2, N3NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, Halogen, Rk, SRk, S(O)Rk, S(O)2Rk, S(O)ORk, S(O)2ORk, OS(O)Rk, OS(O)2Rk, OS(O)ORk, OS(O)2Rk, ORk, NHRk, N(Rk)RL, +N(Rk)(RL)Rm, P(O)(ORk)(ORL), OP(O)(ORk)(ORL), SiRkRLRm, C(O)Rk, C(O)ORk, C(O)N(RL)Rk, OC(O)Rk, OC(O)Rk, OC(O)ORk, OC(O)N(Rk)RL, N(RL)C(O)Rk, N(RL)C(O)ORk, und N(RL)C(O)N(Rm)Rk, wobei Rk, RL und Rm unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H und gegebenenfalls substituierte C1-4 Alkyl, C1-4 Heteroalkyl, C3-7 Cycloalkyl, C3-7 Heterocycloalkyl, C4-12 Aryl oder C4-12 Heteroaryl Gruppen, zwei oder mehr von Rk, RL und Rm bilden gegebenenfalls miteinander ein oder mehrere gegebenenfalls substituierte aliphatische oder aromatische Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen aus;
und/oder R5' und R6'und/oder R6' und R7' und/oder R7 und R14' sind nicht vorhanden, d. h., sie bilden eine im Ring vorhandene Doppelbildung zwischen den mit den entsprechenden substituierten Atomen aus, nämlich R5' und R6', und/oder R6' und R7', und/oder R7' und R14';
zwei oder mehrere von R5, R5', R6', R7, R14, und R14' können gegebenenfalls miteinander verbunden sein, um ein oder mehrere gegebenenfalls substituierte aliphatische oder aromatische Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen auszubilden;
und/oder R5 + R5', und/oder R6 + R6' und/oder R7 + R7' sind unabhängig voneinander =O, =S oder =NR12, wobei R12 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-6 Alkyl;
unter der Voraussetzung, dass entweder R6 und/oder R7 unabhängig voneinander eine Gruppe-(C(RCH)2)1-6-X7-Chromophor darstellt,
wobei X7 ausgewählt ist aus C=O, O, NRCH, wobei RCH ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
X6 ist ausgewählt aus C oder N;
RDB ist ausgewählt aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
X1 ist ausgewählt aus O, S, und NR13, wobei R13 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl;
R ist ausgewählt aus Wasserstoff oder ein enzymatisch abspaltbares Substrat;
a und b sind unabhängig voneinander ausgewählt aus 0 und 1;
c ist ausgewählt aus 0, 1 und 2;
d ist ausgewählt aus 0 oder 1;
DB ist Wasserstoff oder eine mit DNA in Wechselwirkung tretende Verbindung, insbesondere eine der allgemeinen Formel III wobei X3 ausgewählt ist aus O, S, und NR15, wobei R15 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl; oder -X3- ist X3a und X3b, wobei X3a verbunden ist mit dem Kohlenstoff mit dem X4 verbunden ist und X3b ist verbunden mit dem Phenylring in ortho-Position zu R10, wobei X3a ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder Acylrest und X3b ist aus der gleichen Gruppe ausgewählt wie die Reste definiert für R8, wobei X3a und X3b keine kovalente Verbindung untereinander ausbilden;
X4 ist ausgewählt aus N und CR16, wobei R16 ausgewählt ist aus Wasserstoff und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl;
X5 ist ausgewählt aus O, S, und NR17, wobei R17 ausgewählt ist aus H und gegebenenfalls substituierten C1-8 Alkyl oder C1-8 Acyl; R8, R9, R10, und R11 werden unabhängig ausgesucht aus H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, Halogen, Rx, SRx, S(O)Rx, S(O)2R, S(O)ORx, S(O)2ORx, OS(O)Rx, OS(O)2Rx, OS(O)ORx, OS(O)2ORx, ORx, NHRx, N(Rx)Ry, +N(Rx)(Ry)Rz, P(O)(ORx)(ORy), OP(O)(ORx)(ORy), SiR RyRz, C(O)Rx, C(O)ORx, C(O)N(Ry)Rx, OC(O)Rx, OC(O)ORx, OC(O)N(Rx)Ry, N(Ry)C(O)Rx, N(Ry)C(O)ORx, N(Ry)C(O)N(Rz)Rx, und einer Wasser-Gruppe, wobei Rx, Ry, und Rz unabhängig ausgewählt sind aus H und optional substituierten C1-15 Alkyl-, C1-15 Heteroalkyl-, C3-15 Cycloalkyl-, C3-15 Heterocycloalkyl-, C4-15 Aryl-, oder C4-15 Heteroaryl-Resten, wobei einer odermehrere der optionalen Substituenten in Rx, Ry, und Rz optional eine wasserlösliche Gruppe ist, und zwei oder mehr der Rx, Ry, und Rz können optional verbunden sein, um einen oder mehrere optional substituierte Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen zu bilden, und mindestens einer der Reste von R8, R9, R10, und R11 umfasst eine wasserlösliche Gruppe, zwei oder mehr der R8, R9, R10, R11, oder X3b sind optional verbunden, um einen oder mehrere optional substituierte aliphatische oder aromatische Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen zu bilden;
oder pharmazeutische annehmbare Salze oder Solvate hiervon.

Bevorzugt handelt es sich bei diesen Verbindungen um solche CC-1065-Analoga, wie sie z. B. in der WO 2007/089149 und WO 01/83448 offenbart sind, auf die hiermit vollständig Bezug genommen wird. Die vorliegenden Verbindungen zeichnen sich dadurch aus, dass sie einen DNA-bindenden Bereich, einen pharmakophoren Anteil sowie einen fluorophoren Anteil aufweisen.

Überraschend wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen spezifisch in bestimmten sub-zellulären Bereichen von Zellen aufgrund ihrer Fluoreszenz nachweisbar sind. Um so überraschender zeigte es sich, dass die mit einem fluorophoren Bestandteil ausgestatteten erfindungsgemäßen Verbindungen DNA-enthaltende Strukturen, wie den Zellkern einer Zelle, nicht farblich markieren obwohl sie DNA-bindende Domänen besitzen. Überraschend zeigte sich, dass bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Zellkern keine erwartete Färbung aufzeigt, während eine Fluoreszenzmarkierung insbesondere in zellulären Organellen der Endo- und Exozytose aber auch der Mitochondrien beobachtet werden konnte. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind daher insbesondere bei bildgebenden Methoden geeignet. Diese bildgebenden Methoden sind insbesondere lichtmikroskopische und Fluoreszenz-basierende Methoden.

Unter dem Ausdruck „zelluläre Organellen der Endo- und Exozytose” sind insbesondere die zellulären Strukturen Golgi-Apparat, endoplasmatisches Retikulum, Lysosomen, Endosomen, Mikrokörperchen, Peroxisomen, Mikrosomen, Glyoxysomen und Zellenmembranen zu verstehen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen des Weiteren eine spezifische Anfärbung von Mitochondrien. Sie sind deshalb insbesondere auch geeignet für die Verwendung in der bildgebenden Diagnose, Prognose, Verlauf und Wirkstoffeffektivitätsbestimmung von Mitochondrien-assoziierten Krankheiten und zur Bestimmung der Diagnose, Prognose, Verlauf und Wirkstoffeffektivitätsbestimmung von Therapien mit Wirkstoffen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen erlauben des Weiteren den Einsatz dieser in Kombination mit anderen bekannten Fluoreszenzfarbstoffen, um so eine Mehrfachmarkierung verschiedener Organellen zu erreichen. So können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit z. B. DNA-interkalierenden Verbindungen aber auch in Kombination mit entsprechenden Molekülen, die z. B. spezifisch Lysosomen, Endosomen oder andere subzelluläre Strukturen markieren, Mehrfachfärbungen erfolgen. Beispielhaft sei eine Kombination der erfindungsgemäßen Verbindungen mit Systemen von Invitrogen, USA, wie Lyso-Tracker, ER-Tracker oder Mito-Tracker genannt. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit Hoechst Farbstoffen oder Propidiumjodid eingesetzt werden.

So können die erfindungsgemäßen Verbindungen bei Untersuchungen mit Hilfe von bildgebenden Methoden, insbesondere auf Fluoreszenz-basierende Methoden, wie Fluorometer, Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie, wie FACS, eingesetzt werden. Aufgrund der spezifischen Färbung von Mitochondrien kann des Weiteren eine spezifische Markierung von Mitochondrien in Kombination mit anderen Farbstoffen erfolgen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen erlauben eine Markierung bei kurzer Inkubationszeit.

In Abhängigkeit der Substituenten, insbesondere in Abhängigkeit des Substituenten R, können die Verbindungen einfach und gerichtet in Zellen eingebracht werden. Bevorzugt ist dabei R Wasserstoff.

Gerade bei der Untersuchung von Veränderungen der mitochondrialen Morphologie sind die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders geeignet. Eine Veränderung der mitochondrialen Morphologie spielt eine Rolle in Myopathien und Neuropathien, verschiedenen Krebsformen, Diabetes, Fettleibigkeit und Alterungsprozesse. Entsprechend kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen eine Detektion solcher Veränderungen der mitochondrialen Morphologie erfolgen.

Beispielhaft können aufgrund des Vorhandenseins der z. B. enzymatisch abspaltbaren Substrate R die erfindungsgemäßen Verbindungen derart eingesetzt werden, dass sie eine Unterscheidung von lebenden, apoptotischen Zellen und toten Zellen erlauben. Während lebende Zellen und apoptotische Zellen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen angefärbt werden und diese durch ein Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden können, ist in toten Zellen kein deutliches Signal nachzuweisen. Dieses ist der Fall, wenn R ein Wasserstoff ist. Wenn R ein anderes Substrat als Wasserstoff ist, können die erfindungsgemäßen Verbindungen nur langsam in lebende Zellen eindringen. In tote Zellen sind diese Verbindungen aber schnell nachweisbar. Erfindungsgemäß sind die Verbindungen der allgemeinen Formel I oder II daher insbesondere geeignet, zwischen lebenden, apoptotischen und toten Zellen zu unterscheiden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen erlauben weiterhin qualitativ und quantitativ Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngige Nukleinsäuren, zu bestimmen.

Die vorliegenden Verbindungen haben z. B. über den bekannten auf Plasmiden oder Vektoren basierenden Systemen, wie z. B. das pEGFP-Endo-System von CloneTech den Vorteil, dass keine Zelltransfektion notwendig ist. Dadurch sind die Färbeprozeduren wesentlich weniger arbeitsintensiv und schneller.

Erfindungsgemäß ist das Chromophor eine Komponente oder eine Einheit, die für das prinzipielle Vorhandensein der Farbigkeit sorgt. Diese Farbigkeit kann durch Reflektion und Streuung des Umgebungslichtes, durch Absorption eines Teils des Lichtes oder durch Emission von Licht bestimmter Wellenlänge nach Anregung der Chromophore durch Licht einer anderen Wellenlänge erfolgen. Bei dem Licht kann es sich sowohl um sichtbares als auch um nicht sichtbares Licht handeln.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Verbindungen der allgemeinen Formel I und II bereitgestellt, die ein Dapoxylchromophor aufweisen. In diesem Zusammenhang wird unter dem Ausdruck „Dapoxyl” die folgende Einheit verstanden: (4-[5[4-(dimethylamino)phenyl]-2-oxazolyl]-benzen) oder auch benannt als 2-Phenyl-5-(4-N,N-dimethylaminophenyl)oxazol. Dieser Dapoxylrest kann entsprechend derivatisiert sein, um eine Kopplung mit anderen chemischen Resten zu ermöglichen. Typische Derivate schließen ein: -3-Sulfonamidpropionat-Dapoxylderivate, -3-Sulfonamidbutyrat-dapoxylderivate, -3-sulfonamid-Dapoxylerivate, etc.

Diese Chromophoreinheiten, insbesondere die Dapoxyl-Chromophore, weisen einen großen Stokes-Shift auf, mit einer ersten Anregung bei 378 nm und einer Emission bei 500 nm und einer zweiten Anregung bei 514 nm und einer Emission bei 560 nm. Die Verbindungen zeigen des Weiteren eine hohe Intensität der Emission auf.

Dadurch eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen insbesondere bei Verfahren im Dualexzitations- und Dualemissionsmodus z. B. mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Hierdurch lässt sich z. B. qualitativ und quantitativ die Zellvitalität bestimmen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist R Wasserstoff.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat R um ein abspaltbares Substrat. Dieses abspaltbare Substrat ist bevorzugt eines, dass durch proteolytische Enzyme, Plasmin, Cathepsin, Cathepsin B, beta-Glucuronidase, Galactosidase, Mannosidase, Glucosidase, Neuramidase, Saccharosidase, Maltase, Fructosidase, Glycosylasen, Prostatespecific Antigen (PSA), urokinase-Typ Plasminogen-Aktivator (u-PA), Metalloproteinase, oder ein Enzym, das gezielt mit Hilfe von gerichteter Enzym Prodrug Therapie, wie ADEPT, VDEPT, MDEPT, GDEPT, oder PDEPT gespalten werden kann; oder ein Substituent, der unter hypoxischen Bedingungen oder durch Reduktion durch Nitroreduktase abgespalten oder transformiert werden kann.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Rest R um einen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Monosaccharid, Disaccharid oder Oligosaccharid, insbesondere Hexosen, Pentosen oder Heptosen gegebenenfalls als Desoxy-Derivat oder Amino-Derivat und gegebenenfalls substituiert mit Halogen, C1-8 Alkyl, C1-8 Acyl, C1-8 Heteroalkyl, C3-7 Cycloalkyl, C3-7 Heterocycloalkyl, C4-12 Aryl oder C4-12 Heteroaryl, Amino- oder Amidgruppen, oder mit Amino-, Amido- oder Carboxyleinheiten, die gegebenenfalls substituiert sein können mit Halogen, C1-8 Alkyl, C1-8 Acyl, C1-8 Heteroalkyl, C3-7 Cycloalkyl, C3-7 Heterocycloalkyl, C4-12 Aryl oder C4-12 Heteroaryl, Amino- oder Amidresten; Dextran, Dipeptid, Tripeptid, Tetrapeptid, Oligopeptid, Peptidomimetika, oder einem Antikörper oder einem Antikörperfragment, oder Kombinationen hiervon.

Mit Hilfe des Substrats R ist ein Targeting der erfindungsgemäßen Verbindungen an Zielstrukturen möglich. D. h., es ist ein zielgerichtetes Koppeln der erfindungsgemäßen Verbindungen an Zielstrukturen und ein entsprechendes Einbringen dieser erfindungsgemäßen Verbindungen in z. B. ausgewählte Zellen und Zellarten möglich. Die erfindungsgemäßen Verbindungen worin R ein Substrat außer H ist, weisen eine abspaltbare oder transformierbare Gruppe auf. Das Abspalten oder die Transformation der erfindungsgemäßen Verbindung mit R außer H kann durch chemische, photochemische, physikalische, biologische oder enzymatische Prozesse unter den entsprechenden Bedingungen erfolgen. Diese Bedingungen umfassen z. B. die Bereitstellung entsprechender Enzyme, die Änderung des umgebenen Milieus, das Einwirken von z. B. Strahlung, wie UV-Licht usw. Dem Fachmann sind entsprechende Verfahren bekannt. Das Substrat ist entsprechend zugänglich für bekannte Verfahren wie ADEPT (Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy, PDEPT (Polymer-Directed Enzyme Prodrug Therapy) oder MDEPT (Macromolecular-Directed Enzyme Prodrug Therapy), VDEPT (Virus-Directed Enzyme Prodrug Therapy) oder GDEPT (Gen-Directed Enzyme Prodrug Therapy).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist R weiterhin ein Dextran. Insbesondere für eine zeitliche und räumliche Detektion der Endozytose wird eine Dextran aufweisende erfindungsgemäße Verbindung bereitgestellt.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Verbindung eine der allgemeinen Formel I, wobei DB ausgewählt ist aus einem Rest der allgemeinen Formel III, wobei R8, R9, R10, oder R11 ausgewählt sind aus 2-(morpholino-4-yl)ethoxy, (1-methylpiperidin-4-yl)methoxy, 2-(N,N-dimethylamino)ethoxy, 2-(N,N-dimethylamino)acetylamino, 2-(methylamino)ethoxy, 2-(methylamino)acetylamino, 2-aminoethoxy, 2-aminoacetylamino, (piperidin-4-yl)methoxy, 2-(N-methyl-N-(carboxymethyl)amino)ethoxy, und 2-(N-methyl-N-(2-methoxy-2-oxoethyl)amino)ethoxy oder Wasserstoff und das in R6 und/oder R7 vorhandene Chromophor ist ein Dapoxyl-Derivat.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Verbindung eine der allgemeinen Formel II, wobei das Chromophor von R6 und/oder R7 ein Dapoxyl-Derivat ist und wobei DB ein Rest der allgemeinen Formel III ist mit R8, R9, R10, oder R11 ausgewählt aus 2-(morpholino-4-yl)ethoxy, (1-methylpiperidin-4-yl)methoxy, 2-(N,N-dimethylamino)ethoxy, 2-(N,N-dimethylamino)acetylamino, 2-(methylamino)ethoxy, 2-(methylamino)acetylamino, 2-aminoethoxy, 2-aminoacetylamino, (piperidin-4-yl)methoxy, 2-(N-methyl-N-(carboxymethyl)amino)ethoxy, und 2-(N-methyl-N-(2-methoxy-2-oxoethyl)amino)ethoxy oder Wasserstoff.

Besonders bevorzugte Verbindungen sind die im Folgenden dargestellten Verbindungen IV, V, VI, VII:

Insbesondere die Dapoxyl-Derivate erlauben die Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in verschiedenen Methoden aufgrund ihres großen Stokes-Shift.

Überraschenderweise zeigte sich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen, wenn diese mit Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngigen Nukleinsäuren, interagieren, im sichtbaren Licht aufgrund ihrer Farbigkeit nicht detektierbar sind, hingegen in anderen sub-zellulären Bereichen Licht emittieren (fluoreszieren).

Entsprechend können die erfindungsgemäßen Farbstoffe, insbesondere als Marker in bildgebenden Verfahren eingesetzt werden. Diese Marker eignen sich zur selektiven Markierung von verschiedensten subzellulären Bereichen.

Eine qualitative und quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngige Nukleinsäuren, ist ebenfalls möglich. Mit einem kompetetiven Verfahren mit einer zweiten DNA-bindenden Verbindung kann eine Bestimmung des Gehalts bzw. der Menge an Nukleinsäuren erfolgen.

Der Ausdruck „substituiert”, wie er hierin insbesondere in Bezug auf Alkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Acyl verwendet wird, bezieht sich darauf, dass diese Gruppen ein oder mehrere Substituenten ausgewählt aus der Gruppe umfassend OH, =O, =S, =NRh, =N-ORh, Sh, NH2, NO2, NO, N3, CF3, CN, OCN, SCN, NCO, NCS, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, Halogen, Rh, SRh, S(O)Rh, S(O)ORh, S(O)2Rh, S(O)2ORh, OS(O)Rh, OS(O)ORh, OS(O)2Rh, OS(O)2ORh, OP(O)(ORh)(ORh), P(O)(ORh)(ORi), ORh, NHRi, N(Rh)Ri, +N(Rh)(Ri)Rj, Si(Rh)(Ri)Rj, Si(Rh)(Ri)(Rj), C(O)Rh, C(O)ORh, C(O)N(Ri)Rh, OC(O)Rh, OC(O)ORh, OC(O)N(Rh)Ri, N(Ri)C(O)Rh, N(Ri)C(O)ORh, N(Ri)C(O)N(Ri)Rh, und die Thioderivate dieser Substituenten, oder eine protonierte oder deprotonierte Form dieser Substituenten, wobei Rh, Ri, und Rj unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H and gegebenenfalls substituierte C1-15 Alkyl, C1-15 Heteroalkyl, C3-15 Cycloalkyl, C3-15 Heterocycloalkyl, C4-15 Aryl, oder C4-15 Heteroaryl oder ein Kombination hiervon, zwei oder mehr von Rh, Ri, und Rj sind gegebenenfalls miteinander verbunden, um ein oder mehrere Kohlenstoffzyklen oder Heterozyklen auszubilden.

Der Ausdruck „Alkyl”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoff-Substituenten, Beispiele der Alkylgruppen schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Isopropyl, sec-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Iso-Pentyl, Vinyl, Allyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, Isobutenyl, Pentenyl und dergleichen.

Der Ausdruck „Cycloalkyl” oder „Kohlenstoffzyklen”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf gesättigte oder ungesättigte, nicht aromatische Kohlenwasserstoffzyklen, die aus eins, zwei oder mehr Ringen bestehen können. Beispiele hiervon schließen ein: Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclopentenyl, Cyclopentadienyl, Cyclohexyl, Cyclohexonyl, usw.

Der Ausdruck „Heteroalkyl”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoff-Substituenten, in denen mindestens ein Kohlenstoff durch ein Heteroatom ersetzt ist. Die Heteroatome sind bevorzugt ausgewählt aus S, N, O, und P.

Der Ausdruck „Aryl”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf aromatische Substituenten, die aus ein oder mehreren miteinander fusionierten Ringen bestehen können. Beispiele für Aryl schließen ein: Phenyl, Naphtyl und Antracenyl.

Der Ausdruck „Heteroaryl”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf aromatische Substituenten, die aus ein oder mehreren miteinander fusionierten Ringen bestehen können. Hierbei ist mindestens ein Kohlenstoffatom der aromatischen R-Gruppe durch ein Heteroatom ersetzt. Beispiele für Heteroarylgruppen schließen ein: Pyridinyl, Furanyl, Pyrrolyl, Triazolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Thiophenyl, Indolyl, Benzofuranyl, Benzimidazolyl, Indazolyl, Benzotriazolyl, Benzisoxazolyl, und Chinolinyl.

Der Ausdruck „Heterocycloalkyl” oder „Heterozyklen”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf gesättigte oder ungesättigte, nicht aromatische zyklische Kohlenwasserstoff-Substituenten, die aus ein oder mehreren miteinander fusionierten Ringen bestehen können, dabei ist mindestens ein Kohlenstoff in einem der Ringe durch ein Heteroatom ersetzt. Beispiele für Heterocycloalkyle schließen ein: Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, 1,4-Dioxanyl, Morpholinyl, Piperazinyl, Oxyzolidinyl, Decahydrochinolinyl.

Wenn Ausdrücke wie „gegebenenfalls substituiert” verwendet werden, beziebeziehen sich diese Ausdrücke auf alle sich anschließenden Reste solange nicht anders ausgeführt. D. h., der Ausdruck „gegenbenenfalls substituierte Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Acyl” ist als „gegebenenfalls substituierte Alkyl, gegebenenfalls substituierte Heteroalkyl, gegebenenfalls substituierte Aryl, gegebenenfalls substituierte Acyl” zu lesen.

Pharmazeutisch annehmbare Salze sind insbesondere Säureadditionssalze, die entsprechend an Amingruppen ausgebildet werden. Genauso sind Basenadditionssalze möglich oder entsprechende Zwitteradditionssalze.

Der Ausdruck „pharmazeutisch annehmbare Solvate”, bezieht sich auf die Assoziierung von ein oder mehreren Lösungsmittelmolekülen und einer erfindungsgemäßen Verbindung. Beispiele für solche Lösungsmittelmoleküle, die pharmazeutisch annehmbare Solvate ausbilden, schließen ein: Wasser, Isopropylalkohol, Ethanol, Methanol, DSMO, Ethylacetat und Essigsäure.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, Kombinationen von CC-1065 Analoga und Chromophoren, erlauben eine Mehrfachfarbenmarkierung verschiedener Organellen, wobei ein nachträgliches Waschen der Proben nicht notwendig ist. Aufgrund des großen Stoke-Shifts können die Farbstoffe auf unterschiedliche Art und Weise eingesetzt werden. Die Farbstoffe erlauben eine Unterscheidung von lebenden und toten Zellen.

Kurze Beschreibung der Abbildungen:

1 zeigt ein Schema der Kupplung des Galactosides (–)-(1S,10R)-2 mit dem NHS-aktivierten Fluoreszenzfarbstoff D10162 (3) zum fluoreszenzmarkierten Prodrug (–)-(1S,10R)-4.

2 zeigt ein Schema der Abspaltung der Zuckereinheit im fluoreszenzmarkierten Prodrug (–)-(1S,10R)-4 zum entsprechenden fluoreszenzmarkierten seco-Drug-Hydrochlorid (1S,10R)-5.

3 zeigt die Absorptionsspektren des fluoreszenzmarkierten seco-Drugs (1S,10R)-5 bezüglich einer Fluoreszenzemission von λem = 500 nm und λem = 560 nm nach 24 h Inkubation in a) Wasser oder b–d) einer wässrigen Lösung isolierter zellulärer DNA der Konzentration 7.5 μg/mL (b), 15 μg/mL (c) bzw. 30 μg/mL (d).

4 zeigt die zeitliche Änderung der Intensität der Fluoreszenzemission von Hoechst 33342 nach Zugabe zu einer wässrigen Lösung isolierter zellulärer DNA (Konzentration: 3 μg/mL) ohne oder mit vorheriger Inkubation der DNA mit dem fluoreszenzmarkierten seco-Drug (1S,10R)-5.

5 stellt fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der zwei Zelltypen, die nach Inkubation der Zellen (A549) mit dem seco-Drug (1S,10R)-5 unterschieden werden können. a) vitale und tote Zellen, λem = 500 nm (im Original blau); b) vitale Zellen, λem = 560 nm (im Original gelb); c) Überlagerung der Emissionen bei λem = 500 nm (blau) und λem = 560 nm (gelb) dar.

6 zeigt fluoreszenzmikroskopische Aufnahme vitaler und toter Zellen (A549) nach Inkubation mit (1S,10R)-5. a) λexc = 405 nm, λem = 460–500 nm, Darstellung in blau: durch Hoechst 33342 (8) gefärbte Zellkerne und durch 5 gefärbte zytosolische Organellen; b) λexc = 514 nm, λem = 560 nm, Darstellung in grün: durch (1S,10R)-5 gefärbte Mitochondrien vitaler Zellen (obere 2/3 der Zellen); c) λexc = 633 nm, dem = 680 nm, Darstellung in rot: durch MitoTracker® Deep Red (9) gefärbte Mitochondrien vitaler Zellen (obere 2/3 der Zellen); d) λexc = 561 nm, λem = 630 nm, Darstellung in hellblau: durch Trypanblau gefärbte Zellmembranen vitaler Zellen (obere 2/3 der Zellen) und angefärbtes Zytosol toter Zellen (unteres 1/3 der Zellen); e) Überlagerung der Fluoreszenz von (1S,10R)-5 (grün) und MitoTracker Deep Red 9 (rot) zu gelb; f) Überlagerung von a–d.

Im Folgenden wird die Erfindung mit Hilfe der Beispiele näher erläutert, ohne dass die Erfindung auf diese beschränkt ist.

Beispiel 1Materialien:

Die verwendeten Zelllinien sind über ATCC beziehbar und wurden in den empfohlenen Medien kultiviert.
Kulturmedium für A549: DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) mit 4.5 g/l Glucose (Biochrom, T043-10). Das Medium wurde mit 4 mM L-Glutamin und 3.7 g/l Natriumhydrogencarbonat supplementiert.
Medium-Zusätze: 10% FKS (Fötales Kälberserum) der Firma Biochrom, 30 min inaktiviert bei 56°C.
Enzym: β-D-Galactosidase (E. C. 3.2.1.23) von Eschericha coli G 5635 (Sigma), Aktivität: 250–600 Einheiten (Units (U)) pro mg Protein bei pH 7.3 und 37°C, 1 U = 1 μmol Substratumsatz pro Minute.
PBS-Puffer: Lösung der PBS-Trockensubstanz (Phosphate Buffered Saline) der Firma Biochrom KG in bidestilliertem Wasser. Salzkonzentrationen in der Pufferlösung mit pH 7.4: 137.0 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.1 mM KH2PO4.
Trypanblau: Gebrauchsfertige Lösung der Firma Biochrom von 0.5% (w/v) Trypanblau in physiologischer Kochsalzlösung.
Fluoreszenzfarbstoff der Verbindungen (–)-(1S,10R)-4 und (1S,10R)-5: Zur Kupplung des Farbstoffs Dapoxyl®-3-Sulfonamidpropionsäure an die freie Aminofunktionalität in (–)-(1S,10R)-1 diente der Dapoxyl®-3-Sulfonamidpropionsäure-succinimidylester D10162 (3) der Firma Invitrogen.
Mitochondrien-selektiver Fluoreszenzfarbstoff: Zum Anfärben der Mitochondrien vitaler Zellen diente MitoTracker® Deep Red 633 FM (9) der Firma Invitrogen.
Zellkern-selektiver Fluoreszenzfarbstoff: Zum Anfärben der Kern-DNA diente Hoechst 33342 (8) der Firma Sigma-Aldrich.
Fluoreszenzmarkierung der Endosomen: Endozytotische Vesikel wurden durch die Expression des Vektors pEGFP-Endo (Clontech, Katalognr. 6935-1) in adhärenten Zellen visualisiert. Die Transfektion erfolgte mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) nach dem mitgelieferten Protokoll.
Bildgebungspuffer: Mit NaOH auf pH 7.4 titrierte Lösung von NaCl (135 mM), KCl (5.37 mM), MgCl2 (1.66 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (10 mM) und Glukose (5.55 mM) in bidestilliertem Wasser.
Fluoreszenzmikroskopie: Verwendung fanden ein Konfokales Laserscanning-Mikroskop des Typs Leica SP2 der Firma Leica, ein Spinning-Disc-Mikroskop des Typs UltraVIEW VoX der Firma Perkin Elmer und ein mit einer Hamamatsu ORCA-ER Kamera ausgestattetes inverses Weitfeld-Mikroskop des Typs Zeiss Axiovert 200M der Firma Zeiss. Die Bearbeitung der Daten nach der Datenerfassung erfolgte mit den Programmen ImageJ, Imaris 6.2, Volocity und IgorPro 4.05A Carbon.

Die Detektion der Fluoreszenzemission des Farbstoffs Hoechst 33342 am Weitfeld-Mikroskop erfolgte mit einem 10-fach Objektiv des Typs Plan-Neofluar 10x/0.30 Ph1 und dem Filter Set 49 (DAPI) der Firma Zeiss.
Fluorimetrie: Zur Aufnahme der Anregungs- und Emissionsspektren diente ein Spektrofluorometer Quants Master der Firma PTI (Photon Technology International) ausgerüstet mit 2 Photomultiplier Detektoren 814 der Firma PTI. Verwendung fanden das Programm FeliX32 und eine Präzisionsküvette (Schichtdicke: 10 mm) der Firma Hellma. Zur Aufnahme des Absorptionsspektrums des Prodrugs (–)-(1S,10R)-4 diente zudem ein Spektrometer Cary 5E der Firma Varian und zur Aufnahme des Emissionsspektrums ein Spektrometer Fluorolog der Firma Jabin Yvon.
Präparative HPLC: Präparative Trennungen wurden auf einem HPLC-System der Firma Jasco, ausgestattet mit zwei Lösungsmittelpumpen Modell PU-2087 PLUS und einem UV-Detektor Modell UV-2075 PLUS, vorgenommen. Eingesetzt wurden eine Fertigsäule Chiralpak® IA (250 × 20 mm, Partikelgröße: 5 μm) sowie eine Fertigsäule des Typs Kromasil 100 C18 (7 μm, 250 × 20 mm) der Firma Jasco in Verbindung mit einer Vorsäule des Typs Kromasil 100 C18 (5 μm, 50 × 20 mm) der Firma Jasco. Als Lösungsmittel dienten n-Heptan, n-Hexan und Dichlormethan in HPLC-Qualität (Chiralpak® IA) sowie bidestilliertes Wasser (Zusatz von 0.1 Vol.-% Trifluoressigsäure zur Peptidsynthese) und Acetonitril bzw. Methanol in HPLC-Qualität (Kromasil 100 C18). Alle Proben wurden membranfiltriert und die Lösungsmittel entgast.

Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität bei festgelegter Wellenlänge in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge (Absorption-Scan)

1 Aliquot der Stammlösung (c = 1 mM) der zu untersuchenden Substanz in DMSO (2 μL, 2 nmol) wurde im gewählten Lösungsmittel (200 μL, Lösungsmittel: Methanol, Bildgebungspuffer oder Wasser) gelöst, die Lösung mit einem Vortexgerät durchmischt und in eine Quarz-Küvette pipettiert. Mit einem Fluorimeter wurde die Fluoreszenzintensität der Emissionen bei λem = 500 nm und λem = 560 nm für einen Anregungswellenlängenbereich von λexc = 200–600 nm gemessen.
Parameter: Excitation scan, digital cfg, Exc.: 200–600 nm, length: 400 nm, Em1: 500 nm, Em2: 560 nm, Step size: 5 nm (bzw. 1 nm), Integration: 1 sec, Averages: 1.

Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Messung des Fluoreszenzemissionsspektrums bei festgelegter Anregungswellenlänge (Emission-Scan)

1 Aliquot der Stammlösung (c = 1 mM) der zu untersuchenden Substanz in DMSO (2 μL, 2 nmol) wurde im gewählten Lösungsmittel (200 μL, Lösungsmittel: Methanol, Bildgebungspuffer oder Wasser) gelöst, die Lösung mit einem Vortexgerät durchmischt und in eine Küvette pipettiert. Mit einem Vortexgerät durchmischt und in eine Küvette pipettiert. Mit einem Fluorimeter wurde die Fluoreszenzintensität bei einer Anregung mit Laserlicht der Wellenlänge λexc = 350 nm (bzw. 378 nm, 405 nm oder 514 nm) für einen Emissionsbereich von λem = 400–800 nm gemessen.
Parameter: Emission scan, digital cfg, Exc.: 350 nm (bzw. 378 nm, 405 nm oder 514 nm), Em1 und Em2: 400–800 nm, Step size: 5 nm, Integration: 1 sec, Averages: 1.

Beispiel 1Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden gemäß dem in der 1 gezeigtem Schema synthetisiert.

Synthese von (–)-{3-[4-(5-(4-Dimethylaminophenyl)oxazol-2-yl)benzolsulfonylamino]propionsäure-[(1S,10R)-1-(10-chlor-ethyl)-3-[(5-(2-(N,N-dimethylamino)et hoxy)indol-2-yl)carbonyl]-5-O-β-D-galactopyranosyl-1,2-dihydro-3H-benz[e]indol-7-ylmethyl]amid-trifluoracetat), (–)-(1S,10R)-4

Zu einer Lösung des NHS-Esters (3) (12.3 mg, 24.0 μmol, 1.0 Äq.) in absolutem DMF (200 μL) wurde eine Lösung des Galactosides (–)-(1S,10R)-2 (25.0 mg, 27.9 μmol, 1.2 Äq.) und i-Pr2NEt (23.0 μL, 139 μmol, 5.8 Äq.) in absolutem DMF (150 μL) getropft. Nach 9 h Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung mit bidestilliertem Wasser (0.1% TFA, 3.0 mL) und CH3CN (2.5 mL) verdünnt. Je 2 mL dieser Lösung wurden in das präparative HPLC-System injiziert. Fraktioniertes Auffangen des Eluats, Entfernung der Lösungsmittel unter vermindertem Druck sowie Entfernung des restlichen Lösungsmittels mittels Gefriertrocknung lieferte das fluoreszenzmarkierte glykosidische Prodrug (–)-(1S,10R)-4 als gelben Feststoff (27.8 mg, 21.5 μmol, 89%). Eine Aufreinigung des Prodrugs (–)-(1S,10R)-4 erfolgte mittels präparativer HPLC unter den folgenden Bedingungen: HPLC (präparativ):

Säule:Kromasil 100 C18Gradient:Zeit [min]H2O (0.1% TFA)/CH3CN083/170–6083/17 → 50/5060–7050/50 → 83/17Fluss:12 ml min–1tR:38.5 minFraktion:38.0–41.0 min
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, 80°C): δ = 1.63 (d, J = 6.6 Hz, 3H, 11-H3), 2.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H, 2S-H2), 2.93 (s, 6H, 2''-NMe2), 2.98 (s, 6H, 12#-NMe2), 3.14 (t, J = 7.4 Hz, 2H, 3S-H2), 3.48 (dd, J = 9.6, 3.2 Hz, 1H, 3'''-H), 3.52–3.57 (m, 3H, 5'''-H, 2''-H2), 3.60 (dd, J = 10.6, 5.5 Hz, 1H, 6'''-Ha), 3.69 (dd, J = 10.6, 7.2 Hz, 1H, 6'''-Hb), 3.81–3.86 (m, 2H, 2'''-H, 4'''-H), 4.20 (dt, J = 9.4, 2.6 Hz, 1H, 1-H), 4.36 (t, J = 5.0 Hz, 2H, 1''-H2), 4.42 (mc, 2H, 12-H2), 4.62 (dd, J = 11.0, 2.6 Hz, 1H, 2-Ha), 4.70 (dd, J = 11.0, 9.4 Hz, 1H, 2-Hb), 4.79 (dq, J = 6.6, 3.0 Hz, 1H, 10-H), 4.92 (d, J = 7.8 Hz, 1H, 1'''-H), 6.83 (d, J = 9.0 Hz, 2H, 2 × Ar-H), 7.01 (dd, J = 9.0, 2.2 Hz, 1H, 6'-H), 7.12 (d, J = 2.0 Hz, 1H, 3'-H), 7.28 (d, J = 2.2 Hz, 1H, 4'-H), 7.45–7.48 (m, 2H, 7'-H, 8-H), 7.54–7.56 (m, 2H, 3S-NH, 8#-H), 7.65 (d, J = 9.0 Hz, 2H, 2 × Ar-H), 7.89 (d, J = 8.5 Hz, 1H, 9-H), 7.96 (d, J = 8.4 Hz, 2H, 2 × Ar-H), 8.18 (s, 1H, 12-NH), 8.20–8.23 (m, 4H, 4-H, 6-H, 2 × Ar-H), 9.64 (sbr, 1H, NH+), 11.5 (s, 1H, 1'-NH).
13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ = 23.4 (C-11), 35.5 (C-2S), 38.7 (C-3S), 40.1 (12#-NMe2), 42.5 (C-12), 42.9 (2''-NMe2), 46.0 (C-1), 52.0 (C-2), 55.7 (C-2''), 59.5 (C-6'''), 61.4 (C-10), 62.7 (C-1''), 67.5 (C-4'''), 70.5 (C-2'''), 73.1 (C-3'''), 75.2 (C-5'''), 101.8 (C-9b), 102.1 (C-1'''), 104.0 (C-4'), 105.4 (C-3'), 112.1 (2 × Ar-C), 113.3 (C-7'), 114.6 (CF3CO2), 115.6 (C-6'), 118.9 (C-5a), 121.4 (C-8#), 121.7 (C-4, C-6), 122.7 (C-7), 123.3 (C-9), 125.5 (2 × Ar-C), 126.1 (2 × Ar-C), 127.4 (C-8), 127.4 (2 × Ar-C), 128.5 (C-4#), 130.2 (C-9#), 131.2 (C-9a), 132.0 (C-3a'), 134.7 (C-7a'), 141.1 (C-2', C-1#), 141.6 (C-3a), 150.1 (C-7#), 152.0 (C-12#), 152.7 (C-5'), 153.4 (C-5), 157.5 (C-5#, 1'-C=O), 160.0 (CF3CO2), 169.6 (2S-C=O).
MS (ESI): m/z (%) = 1066.4 (100) [M-CF3CO2]+, 533.7 (80) [M-CF3CO2+H]2+, 452.7 (41) [M-CF3CO2-C6H11O5+H]2+C56H61ClF3N7O14S (1180.64).ber.: 1066.3782gef.: 1066.3778, [M-CF3CO2]+ (ESI-HRMS).

Beispiel 2Umwandlung der Prodrug-Verbindungen in seco-Drug Verbindungen am Beispiel von 3-[4-(5-(4-Dimethylaminophenyl)oxazol-2-yl)benzolsulfonylamino]-propionsäure-[(1S,10R)-1-(10-chlor-ethyl)-3-[(5-(2-(N,N-dimethylamino)ethoxy )indol-2-yl)carbonyl]-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benz[e]indol-7-ylmethyl]amid-Hydrochlorid, (1S,10R)-5

Eine Lösung des fluoreszenzmarkierten Prodrugs (–)-(1S,10R)-4 (5.0 mg, 3.9 μmol) in Methanol (3 mL) wurde mit konz. HCl (0.3 mL) versetzt und die Reaktionsmischung 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand in Methanol gelöst und mittels präparativer HPLC das Produkt vom Edukt getrennt. Das restliche Edukt wurde in Methanol (4 mL) gelöst, mit konz. HCl (4 mL) versetzt und 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und erneut das restliche Edukt mittels präparativer HPLC vom Produkt getrennt. Vereinigung der Produktfraktionen lieferte das Zielmolekül (1S,10R)-5 (2.6 mg, 2.7 μmol, 69%) als gelben Feststoff.
HPLC (präparativ):

Säule:Kromasil 100 C18Gradient:Zeit [min]H2O (0.06% konz. HCl)/ MeOH0–2050/50 → 25/7520–230/10023–250/100 → 50/5025–3050/50Fluss:18 ml min–1tR:15 minFraktion:14.2–17.0 min
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ = 1.61 (d, J = 6.7 Hz, 3H, 11-H3), 2.37 (t, J = 7.2 Hz, 2H, 2S-H2), 2.88 (d, J = 5.0 Hz, 6H, 2''-NMe2), 2.98 (s, 6H, 12#-NMe2), 3.07 (dt, J = 7.2, 6.0 Hz, 2H, 3S-H2), 3.54 (mc, 2H, 2''-H2), 4.14 (mc, 1H, 1-H), 4.33–4.41 (mc, 4H, 1''-H2, 12-H2), 4.56 (dd, J = 11.0, 2.0 Hz, 1H, 2-Ha), 4.68–4.76 (m, 2H, 2-Hb, 10-H), 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 2H, 2 × Ar-H), 7.00 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H, 6'-H), 7.16 (d, J = 1.8 Hz, 1H, 3'-H), 7.26 (d, J = 2.4 Hz, 1H, 4'-H), 7.39 (dd, J = 8.5, 1.4 Hz, 1H, 8-H), 7.44 (d, J = 9.0 Hz, 1H, 7'-H), 7.62 (s, 1H, 8#-H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H, 2 × Ar-H), 7.79 (t, J = 6.0 Hz, 1H, 3S-NH), 7.84 (d, J = 8.5 Hz, 1H, 9-H), 7.94–7.99 (m, 4H, 4-H, 6-H, 2 × Ar-H), 8.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H, 2 × Ar-H), 8.45 (t, J = 6.0 Hz, 1H, 12-NH), 10.2, 10.3 (2 × sbr, 2H, OH, NH+), 11.6 (s, 1H, 1'-NH).
MS (ESI): m/z (%) = 904.3 (100) [M-Cl]+. C48H51Cl2N7O7S (940.93).ber.: 904.3254gef.: 904.3250, [M-Cl]+ (ESI-HRMS).

Beispiel 3Bestimmung der Absorptionsspektren der erfindungsgemäßen Verbindungen bei Interaktion mit DNA

1 Aliquot der Stammlösung (c = 10 mM) der jeweils zu untersuchenden Substanz ((1S,10R)-4 oder (1S,10R)-5 in DMSO (2 μL, 20 nmol) wurde mit einer Lösung zellulärer oder plasmidischer DNA in bidestilliertem Wasser (400 μL) oder mit bidestilliertem Wasser (400 μL) versetzt. Die Konzentration zellulärer DNA betrug 30 μg/mL, 15 μg/mL oder 7.5 μg/mL und die Konzentration plasmidischer DNA 32 μg/mL. 1 Aliquot (200 μL) der Reaktionslösung wurde sofort tiefgefroren und das andere Aliquot (200 μL) 24 h bei 25°C inkubiert und anschließend tiefgefroren. Zum Vergleich wurden die Lösungen der reinen zellulären oder plasmidischen DNA mit DMSO (200 μL, 1% DMSO, Konzentration der zellulären DNA: 30 μg/mL, 15 μg/mL oder 7.5 μg/mL, Konzentration der plasmidischen DNA: 32 μg/mL) verwendet. Die Ergebnisse für die Verbindung 5 sind in der 3 dargestellt. Deutlich ist eine Abnahme der Emission bei 560 nm nach Anregung bei 525 nm zu erkennen.

Beispiel 4Bestimmung der kompetitiven Interaktion der erfindungsgemäßen Verbindungen mit bekannten DNA Farbstoffen

Die nach Beispiel 3 untersuchten Lösungen wurden mit Wasser (800 μL) verdünnt und mit einem Aliquot einer Lösung des Kernfarbstoffs Hoechst 33342 in Wasser (1 μL, Konzentration der Stammlösung: 18 μM, 18 pmol) versetzt (cfinal = 18 nM). Die Lösung wurde kurz mit dem Vortexgerät durchmischt, in eine 1 cm-Küvette mit Rührvorrichtung pipettiert und umgehend (1–2 min nach dem Ansatz) unter ständigem Rühren die zeitliche Änderung der Fluoreszenzemission bei λem = 500 nm und λem = 560 nm für eine Anregung bei λexc = 365 nm, 405 nm und 514 nm aufgezeichnet.
Parameter: Exc. 365 nm: Em1: 500 nm, Em2: 560 nm; Exc. 405 nm: Em1: 500 nm, Em2: 560 nm; Exc. 514 nm: Em1: 500 nm, Em2: 560 nm; Messung: 1 sec, alle 60 sec; Messzeit: 3661 sec; Integration: 1 sec.

Wie in der dargestellt nahm bei einer Lösung mit unbehandelter DNA in Wasser die charakteristische Fluoreszenz für den Hoechstfarbstoff auf das Doppelte der Anfangsintensität zu. Wurde die DNA-Lösung zuvor fünf Stunden mit der Verbindung 5 inkubiert, so erfolgte der Anstieg der Intensität langsamer und erreichte nicht die gleiche Intensität. Bei einer 24stündigen Vorinkubation konnte nur noch eine sehr geringe Zunahme detektiert werden.

Beispiel 5Differenzierte Färbung toter und lebender Zellen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen

Als Zelllinie diente das adhärent wachsende humane Bronchialkarzinom der Linie A549. Die Aussaat der Tumorzellen erfolgte in D10F (DMEM mit Zusatz von 10% fötalem Kälberserum, 44 mM NaHCO3 und 4 mM Glutamin) in einer Konzentrationen von 25 × 103 Zellen in 500 μL Medium pro Kammer des Deckgläschens (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide mit 4 wells auf Permanox®). Die Zellen wurden für 24 h bei 37°C und 7.5% CO2 adheriert. Alternativ wurden die Zellen in einer Konzentration von 5 × 103 Zeilen in 500 μL Medium pro Kammer des Deckgläschens ausgesät und für 3 Tage bei 37°C und 7.5% CO2 adheriert.

Die vorbereiteten Zellen wurden mit serumfreiem UltraCulture® Medium (2 × 1 mL) gewaschen und mit einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO und UltraCulture® Medium (500 μL, 1% DMSO) oder mit einer Lösung aus DMSO in UltraCulture® Medium (500 μL, 1% DMSO) versetzt. Die Konzentration der Verbindungen in der Inkubationslösung betrug 10 μM ((1S,10R)-4 oder (1S,10R)-5 oder 25 nM (9). Nach einer bestimmten Inkubationszeit (45 min – 2.5 h) bei 37°C und 7.5% CO2 wurden die Zellen mit UltraCulture® Medium (1 mL) und optinal mit Bildgebungspuffer (2 × 1 mL) gewaschen und im Bildgebungspuffer mittels eines konfokalen Fluoreszenzmikroskopes untersucht.

In der 5 sind die Ergebnisse für die Verbindung 5 dargestellt. Mit Hilfe einer Trypanblau-Färbung konnten hier zwei Zellpopulationen unterschieden werden (nicht dargestellt):
Bei dem ersten Zelltyp handelte es sich um tote Zellen, die mit Trypanblau angefärbt werden konnten. Sie zeigten nur bei einer Anregung mit Laserlicht der Wellenlänge λexc = 405 nm eine blaugrüne Fluoreszenzemission, die recht diffus im Zytosol der Zellen, aber auch in kleinen runden Strukturen sichtbar war (). Diese Zellen erschienen im Durchlicht bläulich, hatten einen rötlichen Zellkern und neigten zum Ausbilden von Membranausstülpungen. Zellen des zweiten Zelltyps waren vital und wirkten im Durchlicht bräunlich. Hier erfolgte bei einer Anregung mit λexc = 405 nm eine blaugrüne Fluoreszenzemission mit einem Maximum bei λem = 500 nm und bei λexc = 514 nm eine gelbgrüne Fluoreszenzemission mit einem Maximum bei λem = 560 nm (). Es ist also eine Unterscheidung zwischen toten und lebenden Zellen möglich.

Mehrfachfärbung mit Hoechst 33342, Mito-Tracker und der Verbindung 5

Um die Frage zu klären, ob es sich bei den länglichen Organellen, die eine gelbgrüne Fluoreszenzemission von λem = 560 nm zeigten, tatsächlich um Mitochondrien handelte, wurde ein Co-Lolokalisationsexperiment mit dem Mitochondrien-selektiven Farbstoff MitoTracker® Deep Red (9) der Firma Invitrogen durchgeführt. Dieser erlaubt aufgrund seiner stark rot-verschobenen Fluoreszenzemission hierbei nicht nur die gleichzeitige Beobachtung mit dem seco-Drug (1S,10R)-5, welches im blaugrünen und gelbgrünen Bereich fluoreszierte, dem blau fluoreszierenden Hoechst und dem rot fluoreszierenden Trypanblau, sondern auch die Erkennung vitaler Zellen.

Zur Anfärbung der Zellkerne wurde eine Lösung des Farbstoffs Hoechst 33342 in Puffer (1 μL, Konzentration der Stammlösung: 36 mM, 36 nmol) mit dem Bildgebungspuffer in den Kammern vermischt (cfinal = 72 μM) und die Zellen vor der Beobachtung einige Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Zur Anfärbung toter Zellen und zum Färben der Zellmembranen wurde eine Lösung des Farbstoffs Trypanblau in physiologischem Puffer (5–25 μL) mit dem Bildgebungspuffer in den Kammern vermischt und die Zellen vor der Beobachtung einige Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Zur Co-Lokalisation des seco-Drugs (1S,10R)-5 (Inkubation: 2-10 μM, 30 min bis 2,5 h) mit dem Mitochondrienfarbstoff Mito-Tracker wurde eine Lösung des Mito-Trackers in DMSO (1–1.25 μL, Konzentration der Stammlösung: 10 μM) mit dem Bildgebungspuffer in den Kammern vermischt (cfinal = 20–25 nM) und die Zellen vor der Beobachtung bei Raumtemperatur 30 min–1.5 h inkubiert.

In der 6 sind die Ergebnisse dargestellt.

Die Co-Lokalisationsexperimente mit dem MitoTracker® zeigen deutlich, dass das seco-Drug (1S,10R)-5 in den Mitochondrien lebender Zellen angereichert wurde ( und , obere 2/3 der Zellen, 5: grün dargestellt, Mito-Tracker (9): rot dargestellt, , Überlagerung von 5 und 9: gelb dargestellt). Bei diesen lebenden Zellen waren durch Trypanblau (, hellblau dargestellt) nur die Zellmembranen angefärbt. In den Mitochondrien durch Trypanblau deutlich im Zytosol angefärbter toter Zellen (–e, unteres 1/3 der Zellen) konnten 9 und 5 stattdessen nur mit sehr schwachen Intensitäten nachgewiesen werden.

Bemerkenswert war, dass ein zunehmender Anteil der Zellen wenige Stunden nach einer seco-Drug-Inkubation Zeichen einer Apoptose zeigten (). Es kam zur Ausbildung von Membranausstülpungen und zum Zusammenbruch des Membranpotentials in den Mitochondrien betroffener Zellen, sodass die Mitochondrien dieser Zellen nicht mehr durch den MitoTracker® 9 angefärbt werden konnten.

Die blaugrüne Fluoreszenz des seco-Drugs (1S,10R)-5 (, blau dargestellt) konnte in zytosolischen Organellen lebender und toter Zellen, hierbei insbesondere in Kernnähe, detektiert werden. Da die Fluoreszenz des DNA-Farbstoffs Hoechst 33342 (8) bei ähnlichen Wellenlängen wie die blaugrüne Fluoreszenz des seco-Drugs angeregt und detektiert wurde, war die Färbung der Zellkerne durch 8 (, blau dargestellt) nur durch die Lokalisation der Färbung im Kern von der blaugrünen Fluoreszenz des seco-Drugs in den zytosolischen Organellen zu unterscheiden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • WO 02/059122 [0004]
  • WO 98/11101 [0004, 0005]
  • WO 97/12862 [0004]
  • WO 01/83448 [0004, 0005, 0005, 0009]
  • WO 2007/089149 [0004, 0004, 0005, 0005, 0009]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • The Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Molecular Probes – Invitrogen, 10th Edition [0003]