Title:
Non-invasive method for screening of active agent/formulation against skin aging in vivo, comprises contacting human with agent/formulation, applying adhesive tape to skin and tearing off, extracting the biological material and detecting
Kind Code:
A1


Abstract:
Non-invasive method for screening of active agents and/or formulations against skin aging in vivo, comprises: (a) contacting animals, preferably humans with the active agents to be tested and/or the formulation to be tested; (b) applying an adhesive tape to a skin surface; (c) tearing off the tape from the skin; (d) extracting the surrounding biological material; and (e) detecting the presence, quantity, expression and/or activity of at least one marker of skin aging as described in table (table 1 or 2) specification. An independent claim is included for a method of non-invasive determination of biological skin aging in an animal, preferably human, comprising: step (a), (b), (d) and (e); and (f) correcting the results from (d) with the results of a comparison group.



Inventors:
Holtkötter, Olaf, Dr. (Hürth, 50354, DE)
Adomat, Christel, Dr. (Düsseldorf, 40591, DE)
Zimmermann, Birgit (Neuss, 41462, DE)
Ritschel, Ursula (Düsseldorf, 40627, DE)
Application Number:
DE102009046128
Publication Date:
08/05/2010
Filing Date:
10/29/2009
Assignee:
Henkel AG & Co. KGaA (Düsseldorf, 40589, DE)
International Classes:



Foreign References:
EP1112077
6013445
Other References:
Römpp Chemie-Lexikon, Bd. 5, S. 3274
www.uniprot.org
Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000)
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Qiagen, Hilden, Kat. Nr. 74106
Claims:
1. Nicht-invasives Verfahren zum Screening von Wirkstoffen und/oder Formulierungen gegen Hautalterung in vivo, dadurch gekennzeichnet, dass es folgenden Schritte umfasst:
a) In Kontakt bringen eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, mit einem zu testenden Wirkstoffs und/oder einer zu testenden Formulierung
b) Aufbringen eines Klebebandes auf eine ausgewählte Hautoberfläche
c) Abreißen des Klebebandes von der Haut
d) Gewinnung von anhaftendem biologischem Material
e) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder Anhang 2.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) der zu testende Wirkstoffs und/oder die zu testenden Formulierung auf die Hautoberfläche eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, aufgetragen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte b) und c) wiederholt, bevorzugt zwei bis dreißig mal, insbesondere vier bis zwanzig mal, ganz besonders bevorzugt sechs bis sechzehn mal, hintereinander (sukzessive) durchgeführt werden.,

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) mindestens ein Marker für die Hautalterung ausgewählt ist aus der Liste gemäß Anhang 3.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) mindestens ein Marker für die Hautalterung ausgewählt ist aus CANX, KRT15, TXLN, ANXA1, CYP7A1, ENG, VEGFD, MMP11, ADRM1 und MFAP3, insbesondere ausgewählt aus MMP11, ADRM1 und VEGFD.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) in der gleichen Probe die Expression eines, zweier oder mehr weiterer Marker, bevorzugt ebenfalls ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2, insbesondere der Liste gemäß Anhang 2, bevorzugt der Liste gemäß Anhang 3 bestimmt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) die Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mittels ELISA, Proteinanalyse oder Nukleinsäureanalyse, insbesondere auf einem Microarray erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt f) die Auswahl eines geeigneten Wirkstoffs und/oder einer geeigneten Formulierung im Vergleich zu einer Referenz erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenz durch die Durchführung der Schritte b) bis e) des Verfahrens auf einer nicht mit dem zu testenden Wirkstoff und/oder der zu testenden Formulierung in Kontakt gekommenen Hautstelle erhalten wird.

10. Verfahren zur nicht-invasiven Bestimmung des biologischen Alters der Haut bei einem Lebewesen, bevorzugt einem Menschen, das die folgenden Schritte umfasst:
a) In Kontakt bringen eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, mit einem zu testenden Wirkstoffs und/oder einer zu testenden Formulierung
b) Aufbringen eines Klebebandes auf eine ausgewählte Hautoberfläche
c) Gewinnung des am Klebeband anhaftenden biologischen Materials,
d) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2,
e) Korrelieren der Ergebnisse aus d) mit den Ergebnissen einer Vergleichsgruppe.

Description:

Die Erfindung betrifft ein nicht-invasives Screeningverfahren für Wirkstoffe und/oder Formulierungen gegen Hautalterung in vivo.

Die wichtigste Aufgabe von Anti-Aging-Kosmetika ist es, neben der Bereitstellung eines ansprechenden Hautgefühls und der Grundpflege der Haut, positiven Einfluss auf die Alterung der Haut zu nehmen. Insbesondere soll die Hautalterung verlangsamt und der Haut eine jüngere Erscheinung erhalten werden, als es dem biologischen Alter entspricht.

Die Wirkung von Anti-Aging-Kosmetik beruht auf zwei Effekten. Einerseits wird durch Farbstoffe oder -pigmente und die über das Produkt auf die Haut aufgebrachte Feuchtigkeit die Hautoberfläche direkt in ihrer Erscheinung verbessert. Andererseits wirken die beigemengten Aktivstoffe auf die Zellen der Haut ein, um in diesen Prozesse zu induzieren, die eine biologische Verbesserung des Alterungsstatus zu mit sich bringen. Diese zweite Wirkung ist bislang nur zeitaufwendig und kostenintensiv nachzuweisen, da die induzierten Prozesse naturgemäß nur über einen längeren Zeitraum bei regelmäßiger Anwendung zu makroskopisch messbaren Effekten führen.

Die Prozesse, die zur Alterung der Haut führen, sind auf molekularer Ebene in Teilen schon gut verstanden, wobei die gewonnenen Erkenntnisse in der Regel aus der Analyse von kultivierten Zellen der Haut bzw. durch die Untersuchung von Biopsien der Haut (also aus in vitro Experimenten) stammen.

Invasive, d. h. die Dermis sowie tiefer liegende Gewebeschichten verletzende, in vivo Methoden kommen aus ethischen Gründen nicht in Frage. Nicht-invasive Methoden, welche Effekte von Formulierungen und/oder Wirkstoffen gegen die Hautalterung aufzeigen könnten, erlauben nur die Bestimmung makroskopischer Parameter, beispielsweise der Faltentiefe.

Es besteht Bedarf an einer Methode, mit der sich bereits nach kurzer Zeit die biologische Veränderung der Haut bei Produktanwendung über die Messung relevanter molekularer Marker in vivo erfassen lässt.

Im Stand der Technik ist die so genannte Tape Strip (oder Tape Stripping) Methode bekannt, bei der Zellen der Hautoberfläche mit Hilfe von Klebeband isoliert und der molekularen Untersuchung zugänglich gemacht werden. Diese Methode wurde bislang nur für die medizinische Untersuchung von Entzündungsprozessen der Haut/entzündlichen Hauterkrankungen beschrieben.

Die EP 1112077 beschreibt beispielsweise ein entsprechendes Verfahren für den Nachweis von Entzündungsmarkern, speziell Cytokinen. Der Nachweis von Entzündungsmarkern ist im Vergleich mit anderen Markern relativ einfach und gut untersucht, insbesondere aufgrund der hohen differentiellen Expression von Cytokinen bei akuten Entzündungsprozessen.

Die Aufgabe der Erfindung ist es daher ein Verfahren bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet und in vivo Untersuchungen zur Wirkung von Aktivstoffen und/oder Formulierungen gegen die Zeichen der Hautalterung ethisch vertretbar, kostengünstiger und in kürzerer Zeit ermöglicht.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein nicht-invasives Verfahren zum Screening von Wirkstoffen und/oder Formulierungen gegen Hautalterung in vivo, dadurch gekennzeichnet, dass es folgenden Schritte umfasst:

  • a) In Kontakt bringen eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, mit einem zu testenden Wirkstoffs und/oder einer zu testenden Formulierung
  • b) Aufbringen eines Klebebandes auf eine ausgewählte Hautoberfläche
  • c) Abreißen des Klebebandes von der Haut
  • d) Gewinnung von anhaftendem biologischem Material
  • e) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine nicht-invasive in vivo Methode. Es bedarf bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weder eines „chirugischen” Eingriffs noch der Anwesenheit eines Arztes oder irgendwelchen medizinischen Fachpersonals. Die Hautalterung ist darüber hinaus ein natürlicher, nicht krankhafter Prozess. Die Suche nach Wirkstoffen, welche die Hautalterung beeinflussen können, ist an sich ebenfalls kosmetisch und nicht therapeutisch.

In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein zu testender Wirkstoff und/oder eine zu testende Formulierung auf die Hautoberfläche eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, aufgebracht. Das In Kontakt bringen erfolgt bevorzugt topisch. Es kann aber auch über orale, enterale, parenterale oder sonst wie geartete Wirkstoffgaben erfolgen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt a) ein zu testender Wirkstoff und/oder eine zu testende Formulierung auf die Hautoberfläche eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, aufgebracht.

Das In Kontakt bringen erfolgt somit topisch. Besonders bevorzugt wird nach der Aufbringung eines zu testenden Wirkstoffs bzw. einer zu testenden Formulierung auf die Hautoberfläche, dann in Schritt b) ein Klebeband auf die gemäß a) behandelte Hautoberfläche aufgebracht.

Das In Kontakt bringen aus Schritt a), insbesondere die Auftragung auf die Hautoberfläche, kann entweder einmalig oder in ein oder mehreren (bevorzugt regelmäßigen) Wiederholungen erfolgen. Je nach Stärke des Effekts bzw. je nach Marker ist es möglich bereits nach einem In Kontakt bringen, insbesondere einer Auftragung eine Wirkung des zu testenden Wirkstoffs bzw. der zu testenden Formulierung nachzuweisen.

Es kann bevorzugt sein, einen Wirkstoff in regelmäßigen Abständen (z. B. morgens und abends) über ein, zwei oder mehrere Tage oder Wochen in Kontakt zu bringen, insbesondere aufzutragen, und dann die Wirkung des Wirkstoffs bzw. der zu testenden Formulierung durch die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bestimmen.

Bevorzugt werden für die topische Auftragung des Wirkstoffs gemäß bevorzugter Ausführung in Schritt a) und/oder die Applikation des Klebebandes gemäß Schritt b) solche Hautareale ausgewählt, die nur eine geringe Behaarung aufweisen oder auf denen die Behaarung, bevorzugt vor Aufbringung der zu testenden Formulierung bzw. des zu testenden Wirkstoffs, spätestens aber vor Aufbringung des Klebebandes gemäß Schritt b) entfernt wurde.

Solche Testungen können bei Lebewesen, insbesondere Säugetieren, bevorzugt bei Menschen durchgeführt werden. Bevorzugt wird das Verfahren bei Menschen durchgeführt, da die Effekte der Hautalterung als kosmetisches Problem insbesondere bei Menschen eine Rolle spielt und außerdem Artefakte, welche durch die Übertragung von Erkenntnissen von anderen Spezies auf den Menschen entstehen, ausgeschlossen werden.

Gemäß einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in einem Schritt b) ein Klebeband auf eine ausgewählte Hautoberfläche aufgebracht.

Wie bereits zu Schritt a) beschrieben, werden insbesondere Hautareale mit geringer Behaarung ausgewählt bzw. die Haare vor Beginn des Schritt b) entfernt.

Besonders bevorzugt ist es, in Schritt b) das Hautareal aus der Hautoberfläche der Arme, der Beine, insbesondere der Schenkel, bevorzugt der Unterschenkel, des Rückens oder der Gesichtshaut auszuwählen. Bevorzugt wird das Klebeband in Schritt b) auf die Haut der Unterarme, insbesondere auf deren Innenseite, oder auf die Gesichtshaut, aufgebracht.

Erfolgt das In Kontakt bringen mit dem Wirkstoff bzw. der Formulierung durch topisches Aufbringen des zu testenden Wirkstoffs bzw. der zu testenden Formulierung auf die Hautoberfläche, wird in Schritt b) das Klebeband bevorzugt auf die gemäß a) behandelte Hautoberfläche aufgebracht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dann gemäß einer besonderen Ausführungsform durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:

  • a) Auftragen eines zu testenden Wirkstoffs und/oder einer zu testenden Formulierung auf die Hautoberfläche eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen,
  • b) Aufbringen eines Klebebandes auf die gemäß a) behandelte Hautstelle
  • c) Abreißen des Klebebandes von der Haut
  • d) Gewinnung von anhaftendem biologischem Material
  • e) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2,
  • f) Auswahl eines solchen Wirkstoffs und/oder Formulierung, welche zur Modulation mindestens eines der gemäß e) getesteten Marker fähig ist.

Alle im weiteren als bevorzugt beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beziehen sich insbesondere auch auf die vorstehend genannte besondere Ausführungsform, in der in Schritt a) das Auftragen eines zu testenden Wirkstoffs und/oder einer zu testenden Formulierung auf die Hautoberfläche eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, durchgeführt wird.

Die dafür besonders geeigneten Hautstellen wurden bereits für den Schritt unter b) beschrieben. Besonders bevorzugt wird nach der Aufbringung eines zu testenden Wirkstoffs bzw. einer zu testenden Formulierung auf die Innenseite der Unterarme, dann in Schritt b) ein Klebeband auf diese gemäß a) behandelte Hautoberfläche (dieses Hautareal) aufgebracht

Der Zeitabstand zwischen der Durchführung von Schritt a) bzw. bei Wiederholungen von Schritt a) nach der letzten Anwendung von Schritt a) und Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens (dem Aufbringen des Klebebandes) kann beliebig sein, Die Schritte können beispielsweise direkt hintereinander (beispielsweise im Abstand von einer oder mehrere Sekunden, Minuten oder Stunden), aber auch mit längeren Pausen (beispielsweise Tagen bzw. Wochen oder Monaten) erfolgen. Bevorzugt liegen zwischen der letzten Durchführung von Schritt a) und Schritt b) eine Minute bis mehrere Wochen, insbesondere 10 Wochen.

Als Klebeband (Klebestreifen) im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere ein mit einem oder mehreren verschiedenen Haftklebstoffen beschichtetes Trägermaterial, beispielsweise Papier, Gewebe, Metallfolien oder Kunststofffolien, verstanden.

Weiterhin ist darunter auch ein Klebestreifen zu verstehen, der sich erst in situ (insbesondere nach Auftragung auf die Haut) aus einer mehr oder minder flüssigen bzw. halbflüssigen bzw. halbfesten Klebemasse (beispielsweise einer Acrylatklebemasse wie auch aus handelsüblichem Sekundenkleber) bildet.

Bevorzugt werden einseitig beschichtete Klebebänder eingesetzt, bei denen das Trägermaterial nur von einer Seite haftklebrig beschichtet wird. Dies hat den Vorteil, dass das Ablösen des Klebebandes von der Haut erleichtert wird und geringere Kontamination durch Anhaften auf der nicht mit der Haut des Probanden in Kontakt gekommenen Seite stattfindet.

Ebenfalls einsetzbare Klebebänder im Sinne der Erfindung sind Transferklebebänder. Diese besitzen kein Trägermaterial, die Klebebänder bestehen aus einer Haftklebstoffschicht, die durch ein vom Klebstoff gut ablösbares Abdeckmaterial geschützt wird. Diese Haftklebstoffschicht ist bevorzugter Weise fest. Dies hat den Vorteil, dass die Entfernung von der Haut einfach und im wesentlichen ohne Reste erfolgt.

Einen Sonderfall stellen Klebebänder dar, die mit wasseraktivierbaren Klebstoffen (bevorzugt mit Dextrin- oder Glutinleimen) beschichtet sind: Hier ist der Klebstoff mit Wasser aktivierbar, d. h. der Klebstoff bildet bei Wasserzugabe klebrige Eigenschaften aus. In diesem Fall werden das Klebeband und/oder die zu beklebende Hautoberfläche vor Aufbringung des Klebebandes angefeuchtet und/oder mit Wasser benetzt.

Als Haftklebstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind viskoelastische Klebstoffe, deren abgebundener Film bei Raumtemperatur in trockenem Zustand permanent klebrig und klebfähig bleibt. Dabei kann es sich um unterschiedliche Klebstoffarten handeln kann, nämlich insbesondere um einen Schmelzklebstoff, einen Dispersionsklebstoff, einen lösemittelhaltigen Klebstoff oder einen als Paste auf das Trägerband aufzutragenden Klebstoff. Basispolymere der Haftklebstoffe sind Natur- und Synthese-Kautschuke, Polyacrylate, Polyester, Polychloroprene, Polyisobutene, Polyvinylether und Polyurethane, die in Kombination mit Zusätzen wie Harzen, Weichmachern und/oder Antioxidantien eingesetzt werden. Haftklebstoffe können als wässrige Systeme (Dispersionsklebstoffe), als Lösemittel- und als Schmelzklebstoff-Systeme formuliert werden.

Das Material des Trägers bzw. des Trägerbandes kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus einer Vielzahl von polymeren Materialien ausgewählt werden. Als Beispiele seien genannt Polyolefine, wie Polyethylen einschließlich HDPE, Polyethylen hoher Dichte, Polyethylen niedriger Dichte, lineares Polyethylen niedriger Dichte und lineares Polyethylen sehr niedriger Dichte, Polypropylen und Polybuthylen, Polyurethane, Vinyl-Copolymere, wie Poly(Vinylchlorid) und Poly(Vinylacetat), insbesondere weichgemachtes Poly(Vinylchlorid); olefinische Copolymere, wie Ethylen/Methacrylat-Copolymere, Ethylen/Vinylacetat-Copolymere, Acrylnitril-Butadien-Styrolcopolymere und Ethylen/Propylen-Copolymere; acrylische Polymere und Copolymere und Kombinationen dieser Materialien. Coextrudate, Mischungen und Elends von Kunststoffen oder Kunststoff- und Elastomer-Materialien, wie Polypropylen/Polyethylen, Polyurethan/Polyolefin, Polyurethan/Polycarbonat und Polyurethan/Polyester können auch verwendet werden.

Die Dicke des Trägerbandes variiert entsprechend dem Anwendungsgebiet. Für manuelle Anwendungsgebiete, d. h. für Zwecke des täglichen Bedarfs, wird eine Dicke des Trägerbandes von 10 bis 250 μm bevorzugt.

Das Trägerband weist eine lösemittelfreie oder lösemittelhaltige Haftklebemasse auf, welche z. B. durch Coextrusion, Schmelzbeschichtung oder Dispersionsbeschichtung erzeugt wird, wobei diese Klebemasse vermittels einer Flamm- oder Coronavorbehandlung oder einer Haftvermittlerschicht, welche durch Coextrusion oder Beschichtung aufgebracht wird, mit der Oberfläche des Trägermaterials verbunden ist. Es ist auch möglich, eine Zwischenfolie als sogenannten Release Liner einzusetzen.

Der auf dem Trägerband angeordnete Haftkleber wird vorteilhaft ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyestern, Polyurethanen, Styrolcopolymeren und Polyolefinen. Die Klebstoffe auf Basis von Acrylaten können nicht wasserlöslich oder wasserlöslich sein, es kann sich z. B. um Copolymere von Isooctylacrylat und Acrylsäure handeln. Als Synthesekautschuk kommen z. B. Polyisoprene, Polybutadien, Styrol-Isopren-Styrol- und Styrol-Butadien-Styrol-Blockcopolymere und andere Elastomere in Frage. Die Klebstoffe können in Form von Dispersionen vorliegen.

Die Klebstoffe auf Basis von Acrylaten können aus einer wässrigen Matrix oder aus einem Lösungsmittel beschichtet werden, es kann sich z. B. um Copolymere von Isooctylacrylat und Acrylsäure handeln. Als Synthesekautschuk kommen z. B. Polyisoprene, Polybutadien, Styrol-Isopren-Styrol und Styrol-Butadien-Styrol-Blockcoplymere und andere Elastomere in Frage. Die erfindungsgemäß eingesetzten silikonbasierten Haftklebstoffe beinhalten z. B. Siloxane und Silanole. Haftklebstoffe können als Feststoffe oder als Lösung oder in Form von Dispersionen vorliegen.

Die Dicke der Klebstoffschicht kann im Bereich von 5 μm bis 1000 μm variieren. Vorzugsweise wird eine Schichtdicke von 20 μm bis 250 μm verwendet.

Vorteilhaft ist die Klebebeschichtung mit einem Flächengewicht von 10 bis 200 g/m2, vorzugsweise von 30 bis 150 g/m2 auf das Trägerband aufgetragen.

Die auf mindestens einer Seite aufgebrachte Haftklebstoffbeschichtung kann vollflächig sein. Es ist aber auch möglich, dass nur eine partielle Beschichtung vorliegt. Beispielsweise kann die Beschichtung mit Haftklebstoff streifenförmig oder punktförmig aufgebracht sein. Hierdurch kann der Klebstoffverbrauch reduziert werden. Wesentlich ist es aber, dass ein zum zuverlässigen Fixieren des Klebebandes ausreichender Flächenanteil mit Haftklebstoff beschichtet ist.

Unter Haftklebstoffen dieser Art sind insbesondere solche auf Acrylatbasis vorteilhaft. Dieser Begriff ist weitestgehend zu verstehen. So kann es sich um eine Polyacrylat, ein Polymethacrylat, aber auch um geeignete Acrylat- bzw. Methacrylat-Copolymere handeln. Derartige Erzeugnisse werden beispielsweise in Römpp Chemie-Lexikon, Bd. 5, S. 3274 beschrieben, nämlich Polyacrylate, ein Polymethacrylate, Copolymerisate aus Acryl- und Methacrylestern, wie beispielsweise mit Styrol, Vinylchlorid, Vinylacetat, Acrylnitril. Auch Copolymere auf Acrylat/Methacrylat-Basis sind geeignet. Bevorzugt werden als Acrylat-Materialien Copolymerisate aus Methacrylsäuremethylester mit Acrylsäurebutylester.

Geeignete Haftkleber sind außerdem solche auf der Basis von (Meth)-Acrylsäureestern mit Alkylresten von C4 bis C12.

Daneben können aber auch geringe Anteile von (Meth)-Acrylsäureestern mit Alkylresten von C1 bis C3 bzw. C13 bis C18 enthalten sein. Außerdem können geringe Anteile (etwa 0–12 Gew.-%) (Meth)-Acrylsäure und/oder andere copolymerisierbare Säuren, wie Maleinsäure, Fumarsäure, Itaconsäure einpolymerisiert sein. Zur Steigerung der Kohäsion und Verbesserung der Stabilität der Dispersion können auch Anteile von Acrylnitril oder Acrylamiden sowie Vernetzerzusätze, z. B. N-Methylolacrylamid oder Glycidyl-methacrylat in Verbindung mit Hydroxylgruppen tragenden (Meth)-Acrylsäureestern oder mehrfunktionelle Acrylester, z. B. Butandiol-bis-acrylat, verwendet werden. Schließlich kann ein Teil der (Meth)-Acrylester durch copolymerisierbare Verbindungen, wie Vinylacetat oder Vinylpropionat ersetzt sein.

Zur Erzeugung haftklebriger, mit ihrer Basis auf dem Trägerband verankerten Kalotten sind die an sich bekannten technischen Druckverfahren vom Typ Siebdruck oder Tiefdruck hervorragend geeignet, wobei als Haftklebemassen Dispersionen mit hohem Feststoffgehalt, bevorzugt konzentrierte, thixotrope, wässrige Haftklebedispersionen verwendet werden. Wässrige Dispersionen sind bevorzugt, jedoch können auch Dispersionen vom Typ der Organosole verwendet werden, also solche auf Basis eines hochsiedenden organischen Nicht-Lösungsmittels, oder auch solche vom Typ der Plastisole, wie pastenartiger Produkte aus Weichmacher plus Kunststoff. Bevorzugt haben wässrige Dispersionen einen Feststoffgehalt von mindestens 45 Gew.-%, vor allem von etwa 55–69 Gew.-%.

Bei den Ausgangsmaterialien kann es sich um Dispersionen handeln, die auf Kautschuk, Polyacrylaten, Polyvinylethern bzw. Polyvinylisobutylen beruhen. Bevorzugt sind handelsübliche Materialien auf der Basis von Polyacrylaten. Geeignete Handelsprodukte sind Ucecryl 913 und Ucecryl PC 80 (vertrieben von der Firma ucb, Drogenbos, Belgien) sowie die Kunststoffdispersion VP 859/6 (vertrieben von der Firma Freihoff). Vorzugsweise enthält der aufzubringende Haftklebstoff, der zunächst in einem wäßrigen Medium vorliegt, Netzmittel bzw. Tenside (vertrieben unter der Handelsbezeichnung Byk W). Die Dispersionen des Haftklebstoffes zur Ausbildung der Haftkleberschicht werden vorzugsweise in einer Menge von etwa 1 bis 5 g/m2 und ganz besonders bevorzugt in einer Menge von etwa 2 bis 4 g/m2 auf das Trägerband aufgetragen.

Sofern es sich um einen Haftschmelzklebstoff handelt, ist dieser nicht dispergiert oder emulgiert und wird damit nicht in Form einer Dispersion, Emulsion, eines Organosols oder eines Plastisols für die Beschichtung verwendet. Der Schmelzkleber kann als solcher jedoch Additive enthalten, z. B. Weichmacher, Stabilisatoren oder ähnliche Stoffe.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Schmelzkleber umfassen beispielsweise: a) thermoplastische Rückgratpolymere; b) ggf. Klebharze; c) ggf. Weichmacher; d) ggf. viskositätserniedrigende Mittel; e) ggf. Stabilisatoren; f) ggf. Füllstoffe und g) ggf. Fotoinitiatoren. Alle thermoplastischen Polymere (a) und deren Gemische mit den Komponenten (b) bis (g) sind hier verwendbar.

Geeignete thermoplastische Rückgratpolymere sind z. B. natürlicher Kautschuk; synthetischer Kautschuk wie SBS, SIS, SEBS (Styrol/Ethylen/Butadien/Styrol), SEPS (Styrol/Ethylen/Propylen/Styrol) (Triblockcopolymere) und S-B, S-I, S-EP (Diblockcopolymere); Polyolefine wie ataktisches PP, Ethylen-Propylen-Butadien-Copolymer; epoxidiertes Polyolefin, Polyacrylate wie Polybutylacrylsäureester, Poly (2-ethylhexylacrylsäureester), Polymethacrylsäureester und deren Copolymere mit z. B. Acrylsäure, Methacrylsäure, Vinylacetat, Maleinsäureanhydrid, Diacetonacrylamid oder Acrylnitril; Polyvinylderivate wie Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, (1-Vinyl-2-pyrrolidon)-Vinylacetat-Copolymer, Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymer; Polyamide wie Diethylentriaminpolyamid; Copolyamide, Polyester, Copolyester; Copolyetherester, Polyurethane; Silicone. Diese Rückgratpolymere können als Copolymerisate oder als Gemische untereinander, vollständig vernetzt oder UV- oder ESH-nachvernetzbar eingesetzt werden.

Geeignete Klebharze sind z. B. aliphatische, alicyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe; Polyterpene; Kolophoniumester wie Kolophonium-Glycerin-Ester, hydrierter Kolophonium-Pentaerythrit-Ester, polymerisierte Kolophonium-Diethylenglykol-Ester; polymerisiertes Kolophonium.

Geeignete Weichmacher sind z. B. Phthalate wie Diethylphthalat, Dioctylphthalat, Diisodecylphthalat; Phosphate wie Tributylphosphat, Triphenylphosphat; Dioctyladipat; Dioctylsebacat; Dibutylmaleat.

Geeignete viskositätsemiedrigende Additive sind z. B. aliphatische, alicyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe; flüssiges Polybuten; flüssiges Polystyrol; Xylol-Formaldehyd-Harze; Cumaron-Inden-Harze oder Reaktivverdünner wie beispielsweise Ethoxyethoxyacrylate.

Geeignete Stabilisatoren sind z. B. Tetrakis[methylen-3-(3',5'-di-tert.butyl-4'-hydroxyphenyl)propionat]methan; 1,3,5-Trimethyl-2,4,6-tris(3,5-di-tert.butyl-4-hydroxybenzyl)benzol; 4,4'-Thiobis(6-tert.butyl-m-kresol); Zink-dibutyldithiocarbamat; Dibutyl-thioharnstoff; Octylphenylsalicylat; 2-Hydroxy-4-(2-hydroxy-3-methacryloxy)propio-benzophenon; Octa-decyl-3-(3',5'-di-tert.butyl-4'-hydroxyphenyl)propionat.

Geeignete Füllstoffe sind z. B. mineralische Stoffe wie Kaolin, Talk oder Titandioxid. Bevorzugt sind Schmelzkleber mit einer Viskosität von etwa 1000 bis 80000 mPas bei einer Verarbeitungstemperatur von 60 bis 180°C. Für den Schmelzkleber ist eine Flächenbedeckung von 10 bis 100%, insbesondere 30 bis 60%, vorzuziehen.

Erfindungsgemäß geeignete Klebebänder sind die üblicherweise im Haushalt bzw. Büro zu verwendenden Klebebänder, beispielsweise von Scotch guard, Beiersdorf (Tesa), Henkel (Pritt) sowie medizinische Klebebänder, bevorzugt Scanpore® tage von Actavis Norway AS, Norgesplaster Facility, Norway.

Das Klebeband weist vorteilhaft auf rostfreiem Stahl nach einer Minute eine Klebkraft von < 20 N/cm, bevorzugt < 15 N/cm, insbesondere < 10 N/cm, bevorzugt < 8 N/cm, ganz besonders bevorzugt < 6 N/cm, beispielsweise 1 bis 5 N/cm, 1,8 bis 4 N/cm, wobei die Klebkraft der nach der Prüfmethode PSTC-1 gemessenen Schälfestigkeit entspricht. Die Prüfmethode ist von dem Pressure Sensitive Tape Council entwickelt worden, einem Verband amerikanischer Klebebandhersteller. Nach den Prüfbedingungen ist die Klebkraft, die Kraft, die erforderlich ist, um einen Klebestreifen in bestimmter Breiter unter definierten Bedingungen (Abzugswinkel, Andruck, Geschwindigkeit) von einer Standardprüfplatte abzuziehen. Zur Prüfung wird ein Stück Klebeband mit einer Länger von ca. 400 mm und einer Probenbreite von 25 mm auf eine 200 mm lange, 50 mm breite und ca. 2 mm dicke rostfreie Stahlplatte aufgebracht und mittels einer 2 kg schweren gummibeschichteten Metallrolle gleichmäßig angedrückt. Von der so präparierten Stahlplatte werden ca. 25 mm Klebeband abgezogen. Die Stahlplatte wird mit einer Mitnehmerklemme in dem Prüfgerät fixiert, und das freie Bandende wird mit einer anderen Klemme befestigt. Mit einer definierten Geschwindigkeit von 300 +/–30 mm pro Minute wird das Klebeband in einem Winkel von 180° von der Stahlplatte abgezogen, wobei das Prüfgerät die Werte der Klebkraft anzeigt. Nach Beendigung des Tests wird ein Mittelwert errechnet, der den Klebkraftwert auf Stahl darstellt. Ausgedrückt wird dieser Wert mit der Kraft (N), die für den Abzug des Klebebandes von der Stahlfläche erforderlich ist bei einer Probenbreite von 25 mm.

Gemäß einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gemäß Schritt b) aufgebrachte Klebeband in Schritt c) von der Haut abgerissen. Bei diesem nicht-invasiven Verfahren werden die oberste bzw. die oberen und ggf. noch die mittleren Schichten der Epidermis durch das Aufbringen und Abreißen des Klebebandes bzw. wiederholtem Abreißen von mehreren Klebebändern abgetragen.

Das Verfahren wird so angewendet, dass nur die oberen bis maximal die mittleren Schichten der Epidermis (bevorzugt maximal bis zum Stratum spinosum) abgetragen werden. Ein Erreichen der epidermalen/dermalen Grenzschicht (Stratum basale) und/oder ein Abtragen der Hautschichten bis auf die Dermis selbst durch das Abreißen der Klebestreifen sollte unbedingt vermieden werden. Die Grenze ist für den Fachmann klar bestimmbar. Sobald bei den Probanden ein deutlich fühlbarer Schmerz auftritt oder die beprobte Haut eine starke Rötung zeigt, wird die Testung gestoppt. Die behandelte Haut darf insbesondere nicht nässen oder ein wundenartiges Aussehen erhalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Schritte b) und c) wiederholt. Bevorzugt werden die Schritte zwei bis dreißig Mal, insbesondere vier bis zwanzig Mal, ganz besonders bevorzugt sechs bis sechzehn Mal, hintereinander (sukzessive) durchgeführt werden. Dies hat den Vorteil, dass mehr biologisches Material von dem Probanden gesammelt werden kann.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren nach den vorstehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Wiederholung der Schritte b) und c) auf der im wesentlichen gleichen Hautstelle erfolgt.

Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die Wiederholung der Schritte b) und c) auf der im wesentlichen gleichen Hautstelle erfolgt. D. h. das Aufkleben und Abreißen von Klebebändern wird möglichst an der gleichen Stelle, dem gleichen Hautareal immer wieder durchgeführt. Das hat den Vorteil, dass auch biologisches Material aus den tieferen Schichten der Epidermis (beispielsweise Stratum lucidum, Straum granulosum und ggf. auch Stratum spinosum) mit analysiert werden können.

Insbesondere ist es bevorzugt, bei den Wiederholungen jeweils neue Klebebänder einzusetzen. So kann sich besonders viel biologisches Material anhaften, welches hinterher für die Analyse zur Verfügung steht.

Eine besondere Ausführungsform betrifft ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung des anhaftenden biologischen Materials in Schritt d) der oder die Klebestreifen mit einer zur Lyse von Zellen geeigneten Lösung behandelt werden.

In einem weiteren Schritt d) der vorliegenden Erfindung wird das an dem Klebeband anhaftende biologische Material vom Klebeband gewonnen. Als Anhaftung ist hier sowohl die physikalische als auch chemische Anhaftung von Material zu verstehen.

Insbesondere werden die Klebebänder in Kontakt mit einem, bevorzugter Maßen flüssigen Medium gebracht, um das biologische Material von dem Klebeband wieder zu entfernen. Das flüssige Medium enthält insbesondere Lösungsmittel, bevorzugt C1 bis C5 Alkohole (bevorzugt Ethanol, Propanol und/oder Isopropanol), Wasser oder wässrige Systeme, beispielsweise Mischungen von vorstehend genannten Alkoholen und Wasser. Insbesondere bevorzugt sind wässrigen Medien, die ggf. weitere Zusätze, beispielsweise Puffersubstanzen, enthalten.

Insbesondere werden Zellen bzw. Zellbestandteile, welche auf diese Weise von der Haut gewonnen werden, von den Klebeband bzw. den Klebebändern gewonnen.

Beispielsweise ist es geeignet, das biologische Material durch Abspülen mit oder Einlegen in Wasser oder wässrige Lösungen, insbesondere gepufferte wässrige Lösungen, welche weitere Zusätze enthalten können, von den Klebebändern zu gewinnen.

Je nach der Analysemethode, die in Schritt e) eingesetzt werden soll, wird die gewonnene Probe ggf. weiter aufgearbeitet. Die einschlägigen Methoden sind dem Fachmann bekannt.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt d) das oder die Klebebänder mit einer zur Lyse von Zellen geeigneten Lösung behandelt.

Dies hat den Vorteil, dass gleichzeitig zur Gewinnung des anhaftenden biologischen Materials die Zellen lysiert, d. h. geöffnet bzw. aufgeschlossen werden, und biologisches Material, insbesondere Proteine, RNA, DNA etc. austreten und für weitere Analysen verfügbar sind. Geeignet sind alle dem Fachmann bekannten, für die Durchführung des/der nachfolgenden Analyseschritte unproblematischen bzw. vor dem nachfolgenden Analyseschritt einfach wieder zu entfernenden lysierenden Substanzen.

Für die Analyse von RNA eignen sich beispielsweise Guanidinsalz-haltige Puffer, insbesondere Guanidinthiocyanat-haltige Puffer. Für die Gewinnung von Proteinen bzw. Enzymen eignet sich beispielsweise Triton X.

In einem weiteren Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2 detektiert.

Die Listen gemäß Anhang 1, 2 bzw. 3 (auch als Listen 1, 2 bzw. 3 bezeichnet) enthalten solche Marker, die besonders stark differentiell exprimiert werden bzw. sich stark unterscheidend.

Liste 1 beschreibt die als unterschiedlich bei alten im Vergleich zu jungen Personen aufgefundenen mRNAs (Quotient), weiterhin angegeben sind in den Listen 1 und 2 die Genkürzel (Spalte 1) sowie die zur Zeit der Anmeldung gebräuchlichen systematischen Namen über die UniProttrEMBL-Accessionnumber (Spalte 2). Die Sonden des cDNA-Chips aus Beispiel 1 (Spalte 3) wurden anhand der genannten Datenbank-Accessionnummmern designed. In entsprechenden, dem Fachmann bekannten Datenbanken (bspw. uniprotKB über www.uniprot.org) und beziehen sich auf die Zuordnung gemäß Stand der Datenbank vom 01.06.2009.

Die erfindungsgemäße Lehre zu den als unterschiedlich expremiert aufgefundenen Marker (im weiteren als Hautalterungsmarker bezeichnet) als solche oder im erfindungsgemäßen Verfahren betrifft neben der in der Beschreibung explizit genannten mRNA auch die daraus für den Fachmann unmittelbar ableitbaren cDNA und DNAs sowie die entsprechenden codierten Proteine (oder deren Fragmente). Diese Informationen sind für den Fachmann unmittelbar über die Accessionnummer in der entsprechenden Datenbank (uniprotKB etc.) abrufbar.

Anhand der UniProttrEMBL-Accessionnumber (Spalte 2 aus Liste 1 oder 2) kann das Protein sowie das kodierende Gen eindeutig identifiziert werden. Der Fachmann ist selbstverständlich in der Lage, über die offenbarten Sequenzen/Teilsequenzen geeignete Sonden zu entwickeln, welche eine eindeutige Zuordnung der Detektion erlauben.

Erfindungsgemäß ist bei den Markern die Bezeichnung, welche in der linken Spalte der Listen 1 und 2 angegeben ist, entscheidend. Wenn diese Bezeichnung keine eineindeutige Zuordnung erlaubt, kann die Accession-Number aus der Spalte links daneben (2.Spalte von links) zur Zuordnung hinzugezogen werden.

Als Marker im Sinne der vorliegenden Erfindung eignen sich sowohl die über die Beschreibung in der Datenbank auffindbaren Nukleinsäuren bzw. Proteine. Dabei sind darunter auch die Fragmente der Nukleinsäure- als auch die Proteinsequenzen zu verstehen, die dem Fachmann eine eindeutige Zuordnung ermöglichen.

Die Angaben in den Listen 1, 2 und 3 beziehen sich aufgrund des Testdesigns auf den Menschen, wenn das erfindungsgemäße Verfahren bei anderen Lebewesen, beispielsweise Säugetieren wie der Maus eingesetzt werden soll, wählt der Fachmann als Marker den entsprechend in den Datenbanken zugängliche murinen Marker mit der, ggf. abweichenden, murinen Protein- bzw. Nukleinsäuresequenz aus. Analoges gilt für andere Lebewesen, insbesondere Säugetiere, wie z. B. Hunde oder Katzen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist in Schritt e) mindestens ein Marker für die Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 2. Die darin beschriebenen Marker werden in alter und junger Haut deutlich unterschiedlich exprimiert (wie durch die Angabe der Reihenfolge der unterschiedlichen Signifikanztests zu entnehmen ist) und können so zu einer robusten und verlässlichen Einschätzung der Wirkung des Aktivstoffes und/oder der zu testenden Formulierung beitragen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist in Schritt e) mindestens ein Marker für die Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 3. Die darin beschriebenen Marker werden in alter und junger Haut besonders deutlich unterschiedlich exprimiert.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt e) die Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung detektiert, der ausgewählt ist aus CANX, KRT15, TXLN, ANXA1, CYP7A1, ENG, VEGFD, MMP11, ADRM1 und MFAP3.

Die entsprechenden Zuordnungen dieser Gennamen zu Referenzsequenzen bzw. Genen/Genprodukten sind dem Anhang 2 (Spalten 2 bzw. 3) zu entnehmen.

Ganz außerordentlich bevorzugt sind die in Schritt e) zu detektierenden Hautalterungsmarker ausgewählt aus MMP-11, VEGFD und/oder ADRM-1.

MMP-11 (Stromelysin3) ist ein untypisches Mitglied der MMP-Familie, da es als spezifisches Substrat den alphal-protease inhibitor besitzt, hingegen Proteine der extrazellulären Matrix wie Fibronektin, Kollagen und Laminin nur schwach proteolytisch abbauen kann. Damit kommt MMP-11 eine im Wesentlichen andere Funktion zu als den übrigen MMP, beispielsweise der MMP-9, die als so genannte Collagenase denaturiertes Kollagen abbauen.

KRT15 ist ein Typ I-Kerstin, dessen Typ II-Kerstin-Partner zur Bildung eines Kerstin-Heterodimers noch nicht eindeutig indentifiziert ist. KRT15 wird ähnlich wie KRT19 als Stammzellmarker beschrieben, wobei sich die Eigenschaft als Marker auf potentielle Stammzellen in der ”Bulge”-Region des Haarfollikels beziehen. KRT15 wird im Gegensatz zu KRT16 nicht in aktivierten Keratinozyten, wie sie beispielsweise in psoriatischer Haut auftreten, gefunden.

VEGFD ist ein durch c-fos induzierbarer Wachstumsfaktor, der strukturell dem VEGFC ähnelt und an die Rezeptoren VEGFR-2 und VEGFR-3 bindet. Es unterscheidet sich von VEGF (das synonym für VEGFA verwendet wird) durch das Wirkspektrum. Auch die gewebespezifische Expression im Herz- und Skelettmuskel sowie im Mesenchym von Lunge und Haut ist unterschiedlich.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt e) in der gleichen Probe die Expression eines, zweier oder mehrerer weiterer Marker, bevorzugt ebenfalls ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2, insbesondere der Liste gemäß Anhang 2, bevorzugt der Liste gemäß Anhang 3 bestimmt.

Es kann vorteilhaft sein, in Schritt e) mehrere Marker (insbesondere solche ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1) oder 2) zu untersuchen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erster in Schritt e) zu untersuchender Marker ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 3 und ein zweiter in einem weiteren Schritt e) zu untersuchender Marker ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1) oder 2).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt e) die Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung detektiert, der ausgewählt ist aus CANX, KRT15, TXLN, ANXA1, CYP7A1, ENG, VEGFD, MMP11, ADRM1 und MFAP3 sowie mindestens eines weiteren Markers ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1) oder 2).

Besonders bevorzugt wird in Schritt e) eine der folgenden Markerkombinationen untersucht: MMP-11 und CANX; MMP-11 und KRT15; MMP-11 und FLG_2; MMP-11 und SFN; MMP-11 und TXLN; MMP-11 und ANXA1; MMP-11 und CYP7A1; MMP-11 und ENG; MMP-11 und VEGFD; MMP-11 und GJA1; MMP-11 und LAMA2; MMP-11 und ADRM1; MMP-11 und COL9A3; MMP-11 und MFAP3; VEGFD und CANX; VEGFD und KRT15; VEGFD und FLG_2; VEGFD und SFN; VEGFD und TXLN; VEGFD und ANXA1; VEGFD und CYP7A1; VEGFD und ENG; VEGFD und GJA1; VEGFD und LAMA2; VEGFD und ADRM1; VEGFD und COL9A3; VEGFD und MFAP3; ADRM-1 und CANX; ADRM-1 und KRT15; ADRM-1 und FLG_2; ADRM-1 und SFN; ADRM-1 und TXLN; ADRM-1 und ANXA1; ADRM-1 und CYP7A1; ADRM-1 und ENG; ADRM-1 und GJA1; ADRM-1 und LAMA2; ADRM-1 und COL9A3; ADRM-1 und MFAP3.

Diese Kombinationen sind aufgrund der besonders ausgeprägten Unterscheidungskraft zwischen alt und jung besonders zum Screening von Wirkstoffen und/oder Formulierungen geeignet.

Aus gleichem Grund besonders bevorzugt wird in Schritt e) mindestens eine der folgenden Markerkombinationen untersucht: MMP-11 und DCN (Decorin); MMP-11 und MMP13; MMP-11 und Biglycan; MMP-11 und CD44; MMP-11 und CASP4 (Caspase 4); MMP-11 und FN1 (Fibronektin); MMP-11 und VWF (von Willebrandt-Faktor); MMP-11 und Lumican; MMP-11 und XRCC6; VEGFD und DCN (Decorin); VEGFD und MMP13; VEGFD und Biglycan; VEGFD und CD44; VEGFD und CASP4 (Caspase 4); VEGFD und FN1 (Fibronektin); VEGFD und VWF (von Willebrandt-Faktor); VEGFD und Lumican; VEGFD und XRCC6; ADRM-1 und DCN (Decorin); ADRM-1 und MMP13; ADRM-1 und Biglycan; ADRM-1 und CD44; ADRM-1 und CASP4 (Caspase 4); ADRM-1 und FN1 (Fibronektin); ADRM-1 und VWF (von Willebrandt-Faktor); ADRM-1 und Lumican; ADRM-1 und XRCC6;

Zu diesen Kombinationen können selbstverständlich noch ein, zwei, drei, vier bis mehrere hundert weitere Marker, insbesondere ausgewählt aus den Listen 1 oder 2 gleichzeitig oder hintereinander untersucht werden.

Besonders bevorzugt wird in Schritt e) mindestens eine der folgenden Markerkombinationen untersucht: VEGFD und MMP-11 und DCN (Decorin); VEGFD und MMP-11 und MMP13; VEGFD und MMP-11 und Biglycan; VEGFD und MMP-11 und CD44; VEGFD und MMP-11 und CASP4 (Caspase 4); VEGFD und MMP-11 und FN1 (Fibronektin); VEGFD und MMP-11 und VWF (von Willebrandt-Faktor); VEGFD und MMP-11 und Lumican; VEGFD und MMP-11 und XRCC6; ADRM-1 und MMP-11 und DCN (Decorin); ADRM-1 und MMP-11 und MMP13; ADRM-1 und MMP-11 und Biglycan; ADRM-1 und MMP-11 und CD44; ADRM-1 und MMP-11 und CASP4 (Caspase 4); ADRM-1 und MMP-11 und FN1 (Fibronektin); ADRM-1 und MMP-11 und VWF (von Willebrandt-Faktor); ADRM-1 und MMP-11 und Lumican; ADRM-1 und MMP-11 und XRCC6; ADRM-1 und VEGFD und DCN (Decorin); ADRM-1 und VEGFD und MMP13; ADRM-1 und VEGFD und Biglycan; ADRM-1 und VEGFD und CD44; ADRM-1 und VEGFD und CASP4 (Caspase 4); ADRM-1 und VEGFD und FN1 (Fibronektin); ADRM-1 und VEGFD und VWF (von Willebrandt-Faktor); ADRM-1 und VEGFD und Lumican; ADRM-1 und VEGFD und XRCC6;

Zu diesen Kombinationen können selbstverständlich noch ein, zwei, drei, vier bis mehrere hundert weitere Marker, insbesondere ausgewählt aus den Listen 1 oder 2 gleichzeitig oder hintereinander untersucht werden.

In einigen Fällen reicht es aus, die bloße Anwesenheit eines Markers zu detektieren, um eine Aussage bzgl. der Wirkung auf die Hautalterung zu treffen.

In anderen Fällen ist die Bestimmung der Menge, also der Quantität, insbesondere der Expression eines Gens und/oder Genprodukten (insbesondere eines Proteins) bzw. von Genen und/oder Genprodukten (insbesondere Proteinen) wichtig, um eine Aussage bzgl. der Eignung eines getesteten Wirkstoffs und/Oder einer getesteten Formulierung zur Bekämpfung der Hautalterung zu treffen.

Handelt es sich um Enzyme, kann auch die Bestimmung der Aktivität (bevorzugt der spezifischen Aktivität) des Enzyms bzw. der Enzyme zu einer Aussage bzgl. der Eignung der Marker zur Bekämpfung der Hautalterung führen.

Zur Bestimmung der Expression sind alle dem Fachmann bekannten Methoden zur Bestimmung der Expression von Genen und/oder Proteinen geeignet. Insbesondere solche Methoden, die eine Quantifizierung dieser Expression ermöglichen, sind erfindungsgemäß geeignet.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt e) die Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mittels ELISA, Proteinanalyse oder Nukleinsäureanalyse, insbesondere auf einem Microarray.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt e) die Genexpression selbst, die Expression eines Genprodukts und/oder die Aktivität mindestens eines Markers für die Hautalterung (bevorzugt quantitativ) bestimmt.

Ggf. kann die Bestimmung mehrerer absoluter Expressionen durch nachträgliche Quotientenbildung zu einer noch weiter verbesserten Analysegenauigkeit führen. Somit können inter-indivduelle Unterschiede bei der absoluten Expression durch eine einfachere Analyse der relativen Expression, die Auswahl eines geeigneten Wirkstoffes in einem optionalen Schritt f) vereinfachen.

Weiterhin ist es beispielsweise möglich, eine entsprechende relative Expression auch auf Basis einer oder mehrerer nicht von Hautalterung beeinflussten Marker (einem Referenzmarker) zu bestimmen. Diese mindestens eine, nicht beeinflusste Marker kann dann in Schritt e) gleichzeitig mit dem mindestens einen Hautalterungsmarker oder in einem weiteren Schritt vor- oder nachher bestimmt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des Markers in Schritt e) mittels einer Expressionsanalyse auf einem Microarray.

Microarrays im Sinne der Erfindung sind Nukleinsäurechips (Nukleinsäuremicroarrays) und/oder Proteinchips (Proteinmicroarrays).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung in Schritt e) mittels Analyse von Nukleinsäuren.

Zur Bestimmung, insbesondere Quantifizierung von RNA wird insbesondere eine der folgenden Methoden durchführt, die ausgewählt ist unter

  • i. Northern Blots,
  • ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
  • iii. RNase-Schutzexperimente,
  • iv. Dot-Blots,
  • v. cDNA-Sequenzierung,
  • vi. Klon-Hybridisierung,
  • vii. Differential Display,
  • viii. Subtraktive Hybridisierung,
  • ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting,
  • x. Total Gene Expression Analysis (TOGA),
  • xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE),
  • xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®) und insbesondere
  • xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips,
oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes”, Nature, Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays”, Nature, Volume 405, Number 6788, 827–836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Das TOGA-Verfahren ist in ”J. Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing technology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976–1981 (2000)” beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird.

Das MPSS®-Verfahren ist in der US-A-6,013,445 beschrieben, worauf hiermit in vollem umfang Bezug genommen wird.

Beispielhaft sei im Weiteren ein CDNA Microarray beschrieben. Diese dienen dazu, RNA-Menge zu quantifizieren und darüber Genaktivitäten nachzuweisen. Es gibt hauptsächlich zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays, einerseits solche die auf gebundener cDNA beruhen und solche die auf synthetisch hergestellten Oligonukleotiden beruhen. Diese dienen als Sonden, die an definierte Positionen eines Rasters z. B. auf Glasträger aufgebracht werden. Unabhängig von der Art der verwendeten Arrays, wird RNA zunächst aus dem zu untersuchenden Objekt extrahiert und diese nach eventuellen Aufreinigungs- und/oder Vermehrungsschritten der mRNA in cDNA oder cRNA umgeschrieben und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Diese werden dann mit den Microarrays hybridisiert. Hierbei binden markierte cDNA/cRNA Stücke an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array. Nach der Abwaschung der nicht gebundenen cDNA/cRNA Stücke wird das Fluoreszenzsignal jeder Position des DNA-Microarrays mittels eines Lasers ausgelesen. Diese reine Intensität wird üblicherweise noch normalisiert um Abbaueffekte, verschieden gute Extraktionen und andere Effekte mit einzurechnen. In der vorliegenden Studie wurde der Agilent Whole Genome Oligo Microarray eingesetzt, bei welchem ca. 40.000 Gene immobilisiert sind.

Wenn in Schritt e) ein weiterer Marker für Hautalterung bestimmt werden soll, kann diese Bestimmung gleichzeitig oder zeitlich vor oder nach der ersten Markerbestimmung gemäß Schritt e) erfolgen.

Beispielsweise ist es ökonomisch sinnvoll, ein oder insbesondere mehrere Hautalterungsmarker (sowie ggf. ein oder mehrere Referenzmarker) gleichzeitig auf einem Microarray (Protein oder Nukleinsäurechip) zu bestimmen, welcher diese und ggf. noch weitere Marker detektieren kann.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung in Schritt e) mittels Proteinanalyse. Als Alternative zur Bestimmung der Genexrpession oder auch zur breiten Absicherung der Analyse kann die Bestimmung auch über alle dem Fachmann bekannten Methoden zur Proteinanalyse bestimmt werden. Besonders bevorzugt sind

  • i. Affinitätschromatographie
  • ii. ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
  • iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
  • iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere
  • v. Einsatz von Proteinchips (microarrays),
oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

Es muss bei der angewendeten Methode gewährleistet sein, dass der gewünschte Marker spezifisch erkannt wird. Beispielsweise geeignet sind auch ELISA und andere fluoreszenzmarkierende Methoden, Antikörper und sonstige Methoden.

Bevorzugt sind bei mehreren Markern, die in Schritt e) zu bestimmen sind, auch Proteinchips

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes”, Nature, Volume 405, Number 6788, 837–846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L. D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L. D. Adams & S. R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1–10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.

Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben:

  • Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487–512.
  • Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1–0.21.27.

CDNA Microarrays dienen dazu, RNA-Menge zu quantifizieren und darüber Genaktivitäten nachzuweisen. Es gibt hauptsächlich zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays, einerseits solche die auf gebundener cDNA beruhen und solche die auf synthetisch hergestellten Oligonukleotiden beruhen. Diese dienen als Sonden, die an definierte Positionen eines Rasters z. B. auf Glasträger aufgebracht werden. Unabhängig von der Art der verwendeten Arrays, wird RNA zunächst aus dem zu untersuchenden Objekt extrahiert und diese nach eventuellen Aufreinigungs- und/oder Vermehrungsschritten der mRNA in cDNA oder cRNA umgeschrieben und beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Diese werden dann mit den Microarrays hybridisiert. Hierbei binden markierte cDNA/cRNA Stücke an ihren komplementären Gegenpart auf dem Array. Nach der Abwaschung der nicht gebundenen cDNA/cRNA Stücke wird das Fluoreszenzsignal jeder Position des DNA-Microarrays mittels eines Lasers ausgelesen. Diese reine Intensität wird üblicherweise noch normalisiert um Abbaueffekte, verschieden gute Extraktionen und andere Effekte mit einzurechnen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt in einem weiteren Schritt f) dann die Auswahl eines solchen getesteten Wirkstoffs und/oder einer getesteten Formulierung als zur Bekämpfung der Hautalterung geeignet, wenn der getestete Wirkstoff bzw. die getestete Formulierung zur Modulation mindestens eines der gemäß e) getesteten Marker fähig ist.

Modulation im Sinne der vorliegenden Erfindung ist jeder Effekt auf die Expression oder Aktivität der Gene sowie der Genexpressionsprodukte, jeder Effekt auf ein Gen oder dessen Aktivität auf mindestens einen ihrer Expressionspromotoren, das Vorkommen und die Aktivität eines Proteins bzw. Enzyms.

Bevorzugt sind solche Effekt darunter zu verstehen, die eine Erhöhung oder Verminderung der Regulation, eine Stimulation oder eine teilweise oder vollständige Inhibition induzieren.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt f) die Auswahl des Wirkstoffs (insbesondere im Hinblick auf die Bestimmung des Vorliegens einer Modulation) im Vergleich zu einer Referenz.

Es ist beispielsweise möglich, die in dem Verfahren gefundenen Messwerte mit anderen Messwerten aus der gleichen oder anderen Testreihen zu vergleichen, um das Vorliegen einer Modulation zu erkennen und damit den für die Bekämpfung der Hautalterung geeigneten Wirkstoff bzw. die Formulierung auszuwählen.

Bevorzugt werden die Messwerte mit Messwerten aus der gleichen und/oder einer ähnlichen Testreihe verglichen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Referenz durch die Durchführung der Schritte b) bis e) des Verfahrens auf einer nicht mit dem zu testenden Wirkstoff bzw. der zu testenden Formulierung in Kontakt gekommenen Hautstelle erhalten.

Im Falle eines systemischen In Kontakt Bringens (orale, parenterale oder sonst wie geartetes Aufnahme der zu testenden Formulierung bzw. des zu testenden Wirkstoffs) gemäß Schritt a) ist es sinnvoll, vor (oder zeitlich deutlich nach) dem In Kontakt bringen eine entsprechende Referenz des gleichen Lebewesens, bevorzugt des gleichen Menschen zu gewinnen.

Es ist allerdings auch möglich, die Referenz vor, gleichzeitig oder nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Durchführung der Schritte b) bis e) an einem oder mehren anderen Lebewesen, insbesondere anderen Menschen zu erhalten.

Bevorzugt ist es dabei insbesondere, die Referenz vom gleichen Lebewesen, bevorzugt vom gleichen Menschen zu erhalten.

Das erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verfahren, bei dem in Schritt a) die zu testende Formulierung bzw. der zu testende Wirkstoff auf eine Hautstelle topisch aufgebracht wird, wird dann bevorzugt so durchgeführt, dass vergleichbare, nicht behandelte Hautstellen für die Referenz bzw. für die Auftragung eines Placebos ausgewählt werden.

Beispielsweise wird dazu auf der einen Unterarminnenseite ein zu testende Formulierung und/oder ein zu testender Wirkstoff aufgetragen und auf der anderen Unterarminnenseite entweder die Haut unbehandelt belassen oder ein Placebo aufgetragen. Dann wird das erfindungsgemäße Verfahren entsprechend durchgeführt und die unbehandelte/bzw. mit dem Placebo behandelte Probe als Referenz für die Auswahl der Probe von der mit der zu testenden Formulierung bzw. dem zu testenden Wirkstoff behandelten Probe benutzt.

Im Stand der Technik sind bereits Marker für die Hautalterung bekannt. Gewonnen wurden diese aus Hautbiopsien, bei welchen die gesamte Haut (Vollhaut) einschließlich der Dermis) betrachtet und analysiert wurde. Andere Informationen wurden aus Monolayerkulturen der Hautzellen erhalten.

Überraschenderweise konnten viele der bereits für die Hautalterung bekannten Marker, nicht über das Tape Stripping nachgewiesen werden. Trotzdem gelang es überraschenderweise, einige Marker in den unterschiedlichen Altersgruppen zu identifizieren, deren Expression zwischen Alt und Jung deutlich voneinander verschieden ist.

Vorteilhafterweise erhält man durch die Messung der Hautalterungsmarker im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nach kurzer Anwendungszeit bzw. nach wenigen Anwendungen (zum Teil sogar nach nur einer Anwendung) der zu testenden Wirkstoffe bzw. der zu testenden Formulierungen Informationen in vivo über den Einfluss von kosmetischen Produkten, Formulierungen, insbesondere kosmetischen Formulierungen, oder Wirkstoffen, insbesondere kosmetischen Wirkstoffen.

Weiterhin ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise die Bereitstellung neuer Parameter zur Bestimmung der Hautalterung in vivo, die über die bisherigen makroskopischen Eindrücke (sichtbare Hautalterung) hinausgeht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur nicht-invasiven Bestimmung des biologischen Alters der Haut bei einem Lebewesen, bevorzugt einem Menschen, das die folgenden Schritte umfasst:

  • a) In Kontakt bringen eines Lebewesens, bevorzugt eines Menschen, mit einem zu testenden Wirkstoffs und/oder einer zu testenden Formulierung
  • b) Aufbringen eines Klebebandes auf eine ausgewählte Hautoberfläche
  • c) Gewinnung des am Klebeband anhaftenden biologischen Materials,
  • d) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2,
  • e) Korrelieren der Ergebnisse aus d) mit den Ergebnissen einer Vergleichsgruppe.

Insbesondere bevorzugt umfasst dieses Verfahren die folgenden Schritte:

  • a) Aufbringen eines Klebebandes auf die Hautoberfläche
  • b) Abreißen eines Klebebandes von der Haut
  • c) Gewinnung des am Klebeband anhaftenden biologischen Materials,
  • d) Detektion der Anwesenheit, Menge, Expression und/oder Aktivität mindestens eines Markers für Hautalterung ausgewählt aus der Liste gemäß Anhang 1 oder 2,
  • e) Korrelieren der Ergebnisse aus d) mit den Ergebnissen einer Vergleichsgruppe.

Vorteilhafter weise kann mit diesem Verfahren das biologische Alter der Haut durch einen Vergleich der aufgefundenen Messwerte mit den Messwerten von Vergleichsgruppen verschiedener Altersstufen bestimmt werden.

Bezüglich weiterer Eigenschaften sowie bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Hautalterung gilt mutatis mutandis das zu den erfindungsgemäßen Verfahren zum Screening von Wirkstoffen Gesagte.

Die nachstehenden Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung näher erläutern, ohne ihn zu beschränken.

Beispiel 1:

Von einer jungen Gruppe, bestehend aus 20 Personen (beiderlei Geschlechts) im Alter zwischen 18 und 27 Jahren, und einer gealterten Gruppe, bestehend aus 22 Personen (beiderlei Geschlechts) zwischen 54 und 72 Jahren, wurden entweder vom rechten oder linken Arm jeweils zwei Tape Strip-Proben genommen. Dazu wurden an geeigneter Stelle des Unterarms 16 aufeinander folgende Abrisse mit Klebebändern genommen und die Streifen in einer Pufferlösung gesammelt, in der anhaftenden Zellen lysiert und die in Lösung gegangene RNA anschließend nach Standardprotokollen aufgearbeitet wurden.

Probengewinnung:

Vor dem Aufkleben wird die Haut mit 100% Alkohol desinfiziert.

Insgesamt wurden 16, vorher auf entsprechende Größe zugeschnittene Patches (Scanpore tage, Actavis A/S, Norgesplaster, Vennesla, Norwegen) auf einem Hautareal (2 × 2 cm) des Unterarms aufgeklebt, ein Kosmetiktuch aufgelegt und dreimal mit einem 1000 g Roller darüber gerollt. Nach einer Minute wurde das Pflaster mit einer Pinzette abgenommen, mit einer anderen Pinzette in den Lysispuffer (RLT-Puffer (Qiagen, enthält Guanidinthiocyanat, 2 ml) überführen, eine Minute geschüttelt und das Pflaster dann verworfen. Dies wurde 16 mal auf der gleichen Hautstelle durchgeführt. Je 8 Klebebänder (Patches, abwechselnde Reihenfolge) wurden zusammengeführt. Die Probenpuffer werden zum Schluss vereint (~4 ml) und 4 ml Ethanol (70%) dazugegeben.

Die weitere Aufarbeitung erfolgt mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Kat. Nr. 74106) mit DNase Verdau. Die Proben werden dann in 30 μl Wasser eluiert (2 × 15 μl). Die Lagerung der aufgearbeiteten RNA erfolgte bis zur weiteren Bearbeitung bei –20°C.

Zur weiteren Analyse wurden aus den insgesamt 84 verschiedenen RNA-Proben 10 Pools der jungen Spender und 11 Pools der älteren Spender gemäß oben angegebener Vorgehensweise hergestellt und das Genexpressionsprofil der jeweiligen Pools anschließend durch die Verwendung von cDNA-Microarrays (PIQOR (TM) Skin Microarray der Fa. Miltenyi Biotec) analysiert.

Die erhaltenen Daten wurden bioinformatisch aufbereitet und auf alt-jung-diskriminierende Gene hin analysiert. Ein Vergleich auf Basis der Medianwerte der Genexpressionen in den verschiedenen Pools ergab die Liste diskriminerender Gene gemäß Anhang 1.

Beispiel 2:

Um eine möglichst robuste Auswahl an Genen zu treffen, über deren Expressionsniveau zwischen junger und gealterter Haut unterschieden werden kann, wurden verschiedene statistische Verfahren auf die Daten angewendet, namentlich das Pavlidis Template Matching, Zwei-Gruppen t-Test und die Signifikanzanalyse von Mikroarrays (SAM). Über den Vergleich der Ergebnisse lässt sich die Auswahl besonders robuster Diskriminatoren festlegen (angegeben ist die Rangfolge der Gene als Diskriminator im jeweiligen statistischen Test, in der Liste gemäß Anhang 2):

Beispiel 3:

Aus den diskriminierenden Genen gemäß der Liste – Anhang 2 sind Gene von besonderem Interesse ausgewählt (vgl. Liste gemäß Anhang 3). Anhang 1:

NameUniProttrEMBLRefSeqfold-change (old/young)KRT5P13647NM_000424–3,223KRT15P19012NM_002275–3,171CD59_HUMANP13987NM_000611–3,091COL17A1Q9UMD9NM_000494–2,487BIGLYCANP13247NM_001711–2,395TPM4P07226NM_003290–2,387FLG_2P20930NM_002016–2,382ENGQ14926NM_0001182,381COX8P10176NM_0040742,367KRT6P02538NM_005554–2,241HSP90AA1P07900NM_005348–2,219S100A6P06703NM_0146242,119EMP1P54849NM_001423–2,107PFDN1O60925NM_0026222,107COL9A3Q14050NM_001853–2,084CD63P08962NM_001780–2,069DCNP07585NM_001920–1,997ADFPQ99541NM_0011221,970SRP14P37108NM_003134–1,935LAMA2Q14736NM_0004261,925ADRM1Q16186NM_007002–1,902KRT17Q04695NM_000422–1,886GJA1P17302NM_000165–1,879PIG8O14681NM_0048791,877PTK7Q13308NM_002821–1,875HSP90AB1_3PRIMEP08238NM_007355–1,838HSPD1P10809NM_0021561,836MALP21145NM_002371–1,811PSMA6P34062NM_0027911,805TP53BP1Q12888NM_0056571,801CASP4_HUMANP49662NM_001225–1,799XRCC6P12956NM_001469–1,797SERPINF1P36955NM_0026151,795TAGLNQ01995NM_003186–1,794CCT2P78371NM_0064311,784B2MP61769NM_004048–1,783KRT14P02533NM_000526–1,774MAPK9P45984NM_0027521,766VIL2P23714NM_003379–1,742TXNP10599NM_003329–1,735TNCP24821NM_002160–1,704THBS1P07996NM_003246–1,676MCL1Q07820NM_0219601,673CD44_EX10–12_HUMANQ92493NM_000610–1,636ALDH1A1P00352NM_000689–1,622SPRR3Q9UBC9NM_005416–1,619COL1A2P08123NM_000089–1,605SFNP31947NM_006142–1,596ITGA6P23229NM_000210–1,592MGST3O14880NM_004528–1,587CASP1P29466NM_001223–1,587FLK1O60723NM_0022531,586WSB1Q9Y6I7NM_015626–1,581DPTQ07507NM_0019371,579ITGB1P05556NM_002211–1,575CDH1P12830NM_004360–1,560CYP7A1P22680NM_000780–1,559LUMICANP51884NM_002345–1,559HK1O43443NM_000188–1,555COL10A1Q03692NM_0004931,555GJB6O95452NM_006783–1,553CASP2P42575NM_0012241,549CSN1Q13098NM_004127–1,542RHOAP61586NM_0016641,541THY1P04216NM_006288–1,541FN1P02751NM_002026–1,540IKBAP25963NM_0205291,537HSPA5P11021NM_0053471,537CDMQ13836NM_005745–1,536PSMD13O75831NM_1759321,524VWFP04275NM_0005521,523HPAR14Q9Y237NM_0062231,521HP-HPRP00737NM_0051431,519STAT3P40763NM_003150–1,514GPX3P22352NM_002084–1,509ANXA1P04083NM_000700–1,506CANXP27824NM_001746–1,506CAOPQ15067NM_007292–1,503
Anhang 2:NameUniProttrEMBLRefSeqstronger expression inPTMt-tesSAMgroup medianADRM1Q16186NM_007002young22125COL9A3Q14050NM_001853young514219KRT15P19012NM_002275young142143FLG_2P20930NM_002016young1138810SFNP31947NM_006142young68653GJA1P17302NM_000165young13361027CYP7A1P22680NM_000780young1071262SRP14P37108NM_003134young21391423EMP1P54849NM_001423young41231917ANXA1P04083NM_000700young49782KRT6P02538NM_005554young28501513CANXP27824NM_001746young941383TAGLNQ01995NM_003186young37252238ITGA6P23229NM_000210young26331854KRT17Q04695NM_000422young33671626KRT14P02533NM_000526young43452041CAOPQ15067NM_007292young39163384CDH1P12830NM_004360young44562361MFAP3P55082NM_005927young759ENG014926NM_000118old241011KRT5P13647NM_000424young61172DCNP07585NM_001920young283221FOSL2P15408NM_005253young202735LAMA3Q16787NM_000227young292925LAMA2014736NM_000426old194324MCL1Q07820NM_021960old231748GJA1Q9Y518NM_000165young313127TPM4P07226NM_003290young62288RELBQ01201NM_006509young351353SDCBPO00173NM_005625young382639COL17A1Q9UMD9NM_000494young72296CASP2P42575NM_001224old321168MMP13P45452NM_002427young88024BIGLYCANP13247NM_001711young89347FOS_1P01100NM_005252young425236PSMD13O75831NM_175932old124276CD63P08962NM_001780young833820STAT3P40763NM_003150young492680TNCP24821NM_002160young704945COL10A1Q03692NM_000493old308165HP-HPRP00737NM_005143old188479CASP1P29466NM_001223young775656VEGFDO43915NM_004469old31MMP11P24347NM_005940old176CD59_HUMANP13987NM_000611young214QSOX1O00391NM_0010041 28young2515TXLNP40222NM_175852old2724PSMA6P34062NM_002791old1933CYP2A6-CYP2A7-CYP2A13-CYP2A6V2_HUMANP11509NM_000762young4020GRO1_HUMANP09341NM_001511young1845HSP90AA1P07900NM_005348young5214CYP2C9_HUMANP11712NM_000771old3634HSP90AB1_3PRIMEP08238NM_007355young4030XRCC6P12956NM_001469young3736HSPA9P31932NM_004134young3048CD44_EX10-12_HUMANQ92493NM_000610young3149FLK1O60723NM_002253old3757GJA7P36383NM_005497young5350ACTBP60709NM_001101young7330ITGB1P05556NM_002211young4460MMP7P09237NM_002423young4559COL1A2P08123NM_000089young5552HK1O43443NM_000188young4664CASP4_HUMANP49662NM_001225young8235THBS1P07996NM_003246young7147TP53BP1Q12888NM_005657old8834TP53BP2Q13625NM_005426young7547GJB6O95452NM_006783young6066B2MP61769NM_004048young8640FN1P02751NM_002026young5872FBLN1_1P23142NM_006486young7855COX8P10176NM_004074old12S100A6P06703NM_014624old16PFDN1O60925NM_002622old18ADFPQ99541NM_001122old22PIG8O14681NM_004879old28PTK7Q13308NM_002821young29HSPD1P10809NM_002156old31FASLGP48023NM_000639old32MALP21145NM_002371young32SERPINF1P36955NM_002615old37CCT2P78371NM_006431old39TNFSF9P41273NM_003811old41UGGT1Q9NYU2NM_020120young41MAPK9P45984NM_002752old42MT-GRPE1Q9HAV7NM_025196young42HSPA1A-HSPA1BP19790NM_005345young43VIL2P23714NM_003379young43STIP1P31948NM_006819young44TXNP10599NM_003329young44P53P04637NM_000546old46SLIT1O75093NM_003061old47MMP14Q92678NM_004995young48ALDH1A1P00352NM_000689young50AC15P35251NM_002913young51SPRR3Q9UBC9NM_005416young51GDF2Q9Y571NM_016204young51PARP1P09874NM_001618old54LDHBP07195NM_002300young54MGST3O14880NM_004528young55WSB1Q9Y6I7NM_015626young58DPTQ07507NM_001937old59MAPK8P45983NM_002750old63LUMICANP51884NM_002345young63DBPAP16989NM_003651young64MMP6Q99547NM_005792young65IAP1Q13489NM_001165young66GJA5P36382NM_181703young68TIMP3P35625NM_000362young69CSN1Q13098NM_004127young69RHOAP61586NM_001664old70THY1P04216NM_006288young71IKBAP25963NM_020529old73HSPA5P11021NM_005347old74CCT3P49368NM_005998old74CDMQ13836NM_005745young75ABMEP41238NM_001644young76VWFP04275NM_000552old77HPAR14Q9Y237NM_006223old78OSFQ92882NM_012383young79GPX3P22352NM_002084young81MOBPQ13874NM_006501young85STAT6P42226NM_003153young87
Anhang 3:Namestronger expression inPTMt-testSAMgroup medianClusterCANXyoung941383ChaperonKRT15young142143Differenzierungsmarker/BarriereFLG_2young1138810Differenzierungsmarker/BarriereSFNyoung68653Differenzierungsmarker/BarriereTXLNold2724ImmunologieANXA1young49782ImmunologieCYP7A1young1071262MetabolismusENGold241011SignalingVEGFDold31SignalingGJA1young13361027SignalingLAMA2old194324Zell-Matrix-InteraktionMMP11old176Zell-Matrix-InteraktionADRM1young22125Zell-Matrix-InteraktionCOL9A3young514219Zell-Matrix-InteraktionMFAP3young759Zell-Matrix-Interaktion

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

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