Title:
Verfahren und Testsystem zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen umfassend:
a.) Kultivierung
i.) mindestens einer ersten Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
ii.) mindestens einer zweiten Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
unter Zellkulturbedingungen, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) bei Beginn der Kultur nebeneinander auf einer Membran aufgebracht sind,
b.) Zugabe der zu untersuchenden Substanz,
c.) Bestimmung, ob sich zwischen den Gewebeproben i.) und ii.) Faserbahnen ausgebildet haben sowie Darstellung der Faserbahnen mit bildgebenden Methoden und
d.) Auswertung der Fasereigenschaften in den erhaltenen Bildern, wobei Schritt d.) folgende Teilschritte umfasst:
d1.) Skelettierung und Extraaktion der Fasern,
d2.) Bestimmung von Knotenpunkten der extrahierten Fasern und kontinuierliche Rekonstruktion der Faserverläufe zwischen den Knotenpunkten
d3.) kontinuierliche...




Inventors:
Kuska, Jens-Peer, Dr. (14482, Potsdam, DE)
Scherf, Nico (04275, Leipzig, DE)
Franke, Heike, Dr. (04357, Leipzig, DE)
Heine, Claudia, Dr. (04109, Leipzig, DE)
Application Number:
DE102009045924
Publication Date:
04/28/2011
Filing Date:
10/22/2009
Assignee:
Universität Leipzig, 04109 (DE)
International Classes:



Foreign References:
WO2008061548A12008-05-29
Other References:
HEINE, C. u.a.: P2 receptor expression in the dopaminergic system of the rat brain during development. Neuroscience (2007) 149 (1) 165-81
FRANKE, H. u.a.: Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochem. Int. (2003) 42 (5) 431-9
BOLZ, J. u.a.: Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. (1992) 12 (8) 3054-70
Attorney, Agent or Firm:
Kailuweit & Uhlemann, Patentanwälte, 01187, Dresden, DE
Claims:
1. Verfahren zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen umfassend:
a.) Kultivierung
i.) mindestens einer ersten Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
ii.) mindestens einer zweiten Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
unter Zellkulturbedingungen, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) bei Beginn der Kultur nebeneinander auf einer Membran aufgebracht sind,
b.) Zugabe der zu untersuchenden Substanz,
c.) Bestimmung, ob sich zwischen den Gewebeproben i.) und ii.) Faserbahnen ausgebildet haben sowie Darstellung der Faserbahnen mit bildgebenden Methoden und
d.) Auswertung der Fasereigenschaften in den erhaltenen Bildern, wobei Schritt d.) folgende Teilschritte umfasst:
d1.) Skelettierung und Extraaktion der Fasern,
d2.) Bestimmung von Knotenpunkten der extrahierten Fasern und kontinuierliche Rekonstruktion der Faserverläufe zwischen den Knotenpunkten
d3.) kontinuierliche Darstellung und/oder graphbasierte und/oder interpolierte Darstellung der Fasern,
wobei mindestens eine der folgenden Faserparameter wie folgt bestimmt wird:
d4.) Bestimmung der Faserdichte durch Berechnung des Anteils der Vordergnundstrukturen an der gesamten Bildgröße oder über die Anzahl der Kanten mittels der graphbasierten Darstellung der Fasern,
d5.) Bestimmung der Geradlinigkeit des Faserwachstums durch Berechnung der Winkelverteilung entlang der Hauptwachstumsrichtung und/oder mittels Hauptkomponentenanalyse zur Bestimmung der Variation orthogonal zur Hauptwachstumsrichtung auf Basis der kontinuierlichen Darstellung und/oder der interpolierten Darstellung und/oder
durch Analyse der Krümmung entlang der Fasern auf Basis der kontinuierlichen Darstellung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Gewebeprobe i.) aus dem Mittellhirn, Striatum oder Rückenmark und/oder die zweite Gewebeprobe aus dem Cortex stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c.) ein Tracer zugeben wird, der in Schritt c.) durch bildgebende Verfahren detektiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Länge der Fasern und/oder deren Verzweigungsgrad bestimmt wird.

5. Computerprogrammprodukt, welches Schritt d.) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 durchführt.

6. Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5, welches zusätzlich mindestens einen der Schritte a.), b.) und/oder c.) automatisiert.

7. Computer oder eine Datenverarbeitungsanlage auf dem das Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5 oder 6 installiert ist.

8. Datenträger auf dem das Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5 oder 6 gespeichert ist.

9. Testsystem, insbesondere zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen, umfassend ein Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5 oder einen Computer oder eine Datenverarbeitungsanlage nach Anspruch 7 oder einen Datenträger nach Anspruch 8 und mindestens einen der weiteren Komponenten ausgewählt aus: Zellkulturmedien,
– Tracer,
– Fixierungsmittel,
– Referenzsubstanzen,
– ein bildgebendes System,
– Handbuch.

10. Testsystem nach Anspruch 9 zusätzlich umfassend:
i) mindestens eine erste Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
ii.) mindestens eine zweite Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
wobei die Gewebeproben i.) und ii.) nebeneinander auf einer Membran aufgebracht sind.

11. Testsystem nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeproben Gewebeschnitte sind, die vorzugsweise eine Dicke von 150 μm bis 350 μm, bevorzugt 200 bis 300 μm aufweisen, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) bevorzugt zueinander einen Abstand von 0,05 cm bis 0,2 cm aufweisen.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Testsystem zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen, einschließlich Wirkstoffen oder Wirkstoffkandidaten, auf Nervenfasern von Projektionssystemen, insbesondere deren Wachstum und Ausrichtung.

Stand der Technik:

Das zielgerichtete Wachstum von neuronalen Fortsätzen und Faserprojektionen ist bei normalen physiologischen Wachstumsvorgängen sowie bei Regenerations- und Reorganisationsprozessen nach Schäigung des Nervensystems (z. B. ischämische und traumatische Ereignisse des Gehirns bzw. Verletzungen des Rückenmarks) von Bedeutung. Weiterhin resultieren pathophysiologische Krankheitsbilder wie Parkinson und Schizophrenie in Veränderungen und Verlust neuronaler Strukturen, verbunden mit Schädigungen der beteiligten Projektionssysteme. Aufgrund der Tatsache, dass viele neurologische Erkrankungen bis heute nur unzureichend erforscht sind und ein wachsendes Interesse besteht, Substanzen zu entwickeln, die regenerative Prozesse unterstützen können, steht die Suche nach geeigneten Modellen zur Wirkstofftestung im Vordergrund. Methoden, welche eine zuverlässige Quantifizierung dieser Ergebnisse erlauben, sind in Kombination mit den entsprechenden Wachstumsmodellen von besonderer Bedeutung.

Es wurden bislang vorwiegend Zellkulturmodelle verwendet, um den Einfluss bestimmter Substanzen auf das Zellwachstum zu untersuchen (D' Ambrosi et al., Neuroscience 2001, 108: 527–534). Dabei beziehen sich die Substanztestungen zum großen Teil auf Primärzell-Kulturen und Einzelzell-Kulturen. In diesen Modellen werden Zellen genutzt, die während der Präparation aus ihrem intakten Umfeld gelöst werden und damit kommt es zur Zerstörung von Zell-Zell-Verbindungen, Verschaltungen und Interaktionen. Aussagen zum Verhalten der Zellen im Zellverbund und zum Einfluss der Substanzen auf die Entwicklung von Projektionssystemen können nicht mehr getroffen werden.

Die Vorteile von Primärzell-Kulturen und Einzelzell-Kulturen sind ihre einfache Zugänglichkeit und der überschaubare präparative Aufwand, der benötigt wird, um in kurzer Zeit eine große Anzahl potentieller Substanzen zu testen. Bedeutende Nachteile dieser Modelle bestehen in der Künstlichkeit des Systems (Loslösen der Zellen aus dem Zellverband), da entweder primäre Zellen von embryonalem Gewebe bzw. Zelllinien verwendet werden, die in ihrem Verhalten deutlich von den in vivo-Bedingungen abweichen. Weiterhin können durch präparative Maßnahmen (Zellpassagierung) sowie durch das Fehlen des natürlichen Zellverbundes bzw. der afferenten und efferenten neuronalen Verschaltungen adaptive Veränderungen in Morphologie und Funktion entstehen. Somit können die erhaltenen Aussagen und Ergebnisse nicht zweifelsfrei auf die in vivo Bedingungen übertragen werden.

Der Einsatz von organtypischen Gewebe-Kulturen einzelner Himregionen, in denen intakte Gewebeschnitte kultiviert werden, ermöglicht umfassendere Aussagen zum Verhalten der Zellen im Zellverband, da die unmittelbaren Nachbarschaftsbeziehungen erhalten bleiben, womit diese Kultivierungstechnik für vielfältige Studien verwendet werden kann (Noraberg et al., Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2005, 4: 435–452; Cho et al., Curr Neuropharmacol. 2007, 5: 19–33). DE 10 2004 048 462 B4 offenbart z. B. ein Modellsystem zum Testen von pharmazeutischen Zubereitungen auf die Wirksamkeit bei entzündlichen Prozessen. In diesem werden Gewebeschnitte eines neuronalen Gewebes (wie z. B. des Hippocampus) ex vivo auf einer Membran mit einer Porengröße von mindestens 0,02 μm kultiviert. Die Gewebeschnitte werden unter geeigneten Kulturbedingungen proinflammatorischen Botenstoffen oder Inflammogenen ausgesetzt, um die Wirksamkeit dieser pharmazeutischen Zubereitungen hinsichtlich ihrer antientzündlichen Effekte im Nervensystem zu testen.

Dagegen bietet diese Kulturform, die Einzelschnitt-Kultivierung, keine Möglichkeit der Analyse von Projektionssystemen, d. h. die Beobachtung von Faserverbindungen und -verschaltungen zwischen räumlich weiter entfernten bzw. tieferen Hirnstrukturen (z. B. dem Mesencephalon) und dem Cortex. Gewebe-Kulturen einzelner regional getrennter Hirnregionen, welche im Vergleich zu Einzelzell-Kulturen ein komplexeres System darstellen, spiegeln weiterhin nur partiell die in vivo-Situationen wieder, da sie keine Aussagen über die Ausbildung von Faserbahnen zwischen den in vivo kommunizierenden Regionen ermöglichen. Die Entwicklung von Projektionsbahnen bzw. das Studium des targetorientierten Faserwachstums kann durch die Kultivierung einzelner Gewebeschnitte somit nicht berücksichtigt werden.

Ein weiterer Nachteil der zur Verfügung stehenden Testsysteme besteht in dem Fehlen eines Gesamtverfahrens (Kombination von Gewebe-Co-Kultur-Technik, Substanzapplikation und computergestützter, bildbasierter Auswertung/Analyse des Faserwachstums), welches die Kultivierung und Auswertung einschließt und zu einer verbesserten Genauigkeit, Ausbeute und Vergleichbarkeit führt.

Die Auswertung der Bilddaten wurde bisher größtenteils manuell vorgenommen. Weiterhin stehen kommerzielle Softwaresysteme wie NeuroLucida (MBF Bioscience, Williston, VT, USA) zur Verfügung, mit deren Hilfe sich gewisse geometrische Eigenschaften bestimmen lassen, nach manueller Einzeichnung der Fasern. Automatische Auswertungsverfahren beschränkten sich bisher überwiegend auf die Untersuchung der Eigenschaften gesamter Gewebsregionen (Pakura et al. SSIAI 2002: 62–66). Zum dreidimensionalen Tracing von Neuronen in konfokalen und teils auch in lichtmikroskopischen Datensätzen existieren ebenfalls verschiedene Ansätze, die größtenteils semi-automatisch die neuronalen Strukturen extrahieren. Die ausgewerteten Eigenschaften beziehen sich meist auf die Baumstrukturen der Fortsätze sowie deren Längen (He et al., Microsc. Microanal. 2003. 9, 296–310; Meijering et al. Cytometry Part A 2004, Gillies et al. International Journal of Machine Graphics and Vision 1998, 7).

Methoden zur Auswertung von Bilddaten biologischer Präparate werden auch in folgenden Patentveröffentlichungen genannt: US 5 850 464 A offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von Myelin-ummantelten Axonfasern in Bilddaten, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erhalten wurden. Das Verfahren soll durch Graustufenanalyse die Co-Lokalisation von Myelinmantel und Axonen aufzeigen. US 5 231 580 A offenbart eine Methode zur Auswertung der Eigenschaften von Nervenfasern aus Querschnitten (cross sections) mit Hilfe einer elektronischen Kamera. US 6 993 170 B2 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung geometrischer Eigenschaften von Blutgefässen (wie Durchmesser und Fläche) durch automatisierte Bildanalyse von gefärbten histologischen Gewebeschnitten.

Hinsichtlich der Auswertung der Fasern haben die existierenden Verfahren verschiedene Nachteile. Die Nachteile einer manuellen qualitativen Auswertung sind die Subjektivität und schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, was eine statistische Aussage über die Daten erschwert. Die meisten automatischen oder semi-automatischen Methoden zur Extraktion, Rekonstruktion und Analyse von Neuronen oder neuronalen Fasern beruhen auf dreidimensionalen Bildgebungsverfahren. Automatisch extrahierte Maße beschränken sich auf die Länge der Fortsätze, die Fläche oder den Verzweigungsgrad. Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass die erhältlichen kommerziellen Softwarelösungen und Bildverarbeitungsmethoden entweder einen hohen Anteil an manueller Bearbeitung erfordern oder auf eine dreidimensionale Rekonstruktion der Daten abzielen Beides ist nicht optimal für eine Quantifizierung des Einflusses verschiedener Substanzen auf das neuronale Wachstum in Gewebe-Co-Kulturmodellen unter den genannten Bedingungen. Eine besondere Schwierigkeit besteht dabei in der Extraktion und Analyse von einzelnen Fasern aus zweidimensionalen Daten. Daher beschränken sich die quantitativen Untersuchungen üblicherweise auf die Auswertung der Faserdichte und ähnlicher globaler Maße.

Aufgabe:

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Testsystem (Kit) bereitzustellen, welche die Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern bzw. Faserbahnen von Projektionssystemen ex vivo ermöglicht. Insbesondere soll durch die Erfindung ein System bereit gestellt werden, welches die Kultivierung von Projektionssystemen erlaubt und weiterhin den Einfluss von Substanzen auf das Faserwachstum intakter Projektionssysteme angemessen widerspiegelt. Ferner soll die Erfindung ein integriertes System aus ex vivo und in silico Methoden, d. h. Zellkulturtechnik und quantitativer computergestützter Auswertung, angeben.

Erfindung:

Erfindungsgemäß wird die Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen umfassend:

  • a.) Kultivierung
    i.) mindestens einer ersten Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
    ii.) mindestens einer zweiten Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
    unter Zellkulturbedingungen, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) bei Beginn der Kultivierung nebeneinander auf einem Träger aufgebracht werden,
  • b.) Zugabe der zu untersuchenden Substanz (Testsubstanz),
  • c.) Untersuchung, ob sich zwischen den Gewebeproben i.) und ii.) Faserprojektionen ausgebildet haben
  • d.) Auswertung der Fasereigenschaften, bevorzugt computergestützt.

Unter einem Projektionssystem werden im Sinne der Erfindung afferente und efferente Faserverbindungen und -verschaltungen zwischen zwei unterschiedlichen Strukturen oder Regionen des zentralen Nervensystems, bevorzugt räumlich weiter entfernten Hirnstrukturen, wie z. B. dem Mesencephalon und dem Cortex, verstanden. Unter Faserprojektionen oder Projektionsbahnen werden die einzelnen Faserbahnen verstanden, die Teil eines Projektionssystems sind. Die Faserbahnen werden aus Fasern gebildet, die gezielt in eine Richtung verlaufen.

Die in der Erfindung verwendeten Gewebeproben i.) und ii.) stammen somit aus zwei unterschiedlichen Regionen des zentralen Nervensystems. Die erste Gewebeprobe i.) stammt bevorzugt aus dem Mittelhirn (Mesencephalons), besonders bevorzugt dem ventralen tegmentalen Areal/Substantia nigra-Komplex (VTA/SN-Komplex), oder dem Striatum, oder dem Rückenmark Die zweite Gewebeprobe ii.) stammt bevorzugt aus dem Cortex, besonders bevorzugt dem präfrontalen Cortex (PFC).

Die Erfindung kann vorteilhaft sowohl auf andere dopaminerge Projektionssysteme, bestehend aus VTA/SN-Komplex und Striatum (STR) oder Cortex und STR, als auch auf andere existierende Projektionssysteme angewendet werden. In diesem Zusammenhang sind auch Gewebekombinationen zwischen Rückenmark und Cortex zu nennen. Weiterhin sind Kombinationen von drei Gewebeproben (Triple-Kulturen) möglich, z. B. bestehend aus VTA/SN-Komplex, STR und Cortex.

Die Gewebeproben sind bevorzugt Gewebeschnitte, die vorzugsweise eine Dicke von 150 μm bis 400 μm, bevorzugt 200 bis 350 μm aufweisen. Der Durchmesser der einzelnen Gewebeschnitte hängt von der in vivo-Größe der einzelnen Hirnareale, der Tierspezies und dem Alter des Tieres ab, wobei die Gewebeschnitte vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 0,05 cm bis 2,0 cm, bevorzugt 0,1 cm bis 0,5 cm aufweisen.

Die Gewebeproben stammen bevorzugt von Vertebraten, insbesondere Säugetieren, einschließlich transgener und knock-out Tiere, besonders bevorzugt aus Ratten und Mäusen.

Die Gewebeproben enthalten lebende Zellen, bei denen die Nachbarschaftsbeziehungen und Signaltransduktionswege zwischen den Zellen erhalten sind. Die Gewebeproben bestehen bevorzugt aus nativem Gewebe. Die Gewebeproben werden bevorzugt fisch aus dem Tier isoliert und nach der Isolierung bis zu 4 Wochen unter Zellkulturbedingungen kultiviert, bevorzugt für 8 bis 20 Tage. Es ist auch eine verzögerte Kultivierung der Gewebeproben möglich, wobei das Gewebe nach Isolation sofort auf eine Form haltbar gemacht wird, so dass nach Beendigung des Prozesses lebendes Gewebe zur Verfügung steht.

Das erfindungsgemäße Verfahren, welches auf einer Co-Kultur von organtypischem Gewebe basiert, bietet ihrerseits die Möglichkeit, physiologische und pharmakologische Eigenschaften neuronaler Kreisläufe, die Entwicklung von Faserprojektionen zwischen miteinander kultivierten Hirnregionen sowie die Beeinflussung des Wachstums durch verschiedene Substanzen unter kontrollierten ex vivo-Bedingungen, zu studieren. Die ursprüngliche Gewebeorganisation, die zelluläre Kommunikation und afferente und efferente Verschaltungen bleiben erhalten und somit wird die Physiologie des Organs bzw. Gewebeschnittes erheblich besser widergespiegelt, als bei primären Einzelzell-Kulturmodellen bzw. Einzelschnitt-Kulturen. Neben der Bestimmung von globalen Maßen wie der Faserdichte, Länge der Fortsätze und dem Verzweigungsgrad ermöglicht die bioinformatische Auswertung die Beurteilung des Wachstums einzelner Fasern (insbesondere die „Geradlinigkeit” des Faser-Verlaufs sowie ihrer Zielorientierung) und ist damit besonders gut geeignet, den Einfluss verschiedener Substanzen auf die targetorientierte(Re)-Generation neuronaler Fasern zu beschreiben.

Die Gewebeproben i.) und ii.) sind zueinander auf der Membran vorzugsweise in einem Abstand von 0 bis 0,8 cm, besonders bevorzugt von 0,05 cm bis 0,2 cm aufgebracht.

Der Träger ist bevorzugt eine Membran oder aus einem Trägermaterial (wie Glas oder Kunststoff), das eine Zellhaftung und/oder Adhäsion der Gewebeproben ermöglicht.

Die Membran ist bevorzugt semipermeabel, insbesondere für Gase, z. B. für ein im Rahmen der Kailtivierung verwendetes Kulturgas (wie CO2), sowie für Flüssigkeiten, wie z. B. ein Nährmedium.

Weiterhin ist die Membran bevorzugt porös und weist vorzugsweise einen Porendurchmesser von 0,02 μm bis 10 μm, bevorzugt von 0,2 μm bis 1 μm auf. Darüber hinaus sind die Membranen bevorzugt für chemische oder biochemische Verbindungen, die im Kulturmedium gelöst oder suspendiert vorliegen, so wie im Rahmen der Erfindung zu testende Substanzen, Faktoren und Moleküle, durchlässig. Derartige Membranen sind dem Fachmann bekannt und können kommerziell erworben werden. Weiterhin bestehen diese Membranen bevorzugt aus Materialien, die die oben genannten Eigenschaften aufweisen, porös und durchlässig fit die angegebenen Gase, Flüssigkeiten, Verbindungen und/oder Substanzen sind und weiterhin eine geeignete Adhäsion der Gewebeproben ermöglichen.

Das Trägermaterial ist bevorzugt transparent. Bevorzugt wird das Trägermaterial mit Stoffen beschichtet, welche eine Zellhaftung und/oder Adhäsion der Gewebeproben ermöglichen und/oder unterstützen. Derartige Stoffe sind insbesondere Adhäsionsproteine, bevorzugt Kollagen, Fibronektin und/oder Laminin.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in Schritt b.) die Zugabe einer zu testenden Substanz. Die Erfindung ermöglicht damit ein Screening von Wirkstoffkandidaten hinsichtlich ihres Effekts auf das Faserwachstums innerhalb von Projektionssystemen. Damit eignet sich das Verfahren insbesondere für ein systematisches Screening von z. B. wachstumsmodulatorischen Substanzen und Wirkstoffen. Die Art der applizierten oder injizierten Stoffe, Substanzen und/oder Zellen (einschließlich Stammzellen und Vorläuferzellen, sowie markierte Stammzellen/Vorläuferzellen) sowie die Applikationsart (Applikation ins Medium, Applikation auf den Schnitt, Mikroinjektion in das Gewebe), Applikationsintervalle und die Substanzkonzentration können vorteilhaft variiert werden. Dabei können zu testende Substanzkombinationen gemeinsam und/oder jeweils zeitlich versetzt appliziert werden.

Die im Rahmen der Erfindung zu testenden Substanzen umfassen sowohl feste, flüssige und gasförmige chemische als auch biochemische Verbindungen (wie z. B. Proteine, Peptide, siRNA) bzw. deren Metaboliten oder ein Substanzgemisch. Im Rahmen der Erfindung kann vorteilhaft auch der Einfluss, den Zellen auf Projektionssysteme haben, getestet werden. Der Begriff Testsubstanz umfasst daher auch Zellen (einschließlich Zelllinien, Stammzellen und Vorläuferzellen, sowie markierte Stammzellen/Vorläuferzellen). Der Begriff Testsubstanz schließt auch Vektoren, die zum Einschleusen von DNA oder anderen Substanzen (wie Peptiden oder siRNA) in eine Zelle dienen (wie Plasmide, Viruspartikel, Liposomen) mit ein.

Bevorzugt wird vor, parallel oder nach Zugabe der zu untersuchenden Substanz ein Tracer zugeben, der in Schritt c.) durch bildgebende Verfahren detektiert wird. Als Tracer eignen sich z. B. polare Tracer wie Biocytin, lipophile Fluoreszenztracer wie Carbocyanide (z. B. Dil) oder weitere Farbstoffe (insbesondere Fluoreszenz- oder Lumineszenzfarbstoffe) oder auch radioaktiv markierte Stoffe. Dabei kann der jeweilige Tracer in das Medium und/oder auf das Gewebe appliziert beziehungsweise per Mikroinjektion in das Gewebe oder durch geeignete Methoden in die Zellen eingebracht werden. Bevorzugte Tracer im Rahmen dieser Erfindung sind Tracer die in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Lipophilie und aufgrund einer geeigneten Applikationsart eine Aufnahme in die Zellen ermöglichen.

Der Tracer wird vorzugsweise auf eine der co-kultivierten Gewebeproben aufgebracht oder wie oben beschrieben in Zellpopulationen oder Einzelzellen eingebracht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch die gleichzeitige Analyse verschiedener Projektionsbahnen. Dabei wird bevorzugt eine Kombination mehrerer verschiedener Tracer (z. B. unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe) zur parallelen Detektion verwendet. Die kombiniert angewendeten Tracer werden auf die selbe oder bevorzugt auf eine weitere co-kultivierte Gewebeprobe aufgebracht. Dadurch wird ein Tracing verschiedener Projektionsbahnen und somit die gleichzeitige Beobachtung afferenter und efferenter Verschaltungen ermöglicht.

Der Tracer ermöglicht vorteilhaft die Detektion der ausgebildeten Fasern z. B. durch immunohistochemische Methoden (z. B. Detektion von Biocytin mittels eines Streptavidin-Enzymkonjugats und Farbreaktion mit einem chromogenen Substrat oder mittels einem mit Streptavidin gekoppeltem Fluorochrom) oder mittels Fluoreszenzmikroskopie, z. B. über die Kopplung mit einem fluoreszenzmarkierten Stoff oder über seine Fluoreszenz (Eigenfluoreszenz).

Die Untersuchung in Schritt c.) erfolgt bevorzugt durch Mikroskopie, z. B. Durchlicht-, Fluoreszenz- oder Laserscanningmikroskopie [LSM] (wie konfokale Laserscanningmikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie).

Die Mikroskopie kann am lebenden Gewebe oder nach Fixation (z. B. mit Paraformaldehyd) erfolgen. Für die Fixierung wird vorzugsweise eine Fixationslösung, die Paraformaldehyd oder ein anderes geeignetes Fixationsmittel enthält, bevorzugt direkt oberhalb und unterhalb der Membran aufgebracht. Bevorzugt werden die Gewebe-Co-Kulturen auf dem Träger verbleibend fixiert. Weiterhin sind auch andere, für Säugergewebe verwendete, Fixationslösungen und -schritte einsetzbar.

Weiterhin erfolgt im Rahmen der Erfindung optional ein zusätzlicher Bleich- bzw. ein Reinigungsschritt (mit dafür vorgesehenen organischen Lösungen z. B. einem Gemisch aus Benzylbenzoat/Benzylalkohol) des Gewebes vor, parallel oder nach Durchführung des Schrittes c, um die Qualität der mikroskopischen Auswertung zu erhöhen.

Die Kultivierung der Gewebeproben erfolgt bevorzugt unter Standardkulturbedingungen für Säuger-Gewebe bzw. -Organe. Vorteilhaft ist es jedoch auch möglich die Auswirkungen der Testsubstanz(en) auf die Ausbildungen der Projektionssysteme unter speziellen Bedingungen zu prüfen. Somit können beispielsweise die regenerativen Eigenschaften von Testsubstanzen innerhalb pathologischer Mechanismen, wie z. B. nach vorheriger Hypoxie/Ischämie, getestet werden. Dazu wird die Gewebe-Co-Kultur gezielt pathologischen Bedingungen (wie z. B. Sauerstoffmangel, Glucosemangel) ausgesetzt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird es auch möglich, die Auswirkung mehrerer Substanzen gleichzeitig auf die Gewebe-Co-Kultur zu untersuchen, z. B. die Auswirkung einer Testsubstanz in Gegenwart eines bekannten Rezeptoragonisten oder -antagonisten oder Wachstumsfaktors. Außerdem kann die Auswirkung eines Lösungsmittels (z. B. DMSO) bzw. einer Testsubstanz, gelöst in einem Lösungsmittel, auf die Gewebe-Co-Kultur geprüft werden.

Die Erfindung gibt vorteilhaft ein Verfahrensablauf an, welcher die Co-Kultivierung, Substanz-Behandlung und die quantitative Auswertung (Schritt d des erfindungsgemäßen Verfahrens) von Projektionssystemen ermöglicht, um den Einfluss von Stoffen und pharmazeutischen Zubereitungen, insbesondere hinsichtlich ihrer wachstumsmodulatorischen Wirkung zu untersuchen.

Die quantitative Analyse des Wachstums wird bevorzugt auf der Basis von digitalen mikroskopischen Bilddaten durchgeführt. Um eine hohe Quantität bei der Auswertung zu erzielen, werden die geometrischen sowie kontrast- und intensitätsbezogenen Eigenschaften der neuronalen Fasern bevorzugt automatisch extrahiert und quantifiziert. Damit eignet sich das beschriebene Verfahren besonders für ein systematisches Screening von Substanzen, um ihren Einfluss auf Wachstum und Regenerationsfähigkeit von neuronalem Gewebe zu analysieren. Die Auswertung basiert auf einer Software, die verschiedene Methoden der digitalen Bildverarbeitung implementiert. Hierbei handelt es sich um eine Verarbeitungskette aus mehreren Schritten, welche zum Teil auf existierenden Methoden (Hintergrundkorrektur, Intelligent scissors, Skelettierung) und neuen Methoden (graphbasierte Faserbeschreibung, Selektion der Startpunkte für die konturbasierte Segmentierung) basiert.

Der Auswertungsschritt d.) wird bevorzugt Computer-implementiert durchgeführt und umfasst folgende Teilschritte:

  • d1.) Skelettierung und Extraktion der Fasern,
  • d2.) Bestimmung von Knotenpunkten der extrahierten Fasern und kontinuierliche Rekonstruktion der Faserverläufe zwischen den Knotenpunkten, bevorzugt durch konturbasierte Methoden, insbesondere nach der Intellligent scissors Methode oder durch Interpolation der diskreten Daten,
  • d3.) kontinuierliche Darstellung und/oder graphbasierte und/oder interpolierte Darstellung der Fasern,
    wobei mindestens eine der folgenden Faserparameter wie folgt bestimmt wird:
  • d4.) Bestimmung der Faserdichte durch Berechnung des Anteils der Vordergrundstrukturen in der gesamten Bildgröße (pixelbasiert) oder über die Anzahl der Kanten (optional mit Wichtung über die Länge) mittels der graphbasierten Darstellung der Fasern,
  • d5.) Bestimmung der Geradlinigkeit des Faserwachstums durch Berechnung der Winkelverteilung entlang der Hauptwachstumsrichtung oder mittels Hauptkomponentenanalyse zur Bestimmung der Variation orthogonal zur Hauptwachstumsrichtung (2. Hauptkomponente) auf Basis der kontinuierlichen Darstellung und/oder der interpolierten Darstellung und/oder durch Analyse der Krümmung entlang der Fasern auf Basis der kontinuierlichen Darstellung.

Die im Schritt d2.) genannten diskreten Daten sind entweder die Pixel (aus denen das Bild aufgebaut ist) oder die Knotenpunkte.

Die kontinuierliche Darstellung gibt den kompletten Faserverlauf möglichst detailgetreu wieder und wird bevorzugt durch kontinuierliche Rekonstruktion der Faserverläufe zwischen den Knotenpunkten, insbesondere Anfang- und Endpunkt der Fasern, mittels konturbasierter Methoden erhalten, insbesondere nach der Intelligent scissors Methode.

Die graphbasierte Darstellung wird durch Verbindung der Knotenpunkte mit einzelnen Linien erhalten (z. B. wie Braumann UD et al. 2006 in Handels et al. (Hrsg.) Bildverarbeitung für die Medizin 2006 – Algorithmen, Systeme, Anwendungen, S. 379–383. Springer Verlag, Reihe Informatik aktuell).

Die interpolierte Darstellung wird bevorzugt durch Interpolation der diskreten Daten, bevorzugt der Pixel, erhalten.

Der bevorzugte schematische Ablauf der Bildverarbeitungskette wird im Folgenden kurz beschrieben:

  • 1. optionale Vorverarbeitung der Bilder:
    ggf. Umwandlung von Farbtönen in Graustufen (Standardmethode), – Nichtlineare Glättung mittels Total-Variation-Filter und/oder oszillierenden Funktionen (z. B. nach Vese, Osher 2004 Journal of Mathematical Imaging and Vision 20 (1–2), 07–18 – Morphologische Top-Hat-Transformation zum Hervorheben linearer Strukturen (z. B. gemäß Wolfram Mathematica 7.0),
  • 2. Skelettierung und Extraktion der Faserstücke, Bestimmung von Knotenpunkten (Eigenentwicklung),
  • 3. Graphrepräsentation der Fasern (Eigenentwicklung),
  • 4. konturbasierte Extraktion der Faserverläufe mit sub-pixel-Genauigkeit (eigene Implementierung, Standardmethode nach Intelligent scissors for image composition – Mortensen, Barrett 1995, Computer Graphics, SIGGRAPH 95 191–198,
  • 5. optional: Nachkorrektur der extrahierten Fasern durch automatische Konsistenzprüfung (Eigenentwicklung),
  • 6. optional: bei ungenügender Genauigkeit der automatischen Verfahren, kennen die Endpunkte interessanter Fasern auch manuell markiert werden, die Extraktion erfolgt dann wieder automatisch,
  • 7. Auswertung der Faserdichte, Berechnung des Anteils der Vordergrundstrukturen an der gesamten Bildgröße (auch mit lokaler Gewichtung oder auf verschiedenen Skalen) (Eigenentwicklung),
  • 8. alternative Auswertung der Faserdichte über die graphbasierte Darstellung. Da Linienstrukturen in einem zweidimensionalen Bild prinzipiell eine Nullmenge darstellen, sind pixelbasierte Verfahren zur Bestimmung der Faserdichte eigentlich recht unzuverlässig und auflösungsabhängig. Durch unsere spezifische Darstellung der Fasern als Kanten in einem Graphen kann auch die Anzahl der Kanten als Maß für die Anzahl linearer Strukturen im Bild genommen werden, das unabhängig von der Dicke der Faserstrukturen und der Auflösung der Bilddaten ist. Bei Bedarf kann mit der Länge der Kanten gewichtet werden, um lange Strukturen besser zu berücksichtigen (sonst werden kurze, unterbrochene Stücken übermäßig gewichtet)
  • 9. Auswertung der Geradlinigkeit des Faserwachstums, Berechnung der Winkelverteilung entlang der Hauptwachstumsrichtung durch Extrapolation der diskreten Daten, Hauptkomponentenanalyse zur Bestimmung der Variation orthogonal zur Hauptwachstumsrichtung, diese wird als Maß der Geradlinigkeit benutzt (auch normiert auf die Länge),
  • 10. Darstellung der Werte (Boxplots der Verteilungen, Darstellungen der Fasern, farbliche Darstellung der Winkelvariation (Eigenentwicklung)).

Die computergestützte Auswertungsmethode vermeidet vorteilhaft die oben erwähnten Mängel des Standes der Technik (vor allem das Problem der Subjektivität). Die besonderen Merkmale dieser Methode stellen die Extraktion einzelner Fasern aus den Bilddaten sowie die Analyse der allgemeinen Wachstumseigenschaften mittels geeigneter Kenngrößen dar. Um die Eigenschaften projizierender Systeme zu analysieren sind Maße (wie beispielsweise die „Geradlinigkeit” des Wachstums) von Interesse, die normalerweise nicht bestimmt werden bzw. aus den meisten Ansätzen (wie der Auswertung von Cross-Sections) nicht bestimmt werden können.

Der Faserverlauf wird aus den Bildern entweder automatisch oder durch ein semi-automatisches Verfahren mit minimaler Interaktion gewonnen. Die Ermittlung der Geradlinigkeit des Wachstums und der Dicke der Fasern, sowie ggf. weiterer Parameter erfolgt bevorzugt vollständig automatisch.

Die computergestützte Auswertung des targetorientierten Faserwachstums, besonders der Beschreibung der „Geradlinigkeit des Wachstums” erfolgt bevorzugt mittels Analyse der Winkelverteilung und/oder Hauptkomponentenanalyse auf der Basis digitaler Bilder aus mikroskopischen Bildgebungsverfahren, z. B. Durchlicht-, Fluoreszenz- oder Laserscanningmikroskopie (wie konfokale Laserscanningmikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie).

Um den Faserverlauf möglichst exakt reproduzieren zu können, werden in Schritt d.) zunächst Knotenpunkte des Fasergraphen bevorzugt automatisch (oder auch semi-automatisch – s. unten) bestimmt und zwischen Ihnen der Verlauf der Faser konturbasiert bestimmt. Dazu wird bevorzugt die ”intelligent scissors” Methode benutzt. Es sind jedoch auch andere konturbasierte Verfahren einsetzbar. Mittels dieser Methoden ist es möglich, trotz vorhandener ”Lücken” in den Bilddaten, die aus einer vesikulären Speicherung des Tracers sowie projektionsbedingt durch die zweidimensionale Bildgebung entstehen, kontinuierliche Verläufe zu gewinnen. Hierzu werden bevorzugt verschiedene Kombinationen an Ausgangsknoten zur Initialisierung der konturbasierten Methode benutzt. Vorteilhaft können anschließend falsch detektierte Fasern automatisch entfernt werden. Dazu wird bevorzugt das Integral der Grauwerte entlang der Faser bestimmt. Basierend auf diesen Werten werden nur Fasern, die einen vorher festgelegten Schwellenwert überschreiten, ausgewählt (und die anderen entfernt). Daran schließt sich bevorzugt eine Normalisierung bzgl. der Länge der Fasern an.

Alternativ erfolgt eine semi-automatische Extraktion der Fasern aus den Bildern. Dazu werden Anfang und Ende einer Faser manuell markiert und ihr Verlauf dann automatisch mittels einer konturbasierten Methode erfasst.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computerprogrammprodukt welches Schritt d.) des erfindungsgemäßen Verfahrens implementiert und optional zusätzlich mindestens einen der vorherigen Schritte a.) bis c.), insbesondere die Schritte b.) und c.), automatisiert. Bevorzugt werden neben der Auswertung bevorzugt die Schritte Präparation, Kultivierung, Zugabe der zu untersuchenden Substanz, Tracerzugabe und/oder Bildaufnahme automatisiert bzw. teilautomatisiert.

Das Computerprogrammprodukt liegt bevorzugt als eigenständiges interaktives Interface für Wolfram Mathematica 7.0 vor. Es besteht aus dem Mathematica Code für das User Interface und Visualisierung sowie einige Vorverarbeitungsschritte zusammen mit einer C-Bibliothek, die verschiedene Bildverarbeitungsmethoden beinhaltet.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computer oder eine Datenverarbeitungsanlage auf dem das erfindungemäße Computerprogrammprodukt installiert ist. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Datenträger auf dem das erfindungemäße Computerprogrammprodukt gespeichert ist. Der Begriff Datenträger umfasst insbesondere optische (z. B. CD, DVD, Blueray) und elektronische Speichermedien (ROM, USB-Stick, Speicherkarten).

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testsystem, insbesondere zur Untersuchung von Projektionssystemen, insbesondere des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen, umfassend ein erfindungsgemäßes Computerprogrammprodukt bzw. Computer, Datenverarbeitungsanlage oder Datenträger und mindestens einen der weiteren Komponenten ausgewählt aus:

  • – Zellkulturmedien,
  • – Tracer,
  • – Fixierungsmittel,
  • – Referenzsubstanzen,
  • – ein bildgebendes System (bevorzugt ein Mikroskop),
  • – Handbuch.

Mit dem oben genannten Testsystem kann der Anwender den Einfluss von Substanzen auf das Wachstum und die Ausrichtung von Nervenfasern, innerhalb von ex. vivo rekonstruierten Projektionssystemen, bestehend aus verschiedenen Gewebeproben, untersuchen. Bevorzugt enthält das Testsystem zur direkten Anwendung zusätzlich:

  • i.) mindestens eine erste Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
  • ii.) mindestens eine zweite Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
    wobei die Gewebeproben i.) und ii.) nebeneinander auf einer Membran aufgebracht sind.

Die Gewebeproben sind bevorzugt, wie oben beschrieben ausgewählt und auf der Membran aufgebracht.

Die Tracer sind bevorzugt wie oben beschrieben ausgewählt. Als Referenzsubstanzen eignen sich beispielsweise Wirkstoffe mit bekannter Wirkung auf das ZNS oder bekannte Rezeptoragonisten oder – antagonisten sowie Wachstumsfaktoren.

Das erfindungsgemäße Testsystem besteht vorteilhaft aus einem einfachen, leicht zugänglichen Gewebe-Co-Kultursystem, welches den komplexen Aufbau der neuronalen Verschaltungen und Strukturen sowie der neuronalen Projektionsbahnen angemessen widerspiegelt.

Als funktionales Testsystem werden organtypische Gewebe-Co-Kulturen, welche bei geringerer Zeit- und Kostenaufwendung, im Vergleich zu Ganztiermodellen einen hohen Durchsatz an Substanzen ermöglichen, eingesetzt. Im Rahmen der Erfindung werden vorzugsweise Gewebe-Co-Kulturen des dopaminergen Systems eingesetzt.

Die Erfindung wird nachfolgend durch Abbildungen und Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.

1 zeigt die vorverarbeiteten Bilddaten, jedoch als Dithering anstelle von Graustufen,

2 zeigt die extrahierten Pixel, die zu Fasern gehören.

3 zeigt eine graphbasierte Darstellung der extrahierten Graphenstrukturen (Originalbild im Hintergrund).

4 und 5 zeigen Beispiele extrahierter Faserverläufe am Ende der Bildverarbeitungsschritte, dazu wurden die Fasern gedreht und auf das gleiche Koordinatensystem gebracht, von diesen Daten werden dann die Wachstumscharakteristiken berechnet.

6 zeigt ein Beispiel automatisch extrahierter, kontinuierlicher Faserverläufe.

Ausführungsbeispiel 1Co-Kultivierung:

Die Präparation der organotypischen Gewebe-Kulturen erfolgte nach Franke et al., 2003; Heine et al., 2006, 2007. Dazu wurden von 1–5 Tage alten Wistar Ratten die Gehirne unter sterilen Bedingungen unter einer Laminarbox entnommen. Aus dem Mesencephalon wurde der ventrales tegmentales Areal/Substantia nigra-Komplex (VTA/SN-Komplex) bzw. aus dem Cortex der präfrontale Cortex (PFC) präpariert. Mit Hilfe eines Vibratoms wurden 200 μm bis 350 μm dicke Schnitte angefertigt Danach erfolgte das Auflegen der Schnitte als Gewebe-Co-Kulturen auf semipermeable Membranen (Millicell, Firma Millipore) im Abstand von 0,5–1 mm, welche in 6-Kultur-Wellplatten (Nunclon Surface, Firma Roskilde) gelegt wurden. Der Durchmesser der Gewebeproben betrug dabei 0,15–0,3 cm. Die Kulturen wurden von unten mit nährstoffhaltigem Zellkulturmedium (50% Minimal Essential Medium, 25% Hanks Balanced Salt Solution und 25% hitzeinaktiviertes Pferdeserum) versorgt und hatten von oben Kontakt mit sauerstoffhaltiger Atmosphäre (5% CO2).

Substanz-Behandlung mit anschließendem Tracing:

Alle 2 bis 3 Tage erfolgte der Austausch des Mediums bzw. die Behandlung mit den entsprechenden Substanzen, welche in das Medium appliziert wurden. Die Kulturen befanden sich für 12 Tage im Brutschrank. 2 Tage vor Beendigung der Inkubationszeit durch Fixation mit einem Medium, welches Paraformaldehyd und Pikrinsäure enthielt, erfolgte die Behandlung mit dem löslichen Tracer Biocytin. Dabei wurden die Biocytin-Kristalle auf den VTA/SN-Komplex aufgelegt. Unter Verwendung der