Title:
Verfahren zur in vitro Erfassung und Unterscheidung von pathophysiologischen Zuständen
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von definierten Polynukleotiden zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur in vitro Erfassung und/oder Früherkennung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung und/oder Beurteilung von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten, wobei der pathophysiologische Zustand ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma.




Inventors:
Möller, Eva, Dr. (07751, Jena, DE)
Wlotzka, Britta, Dr. (99084, Erfurt, DE)
Ruryk, Andriy, Dr. (07745, Jena, DE)
Application Number:
DE102009044085
Publication Date:
11/17/2011
Filing Date:
09/23/2009
Assignee:
SIRS-Lab GmbH, 07745 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE102007036678A1N/A



Foreign References:
WO2004087949A2
WO2007124820A2
WO2003084388A2
6960439
WO2005083115A2
WO2005106020A1
WO2006042581A1
WO2006100203A2
WO2007144105A2
20060246495
Other References:
Kumar et. al., 2006
Marshall et. al., 2003
Blake 2008
Koulaouzidis et al. 2009
Marshal et al., 2003
Alberti et al., 2003
Brun-Buisson et al., 1995
Le-Gall et al., 1995
Brun-Buisson et al., 2003
MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990
"American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992
Bone et al., 1992
Bone et al., 1992
Poeze et al., 2003
Levy et al., 2003
Opal et al., 2005
Carrigan et al., 2004
Sponholz et al., 2006
Ruokonen et al., 1999
Suprin et al. 2000
Ruokonen, et al., 2002
Tang et al., 2007a
Sponholz et al., 2006
Kofoed et al., 2007
Simon et al., 2004
Mathiak et al., 2003
Pachot et al., 2006
Ramilo et al., 2007
Bone et al., 1992
Tang et al., 2007b
Johnson et al., 2007
Tang et al., 2007b
Johnson et al., 2007
Feezor et al., 2003
Ramilo et al., 2007
Simon et al., 2005
Pruitt et al. 2007; The NCBI handbook 2002
The NCBI handbook 2002
The NCBI handbook 2002
The NCBI handbook 2002
The NCBI handbook 2002
Pruitt et al. 2007
Bone et al., 1992
Levy et al., 2003
Zeni et al., 1997
Knaus et al., 1985
Bone et al., 1992
Roth und Basello, 2003
Amin und Kauffman, 2003
Pile et al., 2006
Bone et al., 1992
Levy et al., 2003
Bone et al., 1992
Levy et al., 2003
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
www.ncbi.nlm.nih.gov
www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html
Altschul et al., J Mol Biol 215: 403-410; 1990
Valasek und Repa, 2005
Klein, 2002
Wong et al., 2005
Bustin 2002
Nolan et al., 2006
Kubista et al., 2006
Whitcombe et al,. 1999
Huggett et al., 2005
Golub et al., 1999
Hastie et al., 2001
Breiman, 2001
Ding und Gentleman, 2004
Vapnik, 1999
Hastie et al., 2001
IVDMIA, FDA-Guidelines, 2003
Mayhall, 2001
Liu et al., 2005
Johnson et al., 2007
Tang et al., 2007a
Levy et al., 2003
ACCP/SCCM, 1992
Levy et al., 2003
Calandra und Cohen, 2005
Buneß et al., 2005
Hastie et al., 2001
Hocking, R. R., 1976
www.ingenuity.com
R. app GUI 1.26 (5256), S. Urbanek & S. M. Iacus, (CR) R Foundation for Statistical Computing, 2008
www.r-project.org
Hastie et al., 2001
Hocking, R. R., 1976
Hastie et al., 2001
Fawcett T., 2006
ACCP/SCCM (1992), Crit. Care Med 20, 864-74
Alberti C, Brun-Buisson C, Goodman SV, Guidici D, Granton J, Moreno R, Smithies M, Thomas O, Artigas A, Le Gall JR; European Sepsis Group (2003) Influence of systemic inflammatory response syndrome and Sepsis on outcome of critically ill infected patients. Am J Respir Crit Care Med 168, 77-84
Altschul et al: J Mol Biol 215: 403-410; 1990
Amin K, Kauffman CA (2003), Fever of unknown origin. Postgrad med114(3), 69-75
Baker SG, und Kramer B (2006), Identifying genes that contribute most to good classification in microarray. BMC Bioinformatics 7, 407
Benson D. A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., Sayers E. W. GenBank. Nucleic Acids Res. 2009 Jan; 37 (Database issue): D26-31
Blake PG (2008) Complicated peritonitis - the biggest cause of technique failiure. Perit Dial Int. 28(4): 327-328
Attorney, Agent or Firm:
WINTER, BRANDL, FÜRNISS, HÜBNER, RÖSS, KAISER, POLTE, Partnerschaft, 85354, Freising, DE
Claims:
1. Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Früherkennung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung und/oder Beurteilung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma; wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Isolierung von Probennukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;
b) Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von wenigstens drei Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17; und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, zur Bildung wenigstens eines für die Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder den Verlauf von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten charakteristischen Multigenbiomarkers; wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind: PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
c) Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens, auf die die unter b) bestimmten Genaktivitäten bezogen, insbesondere normalisiert, werden;
d) Bilden eines Wertes aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten des Multigenbiomarkers, der den pathophysiologischen Zustand anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzgen ausgewählt wird aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus R1, R2 und R3 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Referenzgene gemäß folgender Tabelle definiert sind: ReferenzgeneTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDR1R1_ANM_00122829R1_BNM_03335530R1_CNM_03335631R1_ENM_03335832R1_FNM_00108012433R1_GNM_00108012534R2R2_1NM_00220935R2_2NM_00111438036R3R3NM_00308237


3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente zur Erfassung der Genexpressionsprofile verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Genaktivität von 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, oder 12 Polynucleotiden, oder von sämtlichen 13 Polynucleotiden bestimmt wird, wobei die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind: PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
und/oder wobei eine Anzahl von 7 Polynucleotiden bevorzugt ist.

5. Verwendung von wenigstens drei Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur in vitro Erfassung und/oder Früherkennung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung und/oder Beurteilung von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten, wobei der pathophysiologische Zustand ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma; wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind: PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128


6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen ist, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index gebildet wird.

7. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR, insbesondere sondenbasierte Verfahren wie Taq-Man, Scorpions, Molecular Beacons; und/oder mittels Hybridisierungs-verfahren, insbesondere solchen auf Microarrays; und/oder direkter mRNA-Nachweis, insbesondere Sequenzierung oder Massenspektrometrie; und/oder isothermale Amplifikation, erfasst werden.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands ist, wobei vorzugsweise der Index auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme, insbesondere für die Verwendung zur Patientenstratifikation und als Einschlusskriterium für klinische Studien, einsetzt.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente mit, einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 aufweisen.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Polynucleotide, oder sämtliche 13 Polynucleotide verwendet werden, wobei die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind: PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M5_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
und/oder wobei eine Anzahl von 7 Polynucleotiden bevorzugt ist.

12. Verwendung mindestens eines Polynukleotids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind: PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB_15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs eines pathophysiologischen Zustands.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der pathophysiologische Zustand ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA, ist.

15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur Beurteilung des pathophysiologischen Zustands neben wenigstens einem der Polynucleotide, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind: PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
noch wenigstens ein weiterer Marker verwendet wird, welcher ausgewählt Wird aus der Gruppe bestehend aus: klinischen Laborparametern, insbesondere Procalcitonin (PCT), C-reaktives Protein (CRP); Leukocytenzahl; Cytokinen; Interleukinen und genetischen, transkriptomischen und proteomischen Markern.

16. Primer zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Primer gemäß folgender Tabelle ausgewählt ist: Marker und ReferenzgenePrimer für quantitative PCR/resultierende AmplikonSEQ IDM2M2-fw38M2-rev39M2-Amplikon40M4M4-fw41M4-rev42M4-Amplikon43M6M6-fw44M6-rev45M6-Amplikon46M7M7-fw47M7-rev48M7-Amplikon49M9M9-fw50M9-rev51M9-Amplikon52M10M10-fw53M10-rev54M10-Amplikon55M15M15-fw56M15-rev57M15-Amplikon58M3M3-fw59M3-rev60M3-Amplikon61M8M8-fw62M8-rev63M8-Amplikon64M12M12-fw65M12-rev66M12-Amplikon67M13M13-fw68M13-rev69M13-Amplikon70M16M16-fw71M16-rev72M16-Amplikon73M17M17-fw74M17-rev75M17-Amplikon76R1R1-fw77R1-rev78R1-Amplikon79R2R2-fw80R2-rev81R2-Amplikon82R3R3-fw83R3-rev84R3-Amplikon85


17. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind: Marker und ReferenzgeneTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M1M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma.

18. Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotidsequenzen auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente umfassen.

19. Kit nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass der er wenigstens ein Referenzgen enthält, welches ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus: R1, R2 und R3 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Referenzgene gemäß folgender Tabelle definiert sind: ReferenzgeneTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDR1R1_ANM_00122829R1_BNM_03335530R1_CNM_03335631R1_ENM_03335832R1_FNM_00108012433R1_GNM_00108012534R2_1NM_00220935R2_2NM_00111438036R3R3NM_00308237


Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Früherkennung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen gemäß Anspruch 1, die Verwendung von wenigstens drei Polynukleotiden zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder zur Früherkennung und/oder zur Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung von pathophysiologischen Zuständen gemäß Anspruch 5, eine Verwenung gemäß Anspruch 12; Primer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 16, sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 17.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten von mindestens einem Multigenbiomarker, zur Herstellung eines Hilfsmittels zur Diagnose bei Patienten mit bestimmten pathophysiologischen Zuständen, wie beispielsweise Sepsis und Sepsisähnliche Zuständen, mit ähnlichen Merkmalen wie ein „In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay” (IVDMIA).

Sepsis („Blutvergiftung”) ist eine lebensbedrohliche Infektion, die den gesamten Organismus erfasst. Sie ist mit hoher Sterblichkeit verbunden, kommt immer häufiger vor und erfasst Menschen in jedem Lebensalter. Sepsis gefährdet den medizinischen Fortschritt in vielen Bereichen der Hochleistungsmedizin und verbraucht einen Großteil der Ressourcen im Gesundheitswesen. Die Sterblichkeit der schweren Sepsis hat sich in den letzten Jahrzehnten nicht entscheidend verbessert. Die letzten beiden Innovationssprünge nach Einführung der Blutkultur (ca. 1880) waren die Einführung der Antibiotika vor über 60 und der Beginn der Intensivmedizin vor etwa 50 Jahren. Um heute ähnlich entscheidende Behandlungsfortschritte zu erzielen, müssen neuartige Diagnostika zur Verfügung gestellt werden.

Sepsis wird durch Infektionserreger verursacht. Da es bislang keine spezielle Therapie gegen die Sepsis gibt, hängt der Erfolg der Behandlung weitgehend von der erfolgreichen Bekämpfung der zugrunde liegenden Infektion und der Qualität der intensivmedizinischen Behandlung ab. Entscheidend für das Überleben ist die frühzeitige Gabe eines Antibiotikums, das außerdem den verursachenden Erreger erfolgreich bekämpft [Kumar et. al., 2006]. Defizite der Sepsis-Diagnostik verzögern jedoch den Therapiebeginn und die Wahl eines geeigneten Antibiotikums. Da die Identifizierung des Sepsiserregers mit den derzeitigen Methoden der Blutkultur nur in weniger als 25% der Sepsisfälle gelingt und die Befunde im Fall des Erregemachweises erst nach 2–3 Tagen vorliegen, muss die initiale Wahl des Antibiotikums oder Antimykotikums (gegen Pilze gerichtete Substanzen) „kalkuliert”, d. h. auf Verdacht gewählt werden. In 20–30% der Fälle ist diese Wahl nicht richtig.

Weitere Ursachen für die Verzögerung der Therapie liegen in der Fehlinterpretation der Krankheitssymptome und Laborwerte. Verbesserte Diagnostika, die die Sepsisdiagnose vereinfachen und beschleunigen, können zu einer erheblichen Reduktion der Sepsissterblichkeit und Verkürzung ihrer Behandlungsdauer beitragen. Medizinische Fachgesellschaften bestätigen die Defizite der bisherigen Sepsis-Diagnostik in Umfragen unter nordamerikanischen und europäischen Intensivmedizinern [Marshall et. al., 2003]. Auch die Betroffeneninitiative „Deutsche Sepsis Hilfe e. V.” und der Deutschen Sepsis-Gesellschaft beklagen die Defizite.

Im Zuge der Entwicklung marktreifer in-vitro-Diagnostika aus dem Bereich molekularer Diagnostik wurde am 26.7.2007 ein Richtlinienentwurf der Food and Drug Administration (FDA) der Vereinigten Staaten von Amerika veröffentlicht. Diese Richtlinie liefert Empfehlungen, Definitionen und Anhaltspunkte für den Entwicklungs- und Zulassungsprozess. Weiterhin werden Spezifikationen für die neue Klasse der „in vitro-diagnostischen multivariaten Index-Assays (IVDMIA)” vorgeschlagen. Kennzeichen dieser Assays sind:

  • 1) Die Kombination von mehreren Einzelwerten mittels eines Interpretationsschrittes, um einen einzelnen patientenspezifischen Ausgabewert in Form eines Index, Score oder einer Klassifikation zu erhalten. Dieser Wert ist für diagnostische Aussagen, zur Schadensbegrenzung, Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit einsetzbar.
  • 2) Das erreichte Ergebnis ist von den Messwerten in einer Weise abgeleitet, die keine Rückschlüsse auf die eigentlichen Messdaten erlaubt. Daher kann das Ergebnis vom End-Anwender nicht bestätigt bzw. nachvollzogen werden.
  • 3) Dadurch ist es notwendig, dem Anwender alle Informationen zur Interpretation des Testergebnisses zur Verfügung zu stellen.

Eine Infektion ist mit den Merkmalen Aufnahme von Pathogenen, deren Vermehrung im Organismus und der damit verbundenen Auslösung von pathophysiologischen und symptomatischen Reaktionen verbunden. Im Unterschied dazu liegen bei einer Kolonisierung keinerlei Krankheitssymptome des Wirts-Organismus vor.

Infolge einer Infektion kommt es innerhalb des Körpers zu einer Konfrontation zwischen den Pathogenen und der Körpereigenen Abwehr. Bei der unspezifischen Abwehr handelt es sich um körpereigene, keimschädigende Substanzen, die im Blut gelöst sind (humoral) sowie um Granulocyten und Makrophagen, die begrenzt in der Lage sind, Eindringlinge, Fremdkörper und Zelltrümmer zu beseitigen. Das Wirkprinzip der spezifischen Abwehr besteht darin, Fremdkörper und Pathogene mit im Blut zirkulierenden Antikörpern zu markieren, um sie anschließend durch T-Lymphozyten vernichten zu lassen.

Bei der Ausbreitung eines Pathogens können mehrere krankheitserzeugende Prozesse initiiert werden. Zum einen werden Abwehrreaktionen wie z. B. Fieber, Gefäßerweiterungen und/oder Einkapselungen ausgelöst. Es kann zu einen Schädigung oder Zerstörung von Geweben, Organen oder Organsystemen z. B. Multiorganversagen (MOV) kommen. In Abhängigkeit vom Pathogen kann der Erreger Gifte, Exotoxine, absondern, die zu teilweise heftigen Reaktionen der Wirtsantwort führen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass sich Erregerbestandteile, sogenannte Endotoxine, im Falle einer Keimabtötung wie ein Gift auswirken können.

Bei einer Beschränkung des Infektionsgeschehens auf einen Bereich des Organismus spricht man von einer lokalen Infektion, wie z. B. im Falle von Abszessen oder Wundinfektionen. Die Symptome einer lokalen Infektion sind Rötung, Schwellung, Schmerz und eingeschränkte Funktion. Wenn sich die Pathogene dagegen im ganzen Körper z. B. über die Blutbahnen oder die Lymphbahnen ausbreiten handelt es sich um eine allgemeine oder generalisierte oder systemische Infektion. Vom Beginn einer Infektion bis zur Auslösung von Reaktionen (Symptomen) ist abhängig vom Individuum eine unterschiedlich lange Zeitspanne zu beobachten, die als Inkubationszeit bezeichnet wird.

Die vielgestaltige Art, Symptomatik, Schweregrad und Verläufe von Infektionen machen einen spezifischen Nachweis oder eine Differentialdiagnose bezüglich steriler Entzündungs-erkrankungen in der klinischen Routine sehr schwierig und häufig unpräzise. Hierin ist ein Hauptgrund für häufige schwere infektiöse Komplikationen in vielen unterschiedlichen Indikationen und medizinischen Disziplinen zu sehen. Es besteht ein großer medizinischer Bedarf in einer Vielzahl medizinischer Disziplinen mit ausreichender Sensitivität und Spezifität solche infektiösen Komplikationen zu erkennen, durch adäquate klinische Interventionen zu behandeln und eine Verlaufskontrolle der individuellen klinischen Maßnahmen zur Behandlung der infektiösen Komplikationen verfügbar zu machen. Dies gilt insbesondere für den Übergang von lokalen zu generalisierten Infektionen, die in kurzer Zeit zu lebensbedrohlichen Zuständen führen.

Die Unterscheidung von systemisch-inflammatorisch und infektiös bedingten Krankheitszuständen spielt für die klinischen Entscheidungen zur Behandlung von Patienten und anschließender Verlaufsbeobachtung neben der Sepsis auch in einer Reihe von weiteren Indikationen eine wichtige Rolle. In diesem Zusammenhang kann der Behandlung von akut und chronisch kranken Patienten sowie der peri-operative Kontrolle gesehen werden. Es ist bekannt, dass im Fall einer akuten Pankreatitis die Prognose eines letalen Ausgangs durch eine Infektion von 16% auf 40% signifikant verschlechtert. Bei der Ausbildung einer komplexen Superinfektion besteht ein hohes Risiko einer Sepsis mit einer Mortalität von bis zu 90%. Des Weiteren ist die Verlaufsbeobachtung einer intra-abdominalen Inflammation und/oder Infektion bei chronisch kranken, postoperativen und Trauma-Patienten von Bedeutung. Es bestehen auch heute Schwierigkeiten einer eindeutigen klinischen Diagnose von intra-abdominalen Infektionen. Die Verlaufsbeobachtung chronisch Kranker, wie zum Beispiel Patienten mit Leberzirrhose oder Niereninsuffizienz ist von klinischer Relevanz, da diese Patientengruppe in Abhängigkeit der Organdekompensation prädestiniert sein kann inflammatorische und oder infektiöse Krankenverläufe zu nehmen. Insbesondere niereninsuffiziente Patienten mit Peritonealdialyse neigen zu chronischen Inflammationen und Infektionen [Blake 2008]. Von besonderem Interesse ist die Beobachtung von Patienten mit Leberzirrhose, da diese spontane bakterielle Peritonitiden entwickeln können, die eine hohe Mortalität aufweisen. [Koulaouzidis et al. 2009]. Die Diagnose von sekundären Peritonitiden im Rahmen einer postoperativen Nachbehandlung ist von großem klinischem Wert und kann den Operationserfolg stark beeinflussen. Postoperative Infektionen sind auch heute noch ein großes Problem in der chirurgischen Behandlung. Ein Prozent der durchgeführten Laparotomien führen zu Komplikationen nach der Operation. Dabei kann die Komplikationsrate zwischen den chirurgischen Prozeduren stark schwanken. Insbesondere Eingriffe am Magen-Darm-Trakt können durch Nahtinsuffizienzen zu einer fulminanten Ausbreitung von Bakterien in den sterilen Bauchraum führen. Infektiöse Verläufe spielen unter anderem auch in der Operationsfolgebehandlung nach Transplantationen, Thorakotomien, Extremitäten- und Gelenkkorrekturen und neurochirurgischen Eingriffen eine Rolle.

Dem Fachmann ist bekannt, dass es sich bei diesen Ausführungen um lediglich um eine beispielhafte Auswahl handelt und es zahlreiche weitere Anwendungsfelder gibt, für die die Identifizierung einer infektiösen Komplikation von großer Wichtigkeit ist. Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung für dieses diagnostische Problem bereitgestellt.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Gene und/oder deren Fragmente und ihre Verwendung zur Erstellung von Multigenbiomarkern, welche spezifisch für einen Zustand und/oder Untersuchungsfrage sind.

Die Erfindung betrifft ferner von den Markergenen abgeleitete PCR-Primer und Sonden für Hybridisierungs- bzw. Vervielfertigungsverfahren.

Nach wie vor ist die Sepsis eines der schwierigsten Krankheitsbilder in der modernen Intensivmedizin, wobei für den klinisch tätigen Arzt nicht nur die Therapie, sondern auch die Diagnose eine Herausforderung darstellt. Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS und Sepsis bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [Marshal et al., 2003; Alberti et al., 2003]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20% bei SIRS, ca. 40% bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70–80% an [Brun-Buisson et al., 1995; Le-Gall et al., 1995; Brun-Buisson et al., 2003]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinischmedizinischer Bedeutung, denn dadurch wenden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z. B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz-/Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 wurde ein Anstieg um 139%, nämlich von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten verzeichnet [MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.

Im Laufe der Zeit hat der Sepsisbegriff einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)” aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [Bone et al., 1992]. Entsprechend dieser Kriterien werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom” (SIRS), „Sepsis”, „severe Sepsis” und „septic shock” unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber > 38°C oder Hypothermie < 36°C, eine Leukozytose > 12 g/l oder eine Leukopenie < 4 g/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe > 20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) < 4,3 kPa. Diese Definition hat eine hohe Sensitivität, aber eine niedrige Spezifität. Für intensivmedizinische Belange ist sie wenig hilfreich, da in der Regel jeder Intensivpatient, zumindest für kurze Zeit, die SIRS-Kriterien erfüllt.

Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine Infektion wird definiert als ein pathologischer Prozess, welcher durch eine Invasion von Pathogenen beziehungsweise potentiell pathogenen Organismen in ein normalerweise steriles Gewebe hervorgerufen wird. Wenn es dem Körper nicht gelingt, diese Infektion auf den Ursprungsort zu begrenzen, induzieren die Krankheitserreger oder deren Toxine in den vom Infektionsort entfernten Organen bzw. Geweben des Körpers eine Entzündung. Eine sofortige intensivmedizinische Behandlung, die zielgerichtete Gabe von Antibiotika und die operative Sanierung des infektiösen Herdes sind nötig, um eine Genesung zu erreichen. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsis-induzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20% aller Sepsispatienten nachgewiesen.

Es besteht unter vielen Medizinern Einigkeit darüber, dass die Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71% der befragten Ärzte trotz langjähriger klinischer Erfahrungen Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis hatten [Poeze et al., 2003]. Der Versuch, eine einheitliche Terminologie durchzusetzen, fand in der klinischen Umsetzung variable Akzeptanz. Insbesondere die Fortschritte im Verständnis der Pathophysiologie der Sepsis veranlasste verschiedene Experten, nach einer entsprechenden Modifikation der bisherigen Definitionen zu suchen. Die Definitionen von Sepsis, schwerer Sepsis und septischem Schock wurden bestätigt und als nützlich für Kliniker und Forscher beurteilt. Allerdings wurden die diagnostischen Kriterien der Sepsis erheblich erweitert, um dem klinischen Aspekt der Infektabwehr gerecht zu werden. Die internationale Sepsis-Konferenz 2001 schlug außerdem ein neues Konzept (PIRO genannt) zur Beschreibung der Sepsis vor, welches sich aus den Kriterien Prädisposition, Infektion, Immunantwort (Response) und Organdysfunktion zusammensetzt [Levy et al., 2003]. Trotz einer neuen Definition der SIRS/Sepsis mit dem Akronym PIRO [Opal et al., 2005] wird in den meisten Studien immer noch die ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 benutzt [Bone et al., 1992], um ihre Patienten zu klassifizieren.

Mehrere Ansätze zur Diagnosestellung von SIRS und Sepsis wurden entwickelt. Diese Ansätze können in 3 Gruppen geteilt werden.

Der erste Gruppe enthält Score-Systeme wie beispielsweise APACHE, SAPS und SIRS welche die Patienten auf der Basis einer Vielzahl physiologischer Indices stratifizieren können. Während in einigen Studien für den APACHE II Score ein diagnostisches Potential nachgewiesen werden konnte, haben andere Studien gezeigt, dass APACHE II und SAPS II nicht zwischen Sepsis und SIRS differenzieren können [Carrigan et al., 2004].

Die. zweite Gruppe enthält Proteinmarker, die aus Plasma und Serum nachgewiesen werden. Solche sind zum Beispiel CA125, S100B, Copeptin, Glycin Nacyltransferase (GNAT), Protachykinin und/oder seine Fragmente, Aldose 1-Epimerase (Mutarotase), Chp, Carbamoylphosphat Synthetase 1, LASP-1 (Brahms Diagnostika GmbH Deutschland), IL-1 Ra, MCP-1, MPIF-1, TNF-alpha, TNF-R1, MIG, BLC, HVEM, IL-10, IL-15, MCP-2, M-CSF, MIP-3b, MMP-9, PARC, ST-2; IL-6, sIL-2R, CD141, MMP-9, EGF, ENA-78, EOT, Gro-beta, IL-1b, Leptin, MIF, MIP-1a, OSM, Protein C, P-Selectin, und HCC4 (Molecular Staging, Inc., USA) oder CD 14 Antigen, Lipopolysaccharid-Bindungsstellen auf den Proteinen Alkalische Phosphatase und Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor (Mochida Pharm Co, Ltd. Japan). Trotz der großen Menge von patentierten Biomarkern konnten sich nur wenige im klinischen Alltag durchsetzen. Von diesen scheinen Procalcitonin (PCT, BRAHMS) und das C-reaktive Protein (CRP, Eli Lilly) die Marker zu sein, die am besten zwischen infektiösen und nicht infektiösen Ursachen der SIRS unterscheiden können.

Procalcitonin ist ein 116 Aminosäuren langes Peptid das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Dieser Marker ist im Laufe der Zeit zunehmend als neuer Infektionsmarker auf Intensivstationen eingesetzt worden [Sponholz et al., 2006]. Dieser Marker gilt als Infektionsmarker und dient dazu, den Schweregrad der Sepsis festzulegen, wobei die Dynamik der Werte wichtiger ist als die Absolutwerte selbst, um z. B. bei Herzchirurgie-Patienten zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Komplikation zu unterscheiden [Sponholz et al., 2006]. Trotz der weitgehenden Akzeptanz des Biomackers PCT konnte in internationalen Studien gezeigt werden, dass die erreichten Sensitivitäten und Spezifitäten des Sepsismarkers PCT vor allem bei der Abgrenzung einer systemischen bakteriellen SIRS, also Sepsis, von einer nicht-bakteriellen SIRS noch immer unzureichend sind [Ruokonen et al., 1999; Suprin et al. 2000; Ruokonen, et al., 2002; Tang et al., 2007a]. Die Meta-Analyse von Tang und Kollegen [Tang et al., 2007a], in der 18 Studien berücksichtigt wurden, zeigt, dass PCT nur schlecht geeignet ist, um SIRS von Sepsis zu diskriminieren. Darüberhinaus betonen die Autoren, dass PCT eine sehr schwache diagnostische Genauigkeit mit einem Odd Ratio (OR) von 7.79 hat. Als Regel benennen die Autoren, dass ein OR < 25 nicht aussagekräftig, zwischen 25 und 100 hilfreich und im Falle von mehr als 100 hoch genau ist [Tang et al., 2007a].

C-reaktives Protein (CRP) ist ein 224 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Die Messung von CRP soll dazu dienen, um den Krankheitsverlauf sowie die Wirksamkeit der gewählten Therapie zu verfolgen.

In mehreren Berichten wurde beschrieben, dass im intensivmedizinischen Bereich PCT ein besser geeigneter diagnostischer Marker als CRP ist [Sponholz et al., 2006; Kofoed et al., 2007]. Darüber hinaus wird PCT als besser geeignet als CRP angesehen, um eine nicht infektiöse versus infektiöse SIRS sowie bakterielle versus virale Infektion zu unterscheiden [Simon et al., 2004].

Es ist für den Fachmann naheliegend das die, mit dieser Erfindung bereitgestellten, Lösung mit den vorgenannten Biomarkern wie z. B. aber nicht ausschließlich PCT oder CRP kombiniert werden kann um die diagnostische Aussage zu erweitern.

Die dritte Gruppe enthält Biomarker oder Profile, die auf Transkriptom-Ebene identifiziert wurden. Diese molekularen Parameter sollten eine bessere Korrelation der molekularen inflammatorischen/immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis ermöglichen, aber auch Aussagen zur individuellen Prognose liefern. Nach derartigen Biomarkern wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen Gruppen und kommerziellen Organisationen intensiv gesucht, wie zum Beispiel Veränderungen der Cytokinkonzentrationen im Blut verursacht durch Bakterienzellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide [Mathiak et al., 2003], oder Verwendung von Genexpressionsprofilen in einer Blutprobe zur Bestimmung von Unterschieden bei überlebenden und nicht-überlebenden Sepsispatienten [Pachot et al., 2006]. Genexpressionsprofile oder Klassifikatoren sind für die Bestimmung des Schwergrads von Sepsis [WO 2004/087949], die Unterscheidung zwischen einer lokalen oder systemischen Infektion [nicht veröffentlichte DE 10 2007 036 678.9], die Identifizierung. der Infektionsquelle [WO 2007/124820] oder von Genexpressionssignaturen für die Unterscheidung zwischen mehreren Ätiologien und Pathogen-assoziierten Signaturen [Ramilo et al., 2007] geeignet. Allerdings besteht aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensitivität der Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992], der aktuell verfügbaren Proteinmarker sowie aufgrund des Zeitbedarfs des Nachweises der Infektionsursache durch Blutkultur ein dringender Bedarf für neue Verfahren, die die Komplexität der Erkrankung berücksichtigen. Viele Geneexpressionsstudien, die entweder einzelne Gene und/oder Kombinationen von Genen, die als Klassifikatoren benannt sind, verwenden sowie zahlreiche Beschreibungen von statistischen Verfahren zur Ableitung eines Score und/oder Index [WO03084388; US6960439] gehören zum Stand der Technik.

Es besteht heute ein Konsens dahingehend, dass komplexe Erkrankungen sinnvoll nur über mehrere Parameter beschrieben werden können.

In zunehmendem Maße finden molekulare Signaturen Eingang in die klinische Diagnostik, insbesondere bei komplexen Erkrankungen, die mit herkömmlichen Biomarkern nicht erfasst werden können, aber auch zur Beurteilung von Risiken für die Patienten und zur Identifizierung von Respondern beim Einsatz von Medikamenten und Therapien. Nachfolgende Aufzählung soll den aktuellen Stand und die Einsatzgebiete der Genexpressionsdiagnostik verdeutlichen.

  • 1) Die Microarray-basierte, 70 Gene umfassende Signatur namens MammaPrint (Agendia, NL) erlaubt es, eine Prognose über das Rezidiv- und Metastasierungsrisiko von Frauen mit Brustkrebs zu treffen. Dabei wird untersucht, ob das Risiko, in den nächsten Jahren entfernte Metastasen zu entwickeln, als hoch oder niedrig eingestuft werden kann und sie von einer Chemotherapie profitieren würden. Die Zulassung dieses Tests durch die FDA brachte die Entwicklung von Richtlinien für eine neue Klasse von diagnostischen Tests, sog. IVDMIA (in vitro diagnostic multivariate index assay) mit sich. Die MammaPrint-Signatur wird auf einem Mikroarray in den Laboren des Herstellers gemessen und berechnet.
  • 2) An Formalin-fixierten Gewebeproben wird mittels des Oncotype DX-Multigen-Assays (Genomic Health, USA) die Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens von Brustkrebs in Patientinnen beurteilt, sowie das Ansprechen der Patientinnen auf Chemotherapie geprüft. 21 Gene werden als „Recurrence-Score” zusammengefasst. Die Messung findet in den Räumen der Firma statt, es kommt ebenfalls die TaqMan-PCR Technologie zum Einsatz.
  • 3) Der AlloMap Genexpressionstest der Firma XDx (USA) wird zur Überwachung eventueller Abstoßungsreaktionen bei Patienten mit Herztransplantation eingesetzt, die ca. 30% der Patienten innerhalb eines Jahres zeigen. Bislang waren zur Diagnose mehrere Biopsien notwendig. Der Test basiert auf 11 quantitativen PCR-Assays (zusätzlich 9 Kontrollen und Referenzen) unter Nutzung der TaqMan Technologie (Hoffman-La Roche) in den Räumen des Herstellers. Das Probenmaterial ist Blut. Bereits zwei Monate nach der Transplantation sind die Messergebnisse zuverlässig und sagen das Ausbleiben von Abstoßungsreaktionen für die nächsten 80 Tage voraus.

Eine Gemeinsamkeit dieser Tests ist, dass die addressierte diagnostische Fragestelllung Untersuchungszeiten bis zum Vorliegendes Ergebnisses von mehreren Tagen erlaubt. Für diagnostische Tests in der Indikation Sepsis dagegen, muß die Information innerhalb eines einzigen Arbeitstages vorliegen.

Bei der Verwendung von Genexpressionsmarkern für die Bestimmung eines pathophysiologischen Zustandes werden stets die in einer Probe vorhandenen Mengen der entsprechenden mRNA, die Genexpressions-Level, quantitativ bestimmt. Die durch diese Genexpressionslevel ermittelte Information ist die jeweilige Über- oder Unterexpression dieser mRNAs die bezogen auf einen Kontroll-Zustand oder bezogen auf Kontroll-Gene experimentell ermittelt wird. Die Feststellung von Über- oder Unterexpression kann analog zur Bestimmung der Konzentration einer Protein-Biomarkers gesehen werden.

Mehrere Anwendungen von Genexpressionsprofilen sind in dem Stand der Technik bekannt.

Pachot und Kollegen demonstrieren den Nutzen von Expressionssignaturen für die Verlaufsbeurteilung von Patienten mit septischem Schock. Hier finden sich molekulare Unterschiede, die die Wiederherstellung eines funktionierenden Immunsystems in den Überlebenden Wiederspiegeln. 28 Markergene mit Funktionen im innaten Immunsystem zeigen innerhalb des ersten Tages nach Diagnose des septischen Schocks mit hoher Sensitivität (100%) und Spezifität (88%) an, ob die Immunparalyse reversibel ist und damit das Überleben des Patienten ermöglicht. Allerdings war in der Untersuchung das Patientenkollektiv zu klein (38) um ein robustes Profil zu erstellen und eine Validierung dieses Datensatzes durch einen unabähngigen Datenatz ist bislang nicht erfolgt. Der Stand der Technik enthält zahlreiche Studien zur Identifikation von Genexpressionsmarkern [Tang et al., 2007b] oder Genexpressionsprofilen für die Feststellung einer systemischen Infektion [Johnson et al., 2007].

Tang und Kollegen [Tang et al., 2007b] suchten in einer bestimmten Blutzellpopulation, den Neutrophilen, nach einer Signatur, welche eine Unterscheidung von Patienten mit SIRS und Sepsis ermöglicht. 50 Marker aus dieser Zellpopulation genügen um die Immunantwort auf eine systemische Infektion wiederzugeben und neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie und den beteiligten Signalwegen zu ermöglichen.

Die Klassifikation von Patienten mit und ohne Sepsis gelingt mit hoher Sicherheit (PPV 88% bzw. 91% in Trainings- und Testdatensatz). Die Anwendbarkeit für die klinische Diagnose ist allerdings dadurch begrenzt, dass im Blut diese Signatur von Signalen aus anderen Blutzelltypen überlagert werden kann. Bezüglich der Anwendbarkeit ist die Präparation dieser Blutzellpopulation mit erheblich erhöhtem Aufwand verbunden. Die Aussagekraft der in dieser Studie publizierten Ergebnisse ist für praktische Anwendungen jedoch limitiert, weil die Patientenauswahl sehr stark heterogen war. Es wurden Patienten in die Studie eingeschlossen, die stark unterschiedliche Begleiterkrankungen wie z. B. zu 11% bis 16% Tumorerkrankungen aufwiesen oder sehr stark unterschiedlichen therapeutischen Maßnahmen unterlagen (z. B. 27% bis 64% Vasopressor-Therapie), wodurch die Genexpressionsprofile stark beeinflusst wurden.

Johnson und Kollegen [Johnson et al., 2007] beschreiben an einem Kollektiv von Traumapatienten, dass sich die Ausprägung einer Sepsis bereits bis zu 48 Stunden vor der klinischen Diagnose anhand molekularer Veränderungen messen lässt. Die Traumapatienten wurden über mehrere Tage untersucht. Ein Teil der Patienten entwickelte eine Sepsis. Nichtinfektiöse SIRS-Patienten wurden mit präseptischen Patienten verglichen. Die identifizierte Signatur aus 459 Transkripten setzt sich aus Markern der Immunantwort und Entzündungsmarkern zusammen. Probenmaterial war Vollblut, die Analysen wurden auf einem Mikroarray durchgeführt. Unklar ist, ob sich diese Signatur auch auf andere Kollektive septischer bzw. präseptischer Patienten ausdehnen lässt. Eine Klassifikation und der diagnostische Nutzen dieser Signatur wurde nicht gezeigt.

Weiterhin werden im Stand der Technik andere Signaturen beschrieben, beispielsweise die Antwort des Wirtes auf eine Infektion.

Die Spezifität der Wirtsantwort auf unterschiedliche Erreger ist bisher in mehreren experimentellen Systemen untersucht worden. In keiner Studie jedoch wurden Genexpressionsprofile und/oder Signaturen durch Test aus Vollblut von Sepsis-Patienten beschrieben.

Das Ziel von Feezor und Kollegen [Feezor et al., 2003] war es, Unterschiede zwischen Infektionen mit gram-negativen und gram-positiven Erregern zu identifizieren. Blutproben von drei verschiedenen Spendern wurden ex vivo mit E. coli-LPS und Hitze-inaktiviertem S. aureus stimuliert. Mittels Microarraytechnologie wurden Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt. Die Arbeitsgruppe fand sowohl Gene, die nach S. aureus-Stimulation hochreguliert und nach LPS-Stimulation herunterreguliert waren, als auch Gene die nach LPS-Behandlung starker exprimiert wurden als nach der Zugabe von Hitze-inaktivierten S. aureus-Keimen. Gleichzeitig wurden viele Gene durch gram-positive und gram-negative Stimulation in gleichem Maße hochreguliert. Dies betrifft zum Beispiel die Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6. Die differentiell exprimierten Gene wurden leider nicht namentlich veröffentlicht, so dass lediglich ein indirekter Vergleich anderen Ergebnissen möglich ist. Neben der Genexpression wurden von Feezor et al. auch die Plasmakonzentrationen einiger Zytokine untersucht. Dabei korrelierten die Genexpressionsdaten nicht zwangsweise mit den Plasmakonzentrationen. Bei der Genexpression wird die Menge an mRNA vermessen. Diese ist jedoch vor der Proteinsynthese posttranskriptionaler Regulation unterworfen, woraus die beobachteten Unterschiede resultieren können.

Die interessanteste Publikation zu diesem Thema wurde von einer texanischen Forschungsgruppe um Ramilo [Ramilo et al., 2007], veröffentlicht. Hier wurden ebenfalls Genexpressionsuntersuchungen an humanen Blutzellen durchgeführt, die Unterschiede in der molekularen Wirtsreaktion auf verschiedene Pathogene aufdeckten. Dazu wurden pediatrische Patienten mit akuten Infektionen, wie z. B. akuten Atemwegserkrankungen, Harnwegsinfektionen, Bakteriämien, lokalen Abszessen, Knochen- und Gelenkinfektionen sowie Meningitis untersucht. Microarrayexperimente wurden mit RNA-Proben durchgeführt, die aus peripheren mononuklearen Blutzellen von jeweils zehn Patienten mit E. coli- bzw. S. aureus-Infektion isoliert wurden. Die Identifizierung der Erreger erfolgte mittels Blutkultur. Anhand des Trainingsdatensatzes wurden 30 Gene identifiziert, durch deren Verwendung die verursachenden pathogenen Keime mit hoher Genauigkeit diagnostiziert werden konnten.

Trotz der zahlreichen publizierten Studien und der darin beschriebenen individuellen Signaturen, die den Stand der Technik begründen, erlaubt keine davon eine diagnostische Ausage über Sepsis und/oder Sepsis-ähnliche Zustände. Keine dieser Publikationen bietet die Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Robustheit der hier offenbarten Erfindung. Diese Studien sind darauf konzentriert, den aus wissenschaftlicher Sicht ”besten” Multigenbiomarker (Klassifikator) zu identifizieren, jedoch nicht, wie in der vorliegenden Erfindung, den für eine spezifische klinische Fragestellung optimalen Multigenbiomarker [Simon et al., 2005].

Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem eine schnelle und zuverlässige Aussage über einen pathophysiologischen Zustand, beispielsweise Sepsis und generalisierte Infektion, möglich ist.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt verfahrenstechnisch durch die Merkmale des Anspruchs 1.

Bezüglich einer Verwendung wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 5 und 12 gelöst.

Die Lösung der genannten Aufgabe erfolgt auch durch einen Primer gemäß Anspruch 16.

Ein Kit gemäß Anspruch 17 löst die Aufgabe ebenfalls.

In allgemeiner Form betrifft die vorliegende Erfindung ein System, das folgende Elemente umfaßt:

  • • Set von Genaktivitätsmarkern
  • • Referenzgene als interne Kontrolle der Genaktivitätsmarkersignale in Vollblut
  • • Detektion hauptsächlich über Real-Time-PCR oder andere Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren
  • • Verwendung eines Algorithmus, um die Einzelergebnisse der Genaktivitätsmarker zu einem gemeinsamen numerischen Wert, Index oder auch Score, umzuwandeln
  • • Darstellung dieses numerischen Wertes auf einer entsprechend eingeteilten Skala
  • • Kalibrierung, d. h. Einteilung der Skala entsprechend der intendierten Anwendung durch vorherige Validierungsexperimente.

Das System liefert eine Lösung für das Problem der Feststellung von Krankheitszuständen wie z. B. die Unterscheidung von infektiösem und nicht-infektiösem Multiorganversagen aber auch für andere in diesem Kontext relevante Anwendungen und Fragestellungen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro Erfassung und/oder Früherkennung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung und/oder Beurteilung von pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma; wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

  • a) Isolierung von Probennukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;
  • b) Bestimmung von Genaktivitäten mittels einer Mehrzahl von wenigstens drei Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17; und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, zur Bildung wenigstens eines für die Erfassung und/oder Unterscheidung und/oder den Verlauf von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten charakteristischen Multigenbiomarkers; wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind:

PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
  • c) Bestimmung von Genaktivitäten wenigstens eines internen Referenzgens, auf die die unter b) bestimmten Genaktivitäten bezogen, insbesondere normalisiert, werden;
  • d) Bilden eines Wertes aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten des Multigenbiomarkers, der den pathophysiologischen Zustand anzeigt.

Ein bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzgen ausgewählt wird aus Polynukleotiden der Gruppe bestehend aus R1, R2 und R3 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Referenzgene gemäß folgender Tabelle definiert sind:

ReferenzgeneTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDR1R1_ANM_00122829R1_BNM_03335530R1_CNM_03335631R1_ENM_03335832R1_FNM_00108012433R1_GNM_00108012534R2R2_1NM_00220935R2_2NM_00111438036R3R3NM_00308237

Ein weiter bevorzugtes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass als Polynukleotidsequenzen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente zur Erfassung der Genexpressionsprofile verwendet werden.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform liegt in einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in Schritt b) die Genaktivität von 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, oder 12 Polynucleotiden, oder von sämtlichen 13 Polynucleotiden bestimmt wird, wobei die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind:

PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatonsche SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128

Hierbei hat sich herausgestellt, dass die Verwendung von 7 Polynucleotiden häufig optimal ist.

Die Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung von wenigstens drei Polynukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, zur Bildung wenigstens eines Multigenbiomarkers zur Herstellung eines Multiplex-Assays als Hilfsmittel zur in vitro Erfassung und/oder Früherkennung und/oder Unterscheidung und/oder Verlaufsbeobachtung und/oder Beurteilung von pathophysiologischen Zuständen eines Patienten, wobei der pathophysiologische Zustand ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma; wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind:

PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung, bei der der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen ist, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index gebildet wird.

In der Praxis der Anmelderin hat sich herausgestellt, dass eine solche Verwendung besonders geeignet ist, welche dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR, insbesondere sondenbasierte Verfahren wie Taq-Man, Scorpions, Molecular Beacons; und/oder mittels Hybridisierungs-verfahren, insbesondere solchen auf Microarrays; und/oder direkter mRNA-Nachweis, insbesondere Sequenzierung oder Massenspektro-metrie; und/oder isothermale Amplifikation, erfasst werden.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in einer Verwendung, die dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands ist, wobei vorzugsweise der Index auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt wird.

Es ist ferner bevorzugt, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme, insbesondere für die Verwendung zur Patientenstratifikation und als Einschlusskriterium für klinische Studien, einsetzt.

Darüber hinaus ist eine Verwendung bevorzugt, bei welcher zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotidsequenzen M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 aufweisen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in einer Verwendung die dadurch gekennzeichnet, dass 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Polynucleotide, oder sämtliche 13 Polynucleotide verwendet werden, wobei die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind:

PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
und/oder wobei eine Anzahl von 7 Polynucleotiden bevorzugt ist.

Grundsätzlich kann die Erfindung gemäß einer alternativen Ausführungsform auch ausgeführt werden unter Verwendung mindestens eines Polynukleotids, ausgewählt. aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind:

PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M_12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
zur Herstellung eines Assays zur Beurteilung, ob bei einem Patienten ein pathophysiologischer Zustand vorliegt, und/oder zur Feststellung des Schweregrades und/oder des Verlaufs eines pathophysiologischen Zustands.

Hier bei wird der pathophysiologische Zustand ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma.

Vorzugsweise ist die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA.

Für eine weiter verfeinerte diagnostische Aussage kann es zur Beurteilung des pathophysiologischen Zustands von Vorteil sein, neben wenigstens einem der Polynucleotide, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind:

PolynucleotidTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
noch wenigstens einen weiteren Marker zu verwenden, welcher ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Procalcitonin (PCT), C-reaktives Protein (CRP); Leukocytenzahl; Cytokinen; Interleukinen sowie weiteren bislang im Stand der Technik bekannten, dem Fachmann wohlbekannten klinischen Laborparametern und genetischen, transkriptomischen und proteomischen Markern.

Um die vorliegende Erfindung auszuführen, ist es erforderlich, geeignete Primer-Paare (forward und reverse) einzusetzen. Deratige besonders geeignete Primer sind solche, die in folgender Tabelle aufgezählt sind:

Marker und ReferenzgenePrimer für quantitative PCR/resultierende AmplikonSEQ IDM2M2-fw38M2-rev39M2-Amplikon40M4M4-fw41M4-rev42M4-Amplikon43M6M6-fw44M6-rev45M6-Amplikon46M7M7-fw47M7-rev48M7-Amplikon49M9M9-fw50M9-rev51M9-Amplikon52M10M10-fw53M10-rev54M10-Amplikon55M15M15-fw56M15-rev57M15-Amplikon58M3M3-fw59M3-rev60M3-Amplikon61M8M8-fw62M8-rev63M8-Amplikon64M12M12-fw65M12-rev66M12-Amplikon67M13M13-fw68M13-rev69M13-Amplikon70M16M16-fw71M16-rev72M16-Amplikon73M17M17-fw74M17-rev75M17-Amplikon76R1R1-fw77R1-rev78R1-Amplikon79R2R2-fw80R2-rev81R2-Amplikon82R3R3-fw83R3-rev84R3-Amplikon85

Es muß jedoch betont werden, dass die genannten Primer lediglich beispielhaft sind.

Die genannten Amplikons können beispielsweise als Sonden für Hybridisierungsverfahren verwendet werden.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, enthaltend mindestens einen Multigenbiomarker, welcher eine Mehrzahl von Polynukleotidsequenzen umfasst, die ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus: M2, M3, M4, M6, M7, M8, M9, M10, M12, M13, M15, M16 und M17 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Polynucleotide gemäß folgender Tabelle definiert sind:

Marker und ReferenzgeneTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128
wobei der Multigenbiomarker spezifisch für einen pathophysiologischen Zustand eines Patienten ist und solche Zustände einschließt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: SIRS, Sepsis und deren Schweregraden; sepsisähnlichen Zuständen; septischem Schock; Bakteriämie, infektiösem/nicht-infektiösem Multiorganversagen; Früherkennung dieser Zustände; Fokuskontrolle; Kontrolle von chirurgischen Sanierungsmaßnahmen des Infektionsfokus; Responder/non-Responder für eine bestimmte Therapie; Therapiekontrolle; Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akuter Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma.

Ein bevorzugter Kit ist dadurch gekennzeichnet, dass die Polynukleotidsequenzen auch Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente umfassen.

Ein weiter bevorzugter Kit ist dadurch gekennzeichnet, dass der er wenigstens ein Referenzgen enthält, welches ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus: R1, R2 und R3 und/oder deren Isoformen und/oder deren Genloci und/oder deren Transkripten und/oder Fragmenten mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden davon, wobei die Referenzgene gemäß folgender Tabelle definiert sind:

ReferenzgeneTranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDR1R1_ANM_00122829R1_BNM_03335530R1_CNM_03335631R1_ENM_03335832R1_FNM_00108012433R1_GNM_00108012534R2R2_1NM_00220935R2_2NM_00111438036R3R3NM_00308237

Eine ebenfalls bevorzugte Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index (Score) gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.

Es ist ferner bevorzugt, den Index (Score) auf einer leicht interpretierbaren Skala anzuzeigen.

In der Praxis der Anmelderin hat sich herausgestellt, daß hier eine dimensionslose Skala von –5 bis +5 oder zur Verstärkung der Unterschiede ein entsprechendes Vielfaches, z. B. von –50 bis +50 besonders geeignet ist, um pathophysiologische Zustände zu klassifizieren. Dieser Score wird „SIQ-Score” genannt.

Im Rahmen eines optimierten EDV-gestützten Krankenhausmanagements wie auch zur weiteren Forschung auf dem Gebiet der Sepsis hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme einsetzt.

Der Index wird vorzugsweise mittels statistischer Verfahren wie überwachte Klassifikationsverfahren aus dem Bereich des maschinellen und statischen Lernens wie z. B. (diagonale, lineare, quadratische) Diskriminanzanalyse, Super vector machines, verallgemeinerte partielle kleinste Quadrate, k-nächste Nachbarn, random forests, k-nächste Nachbar ermittelt. Für eine lineare Diskriminanzanalyse kann beispielsweise folgende Formel verwendet werden:

Bevorzugt ist der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index oder Score gebildet wird.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat es sich ferner als vorteilhaft herausgestellt, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.

Bei der Erfassung der Genaktivitäten auftretende differentielle Expressionssignale der in dem Multigenbiomarker enthaltenen Polynukleotidsequenzen können vorteilhaft und eindeutig einem pathophysiologischen Zustand, einem Verlauf und/oder Therapiemonitoring zugeordnet werden.

Typischerweise wird aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index (Score, SIQ-Score) gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands, insbesondere der Sepsis oder des sepsisähnlichen Zustandes, ist.

Dieser Score kann dem behandelnden Arzt ein schnelles diagnostisches Hilfsmittel in die Hand geben.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, als Teil eines integrierten Systems (In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay, IVDMIA) eine potenzielle infektiöse Komplikation in Patienten mit SIRS oder möglichen Sepsis einzuschätzen. Dieses System umfasst die Wahl der Patienten und die Bestimmung von deren Genexpressionssignalen in einem interpretierbaren Index, welchen der Arzt als Hilfsmittel zur Diagnose verwenden kann.

Die Anmelderin hat mehrere Verfahren entwickelt, das unterschiedliche Sequenzpools benutzt, um Zustände festzustellen und/oder zu unterscheiden oder definierte Untersuchungsfragen zu beantworten. Beispiele sind in folgenden Patentschriften zu finden: Unterscheidung zwischen SIRS, Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen [WO 2004/087949; WO 2005/083115], Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis [WO 05/106020], Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens [WO 2006/042581], in vitro Klassifizierung von Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem Multiorganversagen [WO 2006/100203], Feststellung der lokalen Ursachen eines Fiebers unklarer Genese [WO 2007/144105], Polynukleotide zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion [DE 10 2007 036 678.9].

Die Erfindung betrifft Polynukleotidsequenzen, ein Verfahren und ferner Kits zur Erstellung von Multigenbiomarkern, die in einem und/oder mehreren Modulen Merkmale eines „in Vitro Diagnostic Multivariate Index Assay” (IVDMIA) aufweisen.

Bezüglich der in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Nucleotidsequenzen ist Folgendes zu bemerken:
RefSeq ist eine öffentliche Datenbank, die von Nukleotid- und Proteinsequenzen mit ihren Eigenschaften sowie bibliographische Informationen beinhaltet. Die RefSeq Datenbank wurde durch das National Center for Biotechnology Information (NCBI), ein Abteilung von National Library of Medicine, die zum US National Institute of Health gehört erstellt und wird fortlaufend gepflegt und aktualisiert (1).

NCBI erstellt RefSeq. aus den Sequenzdaten der Archiv-Datenbank „GenBank” (2), einer umfangreichen öffentlichen Datenbank von Sequenzen, die bei GenBank in den USA, der EMBL Datenbibliothek in Großbritannien und der DNS Datenbank von Japan eingestellt und auch zwischen diesen Datenbanken ausgetauscht werden. Die RefSeq Sammlung ist einzigartig, wenn es um die Bereitstellung von fehlerkorrigierten, nichtredundanten, explizitverlinkten Nukleotid- und Proteindatenbanken geht. Die Einträge sind nichtredundant mit dem Ziel, die verschiedenen biologischen Moleküle zu repräsentieren, die für Organismus, Stamm oder Haplotyp charakteristisch sind.

Wenn bestimmte Einträge mehrfach in der Sammlung auftreten, kann es mehrere Gründe dafür geben:

  • – es kodieren alternative gespleißte Transkripte für das gleiche Proteinprodukt (sog. Transkriptvarianten),
  • – es existieren mehrere genomische Bereiche innerhalb einer Spezies oder zwischen Spezies, welche für das gleiche Proteinprodukt kodieren,
  • – wenn RefSeqs erstellt werden, die alternative Haplotypen darstellen und manche mRNA- und Proteinsequenzen sind dabei identisch in allen Haplotypen. RefSeq Datenbank liefert das kritische Fundament für Sequenzintegration, genetische und funktionelle Information und gilt international als der Standard für Genomannotation. Bei der Sequenzsuche durch BLAST sind RefSeq Angaben in mehreren NCBI-Resourcen erhältlich einschließlich Entrez Nucleotide, Entrez Protein, Entrez Gene, Map Viewer, beim FTP-Download; oder durch die Vernetzung mit PubMed (Pruitt et al. 2007; The NCBI handbook 2002). RefSeq Angaben können durch das eindeutige Accession-Format, welches den Unterstrich beinhaltet (_) identifiziert werden.

Arbeitsgruppen nutzen verschiedene Methoden und Protokolle und kompilieren die RefSeq Kollektion für verschiedene Organismen. RefSeq Unterlagen werden durch mehrere unterschiedliche Verfahren erstellt (The NCBI handbook 2002):

  • 1. wissenschaftliche Kooperation
  • 2. Computer-unterstützte Genomannotationsverfahren
  • 3. Fehlerkorrektur durch die NCBI-Mitarbeiter
  • 4. Auszüge aus GenBank

Jede Angabe hat einen Kommentar, der den Stand der jeweiligen Fehlerkorrektur aufweist sowie die Zuordnung der kooperierenden Arbeitsgruppe. Dadurch beeinhaltet die RefSeq Angabe entweder die essentiell unveränderte, initial valide Kopie der originellen GenBank Einträge oder korrigierte sowie zusätzliche Informationen, die durch Kooperationspartner oder Experten hinzu gefügt wurden (The NCBI handbook 2002).

Falls ein Molekül in GenBank durch mehrere Sequenzen repräsentiert wird, wird durch die NCBI Mitarbeiter eine Entscheidung für die „beste” Sequenz getroffen, die dann als RefSeq präsentiert wird.

Hauptziel ist es, bekannte Mutationen, Sequenzierungsfehler, Klonierungsartefakte und fehlerhafte Annotationen zu vermeiden. RefSeq Sequenzen, die von solchen Fehlertypen behaftet sind, werden korrigiert. Sequenzen werden validiert, indem geprüft wird, ob die genomische Sequenz, die zur annotierte mRNS korrespondiert, tatsächlich zur mRNA-Sequenzangabe passt, und ob kodierende Regionen tatsächlich in die korrespondierende Proteinsequenz translatiert werden. Eine weitere wichtige Aufgabe ist es, die Kollektion durch das Hinzufügen vorher nicht bekannter unterrepräsentierter Gene und/oder alternative Spliceprodukte zu erweitern sowie zusätzliche Annotation von Sequenzeigenschaften bereit zustellen, welche reife Peptidprodukte und ihre funktionellen Domänen repräsentieren und/oder seltene biologische Phänomene, wie z. B. nicht-AUG-Initiationsorte der Transkription oder Selenoproteine, hervorheben (The NCBI handbook 2002).

Die Überprüfung der Qualität erfolgt auf regelmäßer Basis, um fragwürdige Sequenzen aufzufinden und zu überprüfen. Diese Qualitätstests kontrollieren die Fehler und Konflikte in Nomenklatur, Sequenzähnlichkeiten und genomische Lokalisierung, potenzielle Klonierungsfehler (wie z. B. Chimären) und gleichen die Daten mit anderen NCBI Resourcen, inklusive HomoloGene-, Map Viewer- und GenBank verwandten Sequenzen, ab (The NCBI handbook 2002).

Bei den vorliegenden hoch-qualitativen genomischen Sequenzen von Human und Maus, stand die Prüfung von cDNA-basierten RefSeqs in Bezug zum Genom im Hauptfokus. Die CCDS-Kooperation (The NCBI handbook 2002) hat auch geholfen, die Aufmerksamkeit auf die Bereiche zu fokussieren, wo es Diskrepanzen zwischen mRNA und Protein-Menge gibt.

Die Qualitätssicherungsprozesse umfassen die Registrierung der Datenbankattribute, um zu dokumentieren, dass

  • – die Kategorie des Qualitätstests aktualisiert wurde,
  • – keine Probleme mit RefSeq-Transkript und -Protein gefunden wurden und deshalb der gemeldete Fehler ignoriert werden soll,
  • – bedingt durch Genom-Assemblierung ein Problem an dieser Position entstanden ist
    – Probleme der Genom-Assemblierung können sein:
    – Es entstehen Lücken bei der Zusammensetzung der Einzelsequenzen
    – in manchen Fällen beinhaltet die aufgestellte Sequenz eine bekannte Mutation oder seltenen Polymorphismus und ist somit keine ideale repräsentative Sequenz (Pruitt et al. 2007).

Die Entscheidung, die in der vorliegenden Anmeldung benannte Markerpopulation auf der Basis ihrer RefSeq-Identität für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zu verwenden, wurde aufgrund der oben beschriebenen Eigenschaften der RefSeq-Datenbank gefällt. Die Eigenschaften dieser Datenbank, die Erstellung, Qualität, Pflege und Aktualisierungen der biologischen Sequenzen betreffend, sowie das Vorliegen funktioneller Informationen auf Nukleinsäureebene, gleichermaßen für alternative Spleißvarianten, gaben dafür den Ausschlag.

Wie bereits erläutert, bietet der biologische Mechanismus des alternativen Spleißing Raum für dem Fachmann wohl bekannte Erstreckungen des Schutzumfangs. So ist denkbar, dass mit neuen Transkriptvarianten völlig neue Primärstrukturen identifiziert werden, oder dass sich Sequenzänderungen der bekannten Transkriptvarianten ergeben. Andererseits, werden die genomischen Regionen beansprucht, die für alle diese bekannten und unbekannten Varianten der kodierenden Transkripte, mitsamt ihren cis-regulatorischen Sequenzen als vollkommende genomische funktionelle Einheiten umfasst und somit unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen oder zumindest dem Fachmann leicht auffindbare Äquivalente zu den in den Ansprüchen, Beschreibung und im Sequenzprotokoll genannten Sequenzen zur Verfügung stellen.

Definitionen:

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet:
Zustand: die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom” (SIRS), „sepsis”, „severe sepsis” und „septic shock” wie definiert in [Bone et al., 1992] und das PIRO Konzept [Levy et al., 2003].

Multiorganversagen: Als Multiorganversagen bezeichnet man das gleichzeitig oder in rascher zeitlicher Abfolge auftretende Versagen von zwei oder mehr vitalen Organsystemen. Das Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) geht als initiale Organinsuffizienz dem MOV voraus [Zeni et al., 1997]. Man spricht heute vom Multiorganversagen wenn zwei oder mehr Organe gleichzeitig oder nacheinander Funktionstörungen aufweisen, wobei ein chronisch persistierendes Organversagen auszuschließen ist. Die Prognose des MOV hängt eng mit der Anzahl der beteiligten Organsysteme zusammen. Die Mortalität beträgt bei Versagen eines Organs innerhalb der ersten 24 Stunden 22%, nach 7 Tagen 41%. Beim Versagen von drei Organsystemen steigt die Mortalität am ersten Tag auf 80% und nach 4 Tagen auf 100% an [Knaus et al., 1985].

Ein wichtiger Pathomechanismus für die Entstehung von MODS und MOV ist die Entwicklung eines systemischen Inflammationssyndromes (SIRS, [Bone et al., 1992]. MODS und MOV können sowohl infektiologischer als auch nicht-infektiologischer Genese sein.

Fieber unklarer Genese: Fieber unklarer Genese (Feuer of unknow origin, FUO) ist klinisch definiert als ein Fieber, bei dem die Temperatur über einen Zeitraum von mehr als 3 Wochen höher als 38,8°C ist, ohne dass nach einer einwöchigen Untersuchungszeit eine eindeutige Diagnose der Ursache vorliegt. In Abhängigkeit des Ursprungs wurden vier Klassen des FUO beschrieben: FUO klassischen, nosokomialen, immunschwachen oder HIV-bezogenen Ursprungs [Roth und Basello, 2003]. FUO wurde auch als ”eine eher bekannte Krankheit mit einem ungewöhnlichen Erscheinungsbild als eine seltene Störung” geschildert [Amin und Kauffman, 2003].

Nur in 10% der Patienten mit postoperativem Fieber wird eine Infektion dokumentiert [Pile et al., 2006]. In den meisten Fälle geht die Temperatur des Patienten innerhalb von vier Tagen nach dem Eingriff zurück auf Normaltemperatur. Trotzdem entwickeln einige Patienten am oder nach dem fünften postoperativem Tag eine Infektion, wobei es sich in 12% der Fälle um eine Lungenentzündung handelt. Ebenso wird von Pile und Kollegen berichtet, dass es sich bei Fieber, welches zwei Tage nach dem Eingriff auftritt, mit hoher Wahrscheinlichkeit um eine Infektion handelt, wie z. B. eine Infektion der Hamwege und/oder des inneren Unterleibs (Peritonitis), Lungenentzündung oder eine durch einen intravenösen Katheder ausgelöste Infektion.

Untersuchungsfrage: Eine klinische relevante Frage, die für die Behandlung eines Patientes wichtig ist, beispielsweise: Vorhersage des Krankheitsverlaufs, Therapieüberwachung, Fokus der Infektion, Überlebenschancen, Prädisposition, etc.

Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über die Blutbahn im gesamten Organismus ausgebreitet haben.

SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome, nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer, nichtinfektiöser Zustand eines Patienten.

Sepsis: Nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer infektiöser Zustand eines Patienten.

Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung wenden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.

Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) sowie regulatorische Elemente, welche diese Herstellung aktivieren oder inaktivieren, enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.

Genlocus: Genlocus (Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff „Genlocus” einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzliche DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen Zusammenhang stehen. Die letzteren schließen an Sequenzregionen an, die in der unmittelbar Nahe (1 Kb) aber außerhalb des 5'- und/oder 3'-Endes eines Genlocus liegen. Die Spezifizierung des Genlocus erfolgt durch die Accession-Nummer und/oder RefSeq ID des RNA-Hauptproduktes, welches von diesem Locus abstammt.

Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden.

Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp.

Multigenbiomarker: Kombination von mehreren Gen-Sequenzen deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion ein kombiniertes Gesamtergebnis (z. B. eine Klassifikation und/oder ein Index) bilden. Dieses Ergebnis ist spezifisch für einen Zustand und/oder eine Untersuchungsfrage.

Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.

Amplifikationsbedingungen: Konstante oder sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxyribonukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.

Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für Nukleinsäure-replizierende Enzyme wie z. B. die DNA-Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)

Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z. B. Fluoreszenzlabel, insbesondere Scorpion®, molecular beacons, Minor Groove Binding-Sonden, TaqMan®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA-Molekülen eingesetzt wird.

PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung „Polymerase Chain Reaction” (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile bis zu etwa 3.000 Basenpaare – eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff „PCR” mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die „Real-Time-PCR” (vgl. auch die Erläuterungen weiter unten).

PCR-Primer: Typischerweise benötigt eine PCR zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird. Derartige Primer sind dem Fachmann wohlbekannt, beispielsweise aus der Website „Primer3”, siehe z. B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgides MIT.

Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden; welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.

Small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich:

  • a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist.
  • b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle.
  • c) small non-Protein-coding RNAs, welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA-Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den Introns und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen gefundenen Transkripte aus non-Protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf. miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs) sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere Loci mit ähnlichen – jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression. siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind. Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend.
  • d) Zusätzlich kann der Begriff ”small RNA” auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA” verstanden werden.

RefSeq ID: Diese Bezeichnung bezieht sich auf Einträge in der NCBI Datenbank www.ncbi.nlm.nih.gov). Diese Datenbank liefert nicht-redundante Referenz-Standards zu genomischer Information. Diese genomischen Informationen schließen unter anderem Chromosomen, mRNAs, RNAs und Proteine ein. Jede RefSeq ID stellt ein einzelnes, natürlich vorkommendes Molekül eines Organismus dar. Die biologischen Sequenzen, die eine RefSeq repräsentieren, sind von GenBank Einträgen (ebenfalls NCBI) abgeleitet, sind aber eine Zusammenstellung von Informationselementen. Diese Informationselemente stammen aus Primär-Forschung auf DNA-, RNA- und Proteinebene.

Accession-Nummer: Eine Accession-Nummer stellt die Eintragsnummer eines Polynukleotides in der dem Fachmann bekannten NCBI-GenBank dar. In dieser Datenbank werden sowohl RefSeq ID's als auch weniger gut charakterisierte und redundante Sequenzen als Einträge verwaltet und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html).

Lokale Infektion: Die Infektion beschränkt sich auf die Eintrittspforte des Erregers (z. B. Wundinfektion)

Generalisierte Infektion: Pathogene dringen ins Gefäßsystem vor und ziehen den gesamten Organismus in Mitleidenschaft. Generalisierte Infektionen können zu einer Sepsis führen.

Kolonisierung: Die Gegenwart von Mikroorganismen löst im Organismus keinerlei Krankheitssymptome aus.

Schwere Infektion: Infektiöser Herd mit der Gefahr der zunehmenden Ausbreitung mit den Symptomen Fieber ab 39°C und/oder Bakteriämie.

Bakteriämie: Ein Zustand, in dem vorübergehend und kurzfristig Bakterien im Blut anwesend sind, ohne dass dies mit dem Auftreten von bakteriell bedingten klinischen Symptomen verbunden sein muss.

Alternatives Splicing: ein Prozess, bei dem die Exons des primären Gentranskripts (pre-mRNA) nach Ausschneiden der Introns in unterschiedlichen Kombinationen wiederverbunden werden.

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nach Altschul et al., J Mol Biol 215: 403–410; 1990). Sequenzvergleichalgorithmus, geschwindigkeitsoptimiert, wird für die Suche in Sequenzdatenbanken für eine optimale lokale Anpassung an die Anfragesequenz genutzt.

cDNA: Komplementäre DNA. DNA-Sequenz, Produkt der Reversen Transkription von mRNA.

Codierende Sequenz: Protein-kodierender Abschnitt eines Gens bzw. einer mRNA in Abgrenzung zu Introns (nicht kodierende Sequenzen) und 5'- oder 3'-nichttranslatierten Abschnitten. Kodierende Sequenzen der cDNA oder reifen mRNA umfassen den Bereich zwischen Start-(AUG oder ATG) und Stopcodon.

EST: Expressed Sequence Tag. Kurze ssDNA-Abschnitte der cDNA (normalerweise ~300–500 bp), üblicherweise in großen Mengen produziert. Repräsentieren die Gene, die in bestimmten Geweben und/oder während bestimmter Entwicklungsphasen exprimiert werden. Teilweise codierend bzw. nicht codierende Kennzeichnungen der Expression für cDNA-Bibliotheken. Wertvoll für die Größenbestimmung vollständiger Gene und im Rahmen von Kartierungen (Mapping).

Exon: Kodierender, der mRNA entsprechender Sequenzbereich typischer eukaryotischer Gene. Exons können die kodierenden Sequenzen, den 5'-nichttranslatierten Bereich oder den 3'-nichttranslatierten Bereich umfassen. Exons kodieren spezifische Abschnitte des vollständigen Proteins und sind normalerweise durch lange Abschnitte (Introns) getrennt, die bisweilen als ”junk DNA” bezeichnet werden und deren Funktion nicht genau bekannt ist aber wohl kurze, nicht-translatierte RNAs (snRNA) oder regulatorische Informationen kodieren.

GenBank Nukleotidsequenz-Datenbank mit Sequenzen aus mehr als 100.000 Organismen. Einträge, die mit Eigenschaften der kodierende Bereiche annotiert sind, umfassen auch die Translationsprodukte. GenBank ist Teil der internationalen Kooperation der Sequenzdatenbanken, die auch EMBL und DDBJ umfasst.

Intron: Nicht-codierender Sequenzbereich eines typischen eukaryotischen Gens, wird während des RNA-Splicings aus dem primären Transkript herausgeschnitten und befindet sich somit nicht mehr in der reifen, funktionellen mRNA, rRNA oder tRNA.

mRNA: Messenger RNA oder manchmal nur ”message”. RNA, die die für Proteinkodierung notwendigen Sequenzen enthält. Der Begriff mRNA wird in Abgrenzung zum (ungesplicten) Primärtranskript nur für das reife Transkript mit PolyA-Schwanz (exklusive der über das Splicing entfernten Introns) benutzt. Weist 5'-nichttranslatierte, Aminosäuren-kodierende, 3'-nichttranslatierte Bereiche und (fast immer) einen Poly(A)-Schwanz auf. Stellt typischerweise ca. 2% der gesamten zellulären RNA.

Poly(A)-Schwanz: ssAdenosin-Verlängerung (~50–200 Monomere), die während des Splicings an das 3'-Ende der mRNA gehangen wird. Der PolyA-Tail erhöht vermutlich die Stabilität der mRNA (möglicherweise Protektion gegen Nukleasen). Nicht alle mRNA weisen das Konstrukt auf, so z. B. die Histon-mRNA.

RefSeq NCBI-Datenbank der Rereferenzsequenzen. Fehler-korrigierte, nicht-redundante Sequenzsammlung genomischer DNA-Contigs, mRNA- und Protein-Sequenzen bzw. von bekannten Genen und vollständiger Chromosomen.

SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms. Auf einzelnen Nukleotidabweichungen beruhende genetische Unterschiede zwischen Allelen des gleiches Gens. Entstehen an spezifischen individuellen Positionen innerhalb eines Gens.

Transkriptvarianten: Alternative Splicing-Produkte. Die Exons des primären Gentranskripts (prä-mRNA) wurden auf unterschiedliche Weise wiederverbunden und werden nachfolgend translatiert.

3'-nichttranslatiertes Bereich: Transkribierter 3'-terminaler mRNA-Bereich ohne proteinkodierende Information (Bereich zwischen Stopkodon und PolyA-Schwanz). Kann die Translationseffizienz oder die Stabilität der mRNA beeinflussen.

5'-nichttranslatiertes Bereich: Transkribierter 5'-terminaler mRNA-Bereich ohne proteinkodierende Information (Bereich zwischen initialem 7-Methylguanosin und der Base unmittelbar vor dem ATG-Startcodon). Kann die Translationseffizienz oder die Stabilität der mRNA beeinflussen.

Polynucleotid-Isoformen: Polynucleotide mit gleicher Funktion, jedoch unterschiedlicher Sequenz. Abkürzungen

AUC (area under curve)Fläche unter der KurveCRPC-reaktives ProteinCV (cross validation)KreuzvalidierungDLDAdiagonale lineare Diskriminanzanalyse(diagonal linear discriminant analysis)KlasssifikationsverfahrenGPLS (generalized partial least squares)verallgemeinerte partielle kleinste Quadrate (Klassifikationsverfahren)IQR (inter quartile range)Abstand zwischen dem 75% und 25% PerzentilkNN (k nearest neighbours)k-nächste Nachbarn (Klassifikationsverfahren)LDA (linear discriminant analysis)lineare Diskriminanzanalyse (Klassifikationsverfahren)NPV (negative predictive value)negativer prädikativer Wert (Anteil der korrekt negativen Tests)OROdd RatioPCTProcalcitoninPPV (positive predictive value)positiver prädikativer Wert (Anteil der korrekt positiven Tests)RF (random forests)KlassifikationsverfahrenROC (receiver Operator characteristics)Abbildung zur Darstellung von KlassifikationsergebnissenSensitivitätAnteil der korrekten Tests in der Gruppe mit vorgegebenener Erkrankung (infektiöse SIRS bzw. Sepsis)SpezifizitätAnteil der korrekten Tests in der Gruppe ohne vorgegebenene Erkrankung (nicht-infektiöse SIRS)SVM (support vector machines)Klassifikationsverfahren

Für eine schnelle Diagnosik hat sich in der Praxis herausgestellt, dass Echtzeit- oder Real-Time-Amplifikationsverfahren die bevorzugten Verfahren sind. Daher werden im Folgenden die Grundlagen, welche dem Fachmann wohlbekannt sind, kurz im Hinblick auf ihre Bedeutung für die vorliegende Erfindung zusammengefaßt.

Andere, dem Fachmann bekannten Verfahren, wie z. B. Sequenzierung, Mikroarray basierte Methoden, NASBA usw. sind ebenfalls möglich.

Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist es möglich, spezifische Sequenzbereiche aus geringsten Ausgangsmengen von Nukleinsäuren in-vitro und zudem schnell zu amplifizieren, um sie so einer Analyse oder Weiterverarbeitung zugänglich zu machen. Ein doppelsträngiges DNA-Molekül wird durch Hitzeeinwirkung aufgeschmolzen (denaturiert). Die Einzelstränge dienen in der Folge als Matrize für die enzymatisch katalysierte Polymerisation von Desoxyribonukleotiden, wodurch wieder doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen. Die als Primer bezeichneten Oligodesoxyribonukleotide definieren dabei den zu kopierenden Sequenzabschnitt, indem sie an Orten komplementärer Sequenz mit der Ziel-DNA hybridisieren und als Starter für die Polymerisation dienen. Der Prozess exponentieller Produktbildung wird von verschiedenen Faktoren begrenzt. Im Laufe der PCR geht die Netto-Produktbildung daher schließlich auf Null zurück und die Gesamtmenge an PCR-Produkt erreicht einen Plateauwert.

Geeignete PCR-Primer sind beispielsweise Primer mit den Sequenzen gemäß Tabelle 3. Es ist dem Fachmann jedoch bekannt, dass eine Vielzahl weiterer Primer zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.

Seit ihrer Einführung in das molekularbiologische Methodenspektrum wurde eine nahezu unüberschaubare Vielzahl von technischen Varianten entwickelt. Heute ist die PCR eine der wichtigsten Methoden in der molekularen Biologie und der molekularen Medizin. Heute findet sie Verwendung in einem überaus breiten thematischen Spektrum, z. B. beim Nachweis von Viren oder Keimen, bei der Sequenzierung, dem Verwandtschaftsnachweis, der Erstellung von Transkriptionsprofilen und der Quantifizierung von Nukleinsäuren [Valasek und Repa, 2005; Klein, 2002]. Zudem lassen sich mit Hilfe der PCR in einfacher Weise beliebige Sequenzabschnitte des Nukleinsäurebestandes eines Organismus klonieren. Die Vielzahl entwickelter PCR-Varianten ermöglicht u. a. eine zielgerichtete oder zufällige Veränderung der DNA-Sequenz sowie sogar die Synthese größerer, in dieser Form zuvor nicht existenter Sequenzabfolgen.

Mit diesem klassischen Verfahren lassen sich hochsensitiv DNA und über die reverse Transkription (RT) auch RNA qualitativ nachweisen [Wong et al., 2005; Bustin 2002]. eine Weiterentwicklung dieser Methode ist die Real-Time-PCR, die erstmals 1991 vorgestellt wurde und neben qualitativen Aussagen auch eine Quantifizierung ermöglicht.

Real-Time-PCR, auch quantitative PCR (qPCR) genannt, ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren in Echtzeit [Nolan et al., 2006]. In der Molekularbiologie gehört sie bereits seit einigen Jahren zu den etablierten Standardtechniken.

Im Gegensatz zur PCR findet hier die Detektion bereits während der Amplifikation statt. Basierend auf Fluoreszenz-markierten Sonden, den Fluorophoren, kann die Amplifikation in Echtzeit verfolgt werden. In jedem Reaktionszyklus nehmen die fluoreszierenden PCR-Produkte und damit die Intensität der lichtinduzierten Fluoreszenz-Emission zu. Da die Zunahme der Fluoreszenz und die Menge an neusynthetisierten PCR-Produkten über einen weiten Bereich proportional zueinander sind, kann aus den gewonnenen Daten die Ausgangsmenge des Templates bestimmt werden. Eine gelelektrophoretische Auftrennung der Amplifikate ist nicht mehr erforderlich. Die Ergebnisse sind direkt verfügbar, was eine deutliche Zeitersparnis mit sich bringt. Da die Reaktionen in geschlossenen Gefäßen ablaufen, und nach dem Start der PCR keine weiteren Pipettierschritte erforderlich sind, reduziert sich das Kontaminationsrisiko auf ein Minimum. Als Fluorophore werden entweder nukleinsäure-bindende Fluoreszenzfarbstoffe wie SYBRGreen oder sequenzspezifische Fluoreszenzsonden wie Taq-Man-Sonden, LightCycler-Sonden und Molecular Beacons eingesetzt [Kubista et al., 2006]. SYBRGreen ist ein Farbstoff, dessen Fluoreszenz stark zunimmt, sobald das Molekül an doppelsträngige DNA bindet. Diese kostengünstige Lösung ist besonders bei der parallelen Durchführung mehrerer Reaktionen mit unterschiedlichen Primerpaaren geeignet. Nachteile liegen in der geringen Spezifität, da SYBRGreen sequenzunspezifisch an jede doppelsträngige DNA bindet, sowie darin, dass keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden können. Mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse kann nach erfolgter PCR allerdings zwischen dem Zielprodukt und unspezifischer DNA differenziert werden: In Abhängigkeit der Nukleotidlänge und -zusammensetzung zerfällt jeder DNA-Doppelstrang bei einer für ihn charakteristischen Temperatur, der Schmelztemperatur, in seine zwei Einzelstränge. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung anhand der Fluoreszenzabnahme bei Zunahme der Temperatur möglich.

Im Gegensatz dazu ist der Nachweis mit fluoreszenzbasierten Sonden hochspezifisch, aber auch sehr kostenintensiv. Beim TaqMan-Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern eine sequenzspezifische TaqMan-Hybridisierungssonde, die über einen Quencher und einen Reporterfarbstoff verfügt. Die Sonde ist komplementär zu einer Sequenz, die zwischen den Primern liegt. In freier Lösung wird die Fluoreszenz durch die räumliche Nähe des Quenchers unterdrückt. Nach dem FRET-(Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)-Prinzip schluckt der Quencher die Fluoreszenzemission des angeregten Fluorophors. Hybridisiert diese Sonde jedoch mit der Zielsequenz, wird sie während der PCR von der Taq-Polymerase hydrolysiert, der Reporterfarbstoff wird räumlich vom Quencher entfernt und emittiert bei Anregung detektierbare Fluoreszenz. Beim LightCycler-Prinzip enthält der PCR-Ansatz neben den PCR-Primern zwei fluoreszenz-markierte Sonden (Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoff). Ein nach außen hin messbares Fluoreszenzsignal entsteht nur bei unmittelbar benachbarter Hybridisierung der beiden Sonden mit der spezifischen Zielsequenz. Im Rahmen einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse können sogar das Vorliegen und die Art einzelner Punktmutationen innerhalb der Hybridisierungsbereiche der Sonden detektiert werden. Ein weiteres Beispiel sind die Molecular Beacons. Diese Oligonukleotide enthalten am 5'- und 3'-Ende zueinander komplementäre Sequenzen, die in ungebundenem Zustand hybridisieren und eine Haarnadelstruktur bilden.

Reporterfluorophor und Quencher, lokalisiert an beiden Enden, sind so in direkter Nachbarschaft. Erst wenn die Sonde am Templat bindet, werden die beiden Farbstoffe räumlich getrennt, so dass nach Anregung wieder Fluoreszenz messbar ist. Scorpion- und. Sunrise-Primer bilden zwei weitere Modifikationen für sequenzspezifische Sonden [Whitcombe et al,. 1999].

Die quantitative Bestimmung eines Templates kann mittels absoluter oder relativer Quantifizierung erfolgen. Bei der absoluten Quantifizierung findet die Messung anhand externer Standards, z. B. Plasmid-DNA in unterschiedlichen Verdünnungen, statt. Die relative Quantifizierung nutzt dagegen so genannte Housekeeping oder Referenzgene als Referenz [Huggett et al., 2005]. Diese Referenzgene werden konstant exprimiert und bieten damit die Möglichkeit zur Normierung unterschiedlicher Expressionsanalysen. Die Auswahl der Housekeepinggene muss für jedes Experiment individuell erfolgen. Für die vorliegende Erfindung werden bevorzugt Housekeepinggene mit den Sequenzen gemäß Tabelle 2 verwendet.

Die generierten Experiment-Daten werden mit Hilfe der geräteeigenen Software ausgewertet. Für die grafische Darstellung wird die gemessene Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen. Die resultierende Kurve unterteilt sich dabei in drei Bereiche. In der ersten Phase, also zu Beginn der Reaktion, überwiegt noch das Grundrauschen, ein Signal des PCR-Produktes ist noch nicht nachweisbar. Die zweite Phase entspricht der exponentiellen Wachstumsphase. In diesem Segment verdoppelt sich das DNA-Template annähernd in jedem Reaktionsschritt. Entscheidend für die Auswertung ist der Zyklus, bei dem detektierbare Fluoreszenz auftritt und die exponentielle Phase der Amplifikation beginnt. Dieser Threshold-Cycle(CT)-Wert oder auch Crossing Point liefert die Basis für die Berechnung der Ausgangsmenge an vorhandener Ziel-DNA. So ermittelt die Software bei einer absoluten Quantifizierung die Crossing Points der unterschiedlichen Referenz-Verdünnungen und quantifiziert anhand der errechneten Standardkurve die Template-Menge. In der letzten Phase erreicht die Reaktion schließlich ein Plateau.

Die quantitative PCR ist ein wichtiges Werkzeug für Genexpressionsstudien in der klinischen Forschung. Mit der Möglichkeit, mRNA exakt zu quantifizieren, lassen sich bei der Suche nach neuen Wirkstoffen die Auswirkungen bestimmter Faktoren auf Zellen analysieren, die Differenzierung von Vorläuferzellen in verschiedene Zelltypen beobachten oder die Genexpression in Wirtszellen als Antwort auf Infektionen nachverfolgen. Durch den Vergleich von Wildtyp- und Krebszellen auf RNA-Ebene können in der Zellkultur Gene identifiziert werden, die einen entscheidenden Einfluss auf Krebsentstehung haben. In der Routine-Labordiagnostik wird Real-Time-PCR vorrangig zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Viren und Bakterien eingesetzt. In der klinischen Routine, insbesondere im Bereich der Intensivmedizin, braucht der Arzt einen schnellen und eindeutigen Befund. Auf Basis der Real-Time-PCR können Tests durchgeführt werden, die noch am gleichen Tag das Ergebnis liefern. Hiermit begründet sich ein enormer Fortschritt für die klinische Diagnostik der Sepsis.

Neben den hier beschriebenen technischen Varianten der PCR-Methode können auch sogenannte isothermale Amplifikationsverfahren wie beispielsweise NASBA oder SDA oder andere technische Varianten für die der Detektion vorausgehenden Vervielfältigung der Zielsequenz verwendet werden.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Wahl der Multigenbiomarkersequenzen umfaßt die folgenden Schritte:

  • a. Patientenauswahl basiert auf dem extremen Gruppenverfahren;
  • b. Generierung von mindestens einem Multigenbiomarker;
  • c. Bestimmung finaler Multigenbiomarker.

Ein bevorzugtes Verfahren des dem „in vitro Diagnostic multivariate index assay” ähnlichen Tests umfaßt die folgenden Schritte:

  • a. Isolierung von Proben-Nukleinsäuren aus einer von einem Patienten stammenden Probe;
  • b. Erfassung von. Genaktivitäten mittels Sequenzen von wenigstens einem Zustands- und/oder Untersuchungsfragespezifischen Multigenbiomarkers;
  • c. Erfassung von Genaktivitäten für wenigstens ein internes Referenzgen um. die in b) erfassten Genaktivitäten zu normalisieren;
  • d. Verwendung einer Interpretationsfunktion für die in c) normalisierten Genaktivitäten um einen Zustands und/oder Untersuchungsfrage-spezifischen Index abzuleiten.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt auch in einer Verwendung, bei welcher die Genaktivitäten mittels eines Hybridisierungsverfahrens, insbesondere auf wenigstens einem Mikroarray, bestimmt werden. Der Vorteil eines Mikroarrays liegt in der höheren Informationsdichte des Biochips im Vergleich zu den Amplifikationsverfahren. So ist es z. B. mühelos möglich, auf einem Mikroarray mehrere 100 Sonden bereitzustellen, um in einem einzigen Untersuchungsgang mehrere Fragestellungen gleichzeitig zu untersuchen.

Die mittels der Erfindung erhaltenen Genaktivitätsdaten können auch vorteilhaft für die elektronische Weiterverarbeitung, z. B. zur Aufzeichnung in der elektronischen Krankenakte verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen, einzeln oder in Teilmengen, als Multigenbiomarker in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS und Sepsis.

Für die erfindungsgemäßen Verfahren (Arraytechnik und/oder Amplifikationsverfahren) wird die Probe ausgewählt aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.

Es ist bevorzugt, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.

Klassifikationsmethoden

Die Theorie des Lernens spielt eine Schlüsselrolle auf dem Gebiet der Statistik, Datenanalyse und künstlichen Intelligenz mit zahlreichen Anwendungen in Ingenieurwissenschaften. Klassifikationsverfahren werden hauptsächlich bei 2 unterschiedlichen Aufgaben verwendet, bei der Abgrenzung von vorher unbekannten Klassen (unüberwachtes Lernen, class discovery) und bei der Zuordnung von bestimmten Daten/Proben/Patienten zu einer bereit definierten Klasse (Klassenvorhersage, class prediction) [Golub et al., 1999].

In der Klassenvorhersage werden Daten/Proben/Patienten benutzt, die bereits existierenden bzw. definierten Klassen/Gruppen zugeordnet wurden (so genannter Trainingsdatensatz), um ein analytisches Verfahren (Klassifikationsalgorithmus) zu entwickeln, das die Unterschiede zwischen den Gruppen widerspiegelt. Unabhängige Proben (sogenannter Testdatensatz) werden verwendet, um die Trennungsgüte der Klassifikationsregel zu bewerten. Die Vorgehensweise kann in folgende Schritte eingeteilt werden:

  • 1. Definiere einen idealen Daten/Proben/Patientensatz, um charakteristische Profile der zu detektierenden Gruppen zu bekommen.
  • 2. Jede Gruppe wird dann geteilt, so dass 2 gleichwertige Teilmengen, ein Trainingsdatensatz und ein Testdatensatz, entstehen.
  • 3. Profile für den Trainingsdatensatz enthalten idealerweise Daten, die eine maximale. Differenz zwischen den Gruppen widerspiegeln.
  • 4. Die Differenz zwischen den Gruppen wird mittels geeigneter Abstandsmaße quantifiziert und anhand eines Algorithmus bewertet. Dieser Algorithmus sollte zu einer Klassifikationsregel führen, die mit der höchsten Spezifität und Sensitivität die Daten in die richtige Klasse einordnet. Typische Vertreter solcher Algorithmen aus dem Bereich des überwachten Lernens sind die Diskriminanzanalyse (DA), Random Forests (RF), Generalized Partial Least Squares (GPLS), Support Vector Machines (SVM) oder k-Nearest Neighbors (kNN).
  • 5. Abschließend wird die Güte der Klassifikationsregel am Testdatensatz geprüft.

Definitionen:

Diskriminanzanalyse (DA): Bei der linearen Diskriminanzanalyse erhalten wir eine lineare, bei der quadratischen Diskriminanzanalyse (QDA) eine quadratische Diskriminanzfunktion. Die Diskriminanzfunktion bestimmt sich aus der Kovarianzmatrix und den Gruppenmittelwerten. Im Fall der quadratischen Diskriminanzanalyse wird zusätzlich angenommen, dass auch die Kovarianzmatrix zwischen den Gruppen variiert [Hastie et al., 2001].

Random Forests (RF): Die Klassifikation mittels Random Forests basiert auf der Kombination von Entscheidungsbäumen, [Breiman, 2001]. Der Ablauf des Algorithmus ist etwa folgendermaßen:

  • 1. Wähle durch Ziehen mit Zurücklegen einen Trainingsdatensatz aus (Out-of-bag data).
  • 2. An jedem Knoten des Entscheidungsbaums wähle zufällig Variablen aus. Berechne mit diesen Variablen die beste Aufteilung des Trainingsdatensatzes auf die Klassen.
  • 3. Nachdem alle Entscheidungsbäume generiert wurden, fass die Klassenzuordnungen der einzelnen Entscheidungsbäume zu einer Klassenzuordnung zusammen.

Generalized Partial Least Squares (GPLS): Bei dem Generalized Partial Least Squares [Ding und Gentleman, 2004] Verfahren handelt es sich um eine sehr flexible Verallgemeinerung des multiplen Regressionsmodells. Aufgrund der großen Flexibilität kann diese Methode auch in vielen Situationen angewendet werden, in denen das klassische Modell versagt.

Support Vector Machine (SVM): Beim Support Vector Machine Klassifikator handelt es sich um einen verallgemeinerten linearen Klassifikator. Die Eingabedaten werden in einem höher dimensionalen Raum abgebildet und in diesem Raum wird eine optimale trennende (Hyper-)Ebene konstruiert. Diese im höherdimensionalen Raum linearen Schranken transformieren sich zu nichtlinearen Schranken im Raum der Eingabedaten, [Vapnik, 1999].

k-nächsten Nachbarn (k-Nearest Neighbors, kNN): Bei der Methode der k-nächsten Nachbarn, wird die Klassenzugehörigkeit einer Beobachtung (eines Patienten) anhand der sich in seiner Umgebung befindlichen k-nächsten Nachbarn entschieden. Die Nachbarschaft wird dabei in der Regel mit Hilfe des euklidischen Abstands bestimmt und die Klassenzugehörigkeit dann anhand eines Mehrheitsvotums entschieden [Hastie et al., 2001].

Im Folgenden ist ein generelles Konzept beschrieben, wie die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Dabei ist dem Fachmann wohbekannt, dass geringfüge Anpassungen der statistischen Verfahren erforderlich sein können, wenn andere Patientenkollektive und/oder andere Fragestellungen untersucht werden sollen. Für die Generierung der Klassifikationsregel werden verschiedene statistische Verfahren (Diskriminanzanalyse und/oder Random Forests u. a.) sowie Strategien verwendet (einfache und mehrfache Kreuzvalidierung, zufällige Bootstrapstichproben u. a.)

Basierend auf Genexpressionsdaten sollte ein Verfahren zur Bestimmung eines Multigenbiomarkers entwickelt werden, der eine infektiöse Komplikation wie beispielsweise Sepsis widerspiegelt. Der Biomarker und der zugehörige Index-Wert, auch „Score” genannt, bilden die Grundlage eines sogenannten „in vitro Diagnostic multivariate Index Assays” [IVDMIA, FDA-Guidelines, 2003] zur Verbesserung der Diagnose systemischer Infektionen. Die aus dem Verfahren resultierende Klassifikationsregel sollte insbesondere eine Differenzierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mit – im Vergleich zum etablierten Biomarker Procalcitonin – verbesserter Sensitivität und Spezifität ermöglichen, ist jedoch nicht auf diese Fragestellung beschränkt.

Zur Entwicklung eines solchen Multigenbiomarkers sind die folgenden Schritte notwendig:

  • 1. Schritt: Trainingsdatensatz. Um den Zusammenhang zwischen einer Genexpression bestimmter Gene und der untersuchten Erkrankung aufzudecken, werden Populationen (Kohorten) definiert, die ihr Vorhanden- bzw. Nichtvorhandensein am deutlichsten repräsentieren. Bei der Diagnose einer infektiösen Komplikation werden üblicherweise Sepsis-Patienten (infektiös) und Patienten mit einer sogenannten sterilen SIRS (nichtinfektiös) in die Studie aufgenommen. Entsprechend dieser Festlegung wird ein Plan zur Sammlung bzw. Auswahl der zugehörigen RNA-Proben festgelegt. Von den ausgewählten Proben werden die Genexpressionsprofile auf einer geeigneten Plattform gemessen, vorverarbeitet und einer Qualitätskontrolle unterzogen. Systematische Messfehler werden korrigiert und Ausreißer eliminiert.
  • 2. Schritt: Genvorauswahl. Bei der Generierung eines formalen Klassifikators auf der Basis. von Mikroarray-Daten ist die Genvorauswahl ein Schlüsselschritt, da nur ein geringer Anteil der gemessenen Gene einen Beitrag zur Gruppenunterscheidung leistet. Auch die meisten Klassifikationsverfahren setzen eine Genselektion voraus. Durch eine präzise Genauswahl kann das Klassifikationsverfahren so einfach wie möglich gestaltet und eine Überanpassung an die Trainingsdaten (Overfitting) vermieden werden. Zur Vorauswahl der Klassifikationsgene werden geeignete Filteroptionen wie die Schwelle der statistischen Inferenz, der minimale akzeptierte Abstand zwischen den Gruppen, die minimale Signalintensität u. a. festgelegt. Nur Gene, die solche Bedingungen erfüllen, werden für die Klassifikation betrachtet.
  • 3. Schritt: Klassifikationsverfahren. Verschiedene Klassifikationsverfahren werden bzgl. ihrer Trennfähigkeit hinsichtlich der zu differenzierenden pathophysiologischen Zustände getestet. Dazu werden. Methoden der Cross-Validierung verwendet. Ein Klassifikationsverfahren mit dem kleinsten Klassifikationsfehler wird ausgewählt, wobei die kleinste notwendige Anzahl von Genen gleich mitbestimmt wird. Als sinnvolle Regel hat sich herausgestellt, dass die Anzahl der Gene immer kleiner sein soll als die Anzahl der Proben im Trainingsdatensatz, um eine Überanpassung zu vermeiden. Abschließend wird die resultierende Klassifikationsregel definiert.

Patientenauswahl Die Patientenauswahl ist bei der Aufstellung des Trainingsdatensatzes bedeutsam. In einer Vorstudie im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde vorerst eine Sensitivität von ca. 75% im Trainings- und ca. 65% im Testdatensatz erreicht. Diese reiativ geringe Klassifikationsgüte ließ sich aber nicht durch die schwache Optimierung des Klassifikators, sondern durch die nicht ausreichend präzise Auswahl von Sepsis-Patienten erklären. Dementsprechend wurden Sepsis-Patienten nach einer Peritonitis viel häufiger richtig klassifiziert als Sepsis-Patienten nach einer „VAP (Ventilator-Associated Pneumonia). Tatsächlich liegt die infektiöse Komplikation nach einer Peritonitis an sich vor. Dagegen lässt sich bei VAP eine wirkliche Infektion von einer Kolonisation nur schwer unterscheiden [Mayhall, 2001].

Um die Güte der Patientenauswahl zu bewerten, kann das Prinzip der sogenannten Extremgruppen nützlich sein. Danach werden in einer Studie nur solche Patientengruppen berücksichtigt, die den untersuchten Effekt möglichst deutlich abbilden. Dabei repräsentieren die ausgewählten Stichproben einen idealisierten Fall, in dem viele in der Praxis auftretende Effekte (z. B. die Häufigkeit der Erkrankung) nicht berücksichtigt werden. Von Liu [Liu et al., 2005] wurde vorgeschlagen, für den Trainingsdatensatz eines auf Mikroarrays basierten Klassifikators Extremgruppen zu bilden. Am Beispiel der Überlebensanalyse von Krebspatienten wurde gezeigt, dass die Anwendung von extremen Gruppen (Patienten, die nach kurzer Zeit gestorben sind vs. Patienten, die lange überlebt haben) zu einer besseren Vorauswahl von Klassifikationsgenen und einer höheren Klassifikationgüte geführt hat, auch wenn der Trainingdatensatz aus weniger Profilen (Patienten) bestand, als im üblichen Fall, wenn alle Patienten (auch mit mittleren Überlebenszeiten) berücksicht wurden.

Im Folgenden wird ausgeführt, wie weit die Patientenauswahl die Generierung eines Multigenbiomarkers zur Diagnose der infektiösen Komplikation beeinflussen kann. In einer Studie der Anmelderin wurden Patienten, die nach einem schweren operativen Eingriff eine Sepsis entwickelt haben, untersucht. Es wurden Proben vom ersten Tag der Sepsis-Diagnose mit der Probe vom ersten post-operativen Tag verglichen. Die hier signifikant differentiell exprimierten Gene spiegeln aber einen Mischeffekt wider; die infektiöse Komplikation wird verdeckt durch Effekte wie Erholung nach dem operativen Stress oder die post-operative Behandlung. In der bereits erwähnten Pilotstudie wurden die Patienten mit einer klinischen (nicht immer mikrobiologisch gesicherten) Sepsisdiagnose in die Trainingspopulation eingeschlossen, was zu einer Durchmischung der beiden untersuchten Gruppen (Septiker und Kontrollen) führte und die Sensitivität verschlechterte. In dem Ausführungsbeispiel der US-Patentanmeldung Nr. 20060246495 wurde für die Auswahl der Sepsisgruppe ebenfalls die klinische Sepsisdiagnose verwendet. Darüber hinaus wurde die Schwere der Erkrankung zwischen der Gruppe der Sepsispatienten und der Kontrollgruppe der SIRS-Patienten nicht berücksichtigt. Dies kann der Grund der geringen Klassifikationsgüte und ihrer Abhängigkeit vom Klassifikationsalgorithmus sein. In die Studie von Johnson [Johnson et al., 2007] wurden Patienten nach einem Trauma in zwei Gruppen aufgeteilt, mit einer infektiösen Komplikation und ohne eine Infektion. Der Vorteil dieser Studie war, dass Patienten der beiden Gruppen sich in Komorbidität und Vorbehandlung wenig unterschieden. Die Vorauswahl ist aber nicht für alle Sepsispatienten repräsentativ und die Verallgemeinerung des hier aufgedeckten sepsisrelevanten Genexpressionsmusters auf Patienten mit anderem Hintergrund (auf andere Risikogruppen) ist nicht selbstverständlich. Im Allgemeinen muss davon ausgegangen werden, dass in Studien mit verschiedenen Risikogruppen auch verschiedene Klassifikatoren generiert werden müssen. In der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] wurde das Prinzip der Extremgruppen indirekt angewandt, in dem nur Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Sepsis-Diagnose im Trainingsdatensatz berücksichtigt wurden. Der Proben-Sammelplan führte aber zu einer kleinen Kontrollgruppe (ein Drittel der Proben: 14 aus 44). Dementsprechend wurde im Training eine Spezifität von 77% und in einem unabhängigen Testdatensatz. (unter mehr realen Bedingungen) von lediglich 60% erreicht. Die Beschreibung der Patientengruppen in der SIRS-Lab Studie und der Studie von Tang [Tang et al., 2007a] lässt einen weiteren Einflussfaktor erkennen. Sie zeigt, dass die bzgl. des Infektionsfokus heterogenen Sepsisgruppen nicht ausbalanciert sind, sondern dass Gruppen mit verschiedenen Infektionsfoci unterschiedlich vertreten sind. Tatsächlich ist im Großteil der Fälle auf der Intensivstation (ITS) die Lunge (ca. 45–50%) oder der Abdomen (ca. 25%) der Fokus der Infektion bei einer Sepsisdiagnose. Dementsprechend sind diese Patientengruppen in den Untersuchungen überrepräsentiert, viele andere Foci kommen dann nur vereinzelt vor. Ähnlich sind in den Kontrollgruppen insbesondere postoperative und Traumapatienten vertreten und andere Risikogruppen sind nur durch einzelne Patienten vertreten. Die dargestellte Analyse zeigt, dass in allen Studien die ausgewählten Patientengruppen die infektiöse Komplikation nicht eindeutig abbilden, wodurch die Klassifikationsschwächen erklärt werden können. Andererseits wird aus der Zusammenfassung deutlich, dass es bei der infektiösen Komplikation kaum möglich ist, alle Einflussfaktoren bei der Auswahl der Patientengruppen zu berücksichtigen. Aus diesem Grund wird der folgende Weg zur Patientenauswahl für den Trainingsdatensatz vorgeschlagen.

Allgemeines zu Material und Methoden der vorliegenden Erfindung:Patientenauswahl

Die Auswahl der repräsentativen Stichproben stand im Mittelpunkt des beschriebenen Verfahrens. Es wurden in den Trainingsdatensatz Patienten mit einer mikrobiologischen gesicherten bzw. ausgeschlossenen Infektionsdiagnose aus jeweils zwei der am besten repräsentierten Sepsis- bzw. Kontrolisubgruppen eingeschlossen. Damit wird das Prinzip der Extremgruppen nicht nur für den Haupteffekt (infektiös vs. nicht infektiös) sondern auch für die Kontrolle der wichtigsten Einflussgrössen (Schichtung von Populationen) angewandt. Der Vorteil dieser Auswahl ist vorerst, dass man hier einen Klassifikator für die häufigsten Risiko bzw. Erkrankungsgruppen generiert. Darüberhinaus wird erwartet, dass sich ein Klassifikator, der die systemische Infektion für wenige aber sehr unterschiedliche Subgruppen widerspiegelt, sich auf weitere Patientengruppen anwenden lässt. Bei der Auswahl der Trainingsdaten wurde wie folgt vorgegangen. In die Patientendatenbank der Anmelderin wurden im Zeitrahmen von zweieinhalb Jahren 400 ITS-Patienten aufgenommen, bei denen ein Sepsis-Risiko vermutet wurde, und die zugehörigen klinischen Daten über den gesamten Aufenthalt detailliert dokumentiert. Die RNA-Proben wurden über ca. 7–14 Sepsis-relevante Tage gesammelt. In Annäherung an das PIRO-Konzept [Levy et al., 2003] wurden die Patienten retrospektiv nach folgenden Kriterien stratifiziert: (i) welche Indikation führte zur der Übernahme auf die Intensivstation (postoperative Komplikation, Trauma bzw.

Polytrauma, akuter Sepsisverdacht), (ii) wurde eine infektiöse Komplikation diagnostiziert, was war der Infektionsfokus, (iii) wie war die Reaktion des Organismus (Anzahl der vorhanden SIRS-Kriterien, Schock-Behandlung, PCT-, CRP-Werte), (iv) wie schwer war die Erkrankung (SOFA, MODS-Score). Die Datenbankrecherche ergab, dass mit einer infektiösen Komplikation (Sepsis) insbesondere Patienten nach einer Pneumonie (40%) und nach einer Peritonitis (23%) in die Studie aufgenommen wurden. Weitere Fokuse kamen vereinzeln vor. Diese Daten entsprechen den epidemiologischen Studien der Deutschen Sepsisgesellschaft, womit die Sammlung als repräsentativ eingestuft wurde. Die Patientendaten dieser Gruppen wurden unabhängig von 2 Ärzten [nach ACCP/SCCM, 1992; Levy et al., 2003; Calandra und Cohen, 2005] geprüft und die finale Patientenauswahl festgelegt. Es wurden 29 Patienten mit einer mikrobiologisch gesicherten Diagnose ausgewählt und der erste septische Tag bestimmt. Die Zusammenfassung der Schwere-Kriterien ergab, dass bei den Patienten an diesem Tag eine schwere. Sepsis bzw. ein septischer Schock diagnostiziert wurde. Sie erreichten einen durchschnittlichen SOFA-Wert von 10, die Summe akuter Organdysfunktionen betrug etwa 3. Als Kontrollgruppe wurden 29 Risiko-Patienten nach einer Bypass-Operation eingeschlossen. Es wurde der erste Tag mit einer ähnlichen Schwere wie bei den Sepsis-Gruppen bestimmt aber ohne Zeichen einer Infektion ausgewählt. Eine Aufstellung zu wichtigen klinischen und Labor-Parametern für die ausgewählten Patienten findet sich beispielhaft, jedoch ohne Einschränkung hierauf, in Tabelle 1. Tabelle 1: Zusammenfassung der klinischen Parameter für Patienten des Trainingsdatensatzes. Die Werte entsprechen der Anzahl oder, mit Stern markiert, dem Median (Interquartilabstand) der Werte.

Sepsiskeine SepsisPatientenanzahl2929Mortalität52%21%Geschlecht (m/w)22/720/9Alter (y)*66 (13)68 (8)SIRS-Kriterien*3 (0)3 (2)SOFA-Score*10 (4)7 (4)Anzahl der Organdysfunktionen*3 (2)2 (2)PCT (ng/ml)*12 (24,32)1,82 (10,78)CRP (mg/l)*194 (161)85,45 (88,675)WBC (no/l)*12200 (11150)12800 (8700)Apache II19 (6)13 (5)Hypotensionsbehandlung90%48%Sepsis-Fokus:Indikation für ITS-Aufnahme:Peritonitis13Kardio-pulmonarer Bypass/ITS-Pneumonia8Aufenthalt mehr als 3 Tage: 22Mediastinitis4Myocarditis1Kardio-pulmonarer Bypass/ITS-Urosepsis1Aufenthalt max. 3 Tage: 7Kneeempyem1

Generierung des Klassifikators und Etablierung des SIQ-Scores

Auf dem Weg zur Klassifikatorentwicklung wurden folgende Schritte durchgeführt:

  • 1. Schritt: Qualitätskontrolle: Aus der vom Expertenwissen bestätigten Vorauswahl aus einem Patientenkollektiv wurden die zugehörigen Genexpressionsdaten verschiedenen Ähnlichkeitsanalysen unterworfen, um untypische Hybridisierungsergebnisse auszuschließen [Buneß et al., 2005], wodurch die finale Trainingsdatenmatrix generiert wurde.
  • 2. Schritt: Normalisierung bzw. Vorverarbeitung der Daten: Zum Normalisieren wurde für jede Probe der Mittelwert der 3 ausgewählten Housekeeper-Gene (R1, R2 und R3) berechnet. Von diesem Wert wurde der Ct-Wert jedes einzelnen Markers abgezogen. Jeder so gewonnene Delta Ct Wert spiegelt die relative Abundanz des Targettranskriptes bezogen auf den Kalibrator wider, wobei ein positiver Delta Ct Wert eine Abundanz höher als der Mittelwert der Referenzen und negativer Delta Ct Wert eine Abundanz kleiner als der Mittelwert der Referenzen bedeuten.
  • 3. Schritt: Ranking: Um die Gen-Marker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde die lineare Diskriminanzanalyse (LDA) [Hastie et al., 2001] zusammen mit der Methode der vorwärts Selektion verwendet, wobei die Trennbarkeit mit dem F-Wert bewertet wurde [Hocking, R. R., 1976). Dieser Analyseschritt wurde für 1000 Bootstrap-Stichproben wiederholt. Die in jeder Wiederholung ermittelten Marker-Ranks wurden über die 1000 Läufe gemittelt und die Marker-Kandidaten wurden nach dem mittleren Rank aufsteigend angeordnet. Diese Anordnung bedeutet, dass der Marker mit dem kleinsten mittleren Rank der war, der am häufigsten den meisten Beitrag zur Trennungsgüte leistete und der Marker mit dem höchsten mittleren Rank für die Trennung in meisten Wiederholungen wenig beitrug.
  • 4. Schritt: Klassifikation: Für die Marker, die in der Ranking-Analyse die besten Ergebnisse lieferten, wurde basierend auf der LDA eine Diskriminazfunktion bestimmt. Die zugehörigen Gewichte werden in der Tabelle 9 dargelegt.
  • 5. Schritt: Interne Validierung: Um die Güte der Klassifikation für wachsende Anzahl von Markern zu beurteilen wurde die einfache Kreuzvalidierung verwendet.
  • 6. Schritt: Etablierung des SIQ-Scores: Basierend auf der Diskriminanzfunktion wurde ein auf die Sepsis bezogener diagnostischer Parameter, ein sogenannter SIQ-Score (SIQ) wie folgt eingeführt. Für eine neue unabhängige Probe bekommt man i. a. als Klassifkationsergebnis einen dimensionsfreien Wert der Diskriminanzfunktion. Ein positiver Wert klassifiziert die Probe als infektiös und ein negativer Wert als nicht infektiös. Für typische Vertreter der jeweiligen Gruppe erhält man absolut höhere Werte, schwer klassifizierbare Proben erreichen Werte nahe Null. Der Streubereich der Diskriminanz-Werte entspricht i. a. der Variabilität der Datenmatrix. So erreichte man in der Klassifikation Diskriminanzwerte von ca. –5 bis 5. Um die Unterschiede deutlicher hervorzuheben, wurde der SIQ-Score (SIQ) als der 10-fache Wert der Diskriminanzfunktion mit den Gewichten aus der Tabelle 9 eingeführt. Dementsprechend variierten die SIQ-Werte der Testdaten von ca. –50 bis 50.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen und unter Bezug auf das Sequenzprotokoll, das ebenfalls ein Teil dieser Beschreibung ist, näher erläutert, ohne dass dies eine Einschränkung der Erfindung bedeutet.

Ergebnisse

Im nächsten Schritt wurden die Genexpressionsdaten der Patientendatenbank der Anmelderin, die nicht im Trainingsdatensatz verwendet wurden, einer Klassifikation unterzogen. Dieser unabhängige Testdatensatz bestand aus 113 Proben von 65 Personen (vgl. Tabellen 4 und 5). Dabei wurden Proben von 38 Sepsis-Patienten untersucht, die ein breites Spektrum an klinischen Phänotypen mit dem Risiko eine generalisierte Infektion ausbilden, repräsentieren. Darüber hinaus wurden Proben über den SIRS-Verlauf von 22 postoperativen Patienten sowie 5 gesunden Probanden analysiert.

Für diesen unabhängigen Testdatensatz wurde die beste Klassifikationseffizienz von 81,4% mit 7 folgenden Markern erreicht: M6, M15, M9, M7, M2, M10, M4. Die ROC-Kurve zur Klassifikation von Testdaten wird in 1 dargestellt. Als Vergleich wird in 4 die ROC-Kurve zur Klassifikation von Testdaten mittels PCT oder CRP dargestellt. Aus der 4 wird ersichtich, dass für beide Paramter die Fläche unter der Kurve, die die Güte der Klassifikation widerspiegelt, unter 70% liegt und damit diagnostisch wenig relevant ist.

In der 2 (Patient 8112) wird der Verlauf des SIQ-Scores für einen Patienten dargestellt, der postoperativ eine Sepsis entwickelt hat. Aus 2 wird ersichtlich,. dass SIQ-Score die diagnostisch-relevante Schwelle bereits 2 Tage vor der klinischen Manifestation der Sepsis übersteigt. Der Verlauf weiterer Sepsis-relevanten klinischen Parameter (PCT, CRP, SOFA, Körpertemperatur, Schockbehandlung) wird als Vergleich mit dargestellt. In diesem Vergleich wird ersichtlich, dass SIQ-Score der einzige Parameter ist, der vorzeitig die infektiöse Komplikation widerspiegelt. Damit wird demonstriert, dass die beschriebene Erfindung für die frühe Erkennung von infektiösen Komplikationen, wie Sepsis und/oder generalisierter Infektion, angewendet werden kann.

In der 3 (Patient 7084) wird der Verlauf des SIQ-Scores für einen Patienten dargestellt, der postoperativ eine Sepsis entwickelt hat, in einen septischen Schock fiel, sich aber einer akuten Phase durch eine relevante Behandlung wieder erholt hat. Aus 3 wird ersichtlich, dass SIQ-Score ein Tag vor der klinischen Manifestation der Sepsis über den diagnostischen Schwellenwert ansteigt und in der akuten Phase über der Schwelle bleibt. Nach der akuten Phase fällt der SIQ-Score unter diese Schwelle. Damit wird demonstriert, dass die beschriebene Erfindung für die Verlaufskontrolle und/oder Therapiekontrolle von z. B. Antibiotika-Therapie und/oder adjunktive klinische Maßnahmen und/oder operative Sanierungsmaßnahmen angewendet werden kann.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeipielen sowie anhand der Zeichnung.

Es zeigt:

1 eine ROC-Kurve zur Klassifikation von Testdaten mittels SIQ-Scores;

2 eine Darstellung eines beispielhaften Verlaufs eines erfindungsgemäßen Scores (SIQ-Score) und der sepsisrelevanten klinischen Parameter PCT und CRP (2A) sowie SOFA-Score, Körpertemperatur und Katecholamindosierung (2B) für einen ersten Patienten;

3 eine Darstellung eines beispielhaften Verlaufs eines erfindungsgemäßen Scores (SIQ-Score) und der sepsisrelevanten klinischen Parameter PCT und CRP (3A) sowie SOFA-Score, Körpertemperatur und Katecholamindosierung (3B) für einen zweiten Patienten; und

4 eine ROC-Kurve zur Klasifikation von Testdaten mittels PCT oder CRP.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen und unter Bezug auf das Sequenzprotokoll, das ebenfalls ein Teil dieser Beschreibung ist, näher erläutert, ohne dass dies eine Einschränkung der Erfindung bedeutet.

1 zeigt eine ROC-Kurve zur Klassifikation der Testdaten mittels des SIQ-Scores In 1 wird das Verhältnis zwischen richtig Positiven (Sensitivität) und falsch Positiven (1-Spezifität) markiert, grau gestrichelt für den Schwellenwert von Null und schwarz gestrichelt für die beste erreichte Klassifikation von 81,4%.

2 zeigt einen Verlauf des SIQ-Scores eines beispielhaften Patienten und der Sepsis-relevanten klinischen Parameter PCT, CRP, SOFA, Körpertemperatur sowie die Dosierung von Katecholaminen (norepinephrine), die die Schock-Behandlung reflektiert. Im Teil A der Figur wurde die Skala jedes Parameters so angepasst, dass die schwarze horizontale Mittel-Linie den diagnostisch relevanten Schwellenwert markiert. Die Sepsis wurde am 6. Tag diagnostiziert, der SIQ-Score steigt bereits am 4. Tag über die Schwelle von –4.9.

3 zeigt einen Verlauf des SIQ-Scores eines weiteren Patienten und der Sepsisrelevanten klinischen Parameter PCT, CRP, SOFA, Körpertemperatur sowie die Dosierung von Katecholaminen (norepinephrine), die die Schock-Behandlung reflektiert. Im Teil A der Figur wurde die Skala jedes Parameters so angepasst, dass die schwarze horizontale Mittel-Linie den diagnostisch relevanten Schwellenwert markiert. Die Sepsis wurde am 4. ITS-Tag diagnostiziert, der SIQ-Score steigt bereits am 3. Tag über die Schwelle von –4.9. Nach der akuten Phase, die mit dem Absetzen der Katecholamine (Schock-Behandlung) am 8 Tag beendet wird, fällt der SIQ-Score unter die Schwelle von –4.9.

4 zeigt ROC-Kurven zur Klassifikation der Testdaten mittels der Paramter PCT oder CRP In der 4 wird in schwarz die ROC-Kurve zu PCT und in grau die ROC-Kurve zu CRP dargestellt, Die Flache unter der Kurve, die die Güte der Klassifikation widerspiegelt, beträgt für PCT 56,8% und für CRP 66.9%.

Die nachfolgende Tabelle 2 gibt die eineindeutige Zuordnung der erfindungsgemäßen Marker-Polynucleotide zu ihren Transkriptvarianten/cis regulatorischen Sequenzen (Isoformen), der Gendatenbank-Zugriffsnummer und der SEQ ID des Sequenzprotokolls wieder. Tabelle 2

Marker und ReferenzgeneFranskriptvariante/cis-regulatorische SequenzenAccession NumberSEQ IDM2M2_1NM_0010317001M2_2NM_0166132M2_3NM_0011284243M4M4_1NM_2033304M4_2NM_0006115M4_3NM_2033296M4_4NM_2033317M4_5NM_0011272238M4_6NM_0011272259M4_7NM_00112722610M4_8NM_00112722711M6M6_1NM_00183112M6_2NM_20333913M7M7_1NM_03131114M7_2NM_01902915M9M9NM_00668216.M10M10NM_03355417M15M15_1NM_00358018M15_2NM_00114477219M3M3_ANM_00112304120M3_BNM_00112339621M8M8NM_02520922M8_cisAI80798523M12M12NM_00218524M12_cisDB15556125M13M13NM_00108039426M16M16NM_00326827M17M17NM_18249128R1R1_ANM_00122829R1_BNM_03335530R1_CNM_03335631R1_ENM_03335832R1_FNM_00108012433R1_GNM_00108012534R2R2_1NM_00220935R2_2NM_00111438036R3R3NM_00308237

Tabelle 3 gibt für jeden der erfindungsgemäßen Marker-Polynucleotide die Primer (forward und reverse) für die quantitative PCR sowie das resultierende Amplikon und deren eineindeutige Zuordung zu der jeweiligen SEQ ID des Sequenzprotokolls wieder. Tabelle 3

Marker und ReferenzgenePrimer für quantitative PCR/resultierende AmplikonSEQ IDM2M2-fw38M2-rev39M2-Amplikon40M4M4-fw41M4-rev42M4-Amplikon43M6M6-fw44M6-rev45M6-Amplikon46M7M7-fw47M7-rev48M7-Amplikon49M9M9-fw50M9-rev51M9-Amplikon52M10M10-fw53M10-rev54M10-Amplikon55M15M15-fw56M15-rev57M15-Amplikon58M3M3-fw59M3-rev60M3-Amplikon61M8M8-fw62M8-rev63M8-Amplikon64M12M12-fw65M12-rev66M12-Amplikon67M13M13-fw68M13-rev69M13-Amplikon70M16M16-fw71M16-rev72M16-Amp1ikon73M17M17-fw74M17-rev75M17-Amplikon76R1R1-fw77R1-rev78R1-Amplikon79R2R2-fw80R2-rev81R2-Amplikon82R3R3-fw83R3-rev84R3-Amplikon85

Biologische Plausibilität der identifizierten Biomarker

Die beschriebenen Biomarker sind in funktioneller Hinsicht mit hoher Signifikanz immunologischen und inflammatorischen Signalwegen zuzuordnen. Eine wissensbasierte Analyse der Biomarkerpopulation wurde mit der Software Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity Systems, USA, www.ingenuity.com) durchgeführt, um den funktionellen Kontext der identifizierten Marker zu verdeutlichen. Basierend auf dem gesamten öffentlich verfügbaren Datenbankwissen werden die Marker in funktionelle Netzwerke und Kategorien eingeordnet. Die Hauptkategorien der vorliegenden Markerpopulation sind das Komplementsystem, Toll-like-Rezeptor-Signaltransduktion, Kommunikation zwischen Zellen der innaten und adaptiven Immunabwehr, TREM-1-Signaltransduktion, Ceramid-Signaltransduktion. Die Marker sind demnach mit hoher Signifikanz an immunologischen und entzündlichen Prozessen beteiligt, was die Relevanz für das Krankheitsbild der Sepsis untermauert. Damit konnte eine wichtige Grundvoraussetzung für Biomarker, das Vorhandensein biologischer Plausibilität, nachgewiesen werden.

Theragnostisches Potenzial der Biomarker am Beispiel der Koagulation: Die Analyse der biologischen Plausibilität der Biomarker ergab für M6 und M9 eine funktionelle Rolle im Kontext der Koagulation und Fibrinolyse. Beide Prozesse gehören zu den am stärksten deregulierten physiologischen Funktionen in septischen Patienten. Eine Therapieoption von Patienten mit schwerer Sepsis und Organversagen stellt die Behandlung mit aktiviertem Protein C oder Thrombomodulin dar. M6 ist in septischen Patienten überexprimiert und gleichzeitig der negativen Transkriptionskontrolle durch aktiviertes Protein C unterworfen. M9 ist in septischen Patienten supprimiert und kann die zugeschriebene Aktivität der Prothrombin-Spaltung zur Bereitstellung von Thrombin möglicherweise nicht erfüllen. Thrombin wiederum ist nach Assoziation mit Thrombomodulin ein wichtiger Faktor für die Aktivierung von Protein C. Aufgrund dieser engen funktionellen Zusammenhänge erscheint es möglich, in entsprechenden klinischen Studien nach Mustern zu suchen, welche für den erfolgreichen Einsatz der o. g. therapeutischen Möglichkeiten charakteristisch sind. Dieser theragnostische Ansatz könnte es ermöglichen, die Responder zu identifizieren und Nonrespondern die u. U. gravierenden Nebenwirkungen zu ersparen. Die identifizierten Marker für die für eine solche Anwendung beinhalten somit auch das Potenzial für eine Entscheidungsfindung bezüglich spezieller Therapien des septischen Patienten.

Im Folgenden sind zunächst die klinisch relevanten Daten des untersuchten Patientenkollektives als Tabelle 4 gezeigt: Tabelle 4

PatientAlter [Jahre]GeschlechtApachepostoperative Indikationennicht operative IndikationenAufhmediagnoseÜberlebensstatus (ITS)Liegedauer [Tage]101359männlich22schwere SepsisSepsis, nicht näher bezeichnetja22101571männlich29Eingriff Herzkranzgefäße, ThoraxInstabile Angi pectoritsja41204281männlich15Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ein-Gefäßerkrankungja7500842männlich0respiratorische Insuffiziens (Infektion), pankreatitis, akutes Organversagen (respiratorisch), akutes Organversagen (metabolisch), akutes Organversagen (rel)Akute Pankreatitisnein13500957männlich21schwere Sepsis, respiratorische Insuffiziens (Atemstillstand), respiratorische Insuffiziens (Infektion) leberversagen, akutes Organversagen (respiratorisch) akutes Organversagen (metabolisch)Sepsis, nicht näher bezeichnetnein42501067weiblich0schwere Sepsis, postoperativkardiovaskulaer, postoperativgastrointestil, postoperativmetabolischAkute Peritonitisnein31501871männlich28schwere Sepsis, Eingriff Herzkranzgefäße, postoperativkardiovaskulaer, postoperativrespiratorisch, postoperativ-relLinksherzinsuffizienzja45019weiblichneurochirurgischBandscheibenvorfallja5020männlichneurochirurgischBandscheibenvorfallja5023weiblichneurochirurgischBandscheibenvorfallja600548weiblich17schwere SepsisAkute Cholezystitisnein28600862weiblich14gastrointestilPeritonitis, nicht näher bezeichnetja13602464männlich12schwere SepsisSepsis: Escherichia coli [E. coli]ja6603563männlich29schwere Sepsis, gastrointestilPerforation des Darmes nichttraumatisch)nein20603633männlich9polytraumaNicht näher bezeichnete multiple Verletzungenja20605676weiblich23Eingriff Herzkranzgefäße, Eingriff HerzklappenAortenklappenstenoseja36606168weiblich25Eingriff Herzkranzgefäße, ThoraxAortenklappenstenosenein29606359männlich17WirbelsaeuleRückenmarkkompression, nicht näher bezeichnetja9606478männlich16DHI-ArrythmienSonstige näher bezeichnete Krankheiten des Pankreasja36607066männlich14schwere Sepsis, ThoraxChronische Niereninsuffizienz, nicht näher bezeichnetja19607573weiblich22gastrointestilIleus, nicht näher bezeichnetja47610440weiblich17schwere Sepsis, respiratorische Insuffiziens (Asthma), respiratorische Insuffiziens (Aspiration), respiratorische Insuffiziens (Infektion)Akute respiratorische Insuffiziens, anderenorts nicht klassifiziertja28612054männlich18schwere SepsisPerforation des Ösophagusnein19612469männlich15schwere Sepsis, ThoraxAbnorme Befunde bei der bildgebenden Diagnostik der Lungeja13612639männlich23schwere Sepsis, polytraumaAtemnotsyndrom des Erwachsenen [ARDS]ja126614170männlich21ThoraxEmphysem, nicht näher bezeichnetnein38702375männlich21Eingriff Herzkranzgefäßenein61704070männlich21Sepsis, nicht näher bezeichnetja27705267weiblich22intrakranielle BlutungSubarachnoidalblutung, von der A. communicans anterior ausgehendja33707763männlich17Bösartige Neubildung: Mundboden, nicht näher bezeichnetja38707977männlich26Eingriff Herzkranzgefäßeja33708469männlich17Eingriff HerzkranzgefäßeKrankheiten der Mitral- und Trikuspidalklappe, kombiniertja24709685männlich18Atherosklerose der Extremitäterterien: Becken-Bein-Typ, mit Gangränja8710575weiblich20schwere SepsisSepsis, nicht näher bezeichnetja10711275weiblich27Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Drei-Gefäßerkrankungnein67711964weiblich14Eingriff HerzkranzgefäßeInstabile Angi pectorisja6712084weiblich21schwere SepsisBösartige Neubildung am Rektosigmoid, Übergangnein1371479weiblich26gastrointestilUlcus duodeni: Chronisch oder nicht nähe bezeichnet, mit Perforationnein774975weiblich16Eingriff Herzklappen, ThoraxAortenklappenstenoseja27800960männlich9Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja51801164männlich4Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja2802668weiblich12Eingriff Herzkranzgefäße Eingriff HierzklappenAtherosklerotische Herzkrankheit: Ein-Gefäßerkrankungja6803477weiblich12Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja2803955weiblich16Eingriff HierzklappenAortenklappenstenoseja7804470männlich9Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja2805271männlich11Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja2805670weiblich13Eingriff HierzklappenMitralklappeninsuffizienzja5805863weiblich21Eingriff HierzklappenSonstige Aortenklappenkrankheitenja5807382männlich15Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja2808678männlich13Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ein-Gefäßerkrankungja6809661männlich11Eingriff Herzkranzgefäße Eingriff HerzklappenMitralklappenstenosenein12810163männlich12Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosennein8810270männlich17Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ein-Gefäßerkrankungja6810354männlich6Eingriff HerzklappenAortenklappenstenoseja2810866männlich11Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja2811165männlich16Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosenja14811276männlich13Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ohne hämodymisch wirksame Stenosennein10811680weiblich18Eingriff HerzkranzgefäßeAtherosklerotische Herzkrankheit: Ein-Gefäßerkrankungja5812267männlich17Eingriff HerzkranzgefäßeInstabile Angi pectorisja592074männlich23schwere SepsisSepsis, nicht näher bezeichnetja4

Tabelle 5: allgemeine Beschreibung der Patienten aus dem Testdatensatz, aufgezeichnet wurden allgemeinen klinischen Parametern, durch die die ITS-Behandlung begründet wird.

Tabelle 5 zeigt Sepsis-relevante klinische Parameter aus den Verlaufsbögen der Patienten aus dem Testdatensatz, aufgezeichnet wurden klinische Parameter, durch die der Krankheitsverlauf dokumentiert wird.

AusführungsbeispieleBeispiel 1: Aufstellung eines Klassifikators zur Identifizierung von SIRS- und Sepsis-Patienten mit hoher Sensitivität/SpezifitätPatienten-Gruppen

Im ersten Schritt der Analyse (Training) wurden Proben von Patienten einer Intensiv-Station (ITS) eingeschlossen. Für die Sepsis-Gruppe wurden Patienten mit einem mikrobiologisch bestätigten Infektionsfokus ausgesucht, wobei die Probe vom ersten Tag der Sepsis berücksichtigt wurde. In die Kontroll-Gruppe wurden Patienten nach einer schweren Herz-OP ausgewählt (Kardiopulmonaler Bypass, CPB), die postoperativ eine sterile SIRS entwickelt haben. Die Kontrollgruppe wurde an die Sepsis-Gruppe bzgl. Patientenzahl, Alter, Geschlechtsaufteilung und Erkrankungsschwere angepasst, so dass der wesentliche Unterschied zwischen den Gruppen im Vorhanden einer infektiösen Komplikation lag. Jeder Patient der Kontrollgruppe wurde mit je einer Probe vertreten. Der Trainingsdatensatz bestand aus 29 Sepsis- und 29 Kontrollfällen. Die wichtigsten klinischen Parameter wurden in der Tabelle 6 zusammengefasst.

Im zweiten Schritt (Validierung) wurde ein Testdatensatz untersucht, der aus 113 Proben von 65 Personen bestand (vgl. Tabellen 4 und 5). Dabei wurden Proben von weiteren Sepsis-Patienten untersucht, die ein breites Spektrum an klinischen Phänotypen mit dem Risiko eine generalisierte Infektion ausbilden, repräsentieren. Darüber hinaus wurden Proben über den Krankheitsverlauf von SIRS zu Sepsis ausgesucht. In die Analyse wurden höchstens Proben von den ersten 2 Tagen der Sepsis-Diagnose eingeschlossen.

Als Kontrolle dienten weitere Proben der. SIRS-Patienten aus der Trainingsgruppe, technische Wiederholungen, Proben weiterer postoperativen Fälle und 5 gesunde Kontrollen. Auch mit dieser Auswahl der Kontrollen wird die Anwendbarkeit des Verfahrens in einem breit angelegten Phänotyp sichergestellt.

Messung der Genexpression

Aus dem Blut der Patienten wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese wurde im Assay als Templat eingesetzt. Die Markerkandidaten zur Klassifizierung wurden in den Tabellen 2 und 3 zusammengefasst. Ans Ende der Tabelle wurden 3 sogenannte Referenzgene (auch Housekeepinggene) eingefügt (R1, R2 und R3). Sie ermöglichen eine relative Quantifizierung von Genexpression, die eine Aussage zur Abundanz des Targettranskriptes bezogen auf einen Kalibrator. Für jeden Organismus und jedes Gewebe sind solche Referenzgene spezifisch und müssen für die jeweilige Anwendung, hier die Unterscheidung einer infektiöser von einer nicht-infektiöser Ursache einer systemischen Entzündungreaktion anhand von humanen Vollblut-Proben, sorgfältig ausgewählt werden. Ausgehend von den Genexpressionsprofilen aus dem Vollblut der Sepsis- und Kontrollpatienten wurden die stabilsten Gene mit der geringsten Variabilität ausgewählt und in der quantitativen PCR zur Normalisierung eingesetzt.

Experimentelle AusführungBlutabnahme und RNA-Isolation:

Das Vollblut der Patienten wurde auf der Intensivstation von den Patienten in PAXgene tubes abgenommen (PreAnalytix, Hombrechtikon, CH) und nach den Herstellervorgaben bis zur Aufarbeitung gelagert. Mit PAXGene Blond-RNA-Kits wurde gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen, Hilden, BRD) die RNA isoliert und bis zur Analyse bei –80°C gelagert.

Reverse Transkription:

Von jeder Patienten-Probe wurden 0,5 μg der Total-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen Deutschland, Karlsruhe, BRD) in einem 20 μl-Ansatz (enthält 1 μl 10 mM dNTP-Mix von Fermentas und 1 μl 0,5 μg/μl Oligo(dT)-Primer) umgeschrieben. Die RNA wurde anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Die Reaktionsansätze wurden nicht aufgereinigt, sondern mit Wasser auf 50 μl aufgefüllt.

Real-Time-PCR

Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG – Kit der Firma Invitrogen (Invitrogen Deutschland, Karlsruhe, BRD). Die Patienten-cDNA wurde 1:25 mit Wasser verdünnt, davon wurde jeweils 1 μl in die PCR eingesetzt. Die Proben wurden jeweils in 3 Replikaten pipettiert.

PCR-Ansatz pro well (10 μl)2 μl Templat-cDNA 1:1001 μl forward primer, 10 mM1 μl reverse primer, 10 mM1 μl Fluorescein Reference Dye5 μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG

Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 9 μl-Aliquots in die PCR-Platte aliquotiert, dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert.

Das sich daran anschließende PCR-Programm bestand aus den folgenden Schritten:

Verwendet wurde das iQTM 5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware. Die so genannten Ct-Werte (Anzahl der Zyklen) wurden als Messergebnis vom Programm automatisch im Bereich des linearen Anstiegs der Kurven berechnet. Die Messwerte wurden im String-Format abgespeichert.

Datenanalyse:

Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version R 2.8.0 (R. app GUI 1.26 (5256), S. Urbanek & S. M. Iacus, © R Foundation for Statistical Computing, 2008) durchgeführt, die unter www.r-project.org zur Verfügung steht.

Daten-Vorverarbeitung:

Die in die Analyse eingegangenen Datenmatrizen der gemessenen Ct-Werte wurden in den Tabellen 6 und 7 für jeweils den Training- und Testdatensatz dargelegt. Zum Normalisieren wurde für jede Probe der Mittelwert der 3 ausgewählten Housekeeper-Gene (R1, R2 und R3) berechnet. Von diesem Wert wurde der Ct-Wert jedes einzelnen Markers abgezogen. Jeder so gewonnene Delta Ct Wert spiegelt die relative Abundanz des Targettranskriptes bezogen auf den Kalibrator wider, wobei ein positiver Delta Ct Wert eine Abundanz höher als der Mittelwert der Referenzen und negativer Delta Ct Wert eine Abundanz kleiner als der Mittelwert der Referenzen bedeuten. Tabelle 6: Ct-Werte des Trainingsdatensatzes pro Marker (Mittelwert der Dreifachbestimmung) und die Gruppenzugehörigkeit, (letzte Spalte)Tabelle 7: Ct-Werte des Testdatensatzes pro Marker (Mittelwert der Dreifachbestimmung, fehlende Werte wurden mit NA notiert und aus der Analyse ausgeschlossen) und die Gruppenzugehörigkeit (letzte Spalte). Die ersten 5 Proben gehören zu gesunden Probanden, die anderen zu den Patienten, die in der Tabelle 4 beschrieben wurden. Die zugehörige Experiment-ID setzt sich zusammen aus der Fallnummer und der Proben-ID (eingeführt mit 2 Nullen), eine zusätzliche 1 markiert eine Wiederholung

Klassifikation:

Ziel der Klassifikation war die Bestimmung des Markersets, der die beste Trennung zwischen Proben von Patienten mit und ohne Sepsis ermöglicht.

Um die Gen-Marker nach ihrer Trennungsgüte anzuordnen, wurde die lineare Diskriminanzanalyse (LDA) [Hastie et al., 2001] zusammen mit der Methode der vorwärts Selektion verwendet, wobei die Trennbarkeit mit dem F-Wert bewertet wurde [Hocking, R. R., 1976].

Die Berechnung erfolgte unter der Verwendung der Funktion Ida aus der R-Bibliothek MASS. Für p Marker wurden die Gewichte (w0, ... wp) der Diskriminanzfunktion fLD, die durch die Formel definiert ist, aus den Trainingsdaten berechnet. Jede Trainings-Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für xi die Delta Ct-Werte der Probe eingesetzt wurden. Die Gewichte der Diskriminanzfunktion wurden so berechnet, dass ein positiver Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe mit einer infektiösen Komplikation und ein negativer Wert der Funktion die Zuordnung zur Gruppe ohne eine infektiöse Komplikation bedeuten.

Die Klassifikationsprozedur wurde für eine aufsteigende Anzahl von Markern wiederholt, wobei sukzessiv die Marker-Kandidaten in die Diskriminanzanalyse eingeschlossen wurden, die den höchsten Beitrag zur Trennungsgüte leisteten (vorwärts Selektion). Dieser Analyseschritt wurde für 1000 Bootstrap-Stichproben wiederholt, die durch zufälliges Ziehen mit Zurücklegen aus dem Trainingsdatensatzes gewonnen wurden. Die in jeder Wiederholung ermittelten Marker-Ranks wurden über die 1000 Laufe gemittelt. Die Marker-Kandidaten wurden nach dem mittleren Rank aufsteigend angeordnet. Diese Anordnung bedeutet, dass der Marker mit dem kleinsten mittleren Rank der war, der am häufigsten den meisten Beitrag zur Trennungsgüte leistete und der Marker mit dem höchsten mittleren Rank für die Trennung in meisten Wiederholungen wenig beitrug.

Die Güte des ermittelten Marker-Rankings wurde geprüft, in dem die Trennbarkeit der Trainingsgruppen für Markersets mit aufsteigender Markerzahl bewerten wurde. Dafür wurde die lineare Diskriminanzanalyse mit einer einfachen Kreuzvalidierung verwendet. Für p Marker wurden die Gewichte (w0, ... wp) der Diskriminanzfunktion fLD aus dem reduzierten Trainingsdaten berechnet, in dem nacheinander eine Probe weggelassen wurde. Diese Probe wurde nachhinein klassifiziert, wofür in der vorangegangenen Formel für xi die Delta Ct-Werte der Probe eingesetzt wurden.

Um zu prüfen, dass die Trennungs-Güte nicht primär vom Klassifikationsverfahren sondern von der Marker-Auswahl abhängt, wurde abschließend die einfache Kreuzvalidierung auch für die quadratische Diskriminanzanalyse (QDA) [Hastie et al., 2001] in gleicher weise wiederholt. Die Berechnung erfolgte unter der Verwendung der Funktion qda aus der R-Bibliothek MASS.

Die Klassifikationsergebnisse des Trainingsdatensatzes wurden für die Matrix des Testdatensatzes validiert. Aus dem Trainingsdatensatz wurde für jedes Markersets mit. aufsteigender Markerzahl die Diskriminanzfunktion bestimmt und zu Klassifikation der Test-Proben verwendet. Die Güte der Klassifikation wurde mittels der Receiver Operating Characteristic (ROC) – Kurve bewertet, in der die Rate der richtig Positiven (Sensitivität) gegen die Rate der falsch Positiven (1-Spezifität) für eine aufsteigenden Folge der Klassifikationsschwellen abgebildet wird [Fawcett T., 2006]. Für die Bewertung wurde aus jeder ROC-Kurve die Fläche unter dar Kurve (AUC) berechnet und die höchste erreichbare Klassifikationseffizienz (Anteil der korrekt klassifizierten Proben) bestimmt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der oben beschriebenen Klassifikationsanalyse wurden in der Tabelle 8 zusammengefasst. Die Ranking-Prozedur ergab die folgende Anordnung der Marker-Kandidaten: M6, M15, M9, M7, M2, M10, M4, M12, M17, M3, M8, M13, M16. Die Kreuzvalidierungsrate der LDA und der QDA stieg deutlich für die ersten 3 Marker auf 94.8%. Die beste Trennung der Trainingsgruppen mit 96,6% wurde mit LDA für die ersten 6 Marker erreicht, bei der 56 aus 58 Proben richtig klassifiziert wurden (QDA liefert ein Maximum bei 3 Markern folgend mit 7 Markern). Für mehr als 7 Markern wurde keine Verbesserung der Klassifikation erreicht.

Für den unabhängigen Testdatensatz wurde die größte Fläche unter der ROC-Kurve von mehr als 85% für die ersten 6 und 7 Markern erreicht, die beste Klassifikation mit 81,4% lieferten die ersten 7 Markern. Tabelle 8: Ergebnisse der Klassifikationsoptimierung. Fett markiert ist der maximale Wert der jeweiligen Spalte, der das beste Ergebnis bzgl. der Markerkombination widerspiegelt.

Trainingsdaten (n = 58)Testdaten (n = 113)Markerrankingmittlerer Rank (1000 Bootstraps)Kreuzvalidierungsrate (%)Fläche unter der ROC-Kurve, AUC (%)Klassifikationsq-Effizienz (%)LDAQDAM63.370.774.160.160.2M154.179.381.068.168.1M94.494.894.884.078.8M75.793.187.984.377.9M25.793.189.783.875.2M107.096.687.985.278.8M47.191.493.185.481.4M127.289.789.783.978.8M178.791.489.782.577.9M38.991.487.981.978.8M89.489.784.580.375.2M139.487.981.079.273.5M1610.387.977.678.473.5

Da in der Klassifikationsanalyse die besten Ergebnisse überwiegend mit den ersten 7 Markern aus der obigen Tabelle erreicht wurden, wurde für weitere Klassifikationen die 7-Marker-LDA verwendet, deren Diskriminanzfunktion fLD aus dem Trainingsdatensatz bestimmt wurde. Die zugehörigen Gewichte (w0, ... w7) wurden in der Tabelle 9 dargelegt.

Basierend auf dieser Funktion wurde ein auf die Sepsis bezogener diagnostischer. Parameter, ein sogenannter SIQ-Score (SIQ) wie folgt eingeführt. Für eine neue unabhängige Probe bekommt man als Klassifkationsergebnis einen dimensionsfreien Wert der Diskriminanzfunktion. Ein positiver Wert klassifiziert die Probe als infektiös und ein negativer Wert als nicht infektiös. Für typische Vertreter der jeweiligen Gruppe erhält man absolut höhere Werte, schwer klassifizierbare Proben erreichen Werte nahe Null. Der Streubereich der Diskriminanz-Werte entspricht i. a. der Variabilität der Delta Ct-Datenmatrix. So erreichte man in der Klassifikation Diskriminanzwerte von ca. –5 bis 5. Um die Unterschiede deutlicher hervorzuheben, wurde der SIQ-Score (SIQ) als der 10-fache Wert der Diskriminanzfunktion mit den Gewichten aus der Tabelle 9 eingeführt. Dementsprechend variierten die SIQ-Werte der Testdaten von ca. –50 bis 50. Tabelle 9: Gewichte der Diskriminanzfunktion, die aus dem Trainingsdatensatz ermittelt wurden.

w0w1
(M6)
w2
(M15)
w3
(M9)
w4
(M7)
w5
(M2)
w6
(M10)
w7
(M4)
0.1600.733–0.722–1.0060.188–0.387–0.2680.161

In der linearen Diskriminanzanalyse wird i. a. die Diskriminanzfunktion so bestimmt, dass die Trennungsschwelle zwischen den beiden Trainingsgruppen bei Null liegt. Mittels der ROC-Kurve kann bei einem unabhängigen Testdatensatz ermittelt werden, bei welchem Schwellen-Wert die beste Trennung der zugehörigen Test-Gruppen erreicht wird. in 1 wird die ROC-Kurve zur Klassifikation der Testdaten mittels des SIQ-Scores dargestellt und es wird das Verhältnis zwischen richtig Positiven (Sensitivität) und falsch Positiven (1-Spezifität) markiert, grau gestrichelt für den Schwellenwert von Null und schwarz gestrichelt für die beste erreichte Klassifikation von 81,4%. Dieses Klassifikationsergebnis wurde für den Schwellenwert von SIQ = –4.9 erreicht. Aus 1 wurde ersichtlich, dass durch die Verschiebung der Schwelle von 0 auf –4.9 einen Sensitivität-Gewinn von ca. 63% auf über 80% zu Kosten der Spezifität von ca. 81% auf ca. 80% erreicht wird. Dieses Ergebnis spiegelt die Diskrepanz zwischen den vorausgewählten Patienten des Trainingsdatensatzes und dem heterogenen Kollektiv des Testdatensatzes wider. Die Klassifikationsgüte, die mit der aktualisierten Klassifikationsschwellen von SIQ = –4.9 erreicht wurde, wird in der Tabelle 10 dargestellt.

Damit wird demonstriert, dass die beschriebene Erfindung für die Unterscheidung zwischen infektiöser und nicht-infektiöser Genese bei systemischen Reaktionen des Organismus, wie z. B. SIRS, Sepsis, postoperative Komplikationen, chronischem und/oder akutem Organdysfunktion, Schock-Reaktion, Entzündungsreaktion und/oder Trauma, differentialdiagnostisch angewendet werden kann. Tabelle 10: Güte der Klassifikation für den Testdatensatz mittels des SIQ-Scores bei einer Schwelle

GoldstandardSumme (n)Vorhersage-werteSepsis (n)keine Sepsis (n)SIQ-Score (Schwelle = –4.9)positiv (n)32.7% (37)12.4% (14)45.1% (51)72.5%negativ (n)6.2% (7)48.7% (55)54.9% (62)88.7%Summe (n)38.9% (44)61.1% (69)100.0% (113)Sensitivität 84.1%Spezifität 79.7%Effizienz 81.4%

Beispiel 2: Frühe Sepsis-Erkennung

Im Testdatensatz des 1. Ausführungsbeispiels wurden für den Fall Nr. 8112 4 Proben vor und 2 Proben nach der Entwicklung der Sepsis untersucht (vgl. Tabellen 4 und 7). In der Klassifikationsanalyse wurde ein SIQ-Score über dem Wert von –4.9 bereits 2 Tage vor der klinischen Manifestation der Sepsis erreicht. Der Verlauf des im 1. Ausführungsbeispiel eingeführten SIQ-Scores sowie der Verlauf weiterer Sepsisrelevanten klinischen Parameter (PCT, CRP, SOFA, Körpertemperatur, Schockbehandlung) wird in 2 dargestellt. Aus 2 wird ersichtlich, dass SIQ-Score der einzige Parameter ist, der vorzeitig die infektiöse Komplikation widerspiegelt. Damit wird demonstriert, dass die beschriebene Erfindung für die frühe Erkennung von infektiösen Komplikationen, wie Sepsis und/oder generalisierter Infektion, angewendet werden kann.

Beispiel 3: Beobachtung des Therapieverlaufs

Im Testdatensatz des 1. Ausführungsbeispiels wurden für den Fall Nr. 7084 2 Proben vor und 2 Proben nach der Entwicklung der Sepsis untersucht (vgl. Tabellen 4 und 7). Für das 3. Ausführungsbeispiel wurden 5 nachfolgenden Proben dieses Patienten in gleicher Weise, wie es im 1. Beispiel beschrieben wurde, vermessen und ausgewertet (vgl. Tabelle 11). In 3 wurden die ermittelten Werte des im 1. Ausführungsbeispiel eingeführten SIQ-Scores zusammen mit den Sepsis-relevanten klinischen Parameter PCT, CRP, SOFA, Körpertemperatur sowie der Dosierung von Katecholaminen (norepinephrine), die die Schock-Behandlung reflektiert, dargestellt. Aus 3 wird ersichtlich, dass SIQ-Score ein Tag vor der klinischen Manifestation der Sepsis über den Schwellenwert von –4.9 ansteigt und in der akuten Phase über der Schwelle bleibt. Nach der klinischen Manifestation der Sepsis wurden eine entsprechende Antibiotika-Therapie. und eine Schockbehandlung begonnen (vgl. Tabelle 4 und 3). Die akute Phase wurde mit dem Absetzen der Katecholamine (Schock-Behandlung) am B. Tag beendet. Der verbesserte Zustand des Patienten spiegelt sich auch im Abfallen des SOFA-Scores ab dem 7. Tag wider. Nach der akuten Phase nimmt auch der SIQ-Score ab und fällt am 8. Tag unter die Schwelle von –4.9. Die Parameter PCT und CRP nehmen ebenfalls ab, bleiben aber über dem zugehörigen diagnostischen Entscheidungswert. Damit wird demonstriert, dass die beschriebene Erfindung für die Verlaufskontrolle und/oder Therapiekontrolle von z. B. Antibiotika-Therapie und/oder adjunktive klinische Maßnahmen und/oder operative Sanierungsmaßnahmen angewendet werden kann. Tabelle 11: Ct-Werte des Trainingsdatensatzes pro Marker (Mittelwert der Dreifachbestimmung) und die Gruppenzugehörigkeit (letzte Spalte)

LITERATUR

  • ACCP/SCCM (1992), Crit. Care Med 20, 864–74
  • Alberti C, Brun-Buisson C, Goodman SV, Guidici D, Granton J, Moreno R, Smithies M, Thomas O, Artigas A, Le Gall JR; European Sepsis Group (2003) Influence of systemic inflammatory response syndrome and Sepsis on outcome of critically ill infected patients. Am J Respir Crit Care Med 168, 77–84.
  • Altschul et al: J Mol Biol 215: 403–410; 1990
  • Amin K, Kauffman CA (2003), Fever of unknown origin. Postgrad med114(3), 69–75
  • Baker SG, und Kramer B (2006), Identifying genes that contribute most to good classification in microarray. BMC Bioinformatics 7, 407
  • Benson D. A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., Sayers E. W. GenBank. Nucleic Acids Res. 2009 Jan; 37 (Database issue): D26–31.
  • Blake PG (2008) Complicated peritonitis – the biggest cause of technique failiure. Perit Dial Int. 28(4): 327–328
  • Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger EP, Fein AM, Knaus WA, Schein RM, Sibbald WJ, the ACCP/SCCM Consensus Conference Committee (1992) Definitions for Sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in Sepsis. Chest 101, 1656–1662
  • Box GEP, Cox DR (1964) An analysis of transformations (with discussion). J Roy Stat Soc B 26, 211–252
  • Buneß A, Huber W, Steiner K, Sültmann H, Poustka A (2005) ArrayMagic: two-colour cDNA microarray quality control and preprocessing. Bioinformatics 21, 554–556.
  • Breiman L (2001) Random Forests. Machine Learning 45(1), 5–32
  • Brun-Buisson C, Doyon F, Carlet J, Dellamonica P, Gouin F, Lepoutre A, Mercier JC, Offenstadt G, Regnier B (1995) Incidence, risk factors, and outcome of severe Sepsis and septic shock in adults. A multicenter prospective study in intensive care units. French ICU Group for Severe Sepsis. JAMA 274, 968–974
  • Brun-Buisson C, Roudot-Thoraval F, Girou E, Grenier-Sennelier C, Durand-Zaleski I (2003) The costs of septic syndromes in the intensive care unit and influence of hospital-acquired Sepsis. Intensive Care Med 29, 1464–1471
  • Bustin SA (2002) Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endicronol 29, 23–29
  • Calandra T, Cohen J. (2005) International Sepsis Forum Definition of Infection in the ICU Consensus Conference. Critical Care Med 33(7), 1538–48.
  • Carrigan SD Scott G Tabrizian M (2004) Toward resolving the challenges of Sepsis. Clin Chem 50(8), 1301–1314
  • DE 10 2007 036 678 Verwendung von Polynukleotiden zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion
  • DE 102007036678.9 (nicht veröffentlicht)
  • Ding BY and Gentleman R (2004) Classification using generalized partial least. squares. Bioconductor Project Working Papers. Paper 5. http://www.begress.com/bioconductor/paper5_9
  • Efron B (1979) Bootstrap Methods: Another Look at the Jackknife. The Annals of Statistics 7(1), 1–26
  • Fawcett, T. (2006). An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters, 27, 861–874.
  • FDA: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays. Draft Guidance for Industry, Clinical Laboratories, and FDA Staff (2003) http://www.fda.gov/cdrhloivdlguidance/1610.pdf
  • Feezor RJ, Baker HV, Xiao W et al. (2004) Genomic and Proteomic Determinants of Outcome in Patients Untergoing Thoracoabdominal Aortic Aneurysm Repair. J Immun 172, 7103–7109
  • Klein D (2002) Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends Mol Med. 8(6), 257–260
  • Koulaouzidis A, Bhat S, Saeed AA (2009) Spontaneous bacterial peritonitis. World J Gastroenterol. 15(9): 1042–9.
  • Mayhall G (2001) Ventilator-Associated Pneumonia or Not? Contemporary Diagnosis. Emerging Infection Disease CDC 7(2)
  • Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. (1999) Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286, 531–537
  • T. Hastie, R. Tibshirani, J. Friedman (2001) „The Elements of Statistical Learning”, Springer series in statistics, ISBN 0-387-95284-5.
  • Hocking, R. R. (1976) ”The Analysis and Selection of Variables in Linear Regression” Biometrics, 32.
  • Hollander M., Wolfe D., (1973), Nonparametric statistical inference. New York: John Wiley & Sons.
  • Huber W, von Heydebreck A, Sueltmann H, Poustka A, Vingron M (2003) Parameter estimation for the calibration and variance stabilization of microarray data. Stat Appl in Genetics and Mol Biology 2(1), Article 3
  • Huggett J, Dheda K, Bustin S et al. (2005) Real-time RT-PCr normalisation; strategies and considerations Genes Immun 6(4), 279–284
  • Increase in National Hospital Discharge Survey rates for septicemia-United States, 1979–1987. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990 39, 31–34
  • Johnson SB, Lissauer M, Bochicchio GV, Moore R, Cross AS, Scalea TM. (2007) Gene Expression Profiles Differentiate Between Sterile SIRS and Early Sepsis Annals of Surgery 245(4), 611–621
  • Knaus WA, Draper EA, Wagner DP, Zimmermann JE (1985) Prognosis in acute organ-system failure. Ann Surg 202, 658–693
  • Kofoed K, Andersen O, Kronborg G, Tvede M, Petersen J, Eugen-Olsen J, Larsen K (2007), Use of plasma C-reactive protein, procalcitonin, neutrophils, macrophage migration inhibitory factor, soluble urokinase-type plasminogen activator receptor, and soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in combination to diagnose infections: a prospective study. Critical Care 11, R38
  • Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M et al. (2006) The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med 27, 95–125
  • Kumar A, Roberts D, Wood KE et al. (2006) Duration of hypothension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med 34(6), 1589–1596
  • Le-Gall JR, Lemeshow S, Leleu G, Klar J, Huillard J, Rue M, Teres D, Artigas A (1995) Customized probability models for early severe Sepsis in adult intensive care patients: Intensive Care Unit Scoring Group. JAMA 273, 644–650
  • Levy MM, Fink MP, Marshall JC, Abraham E, Angus D, Cook D, Cohen J, Opal SM, Vincent JL, Ramsay G et al. (2003) 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Intensive Care Med 29, 530–538
  • Liu H, Li J, Wong L (2005) Use of extreme patient samples for outcome prediction from gene expresseion data. Bioinformatics 21(16), 3377–3384
  • MAQC Consortium. The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter-and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. Nat Biotechnol 2006, 24:, 1151–61
  • Mathiak G, Kabir K, Grass G, et al. (2003) Lipopolysaccharides from different bacterial sources elicit disparate cytokine responses in whole blood assays. Int J Mol Med 11(1), 41–44
  • Marshall JC, Vincent JL, Fink MP et al. Measures, markers, and mediators: toward a staging system for clinical sepsis. A report of the Fifth Toronto Sepsis Roundtable, Toronto, Ontario, Canada, October 25-26, 2000 und Crit Care Med. 2003, 31: 1560–1567
  • Mayhall CG (2001) Ventilator-Associated Pneumonia or Not? Contemporary Diagnosis. Emerg Infect Dis 7(2), 200–204
  • Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006) Quantification of mRNA using realt-time RT-PCR. Nat Protoc 1(3), 1559–1582
  • Opal SM, Lim Y-P, Siryapom E. et al. (2005) Longitudinal studies of inter-alpha inhibitor proteins in severly septic patients: A potential clinical marker and mediator of severe sepsis. Clin Invest 35(2), 387–292
  • Pachot A, Lepape A, Vey S, et al. (2006) Systemic transcriptional analysis in survivor and non-survivor septic shock patients: a preliminary study. Immunol Lett 106(1), 63–71. Epub 2006 May 17
  • Pile JC (2006) Evaluating postoperative fever: a focused approach. Clev Clin J Med. 73 (supp. 1) 62–66
  • Pruitt K. D., Tatusova T., Maglott D. R. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins. Nucleic Acids Res. 2007 Jan; 35 (Database issue): D61–5.
  • Ramilo O, Allman W, Chung W, Mejias A, Ardura M, Glaser C, Wittkowski KM, Piqueras P, Bancherau J, Palucka K A, Chaussabel D, (2007) Gene expression patterns in blood leukocytes discriminate patients with acute infections. Blood 109, 2066–2077
  • R Development Core Team (2006) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-Droiect.org
  • Rocke DM, Durbin B. (2001) A model for measurement error for gene expression arrays. J Comput Biol 8, 557–569
  • Roth AR, Basello DO, (2003) Approach to the adult patient with fever of unknown origin. Am Fam Phys 68(11) 2223–2228
  • Ruokonen E et al. (1999) Procalcitonin concentrations in patients with neutropenic fever. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(4), 283–5
  • Ruokonen E et al. (2002) Procalcitonin and neopterin as indicators of infection in critically ill patients. Acta Anaesthesiol Scand 46(4), 398–404
  • Simon L, Gauvin F, Amre DK; Saint-Lois P, Lacroix J, (2004) Serum procalcitonin and C-reactive protein levels as marker of bacterial infection: A systematic review and meta analysis: Clin Infec Dis 39, 206–217
  • Simon R. (2005) Roadmap for Developing and Validating Therapeutically Relevant Genomic Classifiers. J Clin Oncol 23, 7332–7341
  • Sponholz C, Sakr Y, Reinhart K, Brunkhorst F, (2006) Diagnostic value and prognostic implications of serum procalcitonin after cardiac surgery: a systematic review of the literature, Critical Care 10, R145
  • Suprin E et al. (2000) Procalcitonin: a valuable indicator of infection in a medical ICU Intensive Care Med 26(9), 1232–1238
  • Tang BMP, Eslick GD, Craig JC et al. (2007a) Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients: systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis 7, 210–217
  • Tang BMP, McLean AS, Dawes IW, Huang SJ, Lin RCY (2007b) The Use of Gene-Expression Profiling to Identify Candidate Genes In Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 176(7), 676–684 The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information; 2002 Oct.
  • US 20060246495 Diagnosis of sepsis
  • US 6960439 Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles
  • Vandesompele J, Preter De K, Pattyn F, et al. (2002) Accurate normalisation of realtime quantitative PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 3(7), research0034.1-0034.11
  • Valasek MA, Repa JJ (2005) The power of real-time PCR. Advan Physiol Educ 29, 151–159
  • Vapnik V., (1999). The Nature of Statistical Leaming Theory. Springer, New York.
  • Whitcombe D, Theaker J, Guy SP et al. (1999) Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fouoreschence. Nat Biotechnol 17, 904–907
  • WO 2006/100203 Verwendung von Geneaktivitäts-Klassifikatoren für die in vitro Klassifizierung von Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem
  • WO 2004/087949 Verfahren zur Erkennung akuter, generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS), Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen und systemischen Infektionen
  • WO 2005/083115 Verfahren zur Erkennung von Sepsis
  • WO 2005/106020 Verfahren zur Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis
  • WO2006/042581 Verfahren zur Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines Multiorganversagens
  • WO 2007/144105 Verfahren zur Feststellung der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese
  • WO 2007/124820 Verfahren zur in vitro-überwachung postoperativer Veränderungen nach Lebertransplantation
  • WO 2003/084388 Early detection of sepsis
  • Wong ML, Medrano JF (2005) Real-time PCR for mRNA quantification. Biotechniques 39(1) 1–11
  • Zeni F, Freeman B, Natanson C (1997) Anti-inflammatory therapies to treat sepsis and septic shock: A reassessment. Crit Care Med 25(7), 1095–1100
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • WO 2004/087949 [0027, 0083, 0230]
  • DE 102007036678 [0027, 0083, 0230, 0230]
  • WO 2007/124820 [0027, 0230]
  • WO 03084388 [0027]
  • US 6960439 [0027, 0230]
  • WO 2005/083115 [0083, 0230]
  • WO 05/106020 [0083]
  • WO 2006/042581 [0083, 0230]
  • WO 2006/100203 [0083, 0230]
  • WO 2007/144105 [0083, 0230]
  • US 20060246495 [0230]
  • WO 2005/106020 [0230]
  • WO 2003/084388 [0230]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Kumar et. al., 2006 [0004]
  • Marshall et. al., 2003 [0005]
  • Blake 2008 [0012]
  • Koulaouzidis et al. 2009 [0012]
  • Marshal et al., 2003 [0016]
  • Alberti et al., 2003 [0016]
  • Brun-Buisson et al., 1995 [0016]
  • Le-Gall et al., 1995 [0016]
  • Brun-Buisson et al., 2003 [0016]
  • MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990 [0016]
  • „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)” aus dem Jahr 1992 [0017]
  • Bone et al., 1992 [0017]
  • Bone et al., 1992 [0019]
  • Poeze et al., 2003 [0019]
  • Levy et al., 2003 [0019]
  • Opal et al., 2005 [0019]
  • Carrigan et al., 2004 [0021]
  • Sponholz et al., 2006 [0023]
  • Ruokonen et al., 1999 [0023]
  • Suprin et al. 2000 [0023]
  • Ruokonen, et al., 2002 [0023]
  • Tang et al., 2007a [0023]
  • Sponholz et al., 2006 [0025]
  • Kofoed et al., 2007 [0025]
  • Simon et al., 2004 [0025]
  • Mathiak et al., 2003 [0027]
  • Pachot et al., 2006 [0027]
  • Ramilo et al., 2007 [0027]
  • Bone et al., 1992 [0027]
  • Tang et al., 2007b [0033]
  • Johnson et al., 2007 [0033]
  • Tang et al., 2007b [0034]
  • Johnson et al., 2007 [0036]
  • Feezor et al., 2003 [0039]
  • Ramilo et al., 2007 [0040]
  • Simon et al., 2005 [0041]
  • Pruitt et al. 2007; The NCBI handbook 2002 [0087]
  • The NCBI handbook 2002 [0089]
  • The NCBI handbook 2002 [0091]
  • The NCBI handbook 2002 [0092]
  • The NCBI handbook 2002 [0093]
  • Pruitt et al. 2007 [0094]
  • Bone et al., 1992 [0097]
  • Levy et al., 2003 [0097]
  • Zeni et al., 1997 [0098]
  • Knaus et al., 1985 [0098]
  • Bone et al., 1992 [0099]
  • Roth und Basello, 2003 [0100]
  • Amin und Kauffman, 2003 [0100]
  • Pile et al., 2006 [0101]
  • Bone et al., 1992 [0104]
  • Levy et al., 2003 [0104]
  • Bone et al., 1992 [0105]
  • Levy et al., 2003 [0105]
  • http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi [0114]
  • http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi [0117]
  • www.ncbi.nlm.nih.gov [0120]
  • www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html [0121]
  • Altschul et al., J Mol Biol 215: 403–410; 1990 [0128]
  • Valasek und Repa, 2005 [0147]
  • Klein, 2002 [0147]
  • Wong et al., 2005 [0148]
  • Bustin 2002 [0148]
  • Nolan et al., 2006 [0149]
  • Kubista et al., 2006 [0150]
  • Whitcombe et al,. 1999 [0152]
  • Huggett et al., 2005 [0153]
  • Golub et al., 1999 [0165]
  • Hastie et al., 2001 [0167]
  • Breiman, 2001 [0168]
  • Ding und Gentleman, 2004 [0169]
  • Vapnik, 1999 [0170]
  • Hastie et al., 2001 [0171]
  • IVDMIA, FDA-Guidelines, 2003 [0173]
  • Mayhall, 2001 [0175]
  • Liu et al., 2005 [0176]
  • Johnson et al., 2007 [0177]
  • Tang et al., 2007a [0177]
  • Levy et al., 2003 [0178]
  • ACCP/SCCM, 1992 [0179]
  • Levy et al., 2003 [0179]
  • Calandra und Cohen, 2005 [0179]
  • Buneß et al., 2005 [0180]
  • Hastie et al., 2001 [0180]
  • Hocking, R. R., 1976 [0180]
  • www.ingenuity.com [0199]
  • R. app GUI 1.26 (5256), S. Urbanek & S. M. Iacus, © R Foundation for Statistical Computing, 2008 [0213]
  • www.r-project.org [0213]
  • Hastie et al., 2001 [0216]
  • Hocking, R. R., 1976 [0216]
  • Hastie et al., 2001 [0220]
  • Fawcett T., 2006 [0221]
  • ACCP/SCCM (1992), Crit. Care Med 20, 864–74 [0230]
  • Alberti C, Brun-Buisson C, Goodman SV, Guidici D, Granton J, Moreno R, Smithies M, Thomas O, Artigas A, Le Gall JR; European Sepsis Group (2003) Influence of systemic inflammatory response syndrome and Sepsis on outcome of critically ill infected patients. Am J Respir Crit Care Med 168, 77–84 [0230]
  • Altschul et al: J Mol Biol 215: 403–410; 1990 [0230]
  • Amin K, Kauffman CA (2003), Fever of unknown origin. Postgrad med114(3), 69–75 [0230]
  • Baker SG, und Kramer B (2006), Identifying genes that contribute most to good classification in microarray. BMC Bioinformatics 7, 407 [0230]
  • Benson D. A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., Sayers E. W. GenBank. Nucleic Acids Res. 2009 Jan; 37 (Database issue): D26–31 [0230]
  • Blake PG (2008) Complicated peritonitis – the biggest cause of technique failiure. Perit Dial Int. 28(4): 327–328 [0230]
  • Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger EP, Fein AM, Knaus WA, Schein RM, Sibbald WJ, the ACCP/SCCM Consensus Conference Committee (1992) Definitions for Sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in Sepsis. Chest 101, 1656–1662 [0230]
  • Box GEP, Cox DR (1964) An analysis of transformations (with discussion). J Roy Stat Soc B 26, 211–252 [0230]
  • Buneß A, Huber W, Steiner K, Sültmann H, Poustka A (2005) ArrayMagic: two-colour cDNA microarray quality control and preprocessing. Bioinformatics 21, 554–556 [0230]
  • Breiman L (2001) Random Forests. Machine Learning 45(1), 5–32 [0230]
  • Brun-Buisson C, Doyon F, Carlet J, Dellamonica P, Gouin F, Lepoutre A, Mercier JC, Offenstadt G, Regnier B (1995) Incidence, risk factors, and outcome of severe Sepsis and septic shock in adults. A multicenter prospective study in intensive care units. French ICU Group for Severe Sepsis. JAMA 274, 968–974 [0230]
  • Brun-Buisson C, Roudot-Thoraval F, Girou E, Grenier-Sennelier C, Durand-Zaleski I (2003) The costs of septic syndromes in the intensive care unit and influence of hospital-acquired Sepsis. Intensive Care Med 29, 1464–1471 [0230]
  • Bustin SA (2002) Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endicronol 29, 23–29 [0230]
  • Calandra T, Cohen J. (2005) International Sepsis Forum Definition of Infection in the ICU Consensus Conference. Critical Care Med 33(7), 1538–48 [0230]
  • Carrigan SD Scott G Tabrizian M (2004) Toward resolving the challenges of Sepsis. Clin Chem 50(8), 1301–1314 [0230]
  • Ding BY and Gentleman R (2004) Classification using generalized partial least. squares. Bioconductor Project Working Papers. Paper 5. http://www.begress.com/bioconductor/paper5_9 [0230]
  • Efron B (1979) Bootstrap Methods: Another Look at the Jackknife. The Annals of Statistics 7(1), 1–26 [0230]
  • Fawcett, T. (2006). An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters, 27, 861–874 [0230]
  • FDA: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays. Draft Guidance for Industry, Clinical Laboratories, and FDA Staff (2003) http://www.fda.gov/cdrhloivdlguidance/1610.pdf [0230]
  • Feezor RJ, Baker HV, Xiao W et al. (2004) Genomic and Proteomic Determinants of Outcome in Patients Untergoing Thoracoabdominal Aortic Aneurysm Repair. J Immun 172, 7103–7109 [0230]
  • Klein D (2002) Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends Mol Med. 8(6), 257–260 [0230]
  • Koulaouzidis A, Bhat S, Saeed AA (2009) Spontaneous bacterial peritonitis. World J Gastroenterol. 15(9): 1042–9 [0230]
  • Mayhall G (2001) Ventilator-Associated Pneumonia or Not? Contemporary Diagnosis. Emerging Infection Disease CDC 7(2) [0230]
  • Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. (1999) Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286, 531–537 [0230]
  • T. Hastie, R. Tibshirani, J. Friedman (2001) „The Elements of Statistical Learning”, Springer series in statistics, ISBN 0-387-95284-5 [0230]
  • Hocking, R. R. (1976) ”The Analysis and Selection of Variables in Linear Regression” Biometrics, 32 [0230]
  • Hollander M., Wolfe D., (1973), Nonparametric statistical inference. New York: John Wiley & Sons [0230]
  • Huber W, von Heydebreck A, Sueltmann H, Poustka A, Vingron M (2003) Parameter estimation for the calibration and variance stabilization of microarray data. Stat Appl in Genetics and Mol Biology 2(1), Article 3 [0230]
  • Huggett J, Dheda K, Bustin S et al. (2005) Real-time RT-PCr normalisation; strategies and considerations Genes Immun 6(4), 279–284 [0230]
  • Increase in National Hospital Discharge Survey rates for septicemia-United States, 1979–1987. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990 39, 31–34 [0230]
  • Johnson SB, Lissauer M, Bochicchio GV, Moore R, Cross AS, Scalea TM. (2007) Gene Expression Profiles Differentiate Between Sterile SIRS and Early Sepsis Annals of Surgery 245(4), 611–621 [0230]
  • Knaus WA, Draper EA, Wagner DP, Zimmermann JE (1985) Prognosis in acute organ-system failure. Ann Surg 202, 658–693 [0230]
  • Kofoed K, Andersen O, Kronborg G, Tvede M, Petersen J, Eugen-Olsen J, Larsen K (2007), Use of plasma C-reactive protein, procalcitonin, neutrophils, macrophage migration inhibitory factor, soluble urokinase-type plasminogen activator receptor, and soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in combination to diagnose infections: a prospective study. Critical Care 11, R38 [0230]
  • Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M et al. (2006) The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med 27, 95–125 [0230]
  • Kumar A, Roberts D, Wood KE et al. (2006) Duration of hypothension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med 34(6), 1589–1596 [0230]
  • Le-Gall JR, Lemeshow S, Leleu G, Klar J, Huillard J, Rue M, Teres D, Artigas A (1995) Customized probability models for early severe Sepsis in adult intensive care patients: Intensive Care Unit Scoring Group. JAMA 273, 644–650 [0230]
  • Levy MM, Fink MP, Marshall JC, Abraham E, Angus D, Cook D, Cohen J, Opal SM, Vincent JL, Ramsay G et al. (2003) 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Intensive Care Med 29, 530–538 [0230]
  • Liu H, Li J, Wong L (2005) Use of extreme patient samples for outcome prediction from gene expresseion data. Bioinformatics 21(16), 3377–3384 [0230]
  • MAQC Consortium. The MicroArray Quality Control (MAQC) project shows inter-and intraplatform reproducibility of gene expression measurements. Nat Biotechnol 2006, 24:, 1151–61 [0230]
  • Mathiak G, Kabir K, Grass G, et al. (2003) Lipopolysaccharides from different bacterial sources elicit disparate cytokine responses in whole blood assays. Int J Mol Med 11(1), 41–44 [0230]
  • Marshall JC, Vincent JL, Fink MP et al. Measures, markers, and mediators: toward a staging system for clinical sepsis. A report of the Fifth Toronto Sepsis Roundtable, Toronto, Ontario, Canada, October 25-26, 2000 und Crit Care Med. 2003, 31: 1560–1567 [0230]
  • Mayhall CG (2001) Ventilator-Associated Pneumonia or Not? Contemporary Diagnosis. Emerg Infect Dis 7(2), 200–204 [0230]
  • Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006) Quantification of mRNA using realt-time RT-PCR. Nat Protoc 1(3), 1559–1582 [0230]
  • Opal SM, Lim Y-P, Siryapom E. et al. (2005) Longitudinal studies of inter-alpha inhibitor proteins in severly septic patients: A potential clinical marker and mediator of severe sepsis. Clin Invest 35(2), 387–292 [0230]
  • Pachot A, Lepape A, Vey S, et al. (2006) Systemic transcriptional analysis in survivor and non-survivor septic shock patients: a preliminary study. Immunol Lett 106(1), 63–71. Epub 2006 May 17 [0230]
  • Pile JC (2006) Evaluating postoperative fever: a focused approach. Clev Clin J Med. 73 (supp. 1) 62–66 [0230]
  • Pruitt K. D., Tatusova T., Maglott D. R. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins. Nucleic Acids Res. 2007 Jan; 35 (Database issue): D61–5 [0230]
  • Ramilo O, Allman W, Chung W, Mejias A, Ardura M, Glaser C, Wittkowski KM, Piqueras P, Bancherau J, Palucka K A, Chaussabel D, (2007) Gene expression patterns in blood leukocytes discriminate patients with acute infections. Blood 109, 2066–2077 [0230]
  • R Development Core Team (2006) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-Droiect.org [0230]
  • Rocke DM, Durbin B. (2001) A model for measurement error for gene expression arrays. J Comput Biol 8, 557–569 [0230]
  • Roth AR, Basello DO, (2003) Approach to the adult patient with fever of unknown origin. Am Fam Phys 68(11) 2223–2228 [0230]
  • Ruokonen E et al. (1999) Procalcitonin concentrations in patients with neutropenic fever. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(4), 283–5 [0230]
  • Ruokonen E et al. (2002) Procalcitonin and neopterin as indicators of infection in critically ill patients. Acta Anaesthesiol Scand 46(4), 398–404 [0230]
  • Simon L, Gauvin F, Amre DK; Saint-Lois P, Lacroix J, (2004) Serum procalcitonin and C-reactive protein levels as marker of bacterial infection: A systematic review and meta analysis: Clin Infec Dis 39, 206–217 [0230]
  • Simon R. (2005) Roadmap for Developing and Validating Therapeutically Relevant Genomic Classifiers. J Clin Oncol 23, 7332–7341 [0230]
  • Sponholz C, Sakr Y, Reinhart K, Brunkhorst F, (2006) Diagnostic value and prognostic implications of serum procalcitonin after cardiac surgery: a systematic review of the literature, Critical Care 10, R145 [0230]
  • Suprin E et al. (2000) Procalcitonin: a valuable indicator of infection in a medical ICU Intensive Care Med 26(9), 1232–1238 [0230]
  • Tang BMP, Eslick GD, Craig JC et al. (2007a) Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients: systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis 7, 210–217 [0230]
  • Tang BMP, McLean AS, Dawes IW, Huang SJ, Lin RCY (2007b) The Use of Gene-Expression Profiling to Identify Candidate Genes In Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 176(7), 676–684 The NCBI handbook [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information; 2002 Oct. [0230]
  • Vandesompele J, Preter De K, Pattyn F, et al. (2002) Accurate normalisation of realtime quantitative PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 3(7), research0034.1-0034.11 [0230]
  • Valasek MA, Repa JJ (2005) The power of real-time PCR. Advan Physiol Educ 29, 151–159 [0230]
  • Vapnik V., (1999). The Nature of Statistical Leaming Theory. Springer, New York [0230]
  • Whitcombe D, Theaker J, Guy SP et al. (1999) Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fouoreschence. Nat Biotechnol 17, 904–907 [0230]
  • Wong ML, Medrano JF (2005) Real-time PCR for mRNA quantification. Biotechniques 39(1) 1–11 [0230]
  • Zeni F, Freeman B, Natanson C (1997) Anti-inflammatory therapies to treat sepsis and septic shock: A reassessment. Crit Care Med 25(7), 1095–1100 [0230]