Title:
Separation von Mesenchymalen Stammzellen
Kind Code:
B4


Abstract:

Verwendung von an den Zelloberflächenmarker CD146 bindende Bindemoleküle zur in vitro Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential aus einer biologischen Probe.




Inventors:
Aicher, Wilhelm (72119, Ammerbuch, DE)
Pilz, Gregor-Alexander (80802, München, DE)
Ulrich, Christine (72070, Tübingen, DE)
Application Number:
DE102009041885A
Publication Date:
03/22/2012
Filing Date:
09/09/2009
Assignee:
Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum, 72076 (DE)



Foreign References:
200702642392007-11-15
Other References:
SACCHETTI,B., u.a.: Self-Renewing Osteoprogenitors in Bone Marrow Sinusoids Can Organize a Hematopoietic Microenvironment Internetdokument. Cell (2007) 131 (2) 324-336
TRIPODO,C., u.a.: CD146 bone marrow osteoprogenitors increase in the advanced stages of primary myelofibrosis. Haematologica (Januar 2009) 94 (1) 127-130
Attorney, Agent or Firm:
Witte, Weller & Partner, 70173, Stuttgart, DE
Claims:
1. Verwendung von an den Zelloberflächenmarker CD146 bindende Bindemoleküle zur in vitro Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential aus einer biologischen Probe.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemolekül ausgewählt ist aus zumindest einem der folgenden an CD146 bindende Antikörper, Aptamere, oder funktionellen Fragmenten davon.

3. Verfahren zur in vitro Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential aus einer Zellen enthaltenden biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist:
a) in-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, die mesenchymale Stammzellen (MSC) enthält, mit einem Bindemolekül, das an CD146 bindet, zur Bildung von MSC-Bindemolekül-Komplexen,
b) Separieren der MSC-Bindemolekül-Komplexe von Zellen, die das Bindemolekül nicht gebunden haben, zur Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymale Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt a) der weitere Schritt a1) erfolgt:
a1) Separieren des MSC-Bindemolekül-Komplexes von ungebundenen Bestandteilen der biologischen Probe und von ggf. ungebundenen Bindemolekülen.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemolekül ausgewählt ist aus gegen CD146 bindende Antikörpern, Aptameren, oder funktionellen Fragmenten davon.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemolekül an eine Trägersubstanz gekoppelt ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Agarose, Sepharose.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemolekül mit einem detektierbaren Marker gekoppelt ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindemolekül-MSC-Komplex mittels eines der folgenden Verfahren identifiziert und/oder isoliert wird:
a) immunologische Verfahren, insbesondere mittels des enzyme linked immunosorbent assays (ELISA),
b) fluoreszenzaktivierte Zellseparation (FACS), und
c) magnetische Zellseparation (MACS).

9. Verwendung von Stammzellen, die mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8 isoliert und/oder identifiziert wurden, für die Therapie oder Diagnostik.

10. Verwendung von Stammzellen, die mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8 isoliert und/oder identifiziert wurden, zur definierten Generierung von Osteoblasten.

11. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen, die mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8 isoliert und/oder identifiziert und zu Osteoblasten differenziert wurden, zur Therapie und/oder Prophylaxe eingesetzt werden.

12. Verwendung von Stammzellen, die mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8 isoliert und/oder identifiziert wurden, für die Therapie und/oder Prophylaxe von Knochenschäden, -degenerationen-, oder -erkrankungen.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential aus einer biologischen Probe, sowie die Verwendung dieser Stammzellen.

Mesenchymale Stammzellen (MSC), auch mesenchymale stromale Zellen genannt, sind multipotente Zellen, die die Fähigkeit besitzen, unter geeigneten in vitro- und in vivo-Bedingungen in verschiedene mesenchymale Gewebe auszudifferenzieren. So können sie bspw. in Osteoblasten, Chondrocyten, Adipozyten, Myocyten differenzieren, und Knochen-, Knorpel-, Fett-, und Muskelgewebe bilden. Darüber hinaus können sie sich aber auch in Astrozyten, Neurone, Endothelzellen, Hepatocyten, pankreas-ähnliche Zellen und Lungen-Epithelzellen differenzieren. Morphologisch sind sie an ihrem fibroblastoiden Phänotyp zu erkennen, und sind in verschiedenen adulten und embryonalen Geweben des Menschen zu finden, darunter im Gehirn, Knochenmark, Nabelschnurblut, in Blutgefäßen, im Skelettmuskel, der Haut, Leber, Zahnfleisch und der Plazenta.

MSC exprimieren eine Reihe von Oberflächenmarkern wie bspw. CD105 (Endoglin, SH2), CD73 (Ecto-5'-Nucleotidase, SH3, SH4), CD166 (ALCAM), CD29 (β1-Integrin), CD44 (H-CAM) und CD90 (Thy-1), die z. T. auch auf endothelialen, epithelialen Zellen sowie auf Muskelzellen gefunden werden. MSC lassen sich aber von hämatopoetischen Stammzellen abgrenzen, da MSC die für hämatopoetische Stammzellen spezifischen Marker CD45, CD34 und CD133 nicht exprimieren.

Mesenchymale Stammzellen haben die Eigenschaft, schnell und stabil auf Plastik- oder Glasoberflächen zu adhärieren, und koloniebildende Fibroblasten („colony forming units” (CFU-F)) zu bilden. Letztere sind jedoch in Bezug auf ihre Proliferations- und Differenzierungsfähigkeiten heterogen.

Mesenchymale Stammzellen mit einem bestimmten Differenzierungspotential sind in der Medizin und Forschung von großem Interesse: Sie können insbesondere aus dem Knochenmark gewonnen werden, sogar aus jenem älterer Menschen, haben eine hohe Teilungsrate und können wie erwähnt in Gewebszellen mesenchymalen Ursprungs differenzieren. Sie könnten daher bspw. im Rahmen von Stammzelltherapien direkt der Behandlung degenerativer Erkrankungen von Organen wie Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskel, Bindegewebe, Blutzellen, etc. dienen.

Zur Gewinnung bzw. Isolierung von mesenchymalen Stammzellen werden gegenwärtig unfraktionierte Knochenmarkszellen als Ausgangsmaterial verwendet, die auf Plastikschalen kultiviert, die MSC über deren Adhäsion an die Plastikoberfläche identifiziert, und die nicht-adhärierenden hämatopoetischen Zellen aus der Probe verworfen. Die auf diese Weise gewonnenen Zellen sind jedoch wenig definiert und differenzieren sich nicht nur in heterogene MSC Populationen, sondern auch in Osteoblasten, und/oder in Osteoblasten-Vorläuferzellen, in Fettzellen, Retikulumzellen, Makrophagen und Endothelzellen. Eine spezifische Behandlung degenerativer Erkrankungen eines Organs ist daher mit MSC ohne bestimmtes Differenzierungspotential schwierig bzw. auf Grund möglicher Nebenwirkungen unmöglich.

Die Isolierung von mesenchymalen Stammzellen mit einem ganz bestimmten Differenzierungspotential ist im Stand der Technik bisher nicht möglich oder bekannt. Eine solche Isolierung würde jedoch wie erwähnt den großen Vorteil bieten, dass derart identifizierte Stammzellen gezielt für die Therapie/Behandlung von erkranktem, degeneriertem oder beschädigtem Gewebe eingesetzt werden könnten, in welches sich die derart spezifisch isolierten Stammzellen differenzieren.

So könnten bspw. Knorpelschäden dadurch behandelt werden, dass spezifisch isolierte mesenchymale Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential entweder direkt in situ in das betroffene Gewebe gegeben werden, wo sie zu Osteoblasten ausdifferenzieren und dadurch das beschädigte Knochen-Gewebe ersetzen (Stammzelltherapie). Andererseits kann aber auch eine Differenzierung in Osteoblasten in vitro von Interesse sein, wenn – bspw. für die Forschung/Diagnostik/Medizin – ausdifferenzierte Osteoblasten gewonnen werden sollen.

Sacchetti et al. („Self-Renewing Osteoprogenotirs in Bone Marrow Sinusoids Can Organize a Hematopoietic Microenvironment”, Cell (2007) 131: 324–336) beschreiben die hämatopoetische Microumgebung in menschlichem Knochenmark, und versuchen insbesondere die Zelltypen zu charakterisieren, die diese Umgebung bilden. Die Versuche, die Sacchetti et al. hierzu offenbaren, zeigten, dass MCAM/CD146-exprimierende subendotheliale Zellen in menschlichem Knochenmark in der Lage sind, eine solche hämatopoetische Microumgebung bereit zu stellen.

Tripodo et al. (”CD146+ bone marrow osteoprogenitors increase in the advanced stages of primary myelofibrosis”, Haematologica (2009) 94: 127–130), untersuchten in ihrer Veröffentlichung Knochenmarksschnitte von gesunden und an Myelofibrose erkrankten Patienten, und stellten fest, dass die Zahl der CD146+ Stromazellen im Knochenmark mit dem Grad der Fibrosierung, der Gefäßdichte und dem Fortschritt der Erkrankung korreliert.

Vor diesem Hintergrund besteht ein großes Interesse an mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential, insbesondere um die so gewonnenen Stammzellen dann in entsprechenden Verwendungen einzusetzen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, neue Wege bereitzustellen, mit denen mesenchymale Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential isoliert Werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Bindemoleküls, das an den Zelloberflächenmarker CD146 bindet, zur in vitro Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential. CD146 wird in der Literatur auch als ”Melanoma Cell Adhesion Molecule” (MCAM, Mel-CAM), MUC-18, S-endo oder Gicerin bezeichnet.

Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur in vitro Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential, bei welchen an CD146 bindende Bindemoleküle eingesetzt werden.

Ferner betrifft die Erfindung die auf diese Weise isolierten Stammzellen und deren Verwendung, insbesondere in der Therapie.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass es unter Verwendung von an CD146 bindende Bindemoleküle möglich ist, spezifisch mesenchymale Stammzellen zu isolieren, die anschließend in Osteoblasten differenzierten. Auch konnte gezeigt werden, dass MSC, die CD146 nicht exprimieren, weder unter den üblichen osteogenen Induktionsbedingungen, die nachstehend noch weiter beschrieben sind, noch spontan zu Osteoblasten differenzieren.

Damit wird ein Werkzeug bereitgestellt, mit welchem mesenchymale Stammzellen gewonnen werden können, die spezifisch in Osteoblasten ausdifferenzieren. Dies war bisher im Stand der Technik nicht möglich.

Aufgrund der neuen Verwendung und des neuen Verfahrens können also mesenchymale Stammzellen bereitgestellt werden, die bspw. wiederum vorteilhafterweise in der Therapie und Prophylaxe oder aber in der Diagnostik und Forschung eingesetzt werden können. So können die derart isolierten Stammzellen insbesondere zur Behandlung von Krankheiten, die sich durch ein degeneriertes, verletztes oder beschädigtes Gewebe auszeichnen, eingesetzt werden, bspw. im Rahmen einer Stammzelltherapie: Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isolierten Stammzellen werden hierfür in das betroffene Gewebe transplantiert (bspw. auch im Zusammenhang mit bestimmten Implantaten), und differenzieren sich dort in das entsprechende Gewebe. Dadurch wird das degenerierte Gewebe regeneriert und wieder funktionsfähig.

Dabei ist bevorzugt, wenn das an CD146-bindende Bindemolekül ausgewählt ist aus an CD146 bindenden Antikörpern, Aptameren, sowie aus Fragmenten der genannten Antikörper, Aptamere.

Geeignete Antikörper sind bspw. die monoklonalen Antikörper Klone 128018 (R & D Systems, 614 McKinley Place, NE, Minneapolis, USA) oder N1238, P1H12 und c264 (alle von abcam, 1 Kendall Square, Suite 341, Cambridge, MA, USA), wobei es sich versteht, dass auch jeder andere, gegen CD146 gerichtete Antikörper für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung geeignet ist.

Die Formulierungen ”gegen CD146 gerichtet”, ”anti-CD146”, ”an CD146 bindend”, ”CD146 erkennend” werden vorliegend dahingehend synonym verwendet, dass damit ausgedrückt werden soll, dass Bindemoleküle diesen Marker spezifisch erkennen und ihn binden können.

Aptamere sind hochaffine RNA- oder DNA-Oligo- bzw. Polynukleotide, also Nukleinsäuremoleküle, die auf Grund ihrer spezifischen räumlichen Struktur eine hohe Affinität zu einem Zielmolekül aufweisen. Aptamere haben in der Regel eine Länge von bis zu 100 Nukleotiden, die zwar vergleichbare Antigen-Bindungseigenschaften wie Antikörperfragmente aufweisen, jedoch häufig wesentlich spezifischer und deutlich stabiler sind. Mit ihrer relativ großen und flexiblen Oberfläche können sie potenziell mit noch mehr Zielmolekülen hochspezifisch und selektiv interagieren. Aptamere, wenn diese in einen Organismus eingebracht werden, zeigen kaum immunogene oder toxische Effekte, hingegen jedoch eine rasche Clearance.

Mittels ”SELEX” (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) können große Mengen von Aptameren unterschiedlichster Sequenzen und Sekundärstrukturen enzymatisch erzeugt werden. Aus dieser Menge werden anschließend solche Aptamere mit hoher Affinität zu einem Zielmolekül, wie bspw. MSC, herausgesucht und angereichert. Die Primärstruktur dieses Aptamers lässt sich mittels im Stand der Technik bekannter Sequenzierverfahren aufklären, so dass diese daraufhin in vitro synthetisiert werden können.

Vorliegend sollen die Begriffe ”funktionale Fragmente” oder ”funktionelle Fragmente”, wie sie in der Anmeldung verwendet werden, Teile oder Abschnitte der offenbarten Bindemoleküle darstellen und die gleichzeitig noch die funktionellen Eigenschaften, insbesondere die Zelloberflächenmarker-Bindungseigenschaften der Bindemoleküle zeigen und besitzen, von denen sie abgeleitet sind. Dabei können diese Fragmente entweder als solche oder aber in Kombination mit anderen Fragmenten eingesetzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind zu letzteren bspw. auch modifizierte anti-CD146-Antikörper zu verstehen, die für entsprechende Einsätze und Verwendungen beim Menschen angepasst, bspw. humanisiert wurden. Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörper sind vorzugsweise monoklonal.

Vorliegend sind aber auch Fragmente solcher Antikörper, wie bspw. Fab, F(ab)'2 oder scFv Fragmente, und andere Fragmente wie CDR (”complementarity-determining region”), hypervariable Region) als Antikörper im Sinne und Rahmen der vorliegenden Erfindung gemeint, so lange wie sie ihre Funktionalität, d. h. die spezifischen Bindungseigenschaften wie die ”ganzen” Antikörper, von denen sie abgeleitet sind, besitzen. Solche Antikörper-Fragmente können bspw. auch rekombinant unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden.

Daher versteht sich auch, dass die gegen CD146 gerichteten Antikörper andererseits auch entsprechend humanisiert werden können, und im Rahmen der hier offenbarten Erfindung für die erfindungsgemäßen Verwendungen und/oder Verfahren, insbesondere auch für eine Stammzelltherapie, eingesetzt werden können.

Humanisierte Antikörper können bspw. chimäre Antikörper sein, bei welchen die konstanten Regionen der tierischen Antikörper (bspw. von Maus- oder Kaninchen-Antikörpern) durch die entsprechenden Regionen menschlicher Antikörper, bspw. den Fc-Fragmenten, ersetzt wurden (Sharon et al., Nature, (1984), 309: 364–367). Alternativ kann auch die CDR der tierischen Antikörper mit menschlichen Antikörpern verbunden werden, dieser Prozess wird Antikörper ”Reshaping” genannt. In einem weiteren anderen Verfahren werden in transgenen Tieren menschliche Antikörper produziert.

Ferner können in einer erfindungsgemäßen Verwendung die Antikörper, bspw. in humanisierter Form, oder funktionelle Fragmente davon, auf entsprechende implantierbare medizinische Vorrichtungen auf- oder eingebracht werden, und zusammen mit der Vorrichtung in den zu behandelnden Patienten an die zu behandelnden Stellen/Gewebedefekten implantiert werden. An den zu behandelnden Stellen werden dann über die Antikörper mesenchymale Stammzellen rekrutiert, die sich an dem Implantat festsetzen, ausdifferenzieren und so neues Gewebe bilden. Geeignete medizinische Vorrichtungen sind hierbei irgendwelche biokompatiblen Implantate, Endoprothesen, bspw. Stents, etc., jeglicher Art, die entweder dauerhaft oder temporär in den Patienten eingebracht werden. Die Vorrichtungen können optional auch aus vollständig oder teilweise resorbierbaren Materialien bestehen und neben den Antikörpern weitere therapeutische Aktive Substanzen aufweisen, die üblicherweise bei in einen Körper einzubringenden Implantaten/Transplantaten eingesetzt werden.

Die biologische Probe kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung irgendein biologisches Gewebe und/oder eine biologische Flüssigkeit sein, und umfasst jegliches biologische Material tierischen oder humanen Ursprungs bzw. jegliche Flüssigkeit, das bzw. die auf das Vorhandensein von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential untersucht werden soll. Dabei kann es sich um ein Gewebeverband, eine Zellsuspension oder um Organe, Organteile oder um Organismen handeln. Beispiele für biologische Gewebe und Flüssigkeiten sind Knochenmarksgewebe, Knochenmarkszellen, Knorpelzellen, Knochenzellen, Fettgewebe, Fettzellen, Lebergewebe, Leberzellen, Plazentagewebe, peripheres Blut, Nabelschnurblut, Aphereseblut. Dabei ist es bevorzugt, wenn die biologische Probe eine Knochenmarks-Probe ist.

Wie bereits weiter oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential, wobei es die folgenden Schritte aufweist:

  • a) in-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe, die mesenchymale Stammzellen (MSC) enthält, mit einem Bindemolekül, das an CD146 bindet, zur Bildung von MSC-Bindemolekül-Komplexen, und
  • b) Separieren der MSC-Bindemolekül-Komplexe von Zellen, die das Bindemolekül nicht gebunden haben, zur Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential.

Unter Isolierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential wird erfindungsgemäß verstanden, dass ein Komplex aus Bindemolekül und mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential aus der biologischen Probe getrennt wird. Wenn gewünscht, kann anschließend auch der Komplex in mesenchymale Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential und Bindemolekül getrennt werden. Dies erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren. Das Bindemolekül kann bspw. an ein Trägermaterial gekoppelt sein, was die Handhabung des Bindemoleküls erleichtert und eine Zentrifugation des Letzteren ggf. mit daran gebundenen mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential und die Trennung des Komplexes aus Bindemolekül und mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential von der biologischen Probe ermöglicht.

In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner nach Schritt a) der weitere Schritt a1) vorgesehen:

  • a1) Separieren des MSC-Bindemolekül-Komplexes von ungebundenen Bestandteilen der biologischen Probe und von ggf. ungebundenen Bindemolekülen.

Mit diesem, dem Schritt b) vorgeschalteten Schritt kann, abhängig von der Probe, ggf. eine bessere Isolierung und/oder Identifizierung der mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential erreicht werden. Durch diese Maßnahme wird nämlich die Isolierung des Komplexes realisiert und Kontaminanten, wie ungebundene Bindemoleküle, ungebundene weitere Bestandteile der biologischen Probe und ggf. ungebundene mesenchymale Stammzellen von den gewünschten mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential abgetrennt.

Insbesondere ist dabei bevorzugt, wenn das Bindemolekül, wie bereits bei der erfindungsgemäßen Verwendung, ausgewählt ist aus an CD146 bindenden Antikörpern, Aptameren, oder funktionellen Fragmenten dieser Antikörper und Aptamere.

Wie weiter oben erwähnt, stellen diese Bindemoleküle besonders geeignete Werkzeuge dar, die bei der Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgreich zur Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential eingesetzt werden können.

Ferner ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Verwendung bevorzugt, wenn die Bindemoleküle einen detektierbaren und/oder selektierbaren Marker aufweisen.

Mit dieser Maßnahme können mesenchymale Stammzellen besonders leicht detektiert und selektiert werden. Erfindungsgemäß wird unter einem Marker eine jede Verbindung verstanden, mittels derer eine Lokalisierung und Identifizierung des Bindemoleküls in vitro, in vivo oder in situ möglich ist. Hierzu zählen Farbindikatoren mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder chemilumineszierenden Eigenschaften, wie Fluoroceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, AMPPD, CSPD, radioaktive Indikatoren, wie 32P, 35S, 125I, 131I, 14C, 3H, nicht-radioaktive Indikatoren, wie Biotin oder Dioxigenin, alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, etc.

Bei Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Bindemoleküls kann das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen der etablierten fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) eingesetzt werden. Mittels FACS lassen sich mesenchymale Stammzellen besonders gut aus einer Zellsuspension isolieren. Dazu wird die MSC enthaltende Zellsuspension mit den fluoreszenzmarkierten Bindemolekülen inkubiert, wobei die Bindemoleküle an die mesenchymalen Stammzellen binden. Die Zellsuspension wird dann durch eine dünne Kanüle geführt, deren Strahl am Ende durch Vibration in einzelne Tropen aufgelöst wird. Wenn ein Tropfen eine mesenchymale Stammzelle enthält, an die das Bindemolekül gebunden hat, wird der Fluoreszenzmarker durch einen Laserstrahl zur Fluoreszenz angeregt. Diese Fluoreszenz kann mit einem Lichtdetektor gemessen und zur Auftrennung und damit zur Isolierung der mesenchymalen Stammzelle benutzt werden. Dazu werden die gebundenen mesenchymalen Stammzellen mittels eines elektrischen Impulses je nach Fluoreszenzintensität aufgeladen und beim Passieren eines elektrischen Feldes entsprechend abgelenkt und sortiert.

Als selektierbare Marker kommen auch magnetische Partikel in Frage, die vorzugsweise sehr klein in der Größenordnung von 50 nm sind. Diese lassen sich über im Stand der Technik bekannte Verfahren an die Bindemoleküle koppeln. Derartige magnetische Bindemoleküle lassen sich ebenfalls zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen nutzen, und zwar im Rahmen der sog. magnetischen Zellsortierung (MACS). Dazu werden die magnetischen Bindemoleküle zu der Zellsuspension gegeben. Nach einer Inkubation haben die Bindemoleküle an die mesenchymalen Stammzellen gebunden. Das Zellgemisch wird über eine Säule aufgetrennt, deren ferromagnetische Matrix aus Metallkugeln oder -drähten besteht. Hierzu wird die Säule in ein homogenes Magnetfeld gebracht, in dem die mesenchymalen Stammzellen, an die die magnetischen bindemoleküle gebunden sind, an der Matrixoberfläche festgehalten werden. Die übrigen Zellen und Bestandteile des Gemisches werden aus der Säule ausgewaschen. Nach Entfernen des Magnetfeldes können die separierten mesenchymalen Stammzellen ebenfalls aus der Matrix gespült werden. Diese Methode erlaubt eine schnelle Separation von mesenchymalen Stammzellen ohne große mechanische Beeinträchtigung mit einem hohen Anreicherungsgrad, d. h. auch eine sehr kleine Population von mesenchymalen Stammzellen kann fast rein isoliert werden.

In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Isolierung/Identifizierung mittels immunologischer Verfahren, wie dem ELISA (”enzyme-linked immunosorbent assay”, Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay).

Dieses Verfahren hat sich als besonders effektives und einfach durchführbares Trennverfahren von Antigen-Antikörper-Komplexen aus einem Inkubationsmedium etabliert. Bei diesem Verfahren ist entweder der Antikörper oder aber das Antigen mit einem Enzym markiert, das einen colorimetrischen Nachweis erlaubt, üblicherweise mittels alkalischer Phosphatase oder Peroxidase.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Bindemolekül an eine Trägersubstanz gekoppelt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Agarose, Sepharose.

Derartige Materialien haben sich zur Immobilisierung von Bindemolekülen als besonders geeignet erwiesen. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise über ein zwischengeschaltetes bakterielles Protein, wie beispielsweise Protein A, Protein G oder Protein L, die einerseits die konstanten Regionen (Fc) von Antikörpern binden, und andererseits sich leicht an die Trägersubstanz Agarose bzw. Sepharose koppeln lassen.

Die mittels der erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen Stammzellen können dann entweder direkt im Rahmen einer Stammzelltherapie (autologe oder allogene Therapie) eingesetzt werden, wo sie in situ in Osteoblasten differenzieren, und somit degeneriertes oder beschädigtes Knorpelgewebe regenerieren können.

Andererseits können die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential auch zunächst in vitro zu Osteoblasten differenziert werden, und anschließend zur Behandlung von erkranktem oder degeneriertem Gewebe eingesetzt werden.

Bei dieser Ausführungsform können die isolierten mesenchymalen Stammzellen mittels spezifischer Wachstumsfaktoren differenziert werden, wobei es bevorzugt ist, wenn die Wachstumsfaktoren ausgewählt sind aus BMPs (bone morphogenetic proteins) wie BMP-2 und BMP-7. Alternativ kann die osteogene Differenzierung des MSC durch Zugabe von niedermolekularen Komponenten wie Dexamethason, beta-Glyzerophosphat und Vitamin-C erfolgen (siehe Pittenger et al., „Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells”, Science, 1999, 284: 143–147).

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits geeignete Wachstumsfaktoren bereitgestellt werden. Im Falle der Verwendung von BMP wird eine Differenzierung der gebundenen MSC in Osteoblasten bewirkt, was ein Verwachsen eines erfindungsgemäßen Knochenersatzimplantates begünstigt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nun zum ersten Mal möglich, gezielt Stammzellen mit bspw. osteogenem Differenzierungspotential aus dem Gewebe eines Patienten zu isolieren und eine schnelle, effiziente und gezielte Anzüchtung von Osteoblasten-Gewebe für die nachfolgende Transplantation in den Proben-Spender (autologe Transplantation) oder einen anderen Empfänger (allogene Transplantation) zu erreichen.

Dabei ist bevorzugt, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Bindemolekül eingesetzt wird, das ausgewählt ist aus an CD146 bindenden Antikörpern oder Aptameren, oder funktionellen Fragmenten von diesen Antikörpern und Aptameren.

Die Erfinder haben in eigenen Versuchen festgestellt, dass unter Verwendung von gegen CD146 gerichteten Antikörpern in einem Verfahren zur Isolierung/Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen eine gezielte Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential gewonnen werden konnte.

Die von den mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential separierten mesenchymalen Stammzellen können andererseits für nicht-osteogene Anwendungen in den verschiedensten regenerativen Therapien eingesetzt werden, bei denen eine Verknöcherung vermieden werden muss, wie bspw. bei der Regeneration von elastischem Gewebe (Sehnen, Muskel, Fett, etc.), da die CD146 negativen MSC nicht osteogen differenzieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren isoliert und/oder identifiziert wurden, für die Therapie, Diagnostik oder Prophylaxe.

Dabei ist in einer Ausführungsform bevorzugt, wenn die mit den erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Stammzellen zur definierten Generierung von Osteoblasten eingesetzt werden, und zwar in vivo oder in vitro.

Ferner ist in einer weiteren Ausführungsform bevorzugt, wenn die mit den erfindungsgemäßen Verfahren isolierten und/oder identifizierten Stammzellen, die und zu Osteoblasten differenziert wurden, zur Therapie und/oder Prophylaxe von degeneriertem oder anfälligem Gewebe eingesetzt werden.

Insbesondere ist bevorzugt, wenn die mit den erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Stammzellen für die Therapie und/oder Prophylaxe von Knochenschäden, -degenerationen oder -erkrankungen, insbesondere der (Röhrchen-)Knochen in den Extremitäten, oder Knochen im Mund-Kiefer und Gesichtsbereich, Wirbelsäule und anderen Erkrankungen, bei welchen die Stammzellen für den Knochen-Gewebeersatz (also zum so genannten ”tissue repair”) eingesetzt werden sollen.

Die Bindemoleküle können dabei in einem Kit und/oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Isolierung und/oder Identifizeirung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential bereitgestellt werden.

Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Stammzellen, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren isoliert und/oder identifiziert wurden, sowie zumindest einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger- und/oder Hilfsstoff, und ggf. therapeutisch wirksame Substanzen.

Unter ”pharmazeutisch akzeptierbaren Träger- oder Hilfsstoffen” wird vorliegend jede in der Pharmazie im Zusammenhang mit an einen Patienten zu verabreichende Substanz/Zusammensetzung verstanden, die die Wirksamkeit der Zellen/Antikörper nicht nachteilig beeinflusst, und/oder die pharmakologisch die Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung unterstützen oder erleichtern kann.

Unter ”therapeutisch wirksamer Substanz” wird vorliegend jede Substanz verstanden, die für die Zwecke einer Behandlung oder Verbesserung eines Krankheitsbildes eines Patienten eingesetzt wird.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können systemisch verabreicht werden, d. h. bspw. subkutan, intravenös, parenteral, intramuskulär, transdermal, oder topisch, wobei die Verabreichungsart von der Art der Erkrankung, dem Krankheitsbild, sowie dem Zustand der Patienten abhängen wird. Ebenso kann die Verabreichung wiederholt oder einmalig stattfinden, wobei die Verabreichung im ersteren Fall einmal oder mehrmals am Tag, und/oder über einen längeren Zeitraum hinweg erfolgen kann.

Zusätzlich zu den aktiven Substanzen kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch noch Puffer, Verdünnungsmittel und/oder Additive enthalten. Geeignete Puffer schließen bspw. Tris-HCl, Glycin und Phosphat mit ein, und geeignete Verdünnungsmittel bspw. wässrige NaCl-Lösungen, Lactose oder Mannitol, Geeignete Additive schließen bspw. Detergentien, Lösungsmittel, Antioxidantien und Konservierungsstoffe und Schutzkolloide, wie bspw. homologes Albumin oder biokompatible Hydrogele, mit ein. Eine Übersicht über solche zusätzlichen Inhaltsstoffe findet sich bspw. in A. Kibbe.: „Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.

Es versteht sich, dass die oben genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendet werden können, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird in der nachstehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren näher erläutert.

Es zeigen:

1 Untersuchungen zur Expression von CD146 auf MSC des Knochenmarks (A) und der Plazenta (B) und (C): Die Expression von CD146 ist in MSC aus dem Knochenmark (A) höher als in MSC aus der Plazenta (B) und (C);

2 die Einteilung von MSC der Plazenta durch MACS in die Fraktionen CD146hoch, CD146mittel und CD146niedrig;

3 den Nachweis, dass die CD146hoch und CD146mittel Zellen ihren Phänotyp in vitro über mehrere Passagen nicht verloren, und dass in der CD146niedrig Population die Expression des von CD146 über mindestens 4 Passagen ausbleibt;

4 den Nachweis der osteogenen Differenzierung der CD146hoch Zellen; und

5 den Nachweis, dass die CD146niedrig Population weder spontan (links) noch nach Zugabe osteogener Stimuli (rechts) osteogen differenziert.

BeispieleNachweis der Expression von CD146 auf MSC aus Knochenmark und aus Plazenta

Die Erfinder haben in Ausgangsversuchen die Expression des Zelloberflächenmarkers CD 146 auf mesenchymalen Stammzellen (im Folgenden auch: MSC) aus dem Knochenmark und aus der Plazenta untersucht. Hierzu wurden MSC aus dem Knochenmark von Patienten (Patienten der BG-Unfallklinik Tübingen, die operativ und endoprotetisch versorgt wurden) isoliert: Dazu wurde das Knochenmark mit PBS verdünnt, um die mononukleären Zellen durch Gradientenzentrifugation abzutrennen. Die mononuklearen Zellen wurden gewaschen und in geeigentem MSC Expansionsmedium expandiert (siehe Felka et al., „Hypoxia reduces the inhibitory effect of IL-1β an chondrogenic differentiation of FCS-free expanded MSC”, Osteoarthritis and Cartilage, Mai 2009). Zur Isolation von MSC aus Plazenta (Patienten aus der Frauenklinik Türbingen) wurden die maternalen Anteile der Plazenta von den embryonalen abgetrennt. Beide Gewebeanteile wurden separat mit Skalpellen mechanisch zerkleinert und danach enzymatisch aufgeschlossen. Unverdaute Teile wurden durch engmaschige Siebe abgetrennt. Die zellhaltige Suspension wurde mit PBS verdünnt und durch Gradientenzentrifugation aufgereinigt. Die Zellen wurden anschließend in MSC-Expansionsmedium kultiviert.

Die Separation der CD146 positiven MSC erfolgte durch Magnetsortierung (Automacs, Miltenyi, Bergisch Gladbach) mit Hilfe des anti-CD146 Antikörpers (Klon 128018, R & D Systems). Zur osteogenen Induktion wurden die Zellen in spezifischem osteogenem Differenzierungsmedium (Dexamethason, beta-Glyzerophosphat, Vitamin-C) inokuliert.

Die osteogene Differenzierung würde nach 2- bis 4-wöchiger Kultivierung der Zellen durch Silber-Färbung der Ca-Präzipitate in den Zellen mittels von-Kossa-Färbung nachgewiesen hierüfr wurden Zellen fixiert und mit Silbernitratlösung inkubiert. Überschüssige Silbernitratlösung wurde intensiv abgewaschen. Das Ag2+ wurde mittels Carbonat und Thiosulfat zu metallischem Silber reduziert und fixiert. Die Zellen wunden mit Eosin gefärbt (siehe Romeis, Mikroskopische Techniken, 2009, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg). Ferner wurde die Expression von CD146 nachgewiesen (mAK Klon 128018, R & D Systems). Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten, dass die MSC aus Knochenmark eine ausgeprägte osteogene Differenzierung zeigten (siehe 1, obere Reihe links), und auch CD146 sehr prominent exprimierten (siehe 1, untere Reihe links). Hingegen zeigten die Plazenta-MSC eine schwächere osteogene Differenzierung (siehe 1, oberer Reihe mittig und rechts) und zugleich eine geringere Expression von CD146 (siehe 1, untere Reihe, mittig und rechts).

Osteogene Differenzierung von CD146hoch und CD146mittel Populationen

Im Folgenden wurde die CD146-Expression in MSC direkt nach der Magnet-Zellsortierung untersucht. Dabei wurden lediglich MSC aus der Plazenta eingesetzt, um eine Kontamination von Osteoblasten (die in Knochenmark vorliegen können) ausschließen zu können. Hierzu wurden die Plazenta-MSC mittels MACS in CD146hoch, CD146mittel und CD146niedrig Fraktionen aufgetrennt (mAK Klon 128018, R & D Systems) und unmittelbar danach mittels FACS auf die Expression von CD146 untersucht, um die Qualität der Separation zu untersuchen. Mittels MACS können sowohl MSC aus der endometrialen maternalen Zone (siehe 2, obere Reihe) als auch aus der fetalen Zone (untere Reihe) der Plazenta in CD146hoch, CD146mittel und CD146niedrig Populationen aufgetrennt werden.

In weiteren Versuchen wurde untersucht, in wie weit die CD146hoch und CD146mittel Populationen ihren Phänotyp beibehalten. Die CD146hoch und CD146mittel Populationen verloren ihren Phänotyp selbst über mindestens 4 Passagen nach Separation nicht, wohingegen bei der Population die Expression dieses Antigens ausblieb. Dieses Ergebnisse sind 3 zu entnehmen, in der die Expression von CD146 in den MACS-separierten Subpopulationen in der 2. Passage (schwarze Histogramme) und in der 6. Passage (graue Histogramme) untersucht wurden. CD146hoch MSC exprimieren dieses Antigen stabil 3, links), bei den CD146mittel MSC ist ein leichter Trend zu höherer Expression/Zellen feststellbar (siehe 3, Mitte), und die CD146hoch MSC exprimieren dieses Antigen auch 5 Passagen nach MACS-Separation nicht (siehe 3, rechts)

In folgenden Versuchen wurde die osteogene Differenzierung der Populationen untersucht: Hierzu wurden durch MACS sortierte MSC in Expansionsmedium (DMEM Medium, humanes Plasma, Plättchenextrakt, nach Müller et al., „Animal Serum-Free Culture Conditions for Isolation and Expansion of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells from Human Bone Marrow”, Cytotherapy, 2006; 8: 437–444) oder in osteogenem Induktionsmedium (DEMEM Medium, Dexamethason, beta-Glyzerophosphat, vitamin-C, nach Pittenger et al., s. o.) inkubiert. Auch hier wurde die osteogene Differenzierung mittels von-Kossa-Färbung (s. o.) nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass die CD146hoch MSC (wie die CD146mittel MSC, Daten nicht gezeigt) spontan nicht in Osteoblasten differenzierten (siehe 4 links), sondern erst nach Zugabe osteogener Stimuli (siehe 4 rechts). Hingegen zeigten die CD146niedrig MSC weder eine spontane Differenzierung (siehe 5 links) noch eine Differenzierung nach Zugabe von osteogenen Stimuli (siehe 5 rechts).

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression von CD 146 mit dem osteogenen Differenzierungspotential korreliert, und dass daher der Zelloberflächenmarker CD146 ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Identifizierung und Isolierung von mesenchymalen Stammzellen mit osteogenem Differenzierungspotential ist.