Title:
Method for risk stratification of cancer patients identified with cancer disease, involves determining risk of potential of blood samples subjected to fluorescence study
Kind Code:
A1


Abstract:
The method involves determining the risk of potential of blood samples subjected to a fluorescence study. The fluorescence studies of plasma or serum are derived from the blood samples. The fluorescence studies of blood plasma or blood serum are performed similar to the fluorescence determination of glycation.



Inventors:
Bartling, Babett (Halle, 06110, DE)
Simm, Andreas (Lieskau, 06120, DE)
Silber, Rolf-Edgar (Halle, 06114, DE)
Application Number:
DE102009031733
Publication Date:
01/13/2011
Filing Date:
07/04/2009
Assignee:
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Halle, 06108, DE)
International Classes:



Other References:
Schmitt et al., 2005; Yanagisawa et al., 1998
AGE-BSA, AGE-Bovine Serum Albumin (Wrobel et al., 1997)
Zusatz von AGE reicher Brotkruste (Somoza et al., 2005)
Claims:
1. Verfahren zur Risikostratifikation von Krebspatienten mit einer Karzinomerkrankung gekennzeichnet dadurch, dass zur Ermittlung des Risikopotentials Blutproben einer Fluoreszenzuntersuchung unterzogen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass die Fluoreszenzuntersuchungen an Plasma oder Serum, welche aus den Blutproben gewonnen werden, erfolgen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2 gekennzeichnet dadurch, dass die Fluoreszenzuntersuchungen an Blutplasma oder Blutserum analog der Fluoreszenzbestimmung von Glykierungsendprodukten (AGEs) durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die gemessene Fluoreszenz in Blutplasma oder Blutserum ähnlich der Fluoreszenz von Glykierungsendprodukten (AGEs) ist.

5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die AGE-ähnliche Fluoreszenz in Blutplasma oder Blutserum im Bereich der Standardfluoreszenz von AGEs, insbesondere bei einer Anregungswelle von 370 nm und einer Emissionswellenlänge von 440 nm, gemessen wird.

6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass eine sehr niedrige AGE-ähnliche Fluoreszenz in Blutplasma oder Blutserum ein höheres Risiko für das Wiederauftreten von Krebserkrankungen darstellt als eine hohe AGE-ähnliche Fluoreszenz.

7. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass eine sehr niedrige AGE-ähnliche Fluoreszenz in Blutplasma oder Blutserum ein geringeres Überleben infolge der Krebserkrankung anzeigt als eine hohe AGE-ähnliche Fluoreszenz.

8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass eine geringe AGE-ähnliche Fluoreszenz in Blutplasma oder Blutserum mit einem verstärkten Fortschreiten der Karzinomerkrankung verbunden ist.

Description:

Lungentumore stellen den weltweit höchsten Anteil an tumorbedingten Todesfällen dar. Eine genaue Beurteilung des Ausmaßes der Erkrankung ermöglicht eine Prognose des weiteren Krankheitsverlaufes und somit die Auswahl einer geeigneten Therapie. Die Mehrzahl der Lungentumore gehört zur Gruppe der Nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome. Diese werden nach dem englischen Wort Non-Small Cell Lung Carcinoma als NSCLC bezeichnet. Das derzeit angewandte System zur Einstufung der NSCLC-Erkrankung berücksichtigt die Größe und Lokalisierung des Primärtumors (T), die Metastasierung von Tumorzellen in die lokalen Lymphknoten (N) sowie das Vorhandensein von Fernmetastasen (M) (Mountain, 1997). Ein signifikanter Anteil der Patienten wird durch dieses TNM-System jedoch nicht genau eingestuft, so dass dies zu einer ungenauen Beurteilung des Krankheitsausmaßes, der Prognose des Krankheitsverlaufes und somit der geeigneten Anti-Tumor-Therapie führt. Aus diesem Grund und um den Patienten nur im unbedingt erforderlichen Umfang einer Belastung durch Chemo- und/oder Strahlentherapie zu unterwerfen, sind zusätzliche Analysen für eine genaue Tumordiagnostik erforderlich.

Daher bestand die Erfordernis, zusätzliche Analysenmethoden zu entwickeln, die eine genauere bzw. weiter unterstützende Aussage zur Tumordiagnose und Prognose des Krankheitsverlaufes ermöglichen. Die bekannten immunologischen und histologischen Analysemethoden benötigen allerdings Gewebematerial aus dem Primärtumor. Die Entnahme von Tumorgewebe erfolgt durch chirurgische Eingriffe und ist in der Regel nur einmalig möglich. Der Einsatz von leicht zugänglichem Probenmaterial, welches mehrfach und ohne zusätzliche chirurgische Eingriffe gewonnen werden kann, ist daher wünschenswert. Dazu gehören insbesondere Untersuchungen an Blutmaterial, da Blut unter klinischen Bedingungen ständig gewonnen werden kann.

Derzeit sind Blutuntersuchungen möglich, welche die im Blut zirkulierende Tumor-DNA sowie einige Tumor-relevante Proteine und Peptide (z. B. der Tumor-Marker Survivin, der Wachstumsfaktor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)) bestimmen könnten. Diese werden jedoch in der Praxis aus Kostengründen und/oder auf Grund einer begrenzten Diagnose- und Prognosesignifikanz nicht eingesetzt.

Es stellte sich somit die Aufgabe, eine einfache und kostengünstige Untersuchungsmethode an NSCLC-Patienten zu entwickeln, die auf der Basis von Blutproben durchgeführt werden kann.

Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, dass Blutproben von NSCLC-Patienten einer Fluoreszenzuntersuchung unterzogen wurden und die Fluoreszenzdaten anschließend hinsichtlich des krankheitsfreien Zeitraums (kein Wiederauftreten der Tumorerkrankung) sowie des Überlebens der Patienten retrospektiv analysiert worden sind. Da die zellulären Bestandteile im Blut diese Analysen stören, wird aus dem Vollblut das Plasma bzw. das Serum gewonnen und analysiert.

Die Fluoreszenz von Plasma- oder Serumproben steht im Zusammenhang mit den im Blut zirkulierenden Glykierungsendprodukten. Diese werden nach dem englischen Wort Advanced Glycation End-products in der Regel nur als AGEs bezeichnet. Die AGEs entstehen als Folge einer chemischen Reaktion zwischen Aminogruppen (z. B. von Peptiden, Proteinen, einigen Phospholipiden) und Karbonylgruppen (z. B. von reduzierenden Zuckern, Abbauprodukten der Kohlenhydrate, Lipide). Diese Reaktion wurde erstmals im Jahr 1912 von Louis Maillard beschrieben und heißt deshalb auch Maillard-Reaktion. Die Maillard-Reaktion und AGE-Bildung findet sowohl bei der Nahrungsmittelzubereitung (exogen) als auch im menschlichen Körper und anderen biologischen Systemen (endogen) statt. Die AGEs existieren in einer Vielzahl von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden chemischen Verbindungen, von denen bisher nur einige in ihrer chemischen Struktur aufgeklärt sind.

Die Standard-Fluoreszenz der fluoreszierenden AGEs wird bei einer Anregungswellenlänge von 370 nm und eine Emissionswellenlänge von 440 nm bestimmt (Schmitt et al., 2005; Yanagisawa et al., 1998), um einen repräsentativen Gehalt von AGEs im biologischen Material zu erhalten. Durch Bestimmung der Standard-AGE-Fluoreszenz wurde festgestellt, dass Patienten mit Niereninsuffizienz, unbehandeltem Diabetes mellitus, Alzheimer und Leberzirrhose einen pathophysiologischen Anstieg der AGE-Fluoreszenz im Blutplasma oder Blutserum aufweisen. Des Weiteren ist bekannt, dass der physiologische Anteil an zirkulierenden AGEs vom Lebensalter, dem individuellem Lebensstil einschließlich den Ernährungsgewohnheiten abhängt. Aus diesem Grund dürfte jede Person über einen individuellen Gehalt an zirkulierenden AGEs im Blut verfügen.

Da man in biologischen Proben wie dem Plasma die Fluoreszenz von Nicht-AGEs nicht absolut ausschließen kann, spricht man korrekterweise von einer AGE-ähnlichen Fluoreszenz. Der Gehalt sowie die klinische Bedeutung von zirkulierenden AGEs im Blut von Patienten mit einer Tumorerkrankung ist weitestgehend unbekannt. Aus diesem Grund wurde die Relevanz der AGE-ähnlichen Plasmafluoreszenz hinsichtlich des Erfolges der Anti-Tumor-Therapie und weiterer klinischer Parameter an Patienten mit einem NSCLC untersucht. Dazu wurden Plasmaproben von 70 NSCLC-Patienten, die sich als Anti-Tumor-Therapie einer Lungenresektion durch Operation unterzogen hatten, auf die AGE-ähnliche Fluoreszenz analysiert. Alle Blutproben wurden vor der Lungenoperation entnommen und das Plasma präpariert. Es wurde die Plasmafluoreszenz eines jeden Patienten bei 370 nm Anregungswellenlänge und 440 nm Emissionswellenlänge, welche der Standardfluoreszenz von AGEs entspricht, bestimmt. Als positive Kontrolle bzw. interner Vergleich wurde eine definierte Menge an AGE-modifiziertem Rinderserumalbumin (AGE-BSA, AGE-Bovine Serum Albumin (Wrobel et al., 1997)) verwendet. Der Einsatz von AGE-BSA ist aber optional, da auch die relativen Fluoreszenz-Intensitäten des Fluoreszenzspektrophotometers als Angabe ausreichend sind.

Es wurde die mediane Plasmafluoreszenz von 1,08 μg/ml AGE-BSA (Bereich: 0,73 bis 1,61 μg/ml AGE-BSA) bestimmt. Auf der Grundlage dieses Medians wurden die NSCLC-Patienten in Patienten mit einem niedrigen oder einem hohen Fluoreszenzwert eingeteilt. Die Analyse klinisch-pathologischer Daten zeigte keinen signifikanten Einfluss von Geschlecht, Alter, Raucherstatus und sekundären Erkrankungen wie Diabetes mellitus und Niereninsuffizienz auf die Plasmafluoreszenz (1). Ferner konnte auch kein Einfluss von NSCLC-Parametern wie dem T- und N-Stadium auf die Plasmafluoreszenz gefunden werden (1). Im Gegensatz dazu zeigte sich aber, dass NSCLC-Patienten mit einer hohen Plasmafluoreszenz einen längeren krankheits-(tumor-)freien Zeitraum nach der Operation sowie ein bedeutend besseres post-operatives Überleben als Patienten mit einer niedrigen Plasmafluoreszenz besitzen (2A).

Nur 30% der Patienten, die eine niedrige Plasmafluoreszenz aufwiesen, waren 5 Jahre nach der Operation noch am Leben im Gegensatz zu 70% der Patienten mit einer niedrigen Plasmafluoreszenz (P = 0,015). Auf Grundlage dieser Bestimmung wurden die NSCLC-Patienten in Quartile (QI bis QIV) unterteilt. Kaplan-Meier-Analysen zeigten, dass insbesondere die NSCLC-Patienten mit einer sehr niedrigen AGE-Fluoreszenz (QI) eine extrem schlechte Überlebensrate hatten. Die Abhängigkeit zwischen der ansteigenden Plasmafluoreszenz (QI → QIV) und dem post-operativem Überleben der NSCLC-Patienten ist in 2B dargestellt.

Die Analyse histopathologischer Daten zeigte, dass unabhängig vom histologischen Subtyp des NSCLC (Adenkarzinom und Plattenepithelkarzinom als NSCLC-Hauptsubtypen) die Gruppe der NSCLC-Patienten mit einer hohen Plasmafluoreszenz über eine höhere Überlebensrate verfügt (3).

Insgesamt wiesen die klinischen Daten daraufhin, dass fluoreszierende AGEs im Blut einen hemmenden Einfluss auf das Tumorwachstum haben könnten. Um dies zu bestätigen, wurden weitere Untersuchungen in der Zellkultur (in vitro) und im Maustiermodell (in vivo) durchgeführt.

So zeigten die in vitro-Untersuchungen, dass das Wachstum von multizellulären Verbänden (Sphäroiden) aus NSCLC-Zellen umgekehrt proportional zur AGE-abhängigen Fluoreszenz der zugesetzten Plasmaprobe von individuellen NSCLC-Patienten ist (4). Diese umgekehrte Beziehung zwischen der AGE-ähnlichen Fluoreszenz und dem Sphäroidwachstum konnte auch für das Blutserum von Mäusen gezeigt werden, deren Anteil an fluoreszierenden AGEs im Blut durch eine AGE-reiche Ernährung (Zusatz von AGE reicher Brotkruste (Somoza et al., 2005)) hervorgerufen worden ist. Anhand dieses Ernährungsmodells konnte anschließend gezeigt werden, dass eine Erhöhung von fluoreszierenden AGEs im Blut mit einem verminderten subkutanen Wachstum von NSCLC-Zellen in immundefizienten Mäusen einher geht (in vivo-Tumorigenitäts-Assay).

Ausführungsbeispiele1. Bestimmung der AGE-ähnlichen Fluoreszenz im Blutplasma von Patienten

Zur Bestimmung der Plasmafluoreszenz wurde Blut vor der Anti-Tumor-Therapie (d. h. vor der chirurgischen Entfernung des NSCLC) von NSCLC-Patienten in Monovetten (z. B. Na-EDTA-Monovetten, Citrat-Monovetten zur Gewinnung von Plasma) entnommen. Das Blut wurde anschließend abzentrifugiert, um die Zellbestandteile zu sedimentieren, das gewonnene Plasma abpipettiert und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Nach dem Auftauen des Blutplasmas wurde dieses 1:20 in physiologischem Puffer (PBS, Phosphate-buffered Saline) verdünnt. Danach wurden von jeder verdünnten Plasmaprobe 100 μl als Dreifachbestimmung in eine schwarze Multi-Well-Fluoreszenzplatte (96-Well-Format) überführt. Darin erfolgte anschließend die Fluoreszenzmessung in einem Fluoreszenzspektrophotometer (FLUOstar OPTIMA Reader; BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany) unter Nutzung eines 370–10 nm-Filters für die Anregungswellenlänge und eines 440 nm-Filters für die Emissionswellenlänge. Als positive Kontrolle bzw. Standard wurde AGE-BSA genutzt. Dieses wurde zuvor durch Behandlung von kommerziell erhältlichem BSA mit Glukose hergestellt (1 mM BSA + 1 M Glucose für 6 Wochen bei 37°C).

2. AGE-ähnlichen Fluoreszenz im Blutplasma von Patienten und Tumorwachstum in vitro (Sphäroid-Assay)

Um den potentiellen Einfluss der AGEs im Blutplasma auf das Tumorwachstum in vitro zu untersuchen, wurden in der Zellkultur dreidimensionale multizelluläre Verbände aus der NSCLC-Zelllinie NCI(National Cancer Institute)-H358 gebildet. Jeder Sphäroid bestand zu Beginn des Versuches aus 300 H358-Zellen. Die jeweiligen Sphäroide wurden dann im Standard-Zellkulturmedium (DMEM, Dulbecco's modified Eagle's medium) mit 7,5% Plasma von 28 zufällig ausgewählten NSCLC-Patienten behandelt und das Sphäroid-Wachstum für mehrere Tage verfolgt. Die Größenzunahme jedes Sphäroids wurde mikroskopisch ausgewertet (Axiovert 200-Microskop mit Spot-Kamera; Carl Zeiss, Jena; Metamorph 4.6.5.-Software; Visitron Systems, Puchheim) und das Sphäroidvolumen (4/3π·Durchmesser3) berechnet. Insgesamt wurden 10 Sphäroide pro Blutplasma pro NSCLC-Patient untersucht und die Daten gemittelt.

3. Fluoreszenz in Blutserum von Mäusen und in vitro-Tumorwachstum (Sphäroid-Assay)

Im Maustiermodell wurde der Anteil an fluoreszierenden AGEs im Blut durch eine AGE-reiche Ernährung hervorgerufen um nachzuweisen, dass AGEs im Blut einen Einfluss auf das Tumorwachstum in vitro haben. Hierbei wurden jeweils 13 weibliche Mäuse (ca. 3 Wochen alt; NMRI Nude-Stamm; Harlan-Winkelmann, Borchen) mit einer AGE-reichen Diät (Zusatz von 15% AGE-reicher Brotkruste) bzw. mit einer Kontroll-Diät (Zusatz von 15% Stärke anstelle von Brotkruste) ernährt. Die Diät wurde am Deutschen Forschungsinstitut für Nahrungsmittelchemie (Garching) zusammengestellt. Nach 3 Wochen Diät wurden die Tiere getötet, das Blut entnommen und anschließend das Serum (aufgrund einer zu schnellen Blutgerinnung kein Plasma) präpariert. Analog dem Ausführungsbeispiel 1 wurde das Serum 1:5 in PBS verdünnt (aufgrund einer unterschiedlichen Grund-Fluoreszenz im Blut von Maus und Mensch waren unterschiedliche Verdünnungen in PBS notwendig). Dieses wurde anschließend im Fluoreszenzspektrophotometer (FLUOstar OPTIMA Reader; BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany) unter Nutzung eines 370–10 nm-Filters für die Anregungswellenlänge und eines 440 nm-Filters für die Emissionswellenlänge auf die AGE-ähnliche Fluoreszenz untersucht. Analog dem Ausführungsbeispiel 2 wurden Sphäroide von 300 H358-Zellen gebildet, diese anschließend in vitro mit dem Serum der Mäuse behandelt und das Wachstum der H358-Sphäroide mikroskopisch verfolgt und ausgewertet. Insgesamt wurden 10 Sphäroide pro Blutserum pro Maus untersucht und die Daten gemittelt. Die Durchführung dieses AGE-Ernährungsmodells an der Maus wurde zuvor von der Tierschutzkommission in Halle/S. genehmigt.

4. Fluoreszenz in Blutserum von Mäusen und in vivo-Tumorwachstum in Mäusen (in vivo-Tumorigenitäts-Assay)

Analog dem Ausführungsbeispiel 3 wurde das Ernährungsmodell der Maus genutzt um nachzuweisen, dass AGEs im Blut auch einen Einfluss auf das Tumorwachstum in vivo haben. Dazu wurden jeweils 16 weibliche Mäuse (ca. 3 Wochen alt; NMRI Nude-Stamm; Harlan-Winkelmann, Borchen) mit einer AGE-reichen Diät (Zusatz von 15% AGE-reicher Brotkruste) bzw. mit einer Kontroll-Diät (Zusatz von 15% Stärke anstelle von Brotkruste) ernährt. Nach 2 Wochen Diät wurden den immundefizienten Tieren 2·106 NSCLC-Zellen der Zelllinie NCI-H358 subkutan auf die linke und rechte obere Flanke injiziert. Unter Fortführung der jeweiligen Diät wurde dann das Wachstum der NSCLC-Zellen verfolgt. Die Länge und Breite des sich bildenden Tumors wurde zwei Mal pro Woche vermessen und das Tumorvolumen [4/3π·(Länge/2)·(Breite/2)2] ermittelt. Nach 25 Tagen Tumorwachstum wurden die Mäuse getötet, die gebildeten Tumore präpariert und anschließend gewogen.

BezugszeichenlisteFig. 1 Eigenschaften der NSCLC-Patienten in Abhängigkeit von der AGE-ähnlichen Plasmafluoreszenz (Plasma-FL).

Daten sind als Median mit interquartilem Range (M (IR)) oder als Anzahl der NSCLC-Patienten (N) angegeben. *Cut off-Wert entspricht der medianen Plasma-FL aller NSCLC-Patienten (1,08 μg/ml AGE-BSA). †P-Werte wurden mittels Student's t-Test (bei Median) bzw. chi2-Test (bei Anzahl) ermittelt.
ADC, Adenkarzinom; PEC, Plattenepithelkarzinom.

Fig. 2 Überleben von NSCLC-Patienten mit unterschiedlichem Gehalt an AGE-ähnlicher Plasmafluoreszenz (Plasma-FL).

Kaplan-Meier-Blot des 4-Jahre-krankheitsfreien Zeitraums und des 5-Jahre-Überlebens nach chirurgischer Entfernung des Tumors von NSCLC-Patienten, die entweder eine niedrige oder eine hohe Plasmafluoreszenz aufwiesen (A). Die NSCLC-Patienten wurden entsprechend der Plasmafluoreszenz weiter in Quartile (QI to QIV) und anschließend für jede Gruppe die 5-Jahre-Überlebenskurve ermittelt (B). Die mediane Plasmafluoreszenz (μg/ml AGE-BSA) ist in QI: 0,73, QII: 0,94, QIII: 1,21, und QIV: 1,61. Die P-Werte zwischen den Kaplan-Meier-Kurven wurden nach dem log-rank-Test ermittelt. *Für alle paarweise multiplen Vergleiche wurde ein P-Wert von 0,008 ermittelt (Bonferroni-Methode).

Fig. 3 Eigenschaften der NSCLC-Patienten in Abhängigkeit von der NSCLC-Histologie und AGE-ähnlichen Plasmafluoreszenz (Plasma-FL)

Daten sind als Median (M) oder als Anzahl der NSCLC-Patienten (N) angegeben. *Cut off-Wert entspricht der medianen Plasma-FL aller NSCLC-Patienten (1,08 μg/ml AGE-BSA). †P-Werte (niedrige versus hohe Plasma-FL-Gruppe) und ‡P-Werte (alle Adenokarzinome versus alle Plattenepithelkarzinome) wurden mittels Student's t-Test (bei Median), chi2–-Test (bei Anzahl) bzw. log-rank-Test (Kaplan-Meier-Blot) ermittelt.

Fig. 4 Einfluss des Plasmas von NSCLC-Patienten auf das Wachstum von multizellulären Verbänden (Sphäroiden) aus NSCLC-Zellen.

Sphäroide aus NSCLC-Zellen (Zelllinie NCI-H358) wurden in der Zellkultur mit dem Blutplasma von zufällig ausgewählten NSCLC-Patienten behandelt und das in vitro-Wachstum mikroskopisch ausgewertet. Das absolute Sphäroidwachstum wurden gegen die AGE-ähnliche Fluoreszenz (FL) der individuellen Plasmaproben aufgetragen und eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt. Der P-Wert des Regressionskoeffizienten R wurde mittels two-sided-Test ermittelt.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • - Schmitt et al., 2005; Yanagisawa et al., 1998 [0007]
  • - AGE-BSA, AGE-Bovine Serum Albumin (Wrobel et al., 1997) [0008]
  • - Zusatz von AGE reicher Brotkruste (Somoza et al., 2005) [0013]