Title:
Verfahren zum Screening nach Pathogenen
Kind Code:
A1


Abstract:

Es wird ein Verfahren zum Screening auf das Vorhandensein von MRSA in einem Subjekt offenbart, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Gewinnen einer geeigneten Probe von dem Subjekt unter Verwendung eines Tupfers oder einer anderen geeigneten Einheit zur Probengewinnung;
(b) im Wesentlichen unmittelbar nach der Durchführung von Schritt (a) Kontaktieren des Tupfers oder der anderen Einheit zur Probengewinnung mit einem Identifizierungsmedium, wobei das Medium Folgendes umfasst:
(i) Nährstoffe, um das Wachstum von MRSA zu ermöglichen;
(ii) wenigstens einen Inhibitorstoff, um bevorzugt das Wachstum von Organismen, die von MRSA verschieden sind, zu hemmen; und
(iii) einen visuellen Indikatorstoff, der eine visuelle Anzeige des Wachstums von MRSA, wenn vorhanden, erzeugt;
(c) Inkubieren des Identifizierungsmediums, typischerweise während es noch in Kontakt mit dem Tupfer oder der anderen Einheit zur Probengewinnung steht, unter Bedingungen, die genügen, um das Wachstum von MRSA zu bewirken; und nach dem Verstreichen einer ausreichenden Zeitspanne;
(d) Kontrollieren des Mediums, um das Vorhandensein oder Fehlen der visuellen Anzeige des Wachstums von MRSA zu bestimmen.




Inventors:
Brown, Alistair John (Noth End Lane, Hampshire, GB)
Dimmer, Stephen (Chandlers Ford, Hampshire, GB)
Application Number:
DE102009026285
Publication Date:
02/04/2010
Filing Date:
07/29/2009
Assignee:
Oxoid Ltd. (Basingstoke, Hampshire, GB)
International Classes:



Foreign References:
200600035032006-01-05
Attorney, Agent or Firm:
Loesenbeck und Kollegen (Bielefeld, 33602)
Claims:
1. Verfahren zum Screening nach dem Vorhandensein von MRSA in einem Subjekt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Gewinnen einer geeigneten Probe von dem Subjekt unter Verwendung eines Tupfers oder einer anderen geeigneten Einheit zur Probengewinnung;
(b) im Wesentlichen unmittelbar nach der Durchführung von Schritt (a) Kontaktieren des Tupfers oder der anderen Einheit zur Probengewinnung mit einem Identifizierungsmedium, wobei das Medium Folgendes umfasst:
(i) Nährstoffe, um das Wachstum von MRSA zu ermöglichen;
(ii) wenigstens einen Inhibitorstoff, um bevorzugt das Wachstum von Organismen, die von MRSA verschieden sind, zu hemmen; und
(iii) einen visuellen Indikatorstoff, der eine visuelle Anzeige des Wachstums von MRSA, wenn vorhanden, erzeugt;
(c) Inkubieren des Identifizierungsmediums, typischerweise während es noch in Kontakt mit dem Tupfer oder der anderen Einheit zur Probengewinnung steht, unter Bedingungen, die genügen, um das Wachstum von MRSA zu bewirken; und nach dem Verstreichen einer ausreichenden Zeitspanne
(d) Kontrollieren des Mediums, um das Vorhandensein oder Fehlen der visuellen Anzeige des Wachstums von MRSA zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Identifizierungsmedium flüssig ist oder ein halbfester Stoff ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schritte (a) und (b) am Ort der Betreuung in Gegenwart des Subjekts durchgeführt werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Medium eine Quelle von Kohlenhydrat umfasst, das als Energiequelle von MRSA verwendbar ist; und eine oder mehrere der folgenden Quellen von Nährstoffen: Peptone, Hefeextrakt, Salze und Mineralstoffe.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Medium zwei oder mehrere der folgenden Stoffe mit einer Konzentration umfasst, die ein bevorzugtes Hemmen des Wachstums von Kompetitororganismen ermöglichen, umfassend: Polymyxin B; Colistinsulfat; Aztreonam; Lithiumchlorid; Deferoxaminmesylat; und Amphotericin B, Fluconazol oder eine andere fungizide Verbindung.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Medium drei oder mehr der in Anspruch 5 genannten Inhibitorstoffe mit einer Konzentration, die ein bevorzugtes Hemmen des Wachstums von Kompetitororganismen ermöglicht.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Medium eines oder mehrere von Folgendem mit einer Konzentration umfasst, die ein bevorzugtes Hemmen des Wachstums von MSSA oder anderen Kompetitororganismen, wenn vorhanden, ermöglicht, umfassend: Meticillin; Oxacillin; ein Cephalosporin; oder ein Cephamycin.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Medium zwei oder mehr der in Anspruch 7 genannten antibakteriellen Stoffe mit einer Konzentration umfasst, die ein bevorzugtes Hemmen des Wachstums von MSSA oder anderen Kompetitororganismen ermöglicht.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Indikatorstoff ein Chromogen oder ein Fluorogen umfasst.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Indikatorstoff ein Chromogen- oder Fluorogensubstrat für MRSA-Phosphatase umfasst.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt (c) das Inkubieren des Mediums, typischerweise während es noch in Kontakt mit dem Tupfer oder der anderen Einheit zur Probengewinnung steht, bei einer Temperatur im Bereich von 35–38°C über einen Zeitraum im Bereich von 16–24 Stunden umfasst.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der visuelle Indikatorstoff ein Signal erzeugt, welches das Wachstum von MRSA spezifisch anzeigt.

13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend die Verwendung eines Mediums, das einen pH-Indikator oder ein Fluorogen umfasst, aber nicht beides.

14. Kit, das zur Verwendung für die Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche geeignet ist, wobei das Kit Folgendes umfasst: eine sterile Packung, die einen Tupfer oder eine andere Einheit zur Probengewinnung und ein wie in Anspruch 1 beschriebenes Identifizierungsmedium enthält.

15. Kit nach Anspruch 14, wobei das Identifizierungsmedium in flüssiger oder halbfester Form bereitgestellt ist und in einem sterilen Behälter enthalten ist, der ein entfernbares und wiederverschließbares Verschlussmittel aufweist.

16. Kit nach Anspruch 15, wobei der Behälter eine Schraubkappe umfasst.

17. Kit nach Anspruch 15, wobei der Tupfer oder die andere Einheit zur Probengewinnung als integraler Teil des Behälters bereitgestellt ist.

18. Kit nach einem der Ansprüche 14–17, ferner umfassend Anweisungen für die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–13.

19. Kit nach einem der Ansprüche 14–18, umfassend ein Medium, das einen pH-Indikator oder ein Fluorogen umfasst, aber nicht beides.

20. Flüssiges oder halbfestes Identifizierungsmedium, das zur Verwendung für die Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–13 geeignet ist, wobei das Medium wie in Anspruch 1 beschrieben ist.

21. Medium nach Anspruch 20, wobei das Medium einen pH-Indikator oder ein Fluorogen umfasst, aber nicht beides.

Description:
Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening nach Pathogenen, insbesondere ein schnelles Verfahren zum Screening nach dem Vorhandensein von Meticillinresistentem Staphylococcus aureus (MRSA), sowie Medien und Kits zur Verwendung bei solchen Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

Nosokomiale und iatrogene Infektionen mit MRSA sind im Vereinigten Königreich und andernorts ein gut bekanntes und weitverbreitetes Problem. In einem Versuch, die Inzidenz von MRSA-Infektionen im Vereinigten Königreich besser zu kontrollieren, ist geplant, jeden in ein Krankenhaus aufgenommenen Patienten im Screening zu erfassen, um Personen zu identifizieren, die asymptomatische Träger sein könnten. Es wird geschätzt, dass zwischen 10 und 20% der allgemeinen Bevölkerung des Vereinigten Königreichs Träger von MRSA sein könnten.

Gegenwärtig umfassen herkömmliche Screeningverfahren das Nehmen eines Abstrichs (wie z. B. eines nasalen Abstrichs) von einer Person am Ort der Betreuung. Der Abstrich wird in einen sterilen Behälter gegeben und zu dem mikrobiologischen Labor des Krankenhauses weitergeleitet, wo er ausgepackt und zum Inokulieren einer Screening-Platte verwendet wird. Die Platte enthält ein festes Medium mit Bestandteilen zum Anregen des Wachstums von vorhandenen MRSA-Bakterien sowie einen Marker, der bei Vorhandensein von MRSA ein sichtbares Zeichen erzeugt.

Das Screeningmedium, das unter dem Handelsnamen „Brilliance” MRSA Agar von Oxoid Limited verkauft wird, ist eines der besten, die gegenwärtig erhältlich sind. Es handelt sich dabei um ein undurchsichtiges Medium, das ein Chromogen umfasst, das infolge von Phosphataseaktivität eine blaue Farbe ergibt. Das Enzym Phosphatase ist in vielen Staphylokokken vorhanden, einschließlich S. aureus. Um dem Medium das Unterscheiden zwischen MRSA und anderen Staphylokokken zu ermöglichen, umfasst das Medium auch eine Kombination von antibakteriellen Verbindungen, die zum Hemmen des Wachstums einer breiten Vielfalt von wahrscheinlichen Kompetitororganismen ausgewählt sind, einschließlich von Meticillin-empfindlichen Staph. aureus (MSSA). Das Medium umfasst auch Verbindungen zum Unterdrücken der Expression von Phosphataseaktivität in anderen Staphylokokken, um so einen hohen Grad an Empfindlichkeit und Spezifität zu ergeben. Falls vorhanden, ist MRSA durch seine markante, hellblaue Färbung auf dem Medium erkennbar.

Das gängige Verfahren und das gängige Medium sind zwar befriedigend, es ist dabei aber notwendig, die Probe von dem Abstrichtupfer auf ein Wachstumsmedium zu überführen und die Platten nach der Inokulation mit dem Abstrich wenigstens 18 Stunden bei 37°C zu inkubieren. Der Überführungsschritt erfordert den Zeitaufwand einer Laborkraft, insbesondere wenn das Screening im großen Maßstab durchgeführt werden soll, und erhöht das Risiko einer Kontamination oder eines anderen Missgeschicks.

Rambach et al. (US 2006/003503) offenbart ein Verfahren zum Nachweisen von Meticillin-resistenten Mikroorganismen unter Verwendung eines festen Mediums, umfassend ein Cephalosporin und ein chromogenes Mittel, das nach Hydrolyse durch ein Enzym, das von den nachzuweisenden Mikroorganismen hergestellt wird, ein Chromophor freisetzt. Rambach et al. offenbart jedoch nicht die Verwendung von flüssigen oder halbfesten Medien und offenbart nicht die Verwendung eines geeigneten Mediums am Ort der Betreuung.

In Anbetracht der sehr großen Anzahl der Personen, die nun von dem Screening erfasst werden sollen, wird das durchschnittliche Krankenhauslabor viele tausend Platten pro Jahr verwenden müssen, und zu jedem Zeitpunkt werden wahrscheinlich mehrere hundert Platten Inkubation oder Prüfung benötigen, wofür viel Platz in Inkubatoren und auf Arbeitsflächen erforderlich sein wird.

Demnach besteht dringender Bedarf an einem Verfahren zum Screening nach MRSA, bei dem das arbeitsintensive Überführen der Proben von dem Abstrichtupfer auf das Wachstumsmedium vermieden wird (und damit die Risiken, die mit einer solchen Überführung verbunden sind), das auch bei Durchführung in großem Maßstab kostengünstig ist und das weniger Platz benötigt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Screening nach dem Vorhandensein von MRSA in einem Subjekt bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

  • (a) Gewinnen einer geeigneten Probe von dem Subjekt unter Verwendung eines Tupfers oder einer anderen geeigneten Einheit zur Probengewinnung;
  • (b) im Wesentlichen unmittelbar nach der Durchführung von Schritt (a) Kontaktieren des Tupfers oder der anderen Einheit zur Probengewinnung mit einem Identifizierungsmedium, wobei das Medium Folgendes umfasst:
  • (i) Nährstoffe, um das Wachstum von MRSA zu ermöglichen;
  • (ii) wenigstens einen Inhibitorstoff, um bevorzugt das Wachstum von Organismen, die von MRSA verschieden sind, zu hemmen; und
  • (iii) einen visuellen Indikatorstoff, der eine visuelle Anzeige des Wachstums von MRSA, wenn vorhanden, erzeugt;
  • (c) Inkubieren des Identifizierungsmediums, vorzugsweise während es noch in Kontakt mit dem Tupfer oder der anderen Einheit zur Probengewinnung steht, unter Bedingungen, die genügen, um das Wachstum von MRSA zu bewirken; und nach dem Verstreichen einer ausreichenden Zeitspanne
  • (d) Kontrollieren des Mediums, um das Vorhandensein oder Fehlen der visuellen Anzeige des Wachstums von MRSA zu bestimmen; wobei die beiden Schritte (a) und (b) am Ort der Betreuung stattfinden (vorzugsweise in Gegenwart des Subjekts).

Schritt (b) findet im Wesentlichen unmittelbar nach Schritt (a) statt. In der Praxis ist es also wünschenswert, dass die beiden Schritte (a) und (b) am Ort der Betreuung stattfinden, wobei die Betreuungsperson einen Abstrich von dem Subjekt nimmt und im Wesentlichen unmittelbar danach den Tupfer oder die andere Einheit zur Probengewinnung mit dem Identifizierungsmedium kontaktiert. „Im Wesentlichen unmittelbar nach” bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Tupfer oder die andere Einheit zur Probengewinnung typischerweise innerhalb von 3 Minuten, vorzugsweise innerhalb von 2 Minuten, höchst bevorzugt innerhalb von 1 Minute nach dem Gewinnen einer Probe von dem Subjekt mit dem Identifizierungsmedium kontaktiert wird.

Die Erfindung stellt somit auch ein Verfahren zum Screening nach dem Vorhandensein von MRSA in einem Subjekt bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

  • (a) Gewinnen einer geeigneten Probe von dem Subjekt unter Verwendung eines Tupfers oder einer anderen geeigneten Einheit zur Probengewinnung;
  • (b) Kontaktieren des Tupfers oder der anderen Einheit zur Probengewinnung mit einem Identifizierungsmedium, wobei das Medium Folgendes umfasst:
    (i) Nährstoffe, um das Wachstum von MRSA zu ermöglichen;
    (ii) wenigstens einen Inhibitorstoff, um bevorzugt das Wachstum von Organismen, die von MRSA verschieden sind, zu hemmen; und
    (iii) einen visuellen Indikatorstoff, der eine visuelle Anzeige des Wachstums von MRSA, wenn vorhanden, erzeugt;
  • (c) Inkubieren des Identifizierungsmediums, typischerweise während es noch in Kontakt mit dem Tupfer oder der anderen Einheit zur Probengewinnung steht, unter Bedingungen, die genügen, um das Wachstum von MRSA zu bewirken; und nach dem Verstreichen einer ausreichenden Zeitspanne
  • (d) Kontrollieren des Mediums, um das Vorhandensein oder Fehlen der visuellen Anzeige des Wachstums von MRSA zu bestimmen; wobei die beiden Schritte (a) und (b) am Ort der Betreuung stattfinden (vorzugsweise in Gegenwart des Subjekts).

Die Gesamtheit von Tupfer und Medium wird dann typischerweise zu einem mikrobiologischen Labor weitergeleitet, in dem normalerweise der Inkubationsschritt (c) und der Kontrollschritt (d) stattfinden werden.

Es ist bevorzugt, dass nach dem Kontaktieren des Tupfers mit dem Medium (Schritt b) der Tupfer wenigstens während eines Teils von Schritt (c), vorzugsweise während des gesamten Schritts (c), in Kontakt mit dem Medium gehalten wird, obwohl der Tupfer oder die andere Einheit zur Probengewinnung nach Verstreichen einer geeigneten Zeitspanne auch von dem Kontakt mit dem Medium entfernt werden kann, wenn dies aus irgend einem Grund gewünscht wird. Ferner ist bevorzugt, dass nach der Durchführung von Schritt (b) das Medium bei einer Temperatur im Bereich von 16–40°C gehalten wird, vorzugsweise bei 16–38°C, sobald dies nach dem Kontaktieren des Tupfers mit dem Medium durchführbar ist, und dass Schritt (c) auf die Durchführung von Schritt (b) folgt, sobald dies durchführbar ist.

Bei einer zweiten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Kit zur Verwendung eines Verfahrens gemäß einer ersten Ausführungsform bereit, wobei das Kit folgendes umfasst: eine sterile Packung, die einen Tupfer oder eine andere Einheit zur Probengewinnung und ein wie bei einer vorstehenden ersten Ausführungsform definiertes Identifizierungsmedium enthält.

Der Tupfer zur Verwendung bei den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann im Wesentlichen herkömmlich aufgebaut sein und ist leicht von zahlreichen Anbietern im Handel erhältlich. Der Tupfer kann beispielsweise mit einem Baumwoll-, Rayon-, Nylon- oder DacronTM-Kopf versehen sein, oder er kann beflockt sein.

Vorteilhafterweise wird der Tupfer als integrale, aber entfernbare Komponente eines Behälters, der zum Beinhalten des Identifizierungsmediums verwendet wird, bereitgestellt. Bei der Verwendung wird die Tupferkomponente von dem Behälter entfernt, mit dem entsprechenden Teil des Subjekts, von dem ein Abstrich zu nehmen ist, kontaktiert und dann auf eine solche Weise wieder in den Behälter eingeführt, dass der Tupfer das darin befindliche Medium kontaktiert. Der Behälter wird typischerweise ein Röhrchen mit einem Volumen im Bereich von 3–30 ml umfassen, vorzugsweise 5–25 ml, bevorzugter 10–25 ml, das in einem Reagenzglashalter für Probenröhrchen aufgenommen werden kann.

Das Identifizierungsmedium zur Verwendung bei der Erfindung wird Nährstoffe umfassen, die ein Wachstum von S. aureus ermöglichen, wie beispielsweise Peptone, Hefeextrakt, verschiedene Salze und Mineralstoffe, sowie eine Kohlenhydratquelle, wie z. B. Glucose, Dextrin oder Stärke. Das Medium ist vorzugsweise flüssig oder halbflüssig, könnte aber auch verfestigt sein. Für die genannten Zwecke ist ein halbfestes Medium ein solches, das quasifest ist (d. h. es kann sein eigenes Gewicht tragen und seine Form behalten, hat aber die Fähigkeit, unter Druck zu fließen, und wird sich der Form einer Oberfläche anpassen, die Druck auf es ausübt). Ein quasifestes Medium kann beispielsweise unter Verwendung einer Konzentration eines Geliermittels (beispielsweise Agar, Agarose, SephadexTM oder Gelatine) erhalten werden, die niedriger ist, als sie herkömmlich zur Herstellung fester Medien verwendet wird. Beispielsweise kann eine Konzentration von Agar im Bereich von 1–8 Gramm pro Liter, vorzugsweise 2–7 Gramm pro Liter, höchst bevorzugt 3–6 Gramm pro Liter zur Bereitstellung eines quasifesten Mediums verwendet werden.

Flüssige und quasifeste Medien sind bevorzugt, da sie u. a. einen besseren Kontakt des Mediums mit dem Tupfer ermöglichen als ein festes Medium.

Das Medium wird ferner wenigstens einen Inhibitorstoff zum Hemmen des Wachstums von Kompetitororganismen (d. h. die von MRSA verschiedenen Organismen) umfassen. In der Praxis wird das Medium wahrscheinlich eine Vielzahl von Inhibitorstoffen umfassen. Normalerweise wird eine solche Vielzahl von Inhibitorstoffen notwendig sein, da in der Probe eine Vielfalt von Kompetitororganismen vorhanden sein kann, die beispielsweise Coagulase-negative Staphylokokken (CoNS), Gram-negative Organismen, Enterokokken spp. und Hefen umfassen können. Demnach wird das Medium typischerweise einen oder mehrere, vorzugsweise zwei oder mehr, höchst bevorzugt drei oder mehr der folgenden Inhibitoren umfassen: Polymyxin B, Colistinsulfat, Aztreonam, Lithiumchlorid, Deferoxaminmesylat und Amphotericin B, Fluconazol oder eine andere fungizide Verbindung.

Wegen der Notwendigkeit, insbesondere das Wachstum von MSSA zu hemmen, wird das Medium vorzugsweise zudem eines oder mehrere von Folgendem umfassen: Meticillin; Oxacillin, ein Cephalosporin oder ein Cephamycin.

Die Inhibitorstoffe werden so ausgewählt und sind in einer solchen Konzentration vorhanden, dass sie vorzugsweise Kompetitororganismen hemmen. Das bedeutet, dass sie das Wachstum von Kompetitororganismen zu einem höheren Maß hemmen als das Wachstum von MRSA.

Ferner wird das Identifizierungsmedium wenigstens einen visuellen Indikatorstoff umfassen, der direkt oder indirekt ein visuelles Signal erzeugt, das für das Wachstum von MRSA indikativ ist. Beispielsweise, aber nicht notwendigerweise, wird das visuelle Signal die Form einer Farbänderung annehmen. Dies könnte beispielsweise eine Änderung von einer Farbe zu einer anderen Farbe sein; oder eine Änderung von farblos zu einer Farbe oder umgekehrt. Bei einer Ausführungsform kann der Indikatorstoff einen Indikator für die Änderung des pH-Werts oder für eine Redoxänderung umfassen, wobei solche Änderungen als Folge der Fermentation oder Veränderung eines Substrats in dem Medium durch die Wirkung eines oder mehrerer von MRSA hergestellten Enzyme stattfinden. Beispiele solcher Indikatoren umfassen beispielsweise Phenolrot, Neutralrot und Anilinblau.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Indikatorstoff eine chromogene oder fluorogene Verbindung. Vorzugsweise wird der Indikatorstoff durch die Wirkung einer von MRSA hergestellten Phosphatase und/oder Ribosidase verändert. Bevorzugte Chromogene werden durch die Wirkung von MRSA-Phosphatase so verändert, dass sie gefärbtes Produkt erzeugen. Besonders bevorzugte Chromogene zum Einschließen in das Medium umfassen Indoxylphosphate. Bevorzugte Fluorogene umfassen Umbelliferylphosphat-Fluorogene, wie z. B. 4-Methylumbelliferylphosphat.

Bei einigen Ausführungsformen kann das Medium einen pH-Indikator als „visuellen Indikatorstoff” umfassen, oder es kann ein Fluorogen als „visuellen Indikatorstoff” umfassen, aber nicht sowohl einen pH-Indikator als auch ein Fluorogen, da die Verwendung von zwei Indikatoren die Einfachheit oder Empfindlichkeit des Nachweises nicht wesentlich verbessert, aber die Kosten und die Komplexität der Herstellung des Mediums erhöht.

Schließlich kann das Medium ein Geliermittel umfassen, wie z. B. Agar, SephadexTM, Agarose oder Gelatine, um ein halbfestes Medium zu bilden und so sicher zu stellen, dass der Tupfer oder die andere Einheit zur Probengewinnung in Kontakt mit dem Medium bleibt.

Bei Kenntnis der vorliegenden Offenbarung wird der Fachmann imstande sein, geeignete Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile des Mediums zu bestimmen, wobei in den nachstehenden Beispielen Beispielformulierungen gegeben werden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung umfasst das Gewinnen einer geeigneten Probe von dem Subjekt. Dies kann im Allgemeinen das Abstreichen der Nasenlöcher und/oder der Hände des Subjekts umfassen, bei denen es sich um die am häufigsten von MRSA kolonisierten Stellen handelt, obwohl zusätzlich oder alternativ dazu auch andere Teile der Haut des Subjekts abgestrichen werden können.

Das Verfahren wird vorteilhaft unter Verwendung eines Kits gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung durchgeführt. Bei einer Ausführungsform ist das Kit als sterile Packung bereitgestellt, die eine undurchlässige Hülle aufweist, wie z. B. eine metallisierte Folie oder einen Film oder eine Tasche aus synthetischem Kunststoff, innerhalb derer ein Röhrchen, eine Flasche oder ein anderer Behälter aus Glas oder einem synthetischen Kunststoff bereitgestellt ist, das ein Aliquot des Wachstums/Identifizierungsmediums enthält und mit einem entfernbaren Verschlussmittel verschlossen ist, wie z. B. mit einer Schraubkappe oder einer anderen Einheit. Das Kit wird auch ein Etikett zum Aufnehmen maßgeblicher Informationen umfassen, wie z. B. des Namens des Patienten, des Tags der Probennahme, des Orts auf dem Patienten, von dem die Probe genommen wurde, und so weiter. Das Etikett kann getrennt bereitgestellt sein oder es kann bereits an dem Röhrchen, der Flasche oder dem Behälter, in dem das Medium enthalten ist, befestigt bereitgestellt sein. Vorzugsweise wird ein selbstklebendes Etikett verwendet.

Die Packung wird auch einen oder mehrere Tupfer umfassen, wie z. B. Tupfer mit Holz- oder Kunststoffgriff, oder eine andere geeignete Einheit zur Probengewinnung. Diese werden steril sein (beispielsweise UV-bestrahlt) und können getrennt von dem Behälter, der das Medium enthält, verpackt sein. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein Tupfer als integraler Teil des Behälters bereitgestellt. Beispielsweise kann der Behälter die Form eines Röhrchens mit einer Schraubkappe annehmen. Von der Kappe ragt ein integral gebildeter Tupfer nach oben. Zum Gewinnen einer Probe wird die Kappe von dem Röhrchen abgeschraubt und der Tupfer mit dem Subjekt kontaktiert. Anschließend wird die Kappe in umgekehrter Orientierung in das Röhrchen zurück gegeben, wobei der Tupfer nun nach unten in das Medium zeigt. Wenn gewünscht, kann die Kappe mit einem Gewindeteil in umgekehrtem Sinn bereitgestellt werden, um das Wiederaufsetzen der Kappe auf das Röhrchen in umgekehrter Orientierung zu erleichtern. Bei einer anderen Ausführungsform kann die Kappe beim Einführen in den Behälter in umgekehrter Orientierung durch eine Wirkung als Stopfen oder Stöpsel eine Abdichtung bilden.

Nach dem Kontaktieren mit dem Medium könnte der Tupfer im Prinzip nach starker Bewegung wieder entfernt werden. Es ist jedoch bevorzugt, den Tupfer während des Inkubationsschritts in Kontakt mit dem Medium zu belassen, um sicher zu stellen, dass wenigstens einige der vorhandenen MRSA-Bakterien auf das Medium übertragen werden.

Die Inkubationsbedingungen werden eine Inkubation bei einer höheren Temperatur als die Umgebungstemperatur umfassen, vorzugsweise im Bereich von 30–40°C, höchst bevorzugt bei etwa 37°C. Die Zeitdauer, die zum Erzeugen eines visuellen Signals benötigt wird, welches das Vorhandensein von MRSA anzeigt, variiert abhängig von den genauen Bedingungen des Assays, der Zusammensetzung des Mediums und dem physiologischen Zustand der Organismen zum Zeitpunkt der Probennahme (beispielsweise unter physiologischem Stress stehend oder nicht, und zu welchem Ausmaß). Typischerweise ist eine Inkubation von etwa 18–24 Stunden geeignet, die Erfinder glauben jedoch, dass unter manchen Bedingungen ein präsumptives Ergebnis bereits nach 6 Stunden Inkubation bei Schritt (c) erhalten werden kann.

Das Medium wird am Günstigsten direkt von einem menschlichen Beobachter kontrolliert, wenn gewünscht, könnte aber auch ein automatisiertes System eingesetzt werden, bei welchem das Medium von einer Maschine geprüft wird, beispielsweise von einem Spektrophotometer oder einer anderen farb- oder fluoreszenzempfindlichen Einheit.

Das Verfahren gemäß der Erfindung bietet vier wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren im Stand der Technik.

Erstens wird im Stand der Technik eine Abstrichprobe von einem Patienten genommen und dann in einem sterilen Behälter ohne Medium oder in einem sterilen Überführungsmedium (wie z. B. Kochsalzlösung), welches das Wachstum von MRSA nicht fördert, zu dem Krankenhauslabor überführt. Nach dem Eintreffen des Tupfers in dem Labor ist keine sofortige Handlung notwendig: der Tupfer kann auf einem Labortisch gehalten und angestapelt werden, bis eine ausreichende Anzahl davon eingetroffen ist, um den Zeitaufwand des Laborpersonals zur Verwendung der Tupfer zum Inokulieren von Platten zu rechtfertigen.

Im Gegensatz dazu wird bei dem Verfahren gemäß der Erfindung der Tupfer sofort in Kontakt mit einem Medium gebracht, das das Wachstum von MRSA fördert und anregt, während es gleichzeitig das Wachstum von Kompetitororganismen bevorzugt hemmt. Dadurch erhalten die MRSA-Organismen einen „Frühstart” im Vergleich zu dem Verfahren im Stand der Technik, so dass Ergebnisse früher nach dem Nehmen des Abstrichs von dem Subjekt erhalten werden können.

Zweitens ist beim Eintreffen der Proben in dem Labor keine Probenvorbereitung notwendig, so dass eine Verzögerung vor der Verarbeitung weniger wahrscheinlich ist. Stattdessen muss das Probenröhrchen oder der Behälter einfach nur von einer Laborkraft in einen Inkubator gegeben werden. Das Verringern der Anzahl der Manipulationen der Proben verringert auch das Risiko einer Kontamination.

Drittens nehmen die Röhrchen oder Behälter, die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wesentlich weniger Volumen als herkömmliche Platten ein, wodurch Arbeitsflächen- und Inkubatorplatz gespart werden, was bei großen Probenahlen sehr maßgeblich ist. Petrischalen, wie sie zur Herstellung von Platten fester Kulturmedien verwendet werden, haben üblicherweise Durchmesser von 90–150 mm, während die Röhrchen oder Behälter zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren typischerweise nur Durchmesser von 10–20 mm aufweisen.

Viertens sollte das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine größere Empfindlichkeit als herkömmliche Verfahren ergeben. Wenn ein Abstrich genommen und in Isolation (d. h. nicht in Kontakt mit einem flüssigen oder halbfesten Medium) zu dem Labor gesandt wird, werden sich die auf dem Tupfer vorhandenen Organismen in suboptimalen Bedingungen befinden. Manche können absterben, und auch Organismen, die nicht absterben, werden physiologisch gestresst werden, was bedeuten kann, dass sie von robusteren Kompetitororganismen überwachsen werden, wenn der Tupfer zum Inokulieren eines festen Wachstumsmediums verwendet wird, was zu einem falsch negativen Ergebnis führt.

Auch wenn der Tupfer in ein herkömmliches Transportmedium eingeführt wird (wie z. B. Amies-Medium), werden die Bedingungen suboptimal sein. Transportmedien sollen nämlich Mikroorganismen in einem Zustand einer relativen „Stase” halten, so dass die Anzahl der anschließend gewonnenen lebensfähigen Zellen jene widerspiegelt, die in der Probe zum Zeitpunkt der Probengewinnung enthalten waren. Das bedeutet, dass jede Verzögerung zwischen der Probennahme und der Inokulation eines Wachstumsmediums zu keiner Zunahme der Anzahl der Zielorganismen führt. Die Empfindlichkeit des letztlichen Wachstumsmediums hängt von der Anzahl der lebensfähigen Zellen ab, die zum Zeitpunkt der Inokulation in dem Transporttupfer verblieben sind.

Im Gegensatz dazu stellt das Verfahren gemäß der Erfindung sicher, dass die Anzahl der Organismen in der Probe zuzunehmen beginnt, sobald diese in das differenzierende MRSA-Transportmedium gegeben wird, vorausgesetzt, dass das Medium bei einer Temperatur von 16–40°C verweilt, vorzugsweise bei 16–38°C. Da die Zielorganismen mit den geeigneten Nährstoffen versorgt werden, ist es wahrscheinlich, dass die Anzahl der lebensfähigen Zellen zunimmt. Ähnlich werden nicht-Zielorganismen gehemmt, sobald die Probe in das MRSA-Transportmedium gegeben wird, wodurch die Wahrscheinlichkeit von übermäßigem Wachstum der „Hintergrundflora” und einer daraus folgenden kompetitiven Hemmung von MRSA verringert wird. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Verfahrens.

Schließlich spart das Verfahren gemäß der Erfindung Arbeitskraft. Die gegenwärtigen Tätigkeiten in mikrobiologischen Laboratorien umfassen das Inokulieren eines Screening-Abstrichs (üblicherweise eines von einem Patienten genommenen nasalen Abstrichs, der in einem Transportmedium enthalten ist) auf ein festes oder flüssiges Wachstumsmedium. Das Wachstumsmedium wird anschließend inkubiert, um das Wachstum von MRSA anzuregen. Diese Tätigkeit wird von Laborpersonal ausgeführt. Die Laboratorien erhalten jeden Tag zahlreiche Abstriche zum Screening nach MRSA, wodurch dies zu einem arbeits- und zeitaufwändigen Vorgang wird.

Bei einer dritten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Identifizierungsmedium bereit, das zum Screening von Proben von einem Subjekt nach dem Vorhandensein von MRSA geeignet ist, wobei das Medium flüssig oder halbfest ist und Folgendes umfasst:

  • (i) Nährstoffe, um das Wachstum von MRSA zu ermöglichen;
  • (ii) wenigstens einen Inhibitorstoff, um bevorzugt das Wachstum von Organismen, die von MRSA verschieden sind, zu hemmen; und
  • (iii) einen visuellen Indikatorstoff, der eine visuelle Anzeige des Wachstums von MRSA, wenn vorhanden, erzeugt.

Das Medium ist vorzugsweise anfangs farblos und durchscheinend, und wird gefärbt, wenn während der Inkubation des Mediums MRSA-Organismen wachsen. Andere bevorzugte Eigenschaften des Mediums sind wie oben im Zusammenhang der ersten und der zweiten Ausführungsform der Erfindung beschrieben. Die Erfindung wird nun durch veranschaulichende Beispiele weiter beschrieben, sowie durch Verweis auf die begleitende Zeichnung 1, die ein Fließdiagramm darstellt, welches das Verfahren im Stand der Technik mit dem Verfahren gemäß der Erfindung vergleicht.

Beispiel 1

Eine Formulierung eines flüssigen Mediums (Brühe), das zur Verwendung bei den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung geeignet ist.

Das flüssige Medium wird Folgendes enthalten:
eine nährende Brühengrundlage, wie z. B. Trypton-Soja-Brühe, Nährstoffbrühe;
wenigstens einen Stoff zum Hemmen des Wachstums von Organismen, die von MRSA verschieden sind, wie z. B. Meticillin, Oxacillin, verschiedene Cephalosporine oder Cephamycine;
wenigstens einen Stoff zum Hemmen des Wachstums von Organismen, die von Staphylococcus aureus verschieden sind. Solche Stoffe umfassen Polymixin B, Colistinsulfat, Aztreonam, Lithiumchlorid, Deferoxaminmesylat, Amphotericin B, Fluconazol, Anisomycin und andere fungizide Verbindungen; und
wenigstens eine Indikatorverbindung, um das Wachstum von MRSA von anderen Organismen zu unterscheiden. Dies kann ein Indikator des pH-Werts oder einer Redoxänderung sein, die sich aus der Fermentation von Kohlenhydrat, das in dem Medium enthalten ist, ergibt. Solche Indikatoren könnten Phenolrot, Neutralrot, Bromcresolpurpur, Bromthymolblau und Anilinblau umfassen.

Bei einem weiteren Beispiel kann der Indikator durch wenigstens eine chromogene Verbindung zum Nachweisen der für Staphylococcus aureus spezifischen Enzymaktivität ersetzt sein. Beispiele dafür sind Indoxylphosphat-Chromogene, die Phosphataseaktivität nachweisen.

Bei einer weiteren Formulierung kann der Indikator durch wenigstens eine fluorogene Verbindung zum Nachweisen der für Staphylococcus aureus spezifischen Enzymaktivität ersetzt sein. Ein Beispiel dafür ist das 4-Methylumbelliferylphosphat-Fluorogen, das Phosphataseaktivität nachweist.

Eine Beispielformulierung ist wie folgt: Typische Zusammensetzung pro Liter Medium:

Pepton10–15 gRindfleischextrakt1–5 gMannitol5–15 gNatriumchlorid50–75 gPhenolrot20–30 mgOxacillin4–6 mgPolymixin B10–15 mgAztreonam10–25 mg

Beispiel 2

Eine Formulierung eines halbfesten Mediums, das zur Verwendung bei den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung geeignet ist.

Das halbfeste Medium wird Folgendes enthalten:
eine nährende Brühengrundlage, wie z. B. Trypton-Soja-Brühe oder Nährmittelbrühe, die wenigstens ein Geliermittel enthält. Solche Geliermittel könnten Agar, Agarose, SephadexTM oder Gelatine umfassen. Es wäre ein Konzentrationsbereich erforderlich, der eine Gelstärke ergibt, die das Verschütten des Mediums aus dem Kulturröhrchen oder der Kulturflasche verhindert und optimalen Kontakt des Mediums mit dem Tupfer erlaubt. Ein Beispiel dafür ist eine Agarkonzentration zwischen 1 und 8 Gramm pro Liter;
wenigstens einen Stoff zum Hemmen des Wachstums von Organismen, die von MRSA verschieden sind, wie z. B. Meticillin, Oxacillin, verschiedene Cephalosporine oder Cephamycine;
wenigstens einen Stoff zum Hemmen des Wachstums von Organismen, die von Staphylococcus aureus verschieden sind. Solche Stoffe umfassen Polymixin B, Colistinsulfat, Aztreonam, Lithiumchlorid, Deferoxaminmesylat, Amphotericin B, Fluconazol, Anisomycin und andere fungizide Verbindungen; und
wenigstens eine Indikatorverbindung, um das Wachstum von MRSA von anderen Organismen zu unterscheiden. Dies kann ein Indikator des pH-Werts oder einer Redoxänderung sein, die sich aus der Fermentation von Kohlenhydrat, das in dem Medium enthalten ist, ergibt. Solche Indikatoren könnten Phenolrot, Neutralrot, Bromcresolpurpur, Bromthymolblau und Anilinblau umfassen.

Eine Beispielformulierung ist wie folgt: Typische Zusammensetzung pro Liter Medium:

Pepton10–15 gRindfleischextrakt1–5 gMannitol5–15 gNatriumchlorid50–75 gAgar2–8 gPhenolrot20–30 mgOxacillin4–6 mgPolymixin B10–15 mgAztreonam10–25 mg

Bei einem weiteren Beispiel kann der Indikator durch wenigstens eine chromogene Verbindung zum Nachweisen der für Staphylococcus aureus spezifischen Enzymaktivität ersetzt sein. Beispiele dafür sind Indoxylphosphat-Chromogene, die Phosphataseaktivität nachweisen.

Bei einem weiteren Beispiel kann der Indikator durch wenigstens eine fluorogene Verbindung zum Nachweisen der für Staphylococcus aureus spezifischen Enzymaktivität ersetzt sein. Ein Beispiel dafür ist das 4-Methylumbelliferylphosphat-Fluorogen, das Phosphataseaktivität nachweist.

Beispiel 3

Wie in den Flussdiagrammen von 1 gezeigt ist, stellt das Verfahren gemäß der Erfindung (Zeitstrahl auf der rechten Seite) ein zielgerichteteres Verfahren als das Verfahren im Stand der Technik (Zeitstrahl auf der linken Seite) bereit und gibt in der Praxis ein präsumptives Ergebnis bereits mehrere Stunden früher als das herkömmliche Verfahren im Stand der Technik.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • - US 2006/003503 [0006]