Title:
Verfahren zum Schutz von Membranen
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz von Membranen durch Behandeln mit einer wässrigen Lösung, enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung, sowie die Verwendung dieser wässrigen Lösung zum Schutz von Matrices.




Inventors:
Singer, Thorsten, Dr. (Solingen, 42719, DE)
Schlumpberger, Martin, Dr. (Solingen, 42699, DE)
Application Number:
DE102009022513
Publication Date:
12/02/2010
Filing Date:
05/25/2009
Assignee:
QIAGEN GmbH (Hilden, 40724, DE)
International Classes:



Foreign References:
EP0819696
Claims:
1. Verfahren zum Schutz von Membranen durch Behandlung mit einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung.

2. Verwendung einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung zum Schutz von Membranen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein negativ geladenes Detergens ist und/oder mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen aufweist.

4. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die OH-Gruppen alkoholische OH-Gruppen sind.

5. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranen für die Immobilisierung von Nukleinsäuren verwendet werden.

6. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Imprägnierungsverfahren und/oder die Verwendung eine Verwendung zur Imprägnierung ist.

7. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren und/oder die Verwendung nach der Behandlung mit der wässrigen Lösung einen Trocknungsschritt umfasst.

8. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein Feststoff ist.

9. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen ein Zuckeralkohol ist.

10. Verfahren und/oder Verwendung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Sorbitol, Xylitol, Lactitol, Threit, Erythrit, Mannitol, Isomalt, Inosit, Palmitat und/oder Citrat oder einer Mischung daraus.

11. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das negativ geladene Detergenz ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Fettalkoholsulfate, insbesondere Natriumdodecylsulfat (SDS), und/oder Alkylbenzolsulfonsäuren und/oder -sulfonate, insbesondere Natriumdodecylbenzolsulfonat, Benzolsulfonsäure, Dodecylbenzolsulfonat, Ammoniumdodecylbenzolsulfonat, und/oder N-Lauroylsarcosin oder einer Mischung daraus.

12. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung mindestens eine Mischung aus mindestens einem negativ geladenen Detergens und mindestens einer wasserlöslichen, nukleophilen Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen enthält.

13. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung ergänzend eine Verbindung, die das Wachstum von Mikroorganismen verhindert, enthält.

14. Verfahren und/oder Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzliche Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Natriumazid, Thiomersal, Phenol, Benzylalkohol und/oder Kresol.

15. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung von ≥ 1 Sekunde bis ≤ 60 Minuten erfolgt.

16. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bei einer Temperatur von ≥ 5°C bis ≤ 45°C stattfindet.

17. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bei einem pH von ≥ 4,5 bis ≤ 9,5 erfolgt.

18. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung in einer Konzentration von ≥ 0,5 bis ≤ 20% vorliegt.

Description:
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Verwendung zum Schutz von Matrices, wie beispielsweise Membranen, insbesondere Silikamembranen. Die Vorrichtung sowie die Verwendung sind beispielsweise für Anwendungszwecke in der Biochemie, Molekularbiologie, Molekulargenetik, Mikrobiologie, medizinischen Diagnostik oder forensischen Medizin geeignet.

Technischer Hintergrund

Matrices, insbesondere Membranen, wie beispielsweise Silikamembranen, sind im Gebiet der Biochemie, Molekularbiologie, Molekulargenetik, Mikrobiologie, medizinischen Diagnostik oder forensischen Medizin weit verbreitet und werden üblicherweise zur Aufreinigung/Isolierung von Biomolekülen eingesetzt. Eine häufig eingesetzte Methode ist z. B. der Einsatz bei der Isolierung von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA.

Hierzu wird eine Probe, die die zu isolierende DNA und/oder RNA enthält, beispielsweise in Gegenwart eines sog. „chaotropen” Reagens an die (Aufreinigungs-)Matrix gebunden. Die übrigen Bestandteile der Probe können anschließend durch Spülen und Waschen entfernt werden. Anschließend wird die DNA bzw. RNA freigesetzt und untersucht.

Im Zuge von internen Untersuchungen der Anmelderin ist nun aufgefallen, dass bei einigen, insbesondere kommerziell vertriebenen Matrices, insbesondere wenn diese in Form von Membranen vorliegen, das Problem auftritt, dass vereinzelt die Fähigkeit, Nukleinsäuren zu binden mit der (Lager-)-Zeit abnimmt. Dies gilt insbesondere, wenn diese bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen gelagert werden. Dieses Problem kann zwar durch eine Lagerung bei 4°C gemindert, aber nicht vollständig verhindert werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen, sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zumindest weitgehend zu überwinden und insbesondere für eine weite Spanne von Anwendungen ein Verfahren sowie eine Verwendung zu schaffen, durch die Matrices vor Alterung geschützt werden können.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird ein Verfahren zum Schutz von Membranen durch Behandeln mit einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung vorgeschlagen.

Die Aufgabe wird ebenfalls durch eine Verwendung gemäß Anspruch 2 der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird die Verwendung einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung zum Schutz von Membranen vorgeschlagen.

Unter dem Term „Alterung” von Matrices, wie insbesondere von Membranen, wird im Sinne der vorliegenden Erfindung der Verlust der Bindefähigkeit von Nukleinsäuren unter chaotropen Bedingungen an eine entsprechende Matrix verstanden. Die Erfinder vermuten, dass die Ursache hierfür die längere Lagerung der Matrices in Gegenwart verschiedener Plastikmaterialien, bzw. in Form fertig assemblierter Spinsäulen, sein kann. So kann es zu Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen, wie zum Beispiel Weichmachern oder sonstigen Additiven und/oder Styrolen oder kurzkettigen Aliphaten, kommen. Dies kann im Extremfall zur völligen Hydrophobizität der Matrix, verbunden mit drastischen Ausbeuteverlusten in verschiedenen Nukleinsäureaufarbeitungs-Protokollen führen, da diese Ausdünstungen mit hoher Wahrscheinlichkeit an die hydrophile Oberfläche der Matrix binden können.

Unter dem Term „Nukleinsäure” im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere – aber nicht darauf beschränkt – natürliche, vorzugsweise lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren wie RNA, insbesondere mRNA, einzelsträngige und doppelsträngige virale RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder Ribozyme, genomische, bacterielle oder virale DNA (einzelsträngig und doppelsträngig), chromosomale und episomale DNA, frei zirkulierende Nukleinsäure und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, beispielsweise Plasmide oder Oligonukleotide, insbesondere für die PCR verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digoxigenin, Biotin oder Fluoreszensfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder sogenannte LNAs (locked nucleic acids) oder PNAs („peptide nucleic acids”) verstanden.

Unter dem Term „Matrices” werden insbesondere – aber nicht darauf beschränkt – feste Phasen, die in der Lage sind Biomoleküle, vorzugsweise Nukleinsäuren, reversibel zu binden, verstanden. Eine solche feste Phase ist im Sinne der Erfindung bevorzugt eine Membran, besonders bevorzugt eine Silikamembran. Aber auch Filtermaterialien mit mineralischen Bestandteilen, wie Metalloxiden, insbesondere Aluminiumoxid, Nitride, Carbide, insbesondere Siliciumcarbid, oder hydrophile Partikel, die in der Lage sind, lose oder feste Packungen zu bilden, sind als Matrices im Sinne der Erfindung zu verstehen Unter dem Term „Immobilisierung” im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere – aber nicht darauf beschränkt – eine reversible Immobilisierung an eine geeignete feste Phase verstanden.

Unter dem Term „nukleophil” wird die Fähigkeit eines negativ polarisierten Moleküls, ein positiv polarisiertes oder geladenes Atom in einem Molekül unter Ausbildung einer kovalenten Bindung anzugreifen, verstanden. Typische Nukleophile sind oft negativ geladen oder besitzen zumindest ein freies Elektronenpaar in einem energiereichen Orbital.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein negativ geladenes Detergens und/oder weist mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen auf.

Das erfindungsgemäße Verfahren und/oder die erfindungsgemäße Verwendung beinhalten die Behandlung mit einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung, da eine solche Verbindung ähnliche chemische Eigenschaften wie die feste Phase selbst aufweist und somit höchstwahrscheinlich in der Lage ist, deren Oberfläche, z. B. die Oberfläche einer Silikamembran, „nachzuahmen”.

Die Gründe für die überraschende Wirkung des Verfahrens und/oder der Verwendung der vorliegenden Erfindung sind bisher noch nicht bekannt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung vermuten jedoch, dass das Verfahren und/oder die Verwendung der vorliegenden Erfindung das Abfangen der für die Alterung der Matrices verantwortlichen bereits erwähnten Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen bewirken. Sie vermuten, dass möglicherweise die wasserlösliche, nukleophile Verbindung die Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen binden kann. Auf diese Weise wird die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung höchstwahrscheinlich anstelle der Matrix von den Ausdünstungen angegriffen.

Ein derartiges Verfahren und/oder eine derartige Verwendung bieten für eine weite Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindungen mindestens einen der folgenden Vorteile:

  • – Der Schutz der festen Phase resp. der Matrix verläuft mittels eines einfachen und sehr schnellen Arbeitsschritts, da die Behandlung eine einfache Tränkung der Matrix in einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung ist.
  • – Das Verfahren und/oder die Verwendung der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise protektiv (Imprägnierung der Matrix), dass heißt die Imprägnierung erfolgt vor der Lagerung der Matrix. Somit bedeutet dies keinen zusätzlichen Arbeitsschritt für den Endverbraucher.
  • – Es kann durch die Imprägnierung eine gleichbleibende Qualität und Funktion der Matrix gewährleistet werden.
  • – Bei den meisten Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindung ist der Schutz so vollständig, dass auf eine Lagerung bei kalten Temperaturen verzichtet werden kann.
  • – Die Reproduzierbarkeit in der Anwendung steigt dadurch signifikant.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Matrices hydrophil. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Matrices hydrophile Membranen. Ein Beispiel zur Bindung von Nukleinsäuren an hydrophile Membranen erläutert das sogenannte „Boom-Verfahren” (EP819696) anhand von Silikamembranen. Zur selektiven Bindung von Nukleinsäuren werden Proben in einem Lysepuffer, das eine chaotrope Substanz, wie zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat, enthält, lysiert. Dabei werden nicht nur die Zellen lysiert, sondern Proteine werden auch denaturiert und inaktiviert. Die Nukleinsäuren werden freigesetzt und binden an die OH-Gruppen der Silikamembran. Die übrigen Bestandteile der Probe können anschließend durch Waschen entfernt werden. Die DNA bzw. RNA kann schließlich für die anschließende Analyse wieder freigesetzt werden.

Bevorzugte hydrophile Membranen sind demnach insbesondere Silikamembranen, auch bekannt als Glasfaserfilter, Quarz- oder Glaswolle, aber auch Filtermembranen mit oder ohne funktionellen Gruppen aus natürlichen oder synthetischen organischen Polymeren, wie regenerierte Cellulose, Cellulose-Acetat, Cellulose-Nitrat, Polyamid oder Poly(ether)sulfon.

Die Bindung von Nukleinsäuren zum Beispiel an die Silikaoberfläche geschieht über Wasserstoffbrücken zu den Si-OH-Gruppen (Silanolgruppen) der Silikamembran. An diese Si-OH-Gruppen können vermutlich auch die bereits erwähnten Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen binden und somit zur Hydrophobizität der Matrix führen. Ebenso wie die Silikamembran über die Si-OH-Gruppen ist die erfindungsgemäße wasserlösliche Verbindung aufgrund ihrer nukleophilen Eigenschaft in der Lage, ein Elektronenpaar für die Bildung einer kovalenten Bindung zur Verfügung zu stellen. Die Erfinder vermuten, dass durch die Behandlung mit der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung die erfindungsgemäße Verbindung anstelle der Matrixoberfläche von den Ausdünstungen der Kunststoffbestandteile angegriffen wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen OH-Gruppen alkoholische OH-Gruppen. OH als klassische Lewisbase ist nukleophil. Es hat freie Elektronenpaare, die es für Bindungen zur Verfügung stellen kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Membranen für die Immobilisierung von Nukleinsäuren verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Imprägnierungsverfahren und/oder die erfindungsgemäße Verwendung eine Verwendung zur Imprägnierung. Die Membran wird vor der Lagerung mit einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung behandelt und dadurch vor der beschriebenen Alterung geschützt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen das erfindungsgemäße Verfahren und/oder die erfindungsgemäße Verwendung nach der Behandlung mit der wässrigen Lösung einen Trocknungsschritt. Dieser findet bevorzugt bei einer Temperatur von ≥ 5°C bis ≤ 45°C statt, wobei Temperaturen von 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C oder 30°C bevorzugt sind. Prinzipiell ist der Temperaturbereich nicht nach oben oder unten begrenzt, jedoch sind Temperaturen bis 45°C aus Handhabbarkeitsgründen bevorzugt. Die Dauer des Trocknungsschrittes findet bevorzugt zwischen ≥ 1 s bis ≤ 60 min statt, ist prinzipiell aber nicht nach oben oder unten begrenzt. Aus Handhabbarkeitsgründen bzw. Produktionsgründen sind Zeiten von 1 min, 2 min, 3 min, 4 min oder bis zu 5 min bevorzugt. Dieser Trocknungsschritt ist aus Handhabbarkeitsgründen, beispielsweise im Fall einer Behandlung vor dem Assemblieren von Spinsäulen, und/oder aus lagerungstechnischen Gründen vorteilhaft.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein Feststoff. So kann die wasserlösliche, nukleophile Verbindung nach einem Trocknungsschritt als dünne Imprägnierungsschicht bis zur Verwendung auf der Matrixoberfläche verbleiben. Aufgrund der wasserlöslichen Eigenschaft der nukleophilen Verbindung ist auch kein separater Waschschritt zur Entfernung der wasserlöslichen, nukleophilen Verbindung erforderlich, da die Verbindung bei dem Kontakt mit der Nukleinsäureprobe gelöst wird und somit bei den üblichen Waschschritten einer Nukleinsäure-Aufreinigungsprozedur entfernt werden kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen ein Zuckeralkohol. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Sorbitol, Xylitol, Lactitol, Threit, Erythrit, Mannitol, Isomalt, Inosit, Palmitat und/oder Citrat oder einer Mischung daraus.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße wässrige Lösung mindestens eine Mischung aus mindestens einem negativ geladenen Detergens und mindestens einer wasserlöslichen, nukleophilen Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das negativ geladene Detergens ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Fettalkoholsulfate, insbesondere Natriumdodecylsulfat (SOS), und/oder Alkylbenzolsulfonsäuren und/oder -sulfonate, insbesondere Natriumdodecylbenzolsulfonat, Benzolsulfonsäure, Dodecylbenzolsulfonat, Ammoniumdodecylbenzolsulfonat, und/oder N-Lauroylsarcosin („Sarcosyl”) oder einer Mischung daraus.

Die erfindungsgemäße wasserlösliche Verbindung ist, wie bereits erläutert wurde, aufgrund ihrer nukleophilen Eigenschaft höchstwahrscheinlich in der Lage, die Matrixoberfläche „nachzuahmen”. Auf diese Weise wird vermutlich die erfindungsgemäße Verbindung anstelle der Matrixoberfläche von den Ausdünstungen der Kunststoffbestandteile angegriffen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße wässrige Lösung ergänzend eine Verbindung, die das Wachstum von Mikroorganismen verhindert. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Natriumazid, Thiomersal, Phenol, Benzylalkohol und/oder Kresol.

Die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung findet bevorzugt ≥ 1 Sekunde bis ≤ 60 Minuten statt. Prinzipiell ist die Dauer der Behandlung nicht nach oben begrenzt, jedoch hat sich bei den meisten Anwendungen herausgestellt, dass eine Behandlung von länger als 5 Minuten, keine wesentlich verbesserte Bindefähigkeit hervorruft. Somit ist die bevorzugte Behandlungsdauer von 1 min, 2 min, 3 min, 4 min bis hin zu 5 Minuten.

Die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung findet weiterhin bevorzugt bei einer Temperatur von ≥ 5°C bis ≤ 45°C statt, wobei Temperaturen von 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C 26°C, 27°C, 28°C, 29°C oder 30°C bevorzugt sind. Prinzipiell ist der Temperaturbereich nicht nach oben oder unten begrenzt, jedoch sind Temperaturen bis 45°C aus Handhabbarkeitsgründen bevorzugt.

Weiterhin beträgt der pH der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung bevorzugt ≥ 4,5 bis ≤ 9,5, besonders bevorzugt ≥ 6 bis ≤ 8 und ganz besonders bevorzugt bei etwa 7. D. h. der pH der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung ist am meisten bevorzugt im Wesentlichen neutral.

Weiterhin liegt die erfindungsgemäße wässrige Lösung bevorzugt in einer Konzentration von ≥ 0,5 bis ≤ 20%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von ≥ 1 bis ≤ 10% und ganz besonders bevorzugt in einer Konzentration von ≥ 1 bis ≤ 5% vor.

Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden Komponenten unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung, den zugehörigen Figuren und Ausführungsbeispielen, in denen – exemplarisch – mehrere Ausführungs- sowie Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung dargestellt sind.

1 zeigt den Versuchsaufbau zur Induktion der Membranalterung.

2 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich Plasmid DNA von Silikamembranen, die erfindungsgemäß vorbehandelt wurden, bzw. Vergleichsbeispiele.

3 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich Plasmid DNA von Silikamembranen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Sorbitol oder SDS vorbehandelt wurde, bzw. Vergleichsbeispiele.

4 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich RNA von Silikamembranen, die erfindungsgemäß vorbehandelt wurden, bzw. Vergleichsbeispiele.

5 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich RNA von Silikamembranen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Sorbitol oder SDS vorbehandelt wurde, bzw. Vergleichsbeispiele.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert, soll aber nicht auf diese beschränkt werden.

Dabei wurde wie folgt vorgegangen:

Beispiel 1:

Silikamembranscheiben (GF51, Fa. Pall) wurden ausgestanzt und jeweils in einer wässrigen Lösung der entsprechenden Substanz getränkt. Die entsprechenden (verwendeten) Substanzen werden im Folgenden genannt. Die Tränkung erfolgte für 5 Minuten bei Raumtemperatur, d. h. bei ca. 20°C. Anschließend wurden die Membranscheiben kurz getrocknet und bei 50°C in Gegenwart einer größeren Anzahl von Fritten (Vyon F, Polyethylen; Fa. Köpp) inkubiert. Durch die Inkubation wurde die Alterung der Membranscheiben induziert. Die Inkubation erfolgte für 7 Tage (2 und 4) bzw. 3 Wochen (3 und 5). Der Versuchsaufbau hierzu ist in 1 dargestellt. Ein geschlossenes Becherglas (1) wird mit einer großen Anzahl von Fritten gefüllt (3). Auf die Fritten werden dann offene Aluschiffchen, in denen sich die behandelten Membranenscheiben befinden (2), gelegt.

Die Membranscheiben wurden dann direkt vor dem Test (auf Bindefähigkeit) in Mini Spinsäulen assembliert (Aufbau von unten nach oben: Fritte/1 × Membran GF51/Spannring).

Für die DNA Testung wurden 10 μg pUC21 Plasmid in 500 μl Puffer PB (QIAGEN) gelöst, auf die Säule gebracht und durch. die Membran zentrifugiert. Anschließend wurde mit 700 μl Puffer PE (QIAGEN) gewaschen, trocken zentrifugiert und mit 200 ml Puffer EB (QIAGEN) eluiert. Die Eluate wurden photometrisch bei 260 nm vermessen.

Die „Wiederfindungsrate” der Silikamembranen ist in Tabelle 1 und 2 zu sehen. Dabei ist jeweils die Bindefähigkeit einer neuen, einer unbehandelten und einer mit Sorbitol, NaCl, SDS oder Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) vorbehandelten Membranscheibe gezeigt. Tabelle 1: Vergleich verschiedener Chemikalien im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von Plasmid DNA

Probe1 μg/μl2 μg/μlMW [μg]unbehandel1,40,20,810% Sorbitol9,38,89,055 M NaCl2,21,21,720% SDS8,68,88,715% CTAB0,60,20,4neu5,87,46,6
  • MW = Mittelwert

Als Ergebnis ist festzustellen, dass die unbehandelten Membranen stark hydrophob waren und ihre Bindefähigkeit nahezu verloren haben. Auch die Behandlung mit NaCl oder dem kationischen Detergens CTAB brachte keine Verbesserung.

Membranen, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit Sorbitol und/oder SDS vorbehandelt wurden, haben überraschenderweise ihre Bindefähigkeit behalten und zeigen keinen Alterungseffekt.

In separaten Experimenten (in 2 nicht gezeigt) wurden zudem PEG 600 und PEG 4000 getestet. Bei beiden Substanzen blieben die Membranen zwar im Gegensatz zu unbehandelten Membranen hydrophil, zeigten aber dennoch keine verbesserte Bindefähigkeit nach der Lagerung.

Die Bindefähigkeit von mit unterschiedlichen Konzentrationen (1%, 5% oder 10%) an Sorbitol oder SDS vorbehandelten Silikamembranen ist in Tabelle 2 und 3 zu sehen. Tabelle 2: Vergleich verschiedener Konzentrationen an SDS und Sorbitol im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von Plasmid DNA

Probe1 μg/μl2 μg/μlMW [μg]unbehandelt0,50,30,4H2O0,80,50,71% Sorbitol7,37,27,35% Sorbitol8,28,28,210% Sorbitol9,08,28,61% SDS9,28,28,75% SDS8,28,88,510% SDS7,97,67,8neu8,18,78,4
  • MW = Mittelwert

Als Ergebnis ist festzustellen, dass die unbehandelten bzw. in Wasser getränkten Membranscheiben ihre Bindefähigkeit nahezu vollständig verloren haben. Im Gegensatz dazu lagen alle mit Sorbitol oder SDS getränkte Membranen im Bereich der nicht gelagerten Referenz.

Beispiel 2:

Die Silikamembranscheiben wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben vorbehandelt und in die Mini Spinsäulen assembliert.

Für den Test wurden pro Präparation 5 × 105 HeLa-Zellen in 350 μl RLT Puffer homogenisiert, mit demselben Volumen 70%-igem Ethanol gemischt, auf die vorbereiteten Spinsäulen aufgebracht und durch die Membranen zentrifugiert. Die Spinsäulen wurden entsprechend der normalen RNeasy-Prozedur aufgearbeitet (QIAGEN RNeasy Mini Handbuch; Protokoll: Purification of Total RNA from Animal Cells Using Spin Technology). Die Elution erfolgte in 30 μl RNase-freiem Wasser. Die Eluate wurden photometrisch bei 260 nm vermessen.

Die „Wiederfindungsrate” der Silikamembranen ist in Tabelle 3 und 4 zu sehen. Dabei ist jeweils die RNA-Bindefähigkeit einer normalen RNeasy Säule (QIAGEN), einer neuen, einer unbehandelten und einer mit Sorbitol, NaCl, SDS oder Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) vorbehandelten Silikamembran gezeigt. Tabelle 3: Vergleich verschiedener Chemikalien im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von RNA

Probe1 μg/μl2 μg/μlMW [ng]StandartabweichungRNy Std. Spin12676101,035,36frisch115123119,05,66unbehandelt634755,011,3115% CTAB486,02,835 M NaCl234936,018,3820% SDS172194183,015,5610% Sorbitol16499131,545,96
  • MW = Mittelwert; RNy Std. Spin = normale RNeasy Säule (2 Membranlagen)

Überraschenderweise zeigten wie in Beispiel 1 auch hier die gemäß der vorliegenden Erfindung mit SDS und/oder Sorbitol behandelten Membranen keinerlei Alterungseffekt.

Die Behandlung mit NaCl zeigte dagegen keine signifikante Verbesserung, und die Behandlung mit CTAB führte sogar zu einer signifikanten Ausbeuteverschlechterung.

Die RNA-Bindefähigkeit von mit unterschiedlichen Konzentrationen (1%, 5% oder 10%) an Sorbitol oder SDS vorbehandelten Silikamembranen ist in Tabelle 4 und 5 zu sehen. Tabelle 4: Vergleich verschiedener Konzentrationen an SDS und Sorbitol im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von RNA

ProbeMW [μg]Standartabweichungfrisch4,581,57H2O2,510,27unbehandelt2,410,621% Sorbitol4,600,105% Sorbitol4,971,5810% Sorbitol6,010,541% SDS6,071,895% SDS5,250,3310% SDS5,800,16
  • MW = Mittelwert

Alle gemäß der vorliegenden Erfindung mit Sorbitol und/oder SDS getränkten Membranen lagen im Bereich der nicht gelagerten Referenzmembran.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • - EP 819696 [0016]