Title:
Verfahren zum Nachweis von Mykorrhizapilzen
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur Analyse einer Probe, die pflanzliches Wurzelgewebe aufweist, auf den Gehalt an Mykorrhizapilz mit den Schritten
Isolierung von Gesamt-DNA aus der Probe,
Denaturieren der Gesamt-DNA,
Kontaktieren der Gesamt-DNA mit einem einzelsträngigen Oligonukleotid,
wobei die denaturierte isolierte Gesamt-DNA unverändert mit dem einzelsträngigen Oligonukleotid kontaktiert wird,
das einzelsträngige Oligonkldeotid durch Bindung eines ersten seiner zwei Enden an einem Träger immobilisiert ist,
nach Kontaktieren der Gesamt-DNA mit dem immobilisierten Oligonukleotid ungebundene DNA durch Waschen vom Träger entfernt wird, und
mit Detektion der Intensität eines Signals, das durch Bindung eines Teils der Gesamt-DNA an das immobilisierte Oligonukleotid verursacht ist, dadurch gekennzeichnet, dass
das Oligonukleotid zusätzlich an seinen gegenüberliegenden Enden jeweils zueinander komplementäre Sequenzabschnitte aufweist und das Oligonukleotid an seinem dem ersten Ende gegenüberliegenden zweiten Ende eine detektierbare Markierung aufweist.




Inventors:
Florschütz, Kristina, Dr. (06484, Quedlinburg, DE)
Watzke, Katja, Dr. (06792, Sandersdorf, DE)
Watzke, Roland, Dr. (06842, Dessau-Roßlau, DE)
Kunze, Gotthard (Gatersleben, DE)
Hacker, Rainer, Dr. (06749, Bitterfeld, DE)
Application Number:
DE102009017965A
Publication Date:
11/04/2010
Filing Date:
04/21/2009
Assignee:
AMYKOR GmbH, 06803 (DE)
Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK), 06466 (DE)
International Classes:



Foreign References:
WO2005017193A12005-02-24
Other References:
Datenbank Genbank bei NCBI, Eintragungsnummer DQ063587.1 [recherchiert am 24.11.2009]
Datenbank Genbank bei NCBI, Eintragungsnummer EF488828.1 vom 01.08.2007 [recherchiert am 24.11.2009]
Sequenzvergleich von SEQ ID No.56 mit Eintragungsnummer EF488828.1 aus (2)
Sequenzvergleich von SEQ ID No.73 mit Eintragungsnummer DQ063587.1 aus (4)
Attorney, Agent or Firm:
Taruttis, Stefan, Dipl.-Ing. Dr.rer.nat., 30159, Hannover, DE
Claims:
1. Verfahren zur Analyse einer Probe, die pflanzliches Wurzelgewebe aufweist, auf den Gehalt an Mykorrhizapilz mit den Schritten
Isolierung von Gesamt-DNA aus der Probe,
Denaturieren der Gesamt-DNA,
Kontaktieren der Gesamt-DNA mit einem einzelsträngigen Oligonukleotid,
wobei die denaturierte isolierte Gesamt-DNA unverändert mit dem einzelsträngigen Oligonukleotid kontaktiert wird,
das einzelsträngige Oligonkldeotid durch Bindung eines ersten seiner zwei Enden an einem Träger immobilisiert ist,
nach Kontaktieren der Gesamt-DNA mit dem immobilisierten Oligonukleotid ungebundene DNA durch Waschen vom Träger entfernt wird, und
mit Detektion der Intensität eines Signals, das durch Bindung eines Teils der Gesamt-DNA an das immobilisierte Oligonukleotid verursacht ist, dadurch gekennzeichnet, dass
das Oligonukleotid zusätzlich an seinen gegenüberliegenden Enden jeweils zueinander komplementäre Sequenzabschnitte aufweist und das Oligonukleotid an seinem dem ersten Ende gegenüberliegenden zweiten Ende eine detektierbare Markierung aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zusätzlich oder alternativ zu pflanzlichem Wurzelgewebe Erde aufweist.

3. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Gesamt-DNA Hemmstoffe enthält, die die Aktivität von DNA-Polymerase hemmen.

4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Mykorrhizapilz ein arbuskulärer Mykorrhizapilz ist.

5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamt-DNA isoliert wird durch Suspendieren der Probe in wässrigem tensidhaltigem Puffer, Mahlen der suspendierten Probe, Abtrennen einer wässrigen Phase von Feststoffen und Ausfallen von Gesamt-DNA aus der abgetrennten wässrigen Phase.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrige Puffer Phosphatpuffer ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer als Tensid Natriumdodecylsulfat enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennte wässrige Phase vor dem Ausfällen mit einem 1,5- bis 3-fachen Volumen wässriger NaJ-Lösung und Silicagel versetzt wird, inkubiert wird, und das Ausfällen durch Zentrifugation erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgefällte Gesamt-DNA vor der Resuspendierung mit wässrigem Puffer gewaschen wird.

10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung des Oligonukleotids an den Träger durch ein Paar von Bindungsmolekülen erfolgt, von denen ein Bindungspartner am ersten Ende des Oligonukleotids gebunden ist und der andere Bindungspartner am Träger gebunden ist.

11. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung ein Farbstoff ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung ein Hapten ist, ein zugesetzter Enzym-gekoppelter Antikörpers an das Hapten bindet, und die Detektion nach enzymatischer Umsetzen eines Substrats für das Enzym zu einem Farbstoff erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung ein Hapten ist, und die Detektion nach Zusetzen eines für das Hapten spezifischen Antikörpers, der ein gekoppeltes Enzym aufweist, Entfernen ungebundenen Antikörpers und enzymatisches Umsetzen eines zugesetzten Substrats zu einem Farbstoff erfolgt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion durch Messung der Änderung der Oberflächenplasmonresonanz des Trägers erfolgt, oder durch Messen der Änderung der Schwingungsfrequenz eines Trägers erfolgt, der einen Piezokristall aufweist oder aus Piezokristall besteht.

15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, die Gesamt-DNA in zumindest 2 Aliquots mit jeweils unterschiedlicher Konzentration an Gesamt-DNA in getrennten parallelen Ansätzen mit dem Oligonukleotid kontaktiert wird.

16. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Aliquots der Gesamt-DNA in unterschiedlichen Mengen mit DNA-Fragment dotiert werden, das einen zum Oligonukleotid komplementären Abschnitt enthält.

17. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz zumindest einer der Seq.-ID Nrn. 1 bis 81 enthält.

Description:
Verfahren zum Nachweis von Mykorrhizapilzen

Die Erfindung betrifft ein quantitatives Verfahren zur Analyse der Anwesenheit von Mykorrhizapilzen in Proben, bevorzugt von arbuskulären Mykorrhizapilzen, insbesondere in Proben mit einem Gehalt an pflanzlichen Wurzeln und/oder an Erde, wobei die Probe und eine daraus isolierte Fraktion Hemmstoffe enthalten können, die eine zuverlässige PCR verhindern.

Stand der Technik

Die US 5,434,048 A beschreibt eine Oligonukleotidsonde mit einer für arbuskuläre Endomykorrhizapilze spezifischen Sequenz, sowie den Nachweis spezifischer DNA durch Kontaktieren der Oligonukleotidsonde mit Nukleinsäuren, die aus einer Probe isoliert sind. Die Beispiele beschreiben ausschließlich den Nachweis von pilzspezifischer DNA durch Amplifikation eines DNA-Abschnitts aus einer DNA-Probe mittels PCR, bei der die Oligonukleotidsonde als ein spezifischer Primer eingesetzt wird. Die US 5,434,048 A enthält keine Beschreibung für ein Analyseverfahren mittels der spezifischen Oligonukleotidsonde, das ohne Amplifikation von DNA funktioniert. Nachweisverfahren, bei denen mittels PCR ein spezifischer Abschnitt von Gesamt-DNA vervielfältigt werden soll, wobei die DNA aus einer erdhaltigen Probe isoliert ist, sind dahingehend nachteilig, dass Hemmstoffe, die die Amplifikationsreaktion beeinträchtigen, z. B. Huminsäuren, in isolierter Gesamt-DNA enthalten sind, bzw. nur mit großem Aufwand aus solcher DNA entfernbar sind.

Die WO 2005/017193 A1 beschreibt den Nachweis von Nukleinsäuremolekülen aus Proben, die ohne weitere Aufreinigung erhalten wurden. Für den Nachweis wird ein erstes Oligonukleotid als Fänger immobilisiert, an welchen die Probe binden kann. Für den Nachweis wird angegeben, dass bevorzugt eine zweite Sonde, die eine Markierung aufweist, mit der gebundenen Probe hybridisiert wird, und anschließend die Markierung nachgewiesen wird.

Bockisch et al., Nucleic Acids Research 2005, Vol. 33, Nr. 11, e101, 1–8, beschreiben die Hybridisierung einer einzelsträngigen Nukleinsäure, die an einem Ende an einen Träger gebunden ist und am gegenüberliegenden Ende eine Markierung aufweist, mit zugesetzter DNA. Die Nukleinsäure weist jeweils endständig komplementäre Abschnitte auf, so dass eine partielle intramolekulare Hybridisierung die Markierung in die Nähe des Trägers bringt. Die Detektion erfolgt dadurch, dass die Markierung auf Grund der Hybridbildung vom Träger beabstandet wird und dadurch für ein Antikörperkonjugat zugänglich wird. In Beispielreaktionen wurde eine Sonde eingesetzt, die für bakterielle RNA spezifisch war, insbesondere für bakterielle ribosomale RNA. Für den Nachweis war es erforderlich, die rRNA zu fragmentieren.

Reuter et al., Bioresour. Technol. 2009, 3343–9, beschreiben den Nachweis von DNA-Fragmenten aus Kompost mittels PCR und betonen, dass die Reinheit von DNA aus Kompostproben für die Analyse mittels PCR kritisch ist. Für die Aufreinigung von DNA aus Kompost wird die Chromatographie vorgeschlagen oder der Zusatz von Rinderserumalbumin, um die Hemmwirkung der Huminsäuren zu vermindern. Eine Alternative zur PCR-Analyse wird nicht in Erwägung gezogen.

Ning et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 209, 983–93, beschreiben, dass Huminsäuren wesentlich für die Hemmumg der PCR und von Microarrayanalysen bei DNA aus Bodenproben verantwortlich sind. Ning et al. zitieren, dass als verbreiteter Maßstab für die Reinheit von DNA der Erfolg einer PCR mit der DNA herangezogen wird.

Broemeling et al., JALA Charlottesv Va. 2008, 40–48, beschreiben, dass in der Forensik enzymatische Nachweisverfahren, insbesondere die PCR, häufig durch Hemmstoffe aus Proben behindert werden. Als verbreitete Hemmstoffe werden Huminsäuren für Erdproben und Indigo für Jeansproben genannt. Broemeling et al. lösen das Problem dieser Hemmstoffe, die oft gemeinsam mit DNA aus Probematerial isoliert werden, durch spezielle automatisierbare Reinigungsverfahren für die DNA.

In New Phytologist 2009, 248–260, wird die Analyse von Proteinen durch Aminosäuresequenzierung beschrieben, die aus kultiviertem, wurzelfreiem Myzel und Sporen von Glomus intraradices isoliert wurden.

Aufgabe der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Analyseverfahren zum spezifischen Nachweis der Anwesenheit von arbuskulären Mykorrhizapilzen in einer Probe, insbesondere einer erdhaltigen Probe bereitzustellen, dass die Nachteile von Nachweisreaktionen auf Basis der PCR vermeidet.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung löst die vorgenannte Aufgabe mit den Merkmalen von Anspruch 1 und insbesondere durch Bereitstellen eines Verfahrens zur Analyse einer Probe, die Erde und/oder pflanzliches Wurzelgewebe enthalten kann, auf den Gehalt an Mykorrhizapilzen, vorzugsweise arbuskulären Mykorrhizapilzen, besonders bevorzugt Glomus intraradices, durch unmittelbare Kontaktierung von Gesamt-DNA, die aus der Probe isoliert wurde und wahlweise Hemmstoffe der PCR enthalten kann, durch Hybridisierung mit zumindest einem anspruchsgemäßen einzelsträngigen Oligonukleotid mit anschließender Detektion der Hybridisierung.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet bei einfacher Durchführung, insbesondere einfacher Isolierung von DNA aus Erdproben und/oder Wurzelproben mykorrhizierter und nicht mykorrhizierter Pflanzen, eine hohe Empfindlichkeit des Nachweises von Mykorrhizapilzen, der vorzugsweise quantitativ ist. Die Robustheit des erfindungsgemäßen Verfahrens, die es auch für DNA mit einem Gehalt an Stoffen geeignet machen, die eine PCR hemmen, ergibt sich daraus, dass erfindungsgemäß Gesamt-DNA aus Erdproben und/oder Wurzelproben mykorrhizierter und nicht mykorrhizierter Pflanzen durch ein Verfahren isoliert werden kann, das die Schritte des Zellaufschlusses, insbesondere mechanisch, von in wässrigem Puffer mit einem Detergenz suspendierter Probe, Abtrennen der wässrigen Phase, Ausfällen der Gesamt-DNA aus der wässrigen Phase und Aufnehmen der gefällten Gesamt-DNA in wässriges Medium umfasst oder daraus besteht. Optional weist das Verfahren zur Isolation von Gesamt-DNA eine Extraktion der wässrigen Phase mit organischem Lösungsmittel auf und/oder die Zugabe eines Adsorptionsmittels, z. B. Kieselgel zur wässrigen Phase, das zusammen mit der Gesamt-DNA aus der wässrigen Phase ausgefällt wird. Die Gesamt-DNA kann vor der Kontaktierung mit der Oligonukleotidsonde gelagert werden, z. B. unter Kühlung und/Einfrieren, z. B. auf –70°C, –20°C bis +5°C.

Die Hybridisierung mit einer für den Mykorrhizapilz spezifischen Oligonukleotidsonde erfolgt mit der isolierten Gesamt-DNA, vorzugsweise unmittelbar, d. h. ohne weitere Reinigungsschritte.

Die Empfindlichkeit bzw. Nachweisgrenze des Verfahrens ist ca. 1 bis 10 ng ds-Gesamt-DNA aus Mykorrhizapilz, die in Mischung mit anderer DNA, z. B. aus Bakterien und Pflanzen vorliegt und z. B. in 100 μL wässriger Phase enthalten ist.

Erfindungsgemäß ist die Oligonukleotidsonde an einem Träger immobilisiert, und das Verfahren umfasst vorzugsweise den Schritt des Waschens des Trägers im Anschluss an die unmittelbare Hybridisierung mit der Gesamt-DNA, um ungebundene DNA im Wesentlichen zu entfernen. Das Oligonukleotid ist für zumindest einen arbuskulären Mykorrhizapilz spezifisch, insbesondere für Glomus intraradices, und kann z. B. ausgewählt sein aus Oligonukleotiden, die eine Sequenz entsprechend einer der Seq: ID Nrn. 1 bis 81 aufweisen oder daraus bestehen.

Als besonderen Vorteil verwendet das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse nicht die spezifische oder unspezifische Vervielfältigung von DNA-Abschnitten, beispielsweise mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), sondern enthält genau einen Hybridisierungsschritt einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz mit Gesamt-DNA, die aus der Probe isoliert ist. Der spezifische Nachweisschritt, der in dem Verfahren enthalten ist, besteht daher aus der Hybridisierung zumindest eines einzelsträngigen immobilisierten Oligonukleotids mit denaturierter Gesamt-DNA.

Das einzelsträngige Oligonukleotid ist vorzugsweise einzelsträngige DNA, PNA, oder weniger bevorzugt RNA. Die einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, vorliegend auch als einzelsträngiges Oligonukleotid und/oder als Sonde bezeichnet, ist erfindungsgemäß an einem Träger immobilisiert, beispielsweise über eine Kopplungsgruppe an seinem ersten Ende mit dem Träger verbunden, wobei das erste Ende das 5'- oder 3'-Ende der Sonde sein kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet dadurch, dass der spezifische Nachweisschritt auf die Hybridisierung des Oligonukleotids mit denaturierter Gesamt-DNA mit anschließendem Nachweis der Hybridisierung, insbesondere durch Detektion eines durch die Hybridisierung zugänglich gemachten, mit dem Oligonukleotid verbundenen Farbstoffs oder Haptens beschränkt ist, die Vervielfältigung von Abschnitten isolierter DNA, und vermeidet entsprechend Probleme, die in isolierter Gesamt-DNA enthaltene Hemmstoffe der DNA-Polymerase verursachen können. Entsprechend weist das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise die Isolierung von Gesamt-DNA aus einer Probe mittels eines chemischen und/oder mechanischen Ausschlusses auf und die Isolierung von Gesamt-DNA aus einer wässrigen Mischung der Probe durch Ausfällung der Gesamt-DNA aus der wässrigen Phase. Die Isolierung kann wahlweise den Schritt der Extraktion der wässrigen Probemischung mit einem organischen Lösungsmittel, insbesondere mit Phenol, vorzugsweise mit anschließender und/oder gleichzeitiger Extraktion mit Chloroform, umfassen, und/oder die Mischung der wässrigen Probemischung mit einem Adsorbenz, insbesondere mit Silicagel (z. B. Kieselgel), Ausfällung der Gesamt-DNA mit dem Adsorbenz und Waschen des Niederschlags mit wässrigem Puffer. Gefällte Gesamt-DNA wird nach Aufnehmen in wässriger Lösung und Denaturieren mit dem immobilisierten Oligonukleotid kontaktiert.

Auf solche Weise aus der Probe gewonnene Gesamt-DNA ist für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt, da diese Isolierung von Gesamt-DNA einfach ist und z. B. ohne Ionenaustauschchromatographie erfolgt. Diese einfache Isolierung von Gesamt-DNA kann erfolgen, da möglicherweise in der Gesamt-DNA enthaltene Hemmstoffe für eine DNA-Polymerase beim erfindungsgemäßen Verfahren keinen wesentlichen negativen Effekt haben. Denn das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die unmittelbare Hybridisierung eines Aliquots von Gesamt-DNA, die aus der Probe isoliert wurde, mit einer an einen Träger gebundenen Oligonukleotidsonde, d. h. ohne Amplifikation auf Basis der Gesamt-DNA. Für das erfindungsgemäße Verfahren kann daher Gesamt-DNA mit Hemmstoffen für die Aktivität von DNA-Polymerase, insbesondere Hemmstoffen für die Aktivität thermophiler DNA-Polymerase eingesetzt werden. Gesamt-DNA mit Hemmstoffen für die Akivität von DNA-Polymerase zeichnet sich z. B. dadurch aus, dass eine Amplifikation von Abschnitten daraus oder von Abschnitten aus zugesetzter DNA mittels Taq-DNA-Polymerase im wesentlichen keine bzw. keine spezifischen Amplifikationsprodukte ergibt. Neben Huminsäuren sind z. B. Tannine und Polyphenolverbindungen Hemmstoffe, sowie Salze, wie sie z. B. aus Proben von Kaliabraumhalden stammen.

Die isolierte Gesamt-DNA wird erfindungsgemäß denaturiert, bevor sie mit der einzelsträngigen, an einem Träger immobilisierten Oligonukleotidsonde kontaktiert wird. Vorzugsweise wird die Gesamt-DNA durch Erwärmen auf 95–100°C für 1 bis 5 min und anschließendes schnelles Abkühlen auf 0–5°C denaturiert.

Erfindungsgemäß wird ein Signal, das durch die Hybridisierung der Sonde mit einem Anteil der mit dieser kontaktierten Gesamt-DNA erzeugt wird, detektiert. Für die Detektion eines Signals, das durch die Hybridisierung der Oligonukleotidsonde mit einem Anteil der isolierten Gesamt-DNA erzeugt wird, ist das Messen eines Farbstoffs bevorzugt, der mit der Oligonukleotidsonde verbunden ist, oder das Messen eines Farbstoffs, der durch Umsetzung eines Substrats durch ein mit der Oligonukleotidsonde verbundenes Enzym erzeugt wird.

In Ausführungsformen, in denen die Oligonukleotidsonde mit einem Farbstoff verbunden ist, ist es bevorzugt, dass ein Farbstoff vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff, am zweiten Ende der Sonde angebunden ist, während ein Quencher, der vorzugsweise auf den Farbstoff abgestimmt ist, am gegenüberliegenden ersten Ende der Sonde angebunden ist. Vorzugsweise weist die Oligonukleotidsonde zusätzlich zu oder als Bestandteil der für einen arbuskulären Mykorrhizapilz spezifischen Nukleinsäuresequenz an ihrem ersten und zweiten Ende jeweils einen komplementären Abschnitt auf, sodass die Sonde mittels ihrer endständigen komplementären Abschnitte partiell unter Ausbildung einer Schleife mit sich selbst hybridisiert.

Für die Detektion kann die Oligonukleotidsonde an ihrem zweiten Ende mit einem Hapten gekoppelt sein, das in einer Hapten-spezifischen Nachweisreaktion, beispielsweise mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper nachweisbar ist, wobei das mit Antikörper gekoppelte Enzym ein Substrat zu einem Farbstoff umsetzen kann, der als Signal für die Anwesenheit von Mykorrhizapilz-DNA gemessen wird.

Besonders bevorzugt ist die Oligonukleotidsonde mit ihrem ersten Ende an einen Träger angebunden, beispielsweise über ein Paar miteinander assoziierender Kopplungspartner, von denen der eine am ersten Ende der Oligonukleotidsonde angebunden ist und der zweite am Träger. Paare solcher Kopplungspartner sind beispielsweise Biotin und Avidin bzw. Streptavidin, ein Hapten und ein für das Hapten spezifischer Antikörper, sowie kovalente Bindungen (z. B. mittels wasserlöslichem Carbodiimid oder N-Hydroxysuccimid hergestellt), Adsorption und Thiolgruppen zur Ausbildung von Disulfidbrücken.

Aufgrund der Immobilisierung der Sonde an einem Träger ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren den Schritt, ungebundene Nukleinsäuren aus der Probe durch Waschen von der Sonde zu entfernen. Das Entfernen ungebundener DNA durch Waschen im Anschluss an das Kontaktieren der Gesamt-DNA mit der an den Träger immobilisierten Oligonukleotidsonde erhöht die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher ohne Amplifikation von DNA und weist als spezifischen Nachweisschritt allein die unmittelbare Hybridisierung eines an einem Träger immobilisierten Oligonukleotids an die aus der Probe extrahierten Gesamt-DNA auf, welche Hemmstoffe für DNA-Polymerasen, z. B. Huminsäure enthalten kann.

Im Anschluss an die Hybridisierung einer einzelsträngigen Oligonukleotidsonde mit der aus der Probe isolierten Gesamt-DNA wird erfindungsgemäß die Bildung eines Hybrids aus einzelsträngiger Oligonukleotidsonde und einem Abschnitt der Gesamt-DNA detektiert. Besonders bevorzugt wird die Bildung eines Hybrids des Oligonukleotids mit einem Abschnitt der Gesamt-DNA dadurch detektiert, dass das Oligonukleotid an seinen beiden gegenüberliegenden Enden jeweils komplementäre, besonders bevorzugt revers komplementäre Abschnitte aufweist, die jeweils z. B. 4 bis 10, vorzugsweise 6 Nukleotide umfassen, sodass bei Ausbildung eines Hybrids des einzelsträngigen Oligonukleotids mit Gesamt-DNA die Konformation der Oligonukleotidsonde geändert wird, insbesondere durch Aushebung der Hybridisierung zueinander komplementärer, endständiger Abschnitte der Oligonukleotidsonde. Ein am zweiten Ende der Oligonukleotidsonde angebundenes Hapten oder Farbstoffmolekül wird in dieser Ausführungsform durch die Hybridbildung in einen weiteren Abstand zum ersten Ende der Oligonukleotidsonde gebracht, mit dem die Oligonukleotidsonde an den Träger angebunden ist. Anschließend kann das Hapten, bzw. Farbstoffmolekül detektiert werden, entweder unmittelbar durch optische Detektion, oder durch immunologischen und/oder kolorimetrischen Nachweis des Haptens, beispielsweise durch Reaktion des Haptens mit einem enzymgekoppelten Antikörper, gefolgt von der enzymatischen Umsetzung eines Substrats durch das an das Hapten gebundene Antikörper-Enzym-Konjugat.

Alternativ kann die unmittelbare Hybridbildung des an einen Träger gebundenen Oligonukleotids mit einem Abschnitt der aus der Probe isolierten Gesamt-DNA durch Messung der Änderung physikalischer Eigenschaften des gebundenen Oligonukleotids erfolgen, beispielsweise durch Oberflächenplasmonresonanzmessung an der Trägeroberfläche, an welche die Oligonukleotidsonde gebunden ist. Alternativ kann zur Messung die Änderung der Schwingungsfrequenz eines Trägers erfolgen, wenn der Träger einen Piezokristall aufweist oder aus Piezokristall besteht.

Erfindungsgemäß ist bevorzugt, die aus einer Probe isolierte Gesamt-DNA in einem ersten Aliquot ohne Dotierung zu analysieren, und in einem zweiten Aliquot mit einer ersten Dotierung, und weiter bevorzugt zusätzlich in einem zweiten Aliquot mit einer zweiten Dotierung, wobei zur Dotierung jeweils ein einsträngiges oder doppelsträngiges DNA-Fragment zugesetzt wird, z. B. in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 10 nM, vorzugsweise 1 nM. Bei Dotierung von zumindest einem Aliquot, vorzugsweise bei jeweils unterschiedlicher Dotierung zweier Aliquots der Gesamt-DNA, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Erzeugung einer Kalibrierkurve aus den Ergebnissen der Messungen für die dotierten Aliquots, und den Vergleich des Messwerts des undotierten Aliquots mit der Kalibrierkurve. Als Nachweis für die Anwesenheit eines arbuskulären Mykorrhizapilzes wird ein Messwert bei der Detektion des nicht dotierten Aliquots angesehen, der signifikant unterhalb der Kalibrierkurve liegt, z. B. maximal um den Faktor 2 bis 5 unterhalb der Kalibrierkurve liegt, die aus den Messwerten bestimmt ist, die für die dotierten Aliquots gemessen wurden.

Zusätzlich oder in Alternative zu der Dotierung der Gesamt-DNA in zumindest einem Aliquot, das parallel zur undotierten Gesamt-DNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert wird, wird vorzugsweise Gesamt-DNA der Probe in einer ersten und einer zweiten Konzentration in dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Vorzugsweise ist die zweite Konzentration etwa 2–10 mal, insbesondere 3–5 mal so hoch wie die erste.

Bei der Analyse von Aliquots einer Gesamt-DNA aus einer Probe in zwei oder mehr Konzentrationen werden Messwerte bei der Detektion dann als Nachweis für die Anwesenheit arbuskulärer Mykorrhizapilze angesehen, wenn die Messwerte etwa im Verhältnis der Konzentrationen der Gesamt-DNA in den Aliquots bestimmt wurden.

Genaue Beschreibung

Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figur beschrieben.

Die Figur zeigt ein Photo einer gelelektrophoretischen Auftrennung von PCR-Reaktionen, die als Vergleich mit Gesamt-DNA durchgeführt wurden.

Beispiel 1: Isolierung von DNA aus Erd- und Wurzelproben mykorrhizierter und nicht-mykorrhizierter Pflanzen.

Da das erfindungsgemäße Analyseverfahren gegenüber Hemmstoffen, die eine PCR-Reaktion beeinträchtigen, unempfindlich ist, konnte Gesamt-DNA aus einer Probe, die auch Erde enthielt, mittels Homogenisieren und Extraktion mit Lösungsmittel isoliert werden. Die Extraktion von Gesamt-DNA wurde durch Homogenisieren und Aufschließen der Probe in wässrigem Puffer und anschließendem Ausfällen der DNA aus der abgetrennten wässrigen Phase durchgeführt. Im einzelnen wurden ca. 0,5 g Bodenprobe mit 500 μL 100 mM Na-Phosphatpuffer (pH 8,0) gemischt. Zu dieser Suspension wurden Glaskugeln und 250 μL 10% Na Dodecylsulfat zugegeben und die Probe durch schnelles radiales Mischen mittels eines Vortex-Mixers 6-mal für 1 min aufgeschlossen, jeweils mit Kühlen auf Eis für 1 min. Die wässrige Phase wird durch Zentrifugation (Tischzentrifuge, 5.000 × g, 5 min) vom Niederschlag abgetrennt. Optional kann die wässrige Phase mittels Extraktion mit dem gleichen Volumen Phenol (25:1 Phenol:Chloroform), Abtrennen der organischen Phase, anschließendes Extrahieren der verbleibenden wässrigen Phase mittels Chloroform und Abtrennen der organischen Phase gereinigt werden. Aus der wässrigen Phase wird Gesamt-DNA durch Fällung abgetrennt, z. B. durch Zugabe von 1/3 Volumen Na-Acetat (3 M, pH 6,5) und 2 bis 3 Volumen Ethanol oder Isopropanol, bezogen auf das Volumen der wässrigen Phase.

Bevorzugt wird die wässrige Phase vor der Fällung mit Silicagel und NaJ versetzt und unter Mischen inkubiert, die Gesamt-DNA wird mit dem Silicagel pelletiert und, vorzugsweise nach Waschen des Pellets mit wässrigem und/oder alkoholischer Lösung, in wässrigem Puffer resuspendiert. Für diese Behandlung werden zu 500 μL wässriger Phase ca. 1 mL 6 M NaJ und 150 μL 100% Silicagel zugesetzt und die Mischung für 1 bis 10 min bei Raumtemperatur inkubiert; anschließend wird die Gesamt-DNA aus der wässrigen Phase mit dem Silicagel durch Zentrifugation (Tischzentrifuge, 1 min bei 5.000 × g) pelletiert. Das Pellet kann gewaschen werden, z. B. mit 500 μL eiskaltem Ethanol. Ausgefällte Gesamt-DNA wird in wässrigem Puffer resuspendiert, z. B. TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 6,5).

Aliquots von Gesamt-DNA, die nach diesem Verfahren einschließlich Aufreinigung mittels Kieselgel, jedoch ohne Phenolextraktion aus verschiedenen Proben gewonnen wurden, wurden als Vergleichstest für eine PCR unter jeweils gleichen Bedingungen eingesetzt. Aliquots der PCR-Ansätze wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt; ein Photo ist in der Figur gezeigt. Die eingesetzten Proben enthielten nachweislich Glomus intraradices, als Arbuskeln in Wurzelproben und als z. T. gekeimte Sporen in Erdproben. Die PCR-Produkte aus Proben aus Erde mit Wurzelgewebe sind in Spuren 11 W, 28 W und 22 W gezeigt, die PCR-Produkte aus Erdproben ohne sichtbares Wurzelgewebe in Spuren 11 E, 28 E, 22 E und 2 E; Spur PK zeigt die Positivkontrolle, bei deren PCR per Ionenaustausch aufgereinigtes Amplifikat von DNA aus Glomus intraradices eingesetzt wurde, welches einen Abschnitt umfasste, für den die eingesetzten Primer spezifisch sind. M zeigt λ/HindIII restringierte DNA.

Es wird deutlich, dass mit der isolierten Gesamt-DNA keine PCR ablief, und entsprechend kein Nachweis von Mykorrizapilzen aus der Gesamt-DNA möglich ist. Dieses Ergebnis entspricht dem Stand der Technik insofern, als Gesamt-DNA aus Probenmaterial, das pflanzliches Wurzelgewebe und/oder Erde enthält, nicht auf einfache Weise und ohne erheblichen Aufwand, z. B. nicht ohne Ionenaustauschchromatographie in einer Reinheit isoliert wird, die frei von Hemmstoffen für die DNA-Polymerase, z. B. thermostabile DNA-Polymerase ist.

Beispiel 2: Hybridisierung von Gesamt-DNA mit immobilisiertem Oligonukleotid

Nach Beispiel 1 erhaltene Gesamt-DNA wurde durch Erwärmen auf 98°C für 5 min und anschließendes Abkühlen im Eisbad denaturiert.

Eine einzelsträngige Oligonukleotidsonde mit der Seq.-ID Nr. 52 oder Seq.-ID Nr. 19 wurde so synthetisiert, dass jeweils endständig 6 zueinander komplementäre Nukleinsäuren angefügt waren, die zueinander komplementäre Nukleinsäuren waren. An das 5'-Ende des Oligonukleotids, das als zweites Ende gewählt wurde, wurde Digoxygenin (DIG) synthetisiert; an das als erstes Ende verwendete 3'-Ende wurde Biotin synthetisiert.

Eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte mit 96 Näpfen wurde durch Kontaktieren mit dem mit Biotin verbundenen Oligonukleotid in wässriger Pufferlösung kontaktiert. Ungebundene Oligonukleotide wurden durch Waschen mit Puffer entfernt.

Als Kontrolltest wurden einige Näpfe der beschichteten Platte mit einer einzelsträngigen Oligonukleotidsonde (Seq. ID Nr. 52 oder Nr. 19) beschichtet, ungebundene Sonde durch Waschen entfernt, und mit anti-DIG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war, inkubiert und gewaschen. Für die Nachweisreaktion wurden 100 μL anti-DIG-Antikörper alkalische Phosphatase-Konjugat (1:1000 verdünnt in eiskaltem 5 × SSC Puffer) hinzugegeben, für 10 min bei 4°C inkubiert, und anschließend dreifach mit 400 μL eiskaltem 0,5 × SSC-Tween20-Puffer gewaschen. Zur Detektion wurden 100 μL des Substrats der alkalischen Phosphatase, p-Nitrophenylphosphat in Lösung zugegeben, und nach Inkubation bei 405 nm gemessen.

Dieser Kontrolltest ergab im Wesentlichen kein Signal und zeigt, dass die Oligonukleotidsonde, die jeweils endständig komplementäre Sequenzabschnitte aufweist, bei Immobilisierung mit einem ersten Ende an einen Träger eine am gegenüberliegenden zweiten Ende des Oligonukleotids angebundene Hapten-(DIG) oder Farbstoffgruppe in einem Zustand aufweist, in dem eine Detektion im wesentlichen nicht erfolgt.

Zu anderen Näpfen der Mikrotiterplatte, an denen mit ihrem ersten Ende angebundene Oligonukleotide immobilisiert waren, wurde denaturierte Gesamt-DNA in 5 × SSC-Puffer (100 μL) gegeben. Die Hybridisierung erfolgte für 0,5–2 h, vorzugsweise für 1–2 h bei einer Temperatur von ca. 22–50°C, vorzugsweise bei 37°C.

Für die Hybridisierung wurde eine Zeitdauer von 60–120 min, vorzugsweise ca. 90 min als geeignet gefunden, als Temperatur für die Hybridisierung 30–50°C, vorzugsweise 35–40°C, °C,besonders bevorzugt 37°C.

Für die Farbentwicklung wurde gefunden, dass bei alkalischer Phosphatase eine Inkubation mit ihrem Substrat für 1–3 h, vorzugsweise etwa 2 h bei Raumtemperatur ausreicht.

Für die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens wurde die minimale Konzentration zu ca. 100 pg/μL Gesamt-DNA bestimmt. Vorzugsweise wird Gesamt-DNA in einer Konzentration von ca. 0,5–2,5 ng/μL eingesetzt. Das erfindungsgemäße Analyseverfahren zeigte eine etwa lineare Abhängigkeit zwischen dem detektierten Signal für die Hybridisierung der immobilisierten Oligonukleotidsonde mit denaturierter Gesamt-DNA in einem Bereich von ca. 0,5 bis 5 ng/μL Gesamt-DNA, insbesondere von 0,5 bis 2,5 ng/μL Gesamt-DNA. SEQUENCE LISTING