Title:
Verfahren und Mittel zum Nachweis der Aktivität von Osteoklasten
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zum Nachweis der Resorptionsaktivität von Osteoklasten, insbesondere zur Anwendung in der Medizin, sowie in der biowissenschaftlichen und pharmazeutischen Forschung.
Bisherige Verfahren zur Messung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten in vitro sind schwierig zu quantifizieren, sind teilweise unflexibel in der Anwendung mit verschiedenen Spenderorganismen und erfordern spezielle Messgeräte zur Datenerfassung.
Das erfindungsgemäße Verfahren und Kit macht vorteilhaft Gebrauch von einer biomineralisierten, calciumphosphathaltigen Matrix, die durch Abscheidung von Calciumphosphat durch Osteoblasten in vitro erhalten wurde.
Auf dieser Matrix werden Osteoklasten inkubiert und anschließend das nicht resorbierte Calciumphosphat quantifiziert.
Das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert vorteilhaft mit Osteoklasten von verschiedenen Organismen und Zelltypen und ist einfach quantifizierbar.




Inventors:
Dieter, Peter, Prof. (Dresden, 01157, DE)
Lutter, Anne-Helen, Dr. (Dresden, 01159, DE)
Hempel, Ute (Dresden, 01307, DE)
Application Number:
DE102009013957
Publication Date:
09/16/2010
Filing Date:
03/13/2009
Assignee:
Technische Universität Dresden (Dresden, 01069, DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE102004021229A1N/A2005-11-24



Foreign References:
WO2008153814A22008-12-18
58495691998-12-15
200802996042008-12-04
WO2007135531A22007-11-29
Other References:
Internetdokument, Adresse, http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/tech_bulletin/live/web_enabled/TB444.pdf zu: SINDREY,D., u.a.: BD Biosciences Technical Bulletin #444: von Kossa Staining of Osteoclast Resorption on BD BioCoatTM OsteologicTM Discs. c 2006
ZHOU,Z., u.a.: HMGB1 regulates RANKL-induced osteoclastogenesis in a manner dependent on RAGE. J. Bone Miner. Res. (2008) 23 (7) 1084-96
Attorney, Agent or Firm:
Kailuweit & Uhlemann, Patentanwälte (Dresden, 01187)
Claims:
1. Verfahren zur Bestimmung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten mit den Schritten:
a.) Inkubation von Osteoklasten mit einer biomineralisierten, Calciumphosphathaltigen Matrix, die durch Osteoblasten in vitro erhalten wurde,
b.) Quantifizierung des nicht resorbierten Calciumphosphats.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung des nicht resorbierten Calciumphosphats durch Anfärben mit Silbernitrat, vorzugsweise mit der von Kossa Färbung, erfolgt.

3. Verwendung einer Matrix, die durch Abscheidung von Calciumphosphat durch Osteoblasten in vitro erhalten wurde, zur Bestimmung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten.

4. Kit zur Bestimmung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten enthaltend:
a.) eine Matrix, die durch Abscheidung von Calciumphosphat durch Osteoblasten in vitro erhalten wurde,
sowie gegebenenfalls als weitere Komponenten:
b.) Zellkulturmedium,
c.) Fixierungslösung, Waschpuffer,
d.) Sibernitratlösung, Reduktionsmittel
e.) eine Kalibriergerade,
f.) Osteoklastenzellinien,
g.) eine Bedienungsanleitung.

5. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, der in Anspruch 3 definierten Matrix oder eines Kits nach Anspruch 4 zur Anwendung in der biologischen Forschung, der pharmakologischen Forschung und/oder der Medizin.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zum Nachweis der Resorptionsaktivität von Osteoklasten, insbesondere zur Anwendung in der Medizin, sowie in der biowissenschaftlichen und pharmazeutischen Forschung.

Knochen ist ein dynamisches Gewebe, welches einem ständigen Umbau (Knochenabbau und Knochenaufbau) unterliegt. Knochenaufbauende Zellen (Osteoblasten) und Knochenabbauende Zellen (Osteoklasten) stehen in gesundem Knochen in einem Gleichgewicht, das sich im Alter zu den Osteoklasten hin verschiebt. Viele Knochenkrankheiten gehen auf Fehlfunktionen in Osteoklasten oder Störungen im Gleichgewicht zurück und werden intensiv untersucht. Bei der Osteoporose ist z. B. die Resorptionsaktivität der Osteoklasten gestört.

Bisherige Verfahren zur Messung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten in vitro sind schwierig zu quantifizieren, sind teilweise unflexibel in der Anwendung mit verschiedenen Spenderorganismen und erfordern spezielle Messgeräte zur Datenerfassung.

Auf dem Markt sind folgende Testkits:

  • 1. Der Osteoclast Culture Kit der Kamiya Biomedical Company (Seattle WA, USA) arbeitet auf der Basis von kompakten Dentin-Scheiben in Verbindung mit speziellen Ratten-Vorläuferzellen V-1, die zu Osteoklasten differenzieren. Dentin ist knochenähnlich und besteht zu ca. 70% aus Calciumhydroxylapatit (hauptsächlich Phosphat und Calcium) und zu 20% aus organischen Bestandteilen (davon sind 90% Kollagen). Die restlichen 10% sind Wasser. Die durch die Osteoklastenaktivität entstandenen Resorptionslakunen sind nachteilig nur nach Hematoxylin-Färbung oder mit dem Elektronenmikroskop zu quantifizieren. Außerdem sind die Dentin-Scheiben undurchlässig für Licht und damit nachteilig Fluoreszenz- und Lichtmikroskopisch nicht auswertbar.
  • 2. Die OAASTM-Plates der OCT USA, Inc. (Buena Park, CA, USA) sind mit synthetisch hergestellten karboniertem Calciumphosphat beschichtete Zellkulturplatten. Eine Quantifizierung der Osteoklastenaktivität ist nur bedingt möglich, da eine Erkennung von Resorptionslakunen im Verhältnis zum Hintergrund schwierig ist. Eine Auswertung ist zwar über eine CCD-Kamera möglich, aber der Kontrast zwischen Fressfläche und Matrix ist schlecht, da die Platten braun färben und nicht schwarz.
  • 3. Der BD BiocoatTM OsteologicTM Discs der BD Biosciences (Bedford, MA, USA) beruht ebenfalls auf mit synthetisch hergestelltem Calciumphosphat beschichteten Platten, welche aber in diesem Fall mit der von Kossa-Methode gefärbt werden, bevor eine Quantifizierung erfolgt. Das Problem dieses Test liegt in dem künstlichen Substrat, was den Zellen angeboten wird und welches das Resorptionsverhalten der Zellen beeinflussen kann.
  • 4. Gegenstand der US20080299604A1 ist der unter dem Namen OsteoLyseTM Assay Kit von der Lonza Walkersville, Inc. vertriebene Kit. Dieser beruht auf der quantitativen Bestimmung von Kollagen-Abbauprodukten. Verwendet werden mit Europium-markiertem Kollagen beschichtete Platten. Gemessen wird der Kollagenabbau und die durch Freisetzung des Europiums hervorgerufene Fluoreszenz. Das System funktioniert nur mit speziellen auf das Testsystem abgestimmten humanen Osteoklast-Vorläuferzellen, was keine Variabilität ermöglicht.
  • 5. Der OsteoAssayTM Human Bone Plate der Lonza Walkersville, Inc. (Walkersville MD, USA) beruht auf einer dünnen Schicht aus adherenten humanen Knochenpartikeln, die eine Matrix für primäre humane oder nicht-humane Osteoklasten bildet. Gemessen wird auch hier der Kollagenabbau im Überstand. Eine direkte Korrelation mit der Resorptionsfläche bzw. mit der Anzahl der Resorptionslakunen ist in diesem Test nicht möglich.
  • 6. Der CalciFluorTM Assay der Lonza Walkersville, Inc. beruht auf der Messung von freiem Calcium, welches während der Resorption freigesetzt wird. Problematisch ist dabei, dass spezielles Medium verwendet werden muss, um zu verhindern, dass Calcium, welches in normalem Medium vorhanden ist, die Messwerte verfälscht.

US5849569 offenbart ein Substrat für die Kultur von Knochenzellen in vitro zur Bestimmung deren Aktivität. Dieses Substrat besteht aus synthetisch hergestelltem Calciumphosphat, welches durch eine Beschichtung im Solgel-Verfahren erhalten wird.

WO2007135531A2 offenbart ein Bildbearbeitungssystem für die Auswertung von Bildern aus Osteoklastenaktivitätsassays.

Aufgabe der Erfindung ist es ein vereinfachtes und verbessertes Verfahren und Mittel für dessen Durchführung anzugeben, um die Resorptionsaktivität von Osteoklasten in vitro nachzuweisen und zu quantifizieren. Das Verfahren soll auf Osteoklasten, die aus unterschiedlichen Zelllinien hervorgehen, und native Zellen unterschiedlicher Spezies anwendbar sein.

Die vorliegende Erfindung entstand dabei in dem Bestreben einen Spezies-unabhängigen, einfach quantifizierbaren und physiologischen Osteoklasten-Resorptionsassay zu entwickeln.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten mit den Schritten:

  • a.) Inkubation von Osteoklasten mit einer biomineralisierten, Calciumphosphathaltigen Matrix, die durch Osteoblasten in vitro gebildet wurde,
  • b.) Quantifizierung des nicht resorbierten Calciumphosphats.

Unter Resorptionsaktivität von Osteoklasten wird die knochenabbauende Aktivität der Osteoklasten verstanden.

Durch die Osteoblasten wird vorteilhaft in vitro eine native biomineralisierte Knochenmatrix auf einem Trägermaterial aufgebaut, d. h. eine Matrix, welche in ihrer Zusammensetzung und in ihrer Struktur nahezu dem natürlichen Knochen entspricht.

Die erfindungsgemäße Matrix, die durch Biomineralisation durch Osteoblasten in vitro erhalten wurde, unterscheidet sich von einer Beschichtung aus synthetisch hergestelltem Calciumphosphat insbesondere in folgenden Punkten:

  • 1. Die Matrix enthält (wie der natürliche Knochen) circa 10 bis 30%, bevorzugt 15 bis 25% organische Materialien (z. B. Kollagen Typ I, Osteonectin, Osteocalcin (ggf. in geringeren Mengen), Osteopontin, Proteoglycane, Bone Sialoprotein) und circa 70 bis 85% aus anorganischen Stoffen (vor allem Calciumphosphat in Form von Hydroxylapatit (Ca10[PO4]6[OH]2)).
  • 2. Die Struktur der Matrix ähnelt dem natürlichen Knochen, d. h. sie besteht aus einem Geflecht aus Strukturproteinen (wie Kollagen Typ I, Osteopontin) an die über Calciumbindende Proteine (wie Calciumnectin) Calciumphosphat (insbesondere in der Form von Hydroxylapatit) gebunden ist.

Da die erfindungsgemäße Matrix in ihrer Struktur und ihrer Zusammensetzung dem natürlichen Knochen entspricht, ermöglicht die Erfindung vorteilhaft die Resorptionsaktivität von Osteoklasten unter nahezu physiologischen Bedingungen zu testen.

Die erfindungsgemäße Matrix besteht vorzugsweise (abgesehen von Resten des Zellkulturmediums) allein aus biologisch hergestellten Komponenten, d. h. enthält kein synthetisch hergestelltes Calciumphosphat. Auch der Einsatz von Crosslinkern oder anderen Materialien zur Fixierung der Matrix auf dem Trägermaterial ist nicht notwendig.

Die erfindungsgemäße Matrix kann vorteilhaft auf gängigen Zellkulturschalen (z. B. aus Polystyren oder Polycarbonat), keramischen oder metallischen Oberflächen (wie Titan), Glas oder anderen bekannten, bevorzugt durchsichtigen Trägermaterialien durch Inkubation mit Osteoblasten in vitro erhalten werden. Die Größe der Schalen (z. B. 6-well, 24-well, 48-well, 96-well) kann beliebig gewählt werden.

Der Begriff Osteoblasten umfasst dabei Osteoblastenzelllinien, einschließlich Osteosarcoma Zelllinien mit Osteoblasteneigenschaften (wie z. B: SAOS-2-Zellen) und native Osteoblasten.

Die Dicke der erfindungsgemäßen Matrix kann vorteilhaft durch die Zeitdauer der Inkubation mit Osteoblasten eingestellt werden. Bevorzugt ist die Schicht jedoch dünn genug um eine lichtmikroskopische oder eine einfache densitometrische oder photometrische Auswertung zu erlauben. Auch die Auswertung mit einer CCD-Kamera, digitalen Photokamera oder einem Desktop Scanner ist möglich. Bevorzugte Schichtdecken liegen im Bereich von 0,4–0,8 μm bezogen auf Hydroxylapatit.

Die Herstellung der Matrix erfolgt bevorzugt durch Inkubation einer Osteoblastenzelllinie, bevorzugt von SAOS-2 Zellen, auf dem Trägermaterial in einem Medium.

Die Inkubation der Zellen erfolgt bevorzugt in einem Standardzellkulturmedium (welches Salze, Aminosäuren, Vitamine Glucose, Desoxyribonucleoside und Ribonucleoside und Puffersubstanzen, wie z. B. Alpha MEM)) und Serum (bevorzugt 5% bis 20% Serum, vorzugsweise Foetales Kalbserum) enthält. Das Medium wird mit Ascorbat (bevorzugt 100 bis 500 μmol/l) und Phosphat, bevorzugt β-Glycerolphosphat, (bevorzugt 2 bis 20 mmol/l) angereichert. Die Konzentration an Calciumsalzen (z. B. CaCl2 × H2O) beträgt bevorzugt 0,1 bis 0,5 g/l besonders bevorzugt 0,1 bis 0,3 g/l.

Die Inkubation zur Bildung der Matrix erfolgt bevorzugt für 15 bis 35 Tage, besonders bevorzugt 20 bis 30 Tage. Das Medium wird bevorzugt täglich bis alle 5 Tage, besonders bevorzugt alle 3 bis 4 Tage gewechselt, um eine optimale Differenzierung und eine ausreichende Dichte der Calciumphosphat Matrix zu gewährleisten. Die CO2-Konzentration liegt bevorzugt im Bereich von 4–12%, besonders bevorzugt bei 5–7% und die O2-Konzentration liegt bevorzugt im Bereich von 10–30%, besonders bevorzugt bei 17 bis 23% oder 20 ± 2% (physiologische Konzentration).

Für das Aufbringen der Matrix ist keine maschinelle Unterstützung notwendig. Jedoch kann die Herstellung durch den Einsatz von Pipettierrobotern automatisiert werden.

Eine gleichmäßige Beschichtung lässt sich über die Bestimmung des Calcium-Phosphat-Gehaltes kontrollieren

Nach erfolgter Matrixproduktion werden die noch vorhandenen Osteoblasten (bzw. Osteocyten) von der Matrix entfernt. Dies geschieht bevorzugt mit wässriger Ammoniaklösung oder einer Harnstofflösung. Anschließend werden die Platten mit Wasser oder einem geeigneten Puffer (wie z. B. einem Phosphatpuffer) gewaschen

Auf die so hergestellte Matrix können die Osteoklasten unmittelbar ausgebracht werden.

Wird die Matrix nicht sofort verwendet, kann diese vorteilhaft getrocknet und bei Raumtemperatur gelagert werden. Auch die Lagerung (z. B. in PBS) bei 4°C ist problemlos möglich, genauso wie das Einfrieren bei –20°C bis –80°C. Die Matrix kann auch mit üblichen Methoden (z. B. UV- oder Gammabestrahlung) sterilisiert werden. Dies ist jedoch nicht unbedingt notwendig wenn ausschließlich sterile Materialien eingesetzt wurden.

Zum Nachweis der Resorptionsaktivität der Osteoklasten (auch Fressaktivität genannt) werden diese auf der erfindungsgemäßen Matrix inkubiert, wobei die Inkubation in dem oben genannten Zellkulturmedium oder anderen bekannten Medien erfolgen kann. Der Test eignet sich auch für die Anwendung auf Osteoklastenvorläuferzellen (oder deren Zellinien), wobei diese durch Zugabe von geeigneten Zytokinen auf der erfindungsgemäßen Matrix in Osteoklasten differenziert werden.

Die Inkubation erfolgt bevorzugt für 3 bis 20 Tage, abhängig von dem jeweiligen Zelltyp. Während dieser Zeit bauen die Osteoklasten die Matrix und insbesondere das darin enthaltene Calciumphosphat ab.

Das verbleibende Calciumphosphat wird anschließend quantifiziert. Durch Vergleich mit dem Ausgangswert bzw. einer Kalibriergerade wird der Anteil an resorbiertem Calciumphosphats berechnet, bzw. die resorbierte Fläche im Verhältnis zur nicht resorbierten Fläche.

Der Test ist nach beliebigen Zeitpunkten abstoppbar. Dabei kann entweder ein Ablösen der Zellen erfolgen oder eine Fixierung der Zellen auf der Matrix für anschließende Färbungen. Bevorzugt erfolgt das Abstoppen durch Abtöten und Ablösen der Osteoklasten mit wässriger Ammoniaklösung oder einer Harnstofflösung. Die verbleibende Matrix wird anschließend mit Wasser oder einem geeignetem Puffer gewaschen.

Die Matrix muss für die Quantifizierung der Resorptionsaktivität nicht fixiert werden. Wenn Zellen auf der Matrix betrachtet werden sollen, dann können diese z. B. mit Paraformaldehyd (3,7–10%), einem Aceton/Methanol-Gemisch oder mit anderen herkömmlichen Fixierungsmethoden fixiert und anschließend gefärbt werden.

Zur Quantifizierung des Calciumphosphats können unterschiedliche Methoden zur Anwendung kommen.

Bevorzugt wird eine Silberabscheidung (Austausch von Calcium gegen Silber) durch Zugabe von löslichen Silbersalzen in Gegenwart von Reduktionsmitteln verwendet. Bei dieser Methode, von Kossa-Färbung genannt, ist eine deutliche Unterscheidung (schon visuell) zwischen nativer Matrix (schwarz) und resorbierten Löchern (durchsichtig) möglich. Die Quantifizierung kann dann über verschiedene Wege erfolgen. Die einfachste Möglichkeit erfordert kein spezielles Gerät zum Auslesen, sondern besteht darin die verbleibende Matrix bzw. das Trägermaterial einzuscannen und danach die hellen Bereiche über eine Software wie z. B. Image Quant oder ImageJ zu analysieren. Vorteil hierbei ist, dass ein ganzes Well (Kavität) analysiert werden kann und nicht nur ein Teilbereich, womit eine ungleichmäßige Verteilung von Löchern im well keinen Einfluss auf die Ergebnisse hat.

Alternativ kann die Quantifizierung des Calciumphosphats durch andere bekannte Nachweismethoden für Calcium (z. B. mit Calcon und/oder Calcein oder Arsenazo-III oder als Hexacyanoferrat) oder Phosphat oder auch radioaktive Markierung des Calciums oder Phosphors erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert vorteilhaft mit Osteoklasten von verschiedenen Organismen und Zelltypen, insbesondere primäre Mausosteoklastenzellen (primary mouse bone marrow monocytes), Maus-Osteoklasten-Zelllinien (wie z. B. RAW 264.7), Osteoklasten, die aus primären humanen peripheren mononuklären Blutzellen (PBMC – Peripheral Blood Mononuclear Cells) oder primären humanen CD14+-Zellen durch Differenzierung erhalten wurden, primäre humane Zellen aus dem Knochenmark (human bone marrow cells), Osteoklasten-Vorläuferzellen von Lonza, gleichermaßen.

Schon während der Kultur kann man lichtmikroskopisch (bevorzugt mit Kontrast-Mikroskopie) die Entstehung von Löchern verfolgen. Auch unterschiedliche Stadien der Differenzierung der Osteoklasten können lichtmikroskopisch, insbesondere mittels Fluoreszenzfärbungen verfolgt werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Bestimmung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten enthaltend:

  • a.) eine Matrix, die durch Abscheidung von Calciumphosphat durch Osteoblasten in vitro erhalten wurde,
    sowie gegebenenfalls mindestens einen der weiteren Bestandteile:
  • b.) Zellkulturmedium, Differenzierungsfaktoren (wie z. B. RANKL)
  • c.) Fixierungslösung, Waschpuffer,
  • d.) Sibernitratlösung, Reduktionsmittel
  • e.) eine Kalibriergerade,
  • f.) eine oder mehrere Osteoklastenzellinien,
  • g.) eine Bedienungsanleitung.
  • h.) Programmhinweise und eventuell Hinweise bzgl. Auswahl und Benutzung eines Scanners.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der Matrix und des Kits zur Bestimmung der Resorptionsaktivität von Osteoklasten, zur Anwendung in der biologischen oder medizinischen Forschung (z. B. zum Studium der Osteoklastendifferenzierung), der pharmakologischen Forschung (z. B. zur Untersuchung und Entwicklung von Stoffen, welche die Osteoklastenaktivität- und/oder differenzierung beeinflussen) und zur Anwendung in der Medizin (z. B. zur Diagnose der Osteoklastenaktivität- und/oder differenzierung). Ausserdem besteht durch die Erfindung die Möglichkeit Cokulturen von Osteoblasten und Osteoklasten unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen.

Ausführungsbeispiele:

Die Erfindung wird nachfolgend durch Abbildungen und Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken:

1 zeigt schematisch den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens, einschließlich des Schritts der Matrixherstellung. Der Ablauf gliedert sich in zwei Phasen. In Phase I findet die Matrixsynthese mit Osteoblasten statt, welche nach Produktion der Matrix (ca. 25 Tage) von der Matrix entfernt werden. Die anschließende Phase II beinhaltet die Verwendung der Matrix für den Osteoklasten-Resorptionsassay. Dabei wurde die Methode in diesem Beispiel angewandt um die Resorptionsaktivität von primären Mausosteoklastenvorläuferzellen (primary mouse bone marrow monocytes) in Abhängigkeit der Konzentration an MCSF (Makrophagen Koloniestimulierender Faktor) zu untersuchen. Die Resorptionsaktivität der differenzierten Osteoklasten ist (wie bereits zuvor gezeigt wurde – Lees RL et al. 1999 J Bone Miner Res. 14(6), 937–45) abhängig von der Menge an zugegebenen MCSF, wenn der Differenzierungsfaktor RANKL („Receptor Activator of NF-κB Ligand”) (40 ng/ml) vorhanden ist. Das Diagramm in 1 zeigt das die Untersuchung der MCSF-Abhängigkeit mit diesem Test signifikant nachweisbar ist.

2 zeigt die Kalibriergerade zur Berechnung der Resorptionsfläche. Die Kalibriergerade wird durch partiellen Auftrag der Matrix erstellt.

Ein weiteres Beispiel für die Anwendung des Testsystem zeigt 3. Hier wurde die Zeitabhängigkeit der Resorptionsaktivität von einer durch RANKL-Zugabe (40 ng/ml) differenzierten Mausosteoklastenzelllinie (RAW 264.7) untersucht, dass heißt die Zunahme an Resorptionsfläche pro Tag kann mit diesem Test einfach und effizient verfolgt werden.

Des Weiteren ist es gerade in der medizinischen Forschung von besonderem Interesse Hemmstoffe bzw. Aktivatoren der Osteoklastenaktivität zu untersuchen. Beispielhaft wird in 4 gezeigt, dass Osteoklastenaktivität von dem Inhibitor Interferon-γ abhängig ist. Die Osteoklasten wurden durch RANKL-Zugabe (40 ng/ml) aus einer Mausosteoklastenvorläuferzelllinie (RAW 264.7) differenziert. Dabei wird eine Konzentrationsabhängige Hemmung gezeigt, die auch schon in der Literatur beschrieben wurde (Kamolmatyakul S, Chen W, Li YP. 2001, J. Dent. Res. 80 (1), 351–355). Damit kann man die Erfindung auch für Hemmstudien im Bezug auf die Osteoklasten-Resorptionsaktivität nutzen.

Ein wichtiger Vorteil des entwickelten Resorptionsassays besteht darin, dass Zelltypen von verschiedenen Organismen eingesetzt werden können. 5 zeigt die resorbierte Matrix von differenzierten primären humanen CD14+ PBMC (A), primären humanen Osteoklasten Vorläuferzellen von Lonza GmbH (B), RAW 264.7 Zellen (C) und primären Mauszellen aus dem Knochenmark (D). Die Abbildungen zeigen, dass die verschiedenen Zelltypen gleichermaßen in der Lage sind, die Matrix abzubauen.

Ausführungsbeispiel 1: Synthese einer knochenähnlichen physiologischen Matrix

Zur Synthese einer knochenähnlichen physiologischen Matrix wird in diesem Beispiel die humane Osteoblastenvorläuferzellinie SAOS-2 (DSMZ ACC 243, DSMZ, Braunschweig) verwendet. Die Zellen werden auf Zellkulturplatten ausgesät. Die Differenzierung der Zellen erfolgt durch Zugabe von Ascorbat (300 μmol/l) und β-Glycerophosphat (10 mmol/l) zum Medium (Alpha MEM, 10% FKS). Inkubiert wird bei 5% CO2 und 20% O2 und 37°C. Das Medium wird alle 3 bis 4 Tage gewechselt, um eine optimale Differenzierung und eine ausreichende Dichte der Calciumphosphat Matrix zu gewährleisten. Nach 25 Tagen werden noch vorhandene Zellen mit Ammoniaklösung (20 mmol/l) von der Matrix entfernt. Die fertigen Platten werden anschließend gründlich mit PBS gewaschen und bei 4°C in PBS bis zur Verwendung gelagert.

Ausführungsbeispiel 2: Resorptionsphase durch Osteoklasten

Um das Resorptionsverhalten von aktiven Osteoklasten zu studieren, werden verschiedene Osteoklastenvorläuferzellen (s. Tabelle 1) auf die vorher gemäß Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Matrixplatten ausgesät. Die Differenzierung der Zellen erfolgt in Kulturmedium (Alpha MEM, 20% Fötales Kälberserum – FKS) durch Zugabe von unterschiedlichen Zytokinen je nach Zelltyp (s. Tabelle 1). Das Medium wird alle 3 Tage gewechselt, um eine optimale Differenzierung zu gewährleisten. Unabhängig von den Zellen, wird die Resorptionsphase nach bestimmten Zeitpunkten beendet. Um eine optimale Auswertung der Platten zu ermöglichen, werden noch vorhandene Zellen mit Ammoniaklösung (20 mmol/l) von der Matrix entfernt. Die resorbierten Platten werden anschließend gründlich mit PBS gewaschen und bei 4°C in PBS bis zur Auswertung gelagert. TABELLE 1: OSTEOKLASTEN VORLÄUFERZELLEN

SpeziesMediumPrimäre KnochenmarkszellenmurinAlpha MEMHitzeinaktivierte FKS20%Penicillin/Streptavidin10000 EL-alanyl-L-glutamin5 mmol/lMurines RANKL40 ng/mlMurines MCSF10–100 ng/mlPrimäre KnochenmarkszellenhumanAlpha MEMHitzeinaktivierte FKS20%Penicillin/Streptavidin10000 EL-alanyl-L-glutamin5 mmol/lhumanes RANKL10–100 ng/mlhumanes MCSF10–100 ng/mlPrimäre CD14+ PBMChumanAlpha MEMHitzeinaktivierte FKS20%Penicillin/Streptavidin10000 EL-alanyl-L-glutamin5 mmol/lhumanes RANKL10–100 ng/mlhumanes MCSF10–100 ng/mlOsteoclast precursor cells (Poietics Osteoclast Precursor Cell System, Lonza, Wuppertal, DE)humanOsteoclast differentiation medium (Lonza)FKS10%Penicillin/Streptavidin10000 EL-alanyl-L-glutamin5 mmol/lhumanes RANKL10–100 ng/ml
(von Firma empfohlen 66 ng/ml)
humanes MCSF10–100 ng/ml
(von Firma empfohlen 33 ng/ml)
RAW 264.7 (ATCC number: TIB71TM, LGC Standards GmbH, Wesel, DE)murinAlpha MEMHitzeinaktivierte FKS20%Penicillin/Streptavidin10000 EL-alanyl-L-glutamin5 mmol/lMurines RANKL40 ng/ml

Ausführungsbeispiel 3: Auswertung der resorbierten Platten

Der Resorptionsassay beruht auf der Kombination von zwei Methoden miteinander. Dabei werden die resorbierten Platten zuerst mit der von Kossa Färbung (von Kossa J, (1901); modifizert von Barkhatov IM, Roumiantsev SA, Vladimirskaya EB, Afanasyev BV (2008) Composition and functional properties of monolayer cell culture from human umbilical cord blond, Cellular Therapy and Transplantation 1 (2)) gefärbt. Die Methode beruht darauf, dass Calciumionen durch Silberionen ausgetauscht werden, welche nach Reduktion durch Lichteinwirkung als metallisches Silber (schwarz) sichtbar werden. Resorbierte Flächen sind Calcium frei und färben nicht schwarz, während nichtresorbierte Bereiche der Matrix schwarz werden. Gefärbt wurde nach dem Waschen mit Wasser durch Inkubation der Matrix mit Silbernitratlösung (5%) für 60 min. Nach wiederholtem Waschen mit Aqua dest. wurde mit Pyrogallollösung (1%) für 5 bis 10 min entwickelt. Zur Bestimmung der Resorptionsfläche wurden die getrockneten Platten danach mit einem Durchlichtscanner eingescannt und mit Hilfe von z. B. Image Quant ausgewertet. Dabei wurde die eingescannte Fläche festgelegt und weiße von schwarzen Flächen unterschieden. Das Volumen der weißen Fläche kann dann über eine Kalibriergerade (s. 2) in die tatsächlich resorbierte Fläche umgerechnet werden.

Vergleichsbeispiel:

Zum Vergleich wurde versucht den aus dem Stand der Technik bekannten OsteoLyse assay von Lonza auf eine andere Osteoklasten-Linie (RAW 264.7) anzuwenden. Dabei wurde nach der Kit-Vorschrift verfahren.

Im Ergebnis zeigt 6, dass der OsteoLyse assay von Lonza mit den RAW 264.7 Zellen nicht funktioniert, während die dem Kit zugehörigen osteoclast precursor cells von Lonza eine zeitabhängige Resorptionsaktivität zeigen.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • - US 20080299604 A1 [0004]
  • - US 5849569 [0005]
  • - WO 2007135531 A2 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • - Lees RL et al. 1999 J Bone Miner Res. 14(6), 937–45 [0039]
  • - Kamolmatyakul S, Chen W, Li YP. 2001, J. Dent. Res. 80 (1), 351–355 [0042]