Title:
Bestimmung von Interaktionen konstanter Antikörperteile mit Fc-gamma Rezeptoren
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur exakten Bestimmung der Bindung des Fc-Anteils von IgG-Antikörpern an Fc-gamma-Rezeptoren und zur gleichzeitigen Prüfung der Antigenspezifität und der Fc-gamma-Rezeptor Aktivierung sowie dazu verwendete spezielle Materialien. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Auffindung von Substanzen, die eine Bindung des Fc-Anteils von IgG-Antikörpern an Fc-gamma-Rezeptoren beeinflussen, auf Basis des Verfahrens zur exakten Bestimmung der Bindung des Fc-Anteils.




Inventors:
Hengel, Hartmut, Prof. Dr. (Düsseldorf, 40225, DE)
Kalinke, Ulrich, Prof. Dr. (Hannover, 30559, DE)
Application Number:
DE102009013748
Publication Date:
10/07/2010
Filing Date:
03/17/2009
Assignee:
Paul-Ehrlich-Institut (Langen, 63225, DE)
International Classes:



Foreign References:
WO2007106707A22007-09-20
WO2006088494A22006-08-24
Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
BOEHMERT & BOEHMERT (München, 80336)
Claims:
1. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend Sequenzen zur rekombinanten Expression mindestens eines Fusionsproteins auf der Oberfläche einer Säugerzelle umfassend a) einen extrazellulären Anteil eines Säuger-Fc-Rezeptors, b) die Transmembranregion der zeta-Kette und c) die intrazelluläre Signaldomäne der T-Zell Rezeptor zeta-Kette.

2. Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die Säugerzelle ausgewählt ist aus einer zeta-Ketten-defizienten Zelle, insbesondere einer menschlichen oder Maus-zeta-Ketten-defizienten Lymphomzelle.

3. Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Rezeptor ausgewählt ist aus Fc-gamma-Rezeptoren, wie zum Beispiel FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16/CD16a), FcγRIIIB (CD16/CD16b) und FcRn, insbesondere ausgewählt aus CD16, CD32 und CD64.

4. Rekombinanter Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Fc-Rezeptor-zeta-Kette mit Fc-Rezeptoren für andere Ig-Subklassen fusioniert ist, wie z. B. FcεR.

5. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Säuger-Lymphomzelle, umfassend Transfektion einer zeta-Kette-defizienten Säuger-Lymphomzelle mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und Expression mindestens eines Fusionsproteins auf ihrer Oberfläche.

6. Rekombinante Säuger-Lymphomzelle, hergestellt nach Anspruch 5.

7. Rekombinante Säuger-Lymphomzelle nach Anspruch 6, wobei die Zelle ausgewählt ist aus einer menschlichen oder Maus-Lymphomzelllinie, wie zum Beispiel BW 5147 (ATCC TIB 47).

8. Rekombinante Säuger-Lymphomzelle nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Rezeptor ausgewählt ist aus Fc-gamma-Rezeptoren, wie zum Beispiel FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16/CD16a), FcγRIIIB (CD16/CD16b) und FcRn, insbesondere ausgewählt aus CD16, CD32 und CD64.

9. Verfahren zur Messung der Stärke der Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor, umfassend
a) in Kontakt bringen einer rekombinanten Säuger-Lymphomzelle nach einem der Ansprüche 6 bis 8 mit den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers, und
b) Messung der Expression von IL-2 von der rekombinanten Säuger-Lymphomzelle,
wobei die Stärke der Expression von IL-2 ein Maß für die Stärke der Interaktion ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei eine gleichzeitige Messung der Antigenspezifität und der Interaktion erfolgt.

11. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor beeinflussen, umfassend
a) in Kontakt bringen einer rekombinanten Säuger-Lymphomzelle nach einem der Ansprüche 6 bis 8 mit den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers in Anwesenheit einer Kandidaten-Verbindung,
b) Messung der Expression von IL-2 von der rekombinanten Säuger-Lymphomzelle, wobei die Stärke der Expression von IL-2 ein Maß für die Stärke der Interaktion ist, und
c) Vergleich der in Schritt b) gemessenen Expression mit der IL-2 Expression in Abwesenheit der Kandidaten-Verbindung.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die konstanten Anteile in löslichen mAbs, in an Plastik gebundenen mAbs, in Immunkomplexen oder an Zielzellen gebunden vorliegen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die konstanten Anteile markiert sind und/oder in markierten mAbs vorliegen.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, weiterhin umfassend die Erstellung eines Bindungsprofils des konstanten Anteils von mAbs verschiedener Subklassen für die einzelnen im Säuger exprimierten Fc-Rezeptoren.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, weiter umfassend die Modifikation des konstanten Anteils und/oder der Kandidaten-Verbindung zu einer Erhöhung oder Verringerung der Stärke der Bindung an einen Fc-Rezeptor.

16. Verfahren zum Nachweis von Fc-gamma-Rezeptor aktivierenden Antikörpern in einer Probe, umfassend ein Verfahren nach einem der Ansprüche 9 und 10 bis 13, wobei eine Expression von IL-2 ein Zeichen für das Vorhandensein von Fc-gamma-Rezeptor aktivierenden Antikörpern in der Probe ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der aktivierende Antikörper ein Autoimmunantikörper ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Probe im Rahmen einer onkologischen Erkrankung, einer Infektionskrankheit, einer Autoimmunerkrankung, einer Erkrankung des muskuloskeletalen Systems, einer endokrinen und/oder metabolischen Funktionsstörung, einer hämatologischen Erkrankung, einer Atemwegserkrankung, Erkrankungen des ZNS und/oder einer immunologischen Erkrankung analysiert wird.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur exakten Bestimmung der Bindung des Fc-Anteils von IgG-Antikörpern an Fc-gamma Rezeptoren und zur gleichzeitigen Prüfung der Antigenspezifität und der Fc-gamma-Rezeptor Aktivierung, sowie dazu verwendete spezifische Materialien. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Auffindung von Substanzen, die eine Bindung des Fc-Anteils von IgG-Antikörpern an Fc-gamma Rezeptoren beeinflussen, auf Basis des erfindungsgemäßen Verfahrens zur exakten Bestimmung der Bindung des Fc-Anteils.

Hintergrund der Erfindung

Die Fragment-kristallisierbare Region (Fc Region) ist diejenige Region eines Antikörpers, die mit Zelloberflächen-Rezeptoren (Fc Rezeptoren) und einigen der Proteine des Komplementsystems interagiert. Die Domäne CH3 ist die Fc-Rezeptor-Bindungsstelle zur Opsonierung, welche sich an den CR1-Rezeptor auf Phagozyten (Monozyten, Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und einem Teil der dentritischen Zellen) bindet und dadurch unter anderem die Phagozytose des markierten Partikels einleitet. Die Opsonierung erlaubt es Antikörpern somit, das Immunsystem zu aktivieren. In IgG, IgA und IgD Antikörper-Isotypen setzt sich die Fc Region aus zwei identischen Proteinfragmenten zusammen, die von den zweiten und dritten konstanten Domänen der schweren Ketten des Antikörpers abgeleitet sind.

Alle Fcγ-Rezeptoren gehören zur Immunglobulin-Superfamilie und sind die wichtigsten Fc Rezeptoren bei der Induktion der Phagocytose von opsonierten Mikroben. Die Familie umfasst mehrere Mitglieder, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b) und FcRn.

Die Einsatzgebiete für Medikamente auf Basis monoklonaler Antikörper (mAbs) sind vielfältig. Monoklonale Antikörper werden heute zunehmend in der Onkologie, bei Infektionskrankheiten, dem muskuloskeletalen System, endokrinen und metabolischen Funktionsstörungen, in der Hämatologie, bei Atemwegserkrankungen, Erkrankungen des ZNS und in der Immunologie und bei Entzündungserkrankungen verwendet.

Bei der Entwicklung und Erprobung neuer mAbs ist es für die Sicherheit und Effizienz dieser Reagenzien unter anderem essentiell, die Integrität und Funktionalität der mAbs durch laufende Kontrolle sicherzustellen.

Derzeit kann über die Komplement-vermittelte Eythrozytenlyse die Integrität des konstanten Anteils von monoklonalen Antikörpern (mAbs) bestimmt werden. Dieser Test ist jedoch sehr ungenau und liefert keine Erkenntnisse über in vivo relevante Bindungen der Fc-Rezeptoren. Aussagen über derartige Interaktionen sind aber von großer Bedeutung, da je nach Expressionsart die konstanten Anteile der mAbs einer gleichen Subklasse unterschiedliche Interaktionen mit Fc-Rezeptoren eingehen können.

Vrdoljak et al. (in Vrdoljak A, Trescec A, Benko B, Simic M. A microassay for measurement of Fc function of human immunoglobulin preparations by using tetanus toxoid as antigen. Biologicals. 2004 Jun; 32(2): 78–83) beschreiben einen modifizierten Test für die Fc-Funktion von Immunglobulinen, der auf der European Pharmacopoeia (EP) basiert. Dabei wird in dem Test Tetanus Toxoid als ein alternatives Ziel anstelle von Rubella Antigen verwendet und das Verfahren an Mikrotiterplatten angepasst.

Perez-del-Pulgar (in: Perez-del-Pulgar S, Lopez M, Gensana M, Jorquera JI. Possible alternative to European Pharmacopoeia's method of analysis Test for Fc Funktion of Immunglobulin (2.7.9) by using tetanus toxoid as antigen. Pharmeur Sci Notes. 2006 Aug; 2006(1): 23–6) beschreiben ebenfalls Tetanus Toxoid als ein alternatives Ziel im Test der EP.

Reipert, B. M. et al (in: Fc function of a new intravenous immunoglobulin product: IGIV 10% triple virally inactivated solution. Vox Sanguinis: Volume 91(3) October 2006 p. 256–263) beschreiben die Anwendung des Verfahrens der EP zusammen mit einem Durchfluss-Zytometrischen Bindungsassay für die Evaluierung der Fc-Funktion.

Zur weiteren Entwicklung von mAbs als effektive Medikamente besteht weiter ein Bedarf an einem genauen und verlässlichen Verfahren zur Bestimmung der Interaktionen des Fc-Anteils eines Antikörpers mit Fc-Rezeptoren. Der gemäß der EP durchgeführte Test ist trotz Modifikationen ungenau und liefert keine Erkenntnisse über in vivo relevante Bindungen und Aktivierung der Fc-Rezeptoren. Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, einen verbesserten Test zur exakten Bestimmung der Bindung des Fc-Anteils von IgG-Antikörpern an Fc-gamma-Rezeptoren und deren nachfolgende Aktivierung sowie die dazu verwendeten speziellen Materialien zur Verfügung zu stellen. Weitere Vorteile und Aufgaben werden aus der folgenden genaueren Beschreibung ersichtlich.

In einem ersten Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Messung der Stärke der Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptors gelöst, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst von: a) in Kontakt bringen einer rekombinanten Säuger-Lymphomzelle gemäß der vorliegenden Erfindung mit den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers, und b) Messung der Expression von IL-2 von der rekombinanten Säuger-Lymphomzelle, wobei die Stärke der Expression von IL-2 ein Maß für die Stärke der Interaktion ist.

Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei gleichzeitig mit der Messung der Stärke der Interaktion mit dem Fc-gamma-Rezeptor und der Aktivierung eine Prüfung der Antigenspezifität des untersuchten monoklonalen Antikörpers einhergehen kann. Dazu können die Antikörper in einem Testsystem zusammen mit den zu untersuchenden Antigenen in Kontakt gebracht werden (in Lösung oder an eine Oberfläche gebunden, z. B. an eine Membran oder aber auch eine Zelle, bevorzugte Beispiel sind ELISA oder „surface plasmon resonance” Technologie), und anschließend wird eine Messung der Stärke der Interaktion zwischen den konstanten Anteilen des monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptors gemäß der Erfindung durchgeführt. Die Durchführung entsprechender Tests, auch im „Highthroughput-Ansatz”, ist dem Fachmann aus der Literatur bekannt. Zum Testen können die Antikörper in unterschiedlichen Formen vorliegen, wie z. B. löslich, an eine Oberfläche (z. B. Plastik) gebunden, in Immunkomplexen oder an Zielzellen gebunden.

Im Rahmen der vorliegende Erfindung wurden in einem bevorzugten Fall Transfektanten einer Maus-Thymomzelllinie erzeugt, die die Fusionsmoleküle aus den extrazellulären Anteilen der humanen Fc-Rezeptoren CD16, CD32, CD64 und der Transmembranregion der zeta-Kette und der intrazellulären Signaldomäne der T-Zell Rezeptor zeta-Kette auf ihrer Oberfläche exprimieren. Damit wird die Untersuchung von Interaktionen mit den konstanten Anteilen von mAbs ermöglicht.

Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung ist dabei ein rekombinanter Expressionsvektor, umfassend Sequenzen zur rekombinanten Expression mindestens eines Fusionsproteins auf der Oberfläche einer Säugerzelle, wobei der rekombinante Expressionsvektor a) einen extrazellulären Anteil eines Säuger-Fc-Rezeptors, b) die Transmembranregion der zeta-Kette und c) die intrazelluläre Signaldomäne der T-Zell Rezeptor zeta-Kette umfasst. Entsprechend geeignete Expressionsvektoren sind dem Fachmann bekannt und enthalten zur Expression der gewünschten Fusionsproteine in der entsprechenden Wirtszelle und der Replikation/Selektion geeignete Sequenzen, wie z. B. Promotoren, z. B. CMV Promotor, T7 Promotor, SV40 Promotor, bla Promotor, Multiple cloning site(s), Polyadenylierungssequenzen, f1 Origin, pUC Origin, Neomycin Resistenzgen; Ampicillin Resistenzgen und Ribosomen Bindestelle(n).

Bevorzugt ist ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung, wobei die Säugerzelle ausgewählt ist aus einer zeta-Ketten-defizienten Zelle, insbesondere einer menschlichen oder Maus-Lymphomzelle, wie zum Beispiel BW 5147 (ATCC TIB 47).

Bevorzugt ist ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung, wobei der Rezeptor ausgewählt ist aus Fc-gamma-Rezeptoren, wie zum Beispiel FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16/CD16a), FcγRIIIB (CD16/CD16b) und FcRn, insbesondere ausgewählt ist aus CD16, CD32 und CD64. In einer bevorzugten Variante des rekombianten Expressionsvektors der Erfindung ist die Fc-Rezeptor-zeta-Kette mit Fc-Rezeptoren für andere Ig-Subklassen fusioniert, wie z. B. FcεR. Es ist somit möglich, durch Herstellung und stabile Expression von Fc-Rezeptor-zeta-Ketten-Fusionsproteinen anderer Subklassen auch IgE-Antikörper, z. B. in der Allergiediagnostik, nachzuweisen (dazu siehe auch unten). Weiterhin können die extrazellulären Domänen von Fcγ-Rezeptoren anderer, für vorklinische Tests relevante Spezies (zum Beispiel nicht-humane Primaten wie Makaka mulatta oder Makaka fascicularis) exprimiert werden.

Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Säuger-Lymphomzelle, umfassend Transfektion einer Säuger-Lymphomzelle mit einem Expressionsvektor der Erfindung wie oben und Expression mindestens eines Fusionsproteins auf der Oberfläche der Wirtszelle. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus einer menschlichen oder Maus-Lymphomzelllinie, wie zum Beispiel BW 5147 (ATCC TIB 47).

Ein noch weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft dann die rekombinante Säuger-Lymphomzelle, hergestellt nach dem Verfahren wie oben. Die Zelle exprimiert mindestens ein Fusionsprotein der Erfindung, kann jedoch auch mehrere Proteine exprimieren (z. B. von mehreren Expressionsvektoren), um so ein „Portfolio” an Fc-gamma-Rezeptoren auf der Oberfläche zu erzeugen. Bevorzugte Beispiele sind CD16 und CD32; CD16 und CD64; CD16 und FcRn; CD32 und FcRn; CD32 und CD64; CD64 und FcRn. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus einer menschlichen oder Maus-Lymphomzelllinie, wie zum Beispiel BW 5147 (ATCC TIB 47).

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur exakten Bestimmung der Bindung des Fc-Anteils von IgG-Antikörpern an Fc-gamma-Rezeptoren und des weiteren ein Verfahren zur gleichzeitigen Prüfung der Antigenspezifität und der Fc-gamma-Rezeptor Aktivierung. Dazu wurden von den Erfindern Transfektanten einer Maus-Thymomzelllinie erzeugt, die die Fusionsmoleküle aus den extrazellulären Anteilen der humanen Fc-Rezeptoren CD16, CD32, CD64 und der Transmembranregion und der intrazellulären Signaldomäne der T-Zell Rezeptor zeta-Kette auf ihrer Oberfläche exprimieren. Damit wird die Interaktion mit den konstanten Anteilen von mAbs untersucht. Dabei können diese in unterschiedlichen Formen vorliegen, wie bevorzugt löslich, weiter bevorzugt an Plastik gebunden, in Immunkomplexen oder an Zielzellen gebunden.

Zur Detektion der Interaktion wird ausgenutzt, dass das Cytokin IL-2 in Abhängigkeit von der Stärke der Bindung eines mAb an einen Fc-Rezeptor exprimiert wird. Anhand des IL-2 Spiegels kann also die Stärke der Interaktion zwischen einem ausgewählten mAb und den verschiedenen Fc-Rezeptoren genau bestimmt werden.

Des Weiteren ist es über das erfindungsgemäße Verfahren möglich, die direkte Bindung markierter mAbs an den Transfektanten zu messen. Entsprechende Markierungen sind dem Fachmann bekannt, wie z. B. radioaktive oder fluoreszente Marker.

Besondere Vorteile der Erfindung beruhen unter anderem darauf, dass das Bindungsverhalten von löslichen mAbs, von mAbs in Immunkomplexen und von an Zielzellen gebundenen mAbs untersucht werden kann. Weiter können die Interaktionen jedes Fc-Rezeptors einzeln untersucht werden. Zudem ermöglicht die Erfindung die Bestimmung eines präzisen Bindungsprofils der mAbs verschiedener Subklassen an die einzelnen Fc-Rezeptoren, die im Säuger, bevorzugt dem Menschen, exprimiert werden. Somit sind erstmals Aussagen über in vivo relevante Bindungen und Aktivierung der Fc-Rezeptoren möglich.

Die vorliegende Erfindung kann als Test bei der Entwicklung und Erprobung neuer mAbs eingesetzt werden. Zudem ist es möglich, auf Grundlage der vorliegenden Erfindung analoge neue Testverfahren für den Nachweis von Fc-gamma-Rezeptor aktivierenden Autoimmunantikörpern zur Verfügung zu stellen.

Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der Erfindung wie oben, weiterhin umfassend die Erstellung eines Bindungsprofils des konstanten Anteils von mAbs verschiedener Subklassen für die einzelnen im Säuger exprimierten Fc-Rezeptoren.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor beeinflussen, umfassend a) in Kontakt bringen einer rekombinanten Säuger-Lymphomzelle der Erfindung mit den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers in Anwesenheit einer Kandidaten-Verbindung, b) Messung der Expression von IL-2 von der rekombinanten Säuger-Lymphomzelle, wobei die Stärke der Expression von IL-2 ein Maß für die Stärke der Interaktion ist, und c) Vergleich der in Schritt b) gemessenen Expression mit der IL-2 Expression in Abwesenheit der Kandidaten-Verbindung.

Die potentielle Kandidatenverbindung, dessen Beeinflussung der Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor identifiziert werden soll, kann jede chemisch Substanz oder ein Gemisch davon sein. Zum Beispiel kann sie eine Substanz einer Peptidbibliothek, einer kombinatorischen Bibliothek, ein Zellextrakt, ein ”small molecular drug”, ein Protein und/oder ein Proteinfragment sein.

Der Ausdruck ”in Kontakt bringen” in der vorliegenden Erfindung bedeutet jegliche Interaktion zwischen der (den) potentiell interagierenden Substanz(e) mit dem konstanten Anteil eines monoklonalen Antikörpers oder dem Fc-Rezeptor, wobei jede der zwei Komponenten unabhängig voneinander in einer flüssigen Phase, zum Beispiel in Lösung oder in Suspension vorliegen kann, oder an eine feste Phase gebunden sein kann, zum Beispiel in Form einer im wesentlichen ebenen Oberfläche oder in Form von Partikeln, Perlen oder ähnlichem. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vielzahl von verschiedenen potentiell bindenden Kandidatenverbindungen auf einer festen Oberfläche, wie zum Beispiel auf einem Substanzbibliothek-Chip immobilisiert, und die Fusionsproteine/Antikörper der vorliegenden Erfindung werden anschließend mit solch einem Chip in Kontakt gebracht.

Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der Erfindung zur Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor beeinflussen, wobei die konstanten Anteile in löslichen mAbs, in an Plastik gebundenen mAbs, in Immunkomplexen oder an Zielzellen gebunden vorliegen. Das genannte Verfahren kann bevorzugt teilweise oder vollständig in vitro in einer rekombinanten Zelle, wie zum Beispiel derjenigen gemäß der Erfindung wie oben beschrieben, durchgeführt werden.

Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der Erfindung zur Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor beeinflussen, wobei die konstanten Anteile markiert sind und/oder in markierten mAbs vorliegen. Ein Messen der Interaktion kann durch Messen eines Markers erreicht werden, der entweder an die Proteine und/oder die potentiell interagierende Verbindung angebracht ist. Geeignete Marker sind dem Fachmann bekannt und umfassen zum Beispiel fluoreszente oder radioaktive Marker. Die Bindung der zwei Komponenten kann auch durch die Veränderung von elektrochemischen Parametern der interagierenden Verbindung oder des Proteins ermittelt werden, z. B. eine Veränderung der Redoxeigenschaften entweder des Proteins/der Proteine oder der interagierenden Verbindung nach Bindung. Geeignete Verfahren zu Nachweis solcher Veränderungen umfassen, zum Beispiel, potentiometrische Verfahren. Weitere Verfahren zum Nachweis und/oder dem Messen der Bindung der Komponenten aneinander sind im Stand der Technik bekannt.

Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der Erfindung, weiterhin umfassend die gleichzeitige Erstellung eines Bindungsprofils des konstanten Anteils von mAbs verschiedener Subklassen für die einzelnen im Säuger exprimierten Fc-Rezeptoren.

Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der Erfindung, wobei das Verfahren weiter die Modifikation des konstanten Anteils und/oder der Kandidaten-Verbindung zu einer Erhöhung oder Verringerung der Stärke der Bindung an einen Fc-Rezeptor umfasst.

Kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Verbindung gefunden werden, die die Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor beeinflusst, ist diese Verbindung erfindungsgemäß eine Leitsubstanz (”lead-compound”) für die weitere kommerzielle Arzneimittel-Entwicklung. Sie wird dann unter anderem in folgenden, insbesondere lebenden Testsystemen angewendet und weiter entwickelt.

Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst daher weiterhin den Schritt der chemischen Derivatisierung der wie oben ausgewählten Verbindung(en). Wie hierin verwendet, soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter einem ”Derivat” eine von der erfindungsgemäß identifizierten Verbindung abgeleitete Verbindung verstanden werden, die z. B. durch verschiedene Restgruppen substituiert ist, sowie Gemische verschiedener dieser Verbindungen, die z. B. auf die jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder den Patienten auf Basis von diagnostischen Daten oder Daten über den Behandlungserfolg oder -verlauf abgestimmt zu einem ”personalisierten” Medikament verarbeitet werden können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll unter einer ”chemischen Derivatisierung” das Verfahren zu einer entsprechenden chemischen Veränderung verstanden werden, also z. B. die Substitution verschiedener Restgruppen. Bevorzugterweise wird eine chemische Derivatisierung zum Zwecke des Erreichens einer besseren Bioverfügbarkeit oder der Verringerung von möglichen Nebenwirkungen durchgeführt. Unter einem ”Derivat” soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch ein ”Vorläufer” einer Substanz verstanden werden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch die Bedingungen im Körper (z. B. pH im Magen, oder ähnliches) so verändert wird oder aber durch den Körper nach Aufnahme so metabolisiert wird, dass sich als wirksame Substanz die erfindungsgemäße Verbindung oder deren Derivate bilden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend a) Identifizieren einer Verbindung, welche die Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptor beeinflusst mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens wie oben, und b) Mischen der Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger und/oder anderen geeigneten pharmazeutischen Hilfs- und Zusatzstoffen, zum Beispiel einem geeigneten pharmazeutischen Träger.

Die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, z. B. in Form von Arzneimitteln mit einem Gehalt an erfindungsgemäßer Verbindung bzw. dessen Einsatz bei der erfindungsgemäßen Verwendung erfolgt in üblicher Weise anhand geläufiger pharmazeutisch-technologischer Verfahren. Hierzu werden die Verbindungen mit geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen zu den für die verschiedenen Indikationen und Applikationsorten geeigneten Arzneiformen verarbeitet.

Dabei können die Arzneimittel in der Weise hergestellt werden, dass die jeweils erwünschte Freisetzungsrate, z. B. eine rasche Anflutung und/oder ein Retard- bzw. Depoteffekt erzielt werden. Ein Medikament kann dabei eine Salbe, Gel, Pflaster, Emulsion, Lotion, Schaum, Creme oder mischphasige oder amphiphile Emulsionssysteme (Öl/Wasser-Wasser/Öl-Mischphase), Liposom, Transfersom, Paste oder Puder sein.

Der Begriff ”Hilfsstoff” bedeutet erfindungsgemäß jedes, nicht-toxische, feste oder flüssige Füll-, Verdünnungs- oder Verpackungsmaterial, solange es nicht ungebührend nachteilhaft mit einer Verbindung oder dem Patienten reagiert. Flüssige galenische Hilfsstoffe sind zum Beispiel steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Zuckerlösungen, Ethanol und/oder Öle. Galenische Hilfsstoffe zur Herstellung von Tabletten und Kapseln können zum Beispiel Bindemittel und Füllmaterial enthalten.

Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Verbindung in Form von systemisch eingesetzten Arzneimitteln verwendet werden. Dazu gehören die Parenteralia, zu denen die Injektabilia und Infusionen gehören. Injektabilia werden entweder in Form von Ampullen oder auch als sog. gebrauchsfertige Injektabilia, z. B. als Fertigspritzen oder Einmalspritzen, daneben auch in Durchstechflaschen zur mehrmaligen Entnahme hergerichtet. Die Verabreichung der Injektabilia kann in Form der subkutanen (s. c.), intramuskulären (i. m.), intravenösen (i. v.) oder intrakutanen (i. c.) Applikation erfolgen. Insbesondere können die jeweils zweckmäßigen Injektionsformen als Kristallsuspensionen, Lösungen, nanopartikuläre oder kolloiddisperse Systeme, wie z. B. Hydrosole, hergestellt werden.

Die injizierbaren Zubereitungen können ferner als Konzentrate hergestellt werden, die mit wässrigen isotonischen Verdünnungsmitteln aufgelöst oder dispergiert werden. Die Infusionen lassen sich ebenfalls in Form von isotonischen Lösungen, Fettemulsionen, Liposomenzubereitungen, Mikroemulsionen zubereiten. Wie Injektabilia können auch Infusionszubereitungen in Form von Konzentraten zum Verdünnen zubereitet werden. Die injizierbaren Zubereitungen können auch in Form von Dauerinfusionen sowohl in der stationären als auch in der ambulanten Therapie, z. B. in Form von Minipumpen, appliziert werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann in den Parenteralia an Microcarrier oder Nanopartikel gebunden sein, beispielsweise an feinstverteilte Partikel auf Basis von Poly(meth)acrylaten, Polylactaten, Polyglycolaten, Polyaminsäuren oder Polyetherurethanen. Die parenteralen Zubereitungen können auch als Depotpräparate modifiziert sein, z. B. aufbauend auf dem ”Multiple Unit Prinzip”, wenn ein erfindungsgemäßer Inhibitor in feinstverteilter bzw. dispergierter, suspendierter Form oder als Kristallsuspension eingearbeitet ist, oder aufbauend auf dem ”Single Unit Prinzip”, wenn ein erfindungsgemäßer Inhibitor eingeschlossen ist in einer Arzneiform, z. B. einer Tablette oder einem Stäbchen, das anschließend implantiert wird. Häufig bestehen diese Implantate oder Depotarzneimittel bei „Single Unit”- und „Multiple Unit”-Arzneiformen aus so genannten bioabbaubaren Polymeren, wie z. B. Polyester der Milch- und Glykolsäure, Polyetherurethanen, Polyaminosäuren, Poly(meth)acrylaten oder Polysacchariden.

Als Hilfs- und Trägerstoffe bei der Herstellung von Parenteralia kommen Aqua sterilisata, den pH-Wert beeinflussende Substanzen, wie z. B. organische und anorganische Säuren und Basen sowie deren Salze, Puffersubstanzen zur Einstellung des pH-Wertes, Isotonisierungsmittel, wie z. B. Natriumchlorid, Natriumhydrogencarbonat, Glucose und Fructose, Tenside bzw. oberflächenaktive Substanzen und Emulgatoren, wie z. B. Partialfettsäureester des Polyoxyethylensorbitans (Tween®) oder z. B. Fettsäureester des Polyoxyethylens (Cremophor®), fette Öle, wie z. B. Erdnußöl, Sojabohnenöl und Rizinusöl, synthetische Fettsäureester, wie z. B. Ethyloleat, Isopropylmyristat und Neutralöl (Miglyol®), sowie polymere Hilfsstoffe, wie z. B. Gelatine, Dextran, Polyvinylpyrrolidon, die Löslichkeit erhöhende Zusätzen organischer Lösungsmittel, wie z. B. Propylenglycol, Ethanol, N,N-Dimethylacetamid, Propylenglycol, oder komplexbildender Stoffe, wie z. B. Citrate und Harnstoff, Konservierungsmittel, wie z. B. Benzoesäurehydroxypropyl- und -methylester, Benzylalkohol, Antioxidantien, wie z. B. Natriumsulfit und Stabilisatoren, wie z. B. EDTA, in Betracht.

Bei Suspensionen erfolgt ein Zusatz von Verdickungsmitteln zum Verhindern des Absetzens von erfindungsgemäßen Inhibitoren von Tensiden und Peptisatoren, um die Aufschüttelbarkeit des Sediments zu sichern, oder von Komplexbildnern, wie EDTA. Es lassen sich auch mit verschiedenen Polymeren Wirkstoffkomplexe erzielen, beispielsweise mit Polyethylenglykolen, Polystyrol, Carboxymethylzellulose, Pluronics® oder Polyethylenglykolsorbitfettsäureestern. Zur Herstellung von Lyophilisaten werden Gerüstbildner, wie z. B. Mannit, Dextran, Saccharose, Humanalbumin, Lactose, PVP oder Gelatinesorten verwendet.

Die jeweils geeigneten Arzneiformen lassen sich in Einklang mit dem Fachmann bekannten Rezepturvorschriften und Verfahrensweisen auf der Basis pharmazeutisch-physikalischer Grundlagen herstellen.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Medikament, dass gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, durch verschiedene Routen verabreicht, zum Beispiel oral, parenteral, subkutan, intramuskulär, intravenös oder intracerebral. Die bevorzugte Route der Verabreichung wäre parenteral bei einer täglichen Dosis der Verbindung für einen Erwachsenen von ungefähr 0,01–5000 mg, bevorzugt 1–1500 mg pro Tag. Bevorzugterweise wird das Medikament in einer Dosierung von zwischen 30 mg/Tag und 2000 mg/Tag, bevorzugt zwischen 100 mg/Tag und 1600 mg/Tag, am meisten bevorzugt zwischen 300 to 800 mg/Tag verabreicht. Die geeignete Dosis kann als eine einzelne Dosis oder als geteilte Dosen, in geeigneten Intervallen, zum Beispiel als zwei, drei, vier oder mehr Subdosen pro Tag, präsentiert werden. Geeignete Dosen können leicht durch einen Fachmann durch Routineexperimente erhalten und auf Faktoren basiert werden, wie zum Beispiel die Konzentration des aktiven Inhaltsstoff, das Körpergewicht und Alter des Patienten und andere Patienten- oder aktive Inhaltsstoff-zusammenhängende Faktoren.

Pharmazeutische Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einer Menge verabreicht, die zur Behandlung oder Prophylaxe eines spezifischen Zustands oder Zustände effektiv ist. Die anfängliche Dosierung im Menschen wird durch klinische Überwachung von Symptomen begleitet, den Symptomen des ausgewählten Zustands. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen in einer Menge an aktivem Mittel von mindestens ungefähr 100 μg/kg Körpergewicht verabreicht. In den meisten Fällen werden sie in einer oder mehreren Dosen in einer Menge nicht im Überschuss von ungefähr 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Bevorzugt ist in den meisten Fällen die Dosis von ungefähr 100 μg/kg bis ungefähr 5 mg/kg Körpergewicht täglich.

Die Einsatzgebiete für Medikamente auf Basis der vorliegenden Erfindung sind vielfältig und betreffen durch Fc-gamma-Rezeptor aktivierende Antikörper vermittelte Zustände und/oder Erkrankungen im Bereich der Onkologie, der Infektionskrankheiten, dem muskuloskeletalen System, endokrine und metabolische Funktionsstörungen, der Hämatologie, Atemwegserkrankungen, Erkrankungen des ZNS und der Immunologie und Entzündungserkrankungen.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zum Nachweis von Fc-gamma-Rezeptor aktivierenden Antikörpern in einer Probe, umfassend ein Verfahren zur Messung der Stärke der Interaktion zwischen den konstanten Anteilen eines monoklonalen Antikörpers und eines Fc-Rezeptors gemäß der Erfindung, wobei eine Expression von IL-2 ein Zeichen für das Vorhandensein von Fc-gamma-Rezeptor aktivierenden Antikörpern in der Probe ist.

Eine Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung kann jede potentiell Fc-gamma-Rezeptor aktivierende Antikörper enthaltende Probe sein, wie z. B. Vollblut, Serum (bevorzugt) oder Fraktionen oder Bestandteile davon sein. Weiterhin kann die Probe eine Probe sein, die rekombinant hergestellt Antikörper oder Fc-Regionen umfassende Teile enthält, z. B. eine Probe in einem Puffer oder auf andere aus einer Hybridomakultur gewonnene Antikörperfraktion.

Bevorzugt ist ein Verfahren zum Nachweis von Fc-gamma-Rezeptor aktivierenden Antikörpern in einer Probe gemäß der Erfindung, wobei der aktivierende Antikörper ein Autoimmunantikörper ist.

Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Probe im Rahmen einer onkologischen Erkrankung, einer Infektionskrankheit, einer Autoimmunerkrankung, einer Erkrankung des muskuloskeletalen Systems, einer endokrinen und/oder metabolischen Funktionsstörung, einer hämatologischen Erkrankung, einer Atemwegserkrankung, Erkrankungen des ZNS und/oder einer immunologischen Erkrankung analysiert wird.

Die Erfinder haben ein neues Testsystem entwickelt, um Virus-Immun-IgG nachzuweisen und zu quantifizieren, das in der Lage ist, FcγRs nach Opsonisierung von infizierten Zielzellen zu aktivieren. Unter der Ausnutzung eines umfassenden Sets an FcγR-ζ chimären Rezeptoren wurde die Bindung von poly- oder monoklonalem IgG an Virus-infizierte Zielzellen in eine IL-2 Sekretion durch BW 5147 Zellen umgesetzt. Die Auftrennung von IgG-aktivierten einzelnen FcγRs innerhalb der globalen Virus-spezifischen IgG Antwort zeigte überraschende Unterschiede in der Zusammensetzung von IgG Antworten zwischen Individuen.

Trotz der Tatsache, dass die IgG Bindung an FcγRs während der Induktion und der Effektorphase von Immunantworten entscheidend ist, existiert sehr wenig einfache Methodologie, um diese Immunantworten in vitro zu messen. Diese Beschränkung kann dem Fehlen von einfachen, verlässlichen und standardisierten Tests zugeordnet werden, die möglicherweise zu der relativen Vernachlässigung einer Entwicklung im Hinblick auf FcγR aktivierende Antikörper beitragen. ADCC stellt ein Surrogat für FcγRIII-vermittelte IgG Antworten dar, jedoch erzeugt die Verwendung von primär heterogenen Effektorzellpopulation, wie etwa PBMC oder isolierten und in vitro propagierten NK Zellpopulationen, in ADCC Tests oft Probleme aufgrund der Variabilität in der FcγR und NK-Zellmarkerexpression, sowie dem fluktuierendem Aktivierungsstatus von Effektorzellen. Diese Unwägbarkeiten machen die Interpretation von Testergebnissen schwierig. Als eine Konsequenz ist die Ermittlung von Immun-IgG Titern unter der Verwendung von ADCC Tests weder zuverlässig noch sensitiv und aus diesen Gründen für die Routinediagnostik ungeeignet.

Das vorliegende erfindungsgemäße Testsystem weist mehrere Vorteile gegenüber traditionellen ADCC Tests auf: i) eine homogene Effektorzellpopulation, die nur einen strikt definierten FcγR exprimiert, was den Bedarf an Zellpräparation von Zellspendern beseitigt: ii) eine hohe intra- und inter-Test Reproduzierbarkeit, basierend auf einer konstanten und unbegrenzten Effektorzellpopulation und erhältlichen Immun IgG Standards; iii) ein umfassendes Panel an FcγR zur Messung spezifischer Antworten; iv) niedrige Nachweisgrenzen; und v) eine exzellente Sensitivität des Tests, was quantifizierbare Daten erzeugt. In praktischer Hinsicht: die BW FcγR-ζ Effektorzellen können relativ leicht gehalten werden, und das Testverfahren erfordert keine radioaktiven Isotope.

Der Nachweis von Virus-Immun-Antikörpern in klassischer PRNT basiert auf sehr wenigen antigenen Determinanten, die auf der Virion-Oberfläche vorhanden sind, die mit den kritischen Schritten der Virus-Anheftung und dem Eintritt in die Zielzelle in Zusammenhang stehen. Im Gegensatz dazu ist der Hauptteil von Virus-Immun-IgG, der in Antwort auf Infektion erzeugt wird, gegen nicht-neutralisierende Epitope gerichtet, die durch strukturelle Oberflächenproteine, nicht-strukturelle virale Polypeptide und interne Proteine des Virions gebildet werden, wobei allen die neutralisierende Aktivität fehlt. Diese IgG Spezifitäten umfassen den Hauptteil an biophysikalisch bindenden Antikörpern, die in ELISA Tests reagieren. Die Ziele der in den BW FcγR-ζ Tests nachgewiesenen IgG stellen eine diskrete Klasse von Virusantigenen dar, die durch ihre infizierte Wirtszell-Oberflächendisposition gekennzeichnet sind und schließen daher sowohl strukturelle als auch nicht-strukturelle Transmembranproteine ein, in Abhängigkeit von dem Proteingehalt eines bestimmten Virus. Jedoch erfasst das neue erfindungsgemäße Testprinzip nur diejenigen IgGs, die einen definierten FcγR aktivieren können. wenn an eine virale Determinante in seiner nativen Konformation gebunden, die auf der Oberfläche einer infizierten Zelle präsentiert wird. Mehrere Eigenschaften werden diese Fähigkeit verstärken oder einschränken, einschließlich die Unterklasse des gebundenen IgG Moleküls, der Zahl und der Dichte der Epitope auf der Oberfläche der Zielzelle, die Fluidität der Zielzellmembran, welche die IgG Dislokation nach FcγR Ligation kontrolliert und konformationelle Rearrangments des gebildeten Immunkomplexes. Das Ergebnis, dass Palivizumab und HCMV-Immun IgG CD16, CD32 und CD64 nur dann mit sehr hoher Effizienz zu aktivieren vermögen, wenn sie vorher an ihre Epitope gebunden haben, jedoch nicht in einer monomeren Konformation, verdeutlicht den enormen konformationellen Einfluss des Antigens auf den Erkennungsprozess, der zu einer Aktivierung des FcγR führt.

Im Gegensatz zu neutralisierenden Virion-Epitopen ist sehr wenig über die antigenen Determinanten bekannt, die durch die IgG Klonotypen erkannt werden, die durch den BW FcγR-ζ Test erfasst werden. Daher ist eine direkte Anwendung des Testsystems die Identifizierung und Kartierung von dominanten viralen FcγR-aktivierenden Epitopen, die auf der Oberfläche von infizierten Zelle unter der Verwendung monoklonaler sowie natürlicher polyklonaler IgG präsentiert werden. Bestimmte Viren, wie zum Beispiel Influenza oder HIV, replizieren unter einem rigorosen Selektionsdruck von neutralisierenden IgGs, was zu viralem Immun-Escape führt. Die erfindungsgemäß entwickelten Tests werden dazu verwendet, um zu dokumentieren, ob diese Viren die gleichen oder im wesentlichen gleichen evasiven Mechanismen bei Epitopen verwenden, die durch IgG Spezifitäten erkannt werden, die FcγRs aktivieren. Wenn dann entsprechend an Fc Rezeptoren angepasst, die für andere Ig Unterklassen spezifisch sind, wie zum Beispiel IgA oder IgM, ist der erfindungsgemäße Test für den Nachweis von Immun IgA oder IgM Antworten geeignet. Neben der vielseitigen Anwendung als ein neues Immuntest-Tool für die medizinische Virologie, Parasitologie oder Bakteriologie, kann das erfindungsgemäße Testprinzip in vielen Bereichen der Immundiagnostik und Entwicklung angewendet werden.

Über die letzten Jahre hinweg wurden zahlreiche Belege dafür gesammelt, dass die Beteiligung von definierten FcγRs für die therapeutischen Effekte von Tumor spezifischem IgG, anti-inflammatorische Effekte von intravenösem Ig und IgG-vermittelten Autoimmunerkrankungen von extremer Wichtigkeit ist. Dieses Wissen hat Ansätze stimuliert, IgG als ein therapeutisches Tool für die Immun-Intervention zu entwickeln. Das neue Testsystem der vorliegenden Erfindung ist bei der Verbesserung der Effektivität solcher IgG hilfreich, indem optimale IgG-Fc-FcγR Interaktionen identifiziert werden können.

Besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden mit Hilfe der Figuren und der Beispiele verdeutlicht, ohne dadurch auf diese beschränkt zu werden. Alle hier zitierten Referenzen sind hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

Fig. 1

Setup von FcγR Aktivierungsassays. (A) Schematische Darstellung von FcγR-ζ Chimären. Extrazelluläre Domänen von humanen oder Maus-FcγR (weiß) wurden an die Transmembrandomäne (hellgrau) und den intra-cytoplasmatischen Schwanz von Maus CD3ζ (dunkelgrau) fusioniert. (B) Schematische Darstellung des Testprinzips. FcγR-ζ Ligation durch Immun-IgG ruft die mIL-2 Sekretion in BW FcγR-ζ Effektorzellen hervor. (C) Nachweis von FcγR Chimären auf BW 5147 Transfektanten durch FACS. Dunkelgraue durchgehende Linie: anti-FcγR-FITC mAb. Dunkelgraue gestrichelte Linie: Transfektante ohne Ab. Hellgraue gestrichelte Linie: Parenterale Zelle mit anti FcγR-FITC mAb. Hellgraue durchgehende Linie: sekundärer Ab GAM-FITC. (D) Crosslinking Experimente mit mAb, gerichtet gegen die Ectodomäne der FcγRs, um die intakte Signaltransduktion nachzuweisen. GAM oder Ziege anti Ratte IgG (GAR) wurden in 96-Well Zellkulturplatten bei einer Konzentration of 2 μg/ml beschichtet. Nach Blockieren und Waschen wurden Maus mAbs spezifisch für humane CD16-A/B, humanes CD32, humanes CD64 und Ratte anti-Maus CD16/CD32 hinzugefügt. Als eine negative Kontrolle wurde mAb anti-humanes CD99 verwendet. Nach Entfernen von nicht gebundenen Antikörpern wurden 200.000 BW FcγR-ζ Transfektanten pro Well hinzugefügt. Die mIL-2 Sekretion wurde nach 16 h Inkubation bestimmt.

Fig. 2

IgG vermittelte Aktivierung von BW FcγR-Transfektanten. (A) Cytotect® oder Virion Präparationen wurden in Bindungspuffer (0,1 M Na2HPO4 pH 9,0) beschichtet. Nach Blockieren und Waschen wurden serielle Verdünnungen von Cytotect® IgG (10 mg/ml bis 0,1 mg/ml) zu beschichteten Virionen hinzugefügt und über 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Entfernen von nicht gebundenen Antikörpern wurden pro Well 100.000 Zellen an BW FcγR-ζ Transfektanten hinzugefügt. MRC-5 Zellen wurden mit 2 pfu pro Zelle an HSV-I infiziert. 24 h nach Infektion wurden serielle Verdünnungen von (C) anti-gD HD1 mAb oder (D) Cytotect® hinzugefügt und über 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Entfernen von nicht gebundenem Antikörper wurden pro Well 100.000 BWFcγR-ζ Transfektanten hinzugefügt. mIL-2 wurde nach 16 h mittels ELISA bestimmt. Ein schematisches Diagramm der IgG-abhängigen Aktivierung von BW FcγR-ζ Transfektanten ist unterhalb der Grafiken gezeigt.

Fig. 3

Antigenspezifität von FcγR-ζ Aktivierung durch Immun-IgG. MRC-5 Zellen wurden mit HCMV (2 pfu/Zelle) für 72 h infiziert, Vero Zellen wurden mit HSV (2 pfu/Zelle) für 24 h oder MV (2 pfu/Zelle) für 72 h infiziert, bevor mit IgG von gepoolten humanen Sera opsoniert wurde. ELISA-reaktive Sera wurden mit ELISA nicht-reaktiver Sera bei 2 mg/ml an IgG Konzentration verglichen. Nach Waschen wurden BW FcγR-ζ Effektorzellen in einem E:T Verhältnis von 20:1 hinzugefügt, und die Kulturen wurden für 16 h inkubiert. mIL-2 wurde mittels ELISA gemessen.

Fig. 4

Nachweis von Virus-Immun IgG aktivierenden Wirts-FcγRs in einer großen humanen IgG Präparation. MRC-5 Zellen wurden mit HCMV (2 pfu/Zelle) für 72 h infiziert, Vero Zellen wurden mit HSV (2 pfu/Zelle) für 24 h und MV (2 pfu/Zelle) für 72 h infiziert, Hep-2 Zellen wurden mit RSV (2 pfu/Zelle) für 72 h infiziert, die EBV-infizierte B95.8-Zelllinie wurde anschließend mit den angegebenen Cytotect® Konzentrationen opsoniert. Nach Entfernen von nicht-gebundenem IgG wurden BW FcγR-ζ Effektorzellen bei einem E:T Verhältnis von 20:1 hinzugefügt, und die Kulturen wurden für 16 h inkubiert. Die Menge von mIL-2 wurde mittels ELISA bestimmt. Dieselben Verdünnungen von Cytotect wurden für alle Viren verwendet, mit der Ausnahme von HSV-1. n. t. nicht getestet. Die PRNT Titer von Cytotect® (unten) werden wie für die angegebenen Viren bestimmt gezeigt.

Fig. 5

Immunogramme: Analyse von heterogenen MV IgG Reaktionsmustern von individuellen Seren. Individuelle Spenderseren wurden mit den angegebenen Tests auf MV-spezifische IgG Antworten hin analysiert. Die Reihenfolge der Proben wurde gemäß der relativen Größenordnung der mittels ELISA gemessenen Antwort angeordnet. Spender Nr. 19 und Nr. 33 sind jeweils durch schwarze und weiße Pfeile hervorgehoben. Mit einem Sternchen hervorgehobene Spender wurden als unterhalb der Nachweisgrenze jedes Tests gefunden. Lineare Korrelationswerte (R2), die die Linearität für jeden Test bestimmen, sind angegeben. Cyt Cytotect®, neg. ein negativer Spender.

Fig. 6

Immungramme: Analyse von HCMV IgG Reaktionsmustern von individuellen Seren. Individuelle Spenderseren wurden mit den angegebenen Tests auf HCMV-spezifische IgG Antworten hin analysiert. Die Reihenfolge der Proben wurde gemäß der relativen Größenordnung der mittels ELISA gemessenen Antwort angeordnet. Die in den hCD16-ζ und hCD32-ζ Tests gesehenen Profile waren erstaunlich übereinstimmend. Spender Nr. 7 und Nr. 20 sind jeweils durch schwarze und weiße Pfeile hervorgehoben. Mit einem Sternchen hervorgehobene Spender wurden als unterhalb der Nachweisgrenze jedes Tests gefunden. Lineare Korrelationswerte (R2), die die Linearität für jeden Test bestimmen, sind angegeben. Cyt Cytotect®, neg. ein negativer Spender.

Fig. 7

Subzusammensetzung der Virus-spezifischen IgG Antwort („Immungramm”). Als ein Teil der Gesamtmenge an Serum IgG ist der Pool an Virus-immunen Ab durch ELISA in Abhängigkeit von der Anordnung an viralen Antigenen, die in dem Test repräsentiert sind, und den biophysikalische Bindeeigenschaften von Immun-IgGs nachweisbar. Innerhalb der ELISA-reaktiven IgG-Fraktion besitzen einige Virus-immun-IgG Klonotypen distinkte funktionelle Eigenschaften, d. h. Virion-Neutralisierung oder Aktivierung von FcγRs (CD16, CD32 oder CD64) nach Erkennung von viralen Epitopen auf der Zelloberfläche. Einige IgGs können überlappende funktionelle Merkmale aufweisen.

Beispiele

In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren im Zusammenhang mit einer Immunantwort von Antikörpern gegen virale Antigene getestet. Es sollte verstanden werden, dass die Verfahren der Erfindung entsprechend auch für Antikörper angewendet werden kann, die andere Antigene erkennen.

Sowohl strukturelle wie auch nicht-strukturelle virale Proteine induzieren Antigen-spezifische IgG Antworten. Der Nachweis von Virus-spezifischen IgG ist für diagnostische Zwecke in vielen klinischen Anwendungen essentiell. Die Anwesenheit von Immun-IgG wird regelmäßig durch prototypische in vitro Tests nachgewiesen, umfassend durch ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay), Zell-basierte Immunfluoreszenztests, Immunblots, Hemagglutinations-Inhibierung und Virus Neutralisationstests. Jedoch liefert lediglich die letztgenannte Methode eine direkte Information über eine biologische Effektorfunktion des Immun-IgG. Lediglich ein Teil der Virus-spezifischen IgG bewirkt eine direkte antivirale Aktivität durch Inhibieren der Infektiösität von Virionen, Komplementaktivierung oder FcγR Aktivierung. Neutralisierende Antikörper inhibieren die Virusbindung an Eintrittsrezeptoren der Zielzelle oder verhindern die Virusfusion mit der Wirtsmembran. Jedoch sind viele der Epitope, die auf der Virion- oder Zelloberfläche exponiert sind, wenn IgG an diese bindet nicht-neutralisierend. Unterfraktionen von IgG können weitere Immunfunktionen durch Komplementaktivierung hervorrufen, womit sie die Phagocytose (Opsonisierung) erhöhen und ADCC (Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität) hervorrufen. Beobachtungen in B Zell defizienten Mäusen zeigten eine prominente Rolle für IgG bei der Kontrolle der Virusreplikation und Reinfektion. Die Neutralisierung der Virus-Infektiösität durch Abs ist ein effektiver Weg, um die Infektion aufzuhalten, was den Impfstoff-vermittelten Schutz den neutralisierenden IgGs erklärt. Das Versagen von adoptiv übertragenen neutralisierenden Abs vor spezifischen viralen Erkrankungen zu schützen, die als sensitiv gegenüber der Ab Immunkontrolle bekannt sind, lässt vermuten, dass nicht-neutralisierende Abs signifikant zu einem Schutz beitragen können.

Von den FcγR-vermittelten Immunantworten, einschließlich ADCC und der Zytokin-Freisetzung, wird angenommen, dass sie essentielle Komponenten der Antwort auf Pathogene und insbesondere Viren sind. ADCC führt zur Lyse von virus-infizierten Zellen, wenn Immun-IgG opsonierte Zielzellen von FcγR tragenden cytotoxischen Effektorzellen aktiviert erkannt werden und diese aktivieren. Verschiedene FcγRs tragen zu klassischen ADCC Antworten bei, für CD16 + NK Zellen wurde gezeigt, dass diese den Prozess am effizientesten hervorrufen. Verschiedene Verfahren, um ADCC in vitro zu messen, wurden entwickelt (Clémenceau B, Congy-Jolivet N, Gallot G, Vivien R, Gaschet J, Thibault G, Vié H. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is mediated by genetically modified antigen-specific human T lymphocytes. Blood. 2006 Jun 15; 107(12): 4669–77. Epub 2006 Mar 2; Gómez-Román VR, Florese RH, Patterson LJ, Peng B, Venzon D, Aldrich K, Robert-Guroff M. A simplified method for the rapid fluorometric assessment of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 2006 Jan 20; 308(1–2): 53–67. Epub 2005 Nov 28; Kantakamalakul W, Pattanapanyasat K, Jongrakthaitae S, Assawadarachai V, Ampol S, Sutthent R. A novel EGFP-CEM-NKr flow cytometric method for measuring antibody dependent cell mediated-cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-1 infected individuals. J Immunol Methods. 2006 Aug 31; 315(1–2): 1–10. Epub 2006 Jul 17; Lichtenfels R, Biddison WE, Schulz H, Vogt AB, Martin R. CARE-LASS (calcein-release-assay), an improved fluorescence-based test system to measure cytotoxic T lymphocyte activity. J Immunol Methods. 1994 Jun 24; 172(2): 227–39), jedoch sind viele Tests mit dem Nachteil behaftet, dass sie inhomogene Effektorzellen verwenden, die in Typ und Dichte der FcγR Expression stark variieren. Zusätzlich sind diese Effektorzellen schwierig zu präparieren und in Kultur zu halten und stehen daher nur begrenzt zur Verfüngung. Diese Schwierigkeiten könnten überwunden werden, wenn eine klonale Effektorzell-Population verwendet würde, die einen definierten FcγR exprimiert. Daher wurde eine Auswahl von neuen Effektorzellen etabliert, um die Kapazität von (in diesem Fall beispielhaften und bevorzugten Virus-spezifischen IgG zu messen, definierte Typen von FcγRs zu aktivieren. Die Tests umfassen die Kokultivierung von Virus-infizierten Zielzellen mit BW 5147 Transfektanten, die stabil einen chimären FcγR exprimieren, in Anwesenheit von poly- oder monoklonalem Immun-IgG. Die FcγR Chimären tragen die extrazelluläre Domäne von definierten FcγRs, d. h. humanem CD16, CD32, CD64 und Maus CD16, die an die Transmembran- und intrazelluläre Schwanz Domäne der Maus CD3-ζ Kette fusioniert sind. Nach Aktivierung der chimären FcγRs wird Maus IL-2 sekretiert und kann leicht gemessen werden. Daher quantifiziert das Testsystem die Kapazität von Virus-Immun-IgG, FcγRs auf eine Rezeptortyp-spezifische Weise zu aktivieren nach der Erkennung eines natürlich gebildeten Epitop, das auf der Oberfläche von infizierten Zielzellen präsentiert wird.

Durch die Verwendung einer vergleichbaren und umfassenden Reihe von Typ-spezifischen FcγR Tests mit einem großen Pool an polyklonalem humanem Immun-IgG konnten substantielle Unterschiede bei der Aktivierung von FcγRs zwischen verschiedenen Viren gezeigt werden. Darüber hinaus wurden individuelle Typen von FcγRs unterschiedlich stark aktiviert, wobei die CD16 Antworten als stärkste identifiziert wurden. Dann wurde eine Reihe von humanen Seren auf die individuelle Kapazität hin gestestet, nach Opsonierung an Virus-infizierte Zellen FcγRs zu aktivieren. Hierbei wurde nur eine schlechte Korrelation zwischen der globalen IgG Antwort mit Spezifität für Masernvirus (MV) und humanem Cytomegalovirus (HCMV) gefunden, wenn diese mit ELISA gemessen wurden, ebenso wie auch im Vergleich mit neutralisierenden IgG gegen das jeweilige Virus.

Klonierung der FcγR-ζ Konstrukte

Die Klonierung der cDNAs, die für die menschlichen FcyRs CD16a (Variante mit höherer Affinität mit einem Valin in Position 15U (Bowles JA, Weiner GJ. CD16 polymorphisms and NK activation induced by monoclonal antibody-coated target cells. J Immunol Methods. 2005 Sep; 304(1–2): 88–99)), CD32a und CD64 kodieren, wurde beschrieben (Allen JM, Seed B. Isolation and expression of functional high-affinity Fc receptor complementary DNAs. Science. 1989 Jan 20; 243 (4889): 378–81; Stengelin S, Stamenkovic I, Seed B. Isolation of cDNAs for two distinct human Fc receptors by ligand affinity cloning. EMBO J. 1988 Apr; 7(4): 1053–9).

Zur Klonierung von Maus CD16 wurde cDNA aus C57BL/6 Splenocyten präpariert. Der extrazelluläre Teil aller FcyRs wurde mittels PCR unter der Verwendung geeigneter Primerpaare mit Restriktionsstellen durchgeführt.

Die FcγR-ζ Gene wurden in den pcDNA3.1 Expressionsvektor (Invitrogen Corp, Carlsbad, California, USA) kloniert und dazu verwendet, stabile BW Transfektanten zu erzeugen. Die humane CD16-ζ und die hBW CD99-ζ Transfektanten wurden beschrieben (Mandelboim O, Malik P, Davis DM, Jo CH, Boyson JE, Strominger JL. Human CD16 as a lysis receptor mediating direct natural killer cell cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 May 11; 96(10): 5640–4; Mandelboim O, Lieberman N, Lev M, Paul L, Arnon TI, Bushkin Y, Davis DM, Strominger JL, Yewdell JW, Porgador A. Recognition of haemagglutinins an virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells. Nature. 2001 Feb 22; 409(6823): 1055–60).

IgG abhängige Aktivierung der BW FcγR-ζ Transfektanten. Um die Aktivierung der BW FcγR-ζ Zellen durch monomeres IgG und durch Immunkomplexe zu ermitteln, wurden jeweils humanes IgG (Cytotect®) und gereinigte HCMV und MCMV Virion Präparationen auf Platten beschichtet. Um die Reaktionsfähigkeit von BW FcγR-ζ Transfektanten auf IgG zu testen, wenn ein natives virales Zelloberflächenantigen erkannt wird, wurde ein Co-Kultivierungstest durchgerührt. Die Ab-vermittelte Signalgebung durch den chimärien Maus CD16 FcγR-ζ Rezeptor wurde unter der Verwendung von abgestuften Konzentrationen of Maus mAb HD-I getestet, der ein Oberflächenepitop von HSV-1 gD nach Inkubation mit HSV-1 infizierten MRC-5 Fibroblasten erkennt. In anderen Experimenten wurden Mock- und Virus-infizierte Zellen mit zweifachen seriellen Verdünnungen von humanen Seren in vollständigem D-MEM für 30 min bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit Vollmedium gewaschen, um nicht gebundenes IgG zu entfernen, bevor der Co-Kultivierung mit BW FcγR-ζ Transfektanten für 16 h durchgeführt wurde. In Standardexperimenten wurden alle Tests in dreifachen Ansätzen durchgeführt, und das Verhältnis von Effektor (BW FcγR-ζ Transfektanten) zu Virus-infizierter Zielzelle war 20:1. Nach Co-Kultivierung für 16 h bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre wurden die Überstände 1:2 in ELISA Probenpuffer (PBS mit 10% FBS und 0,1% Tween 20) verdünnt, und mIL-2 wurde mittels ELISA gemessen. Wenn der BW FcγR-ζ Test auf Suspensionszellen angewendet wurde, wurden V-Boden Zellkulturschalen verwendet. 1 × 104 EBV-infizierte B95.8 Zellen wurden zu vorverdünnten Seren hinzugegeben. Nach der Inkubation der Zellen für 30 min bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 folgte das Waschen der Zellen in drei Runden, um nicht gebundenes IgG zu entfernen. Die Co-Kultivierung der BW FcγR-ζ Transfektanten und der Nachweis von IL-2 wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Um die Spezifität, Sensitivität, negative und positive Vorhersagewerte und die Testeffizienz der BW hCD16-ζ, der BW hCD32-ζ und der BW hCD64-ζ Tests zu bestimmen, wurde die Gruppe von Seren von 38 Spendern mit unbekanntem MV-Serastatus in einem IgG- und einem IgM-MV spezifischen ELISA (Enzygnost, Dade Behring, Deutschland) getestet. Nur MV-IgM negative Seren wurden in einem MV Plaquereduktions-Neutralisierungstest (PRNT) and dem BW FcγR-ζ Aktivierungstests analysiert. Weiterhin wurde eine Reihe von 46 gesunden Spendern mit unbekanntem HCMV Serostatus in einem HCMV IgG und IgM ELISA und in PRNT unter der Verwendung von HCMV AD169 getestet. HCMV-IgM negative Seren wurden in den BW hCD16-ζ, den BW hCD32-ζ und den BW hCD64-ζ Tests analysiert. Positive Werte in dem BW FcγR-ζ Test wurden als die berechnete Serumverdünnung definiert, die benötigt wird, um den Ausschlusswert zu erreichen. Der Ausschlusswert wurde aus der Aktivierung der BW Transfektanten nach co-Kultivieren mit infizierten Zellen und Seren von 15 verschiedenen seronegativen Spendern ermittelt. Zu diesem arithmetischen Mittelwert von durch die 15 seronegativen Spender induziertem mIL-2 wurden drei SD (Standardabweichungen) hinzuaddiert, und dieser Wert wurde als der Ausschlusswert definiert.

Erzeugung von stabilen FcγR-ζ BW 5147 Transfektanten und Nachweis von mIL-2

TCRαβζ negative BW 5147 Thymomazellen wurden unter der Verwendung von Superfect (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) mit pcDNA3.1 Konstrukten transfiziert, die für FcγR-ζ Chimären kodieren. Die Aktivierung der cytoplasmatischen Domäne der TCR-ζ-Kette ist ausreichend, um die IL-2 Sekretion auszulösen (Irving BA, Weiss A. The cytoplasmic domain of the T cell receptor zeta chain is sufficient to couple to receptor-associated signal transduction pathways. Cell. 1991 Mar 8; 64(5): 891–901). Stabile BW Transfektanten wurden bei Konzentrationen von 3 mg/ml Geneticin (G418) (Sigma-Aldrich, Deutschland) selektiert. Nach 4 Wochen wurden die FcγR Oberflächenexpression mittels FACS (Excalibur, Betton Dickinson, Kalifornien, USA) unter der Verwendung von Maus anti-human CD16-FITC (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland), Maus anti-human CD32-FITC (BD PharmigenTM, Erembodegem, Belgien), Maus anti-Maus CD64 (BD PharmigenTM, Erembodegem, Belgien), Ratte anti-Maus CD16/CD32 (BioLegend, Inc, San Diego, Kalifornien), Ziege anti-Ratten IgG-FITC (Sigma-Aldrich, Deutschland) und Maus Fc-FITC (Rockland Immunochemicals, PA. USA) getestet.

Aus BW FcγR-ζ Transfektanten sekretiertes mIL-2 wurde durch ELISA unter der Verwendung des Capture Ab JES6-1A12 und dem biotinylierten Nachweis-Antikörper JES6-5H4 (BD PharmigenTM, Erembodegem, Belgien) gemessen. Die Nachweisgrenze lag bei etwa 3 pg/mL IL-2.

Um die maximalen Spiegel an mIL-2 Induktion der Transfektanten zu ermitteln, wurden FcγR-ζ-Crosslinking Experimente durchgeführt. Ziege anti-Maus IgG (Dianova Deutschland) oder Ziege anti-Ratte IgG (Dianova Deutschland) wurden in 96-well Zellkulturplatten bei einer Konzentration von 1 μg/mL in Bindepuffer (0,1 M Na2HPO4 pH 9.0) beschichtet. Nach Blockieren und Waschen wurden Maus mAb, spezifisch für menschliches CD16-A/B (Santa Cruz Biotechnology, USA), menschliches CD32 (Santa Cruz Biotechnology, USA), menschliches CD64 (Ancell Corporation, USA) und Ratte anti-Maus CD16/CD32 (BioLegend, Inc, San Diego, Kalifornien) hinzugefügt. Als eine Negativkontrolle wurde anti-Mensch CD99 mAb verwendet. Nach Entfernen von nicht gebundenen Antikörpern wurden 200.000 BW FcγR-ζ Transfektanten pro Well hinzugefügt. Die mIL-2 Sekretion wurde nach 16 h Inkubation bestimmt.

Die stabile Expression von FcγR-ζ Chimären vermittelt die Aktivierung von BW FcγR-ζ Transfektanten

Maus BW 5147 Thymomazellen, denen die TCR α, β und ζ Ketten fehlten, wurden mit Konstrukten transfiziert, die für chimäre FcγR Proteine kodierten, in denen jeweils der extrazelluläre Teil von humanem CD16, humanem CD32, humanem CD64 and Maus CD16 an die Transmembran- und intrazelluläre Schwanzdomäne der CD3ζ Kette fusioniert war (1A). Daher simuliert die durch die Ligandenbindung an den chimären FcγR initiierte Signalkaskade die TCR Aktivierung (1B). Die Expression von chimären FcγR durch G41U resistente Zellen wurde durch Zelloberflächen-Färbung und FACS Analyse bestimmt. Alle chimären FcγR wurden in hoher Dichte auf der Plasmamembran von BW Zellen nachgewiesen (1C). Um eine intakte Signaltransduktion durch die hCD16-ζ, hCD32-ζ, hCD64-ζ und mCD16-ζ Rezeptoren nachzuweisen, wurden gegen jede der FcγR Ectodomänen gerichtete mAbs in crosslinking Experimenten verwendet. Alle Transfektanten antworteten effizient und sekretierten hohe Spiegel an mIL-2, während ein mAb gerichtet gegen CD99 IL-2 nicht induzierte (1D). Eine hCD99-ζ Chimäre diente als eine weitere Kontrolle. Die Dosis-abhängige Freisetzung von mIL-2 aus BW hCD99-ζ Transfektanten wurde durch Inkubation mit anti-humanem CD99 mAb erreicht, jedoch nicht, wenn die BW hCD99-ζ Transfektanten mit einem mAb behandelt wurden, der gegen humanes CD16 gerichtet war. Alle BW Transfektanten antworteten somit effizient, wenn durch spezifische mAbs kreuzvernetzt, die gegen die extrazelluläre Domäne der chimären FcγR gerichtet waren.

Universelle Anwendbarkeit der Tests, um Virus-spezifische IgG nachzuweisen

Die hier gezeigten Daten zeigten, dass FcγR-ζ Transfektanten auf Immun-IgG ansprechen, die an Epitope gebunden sind, die auf HSV- und RSV-infizierten Zellen sowie HCMV Virionen präsentiert werden. Um zu ermitteln, ob die FcγR-ζ Aktivierungstests auch angewendet werden können, um Immun-IgG gegen andere humanpathogene Viren und andere Antigene nachzuweisen, wurde die Analyse auf Zielzellen ausgedehnt, die mit dem β-Herpesvirus HCMV, dem γ-Herpesvirus EBV und dem paramyxoviridae Familienmitglied MV infiziert waren, wenn diese mit verschiedenen Konzentrationen an Cytotect® opsonisiert waren. Eine echte Antigenspezifität von Virusnachweis wurde zuerst durch gepoolte humane Seren sichergestellt, die in ELISAs nicht-reaktiv waren, wobei Immun-IgG gegen die bestimmten Viren (nicht-immune Seren) die keine FcγR-ζ Antworten hervorriefen nachgewiesen wurden, in Gegensatz zu Pools von ELISA-reaktiven (immunen) Seren (5).

Wie in 6 gezeigt, war Immun-IgG, das in Cytotect® vorhanden ist, in der Lage, BW hCD16-ζ Zellen, BW hCD32-ζ Zellen und BW hCD64-ζ, jedoch keine BW hCD99-ζ Zellen nach co-Kultivierung mit Zielzellen zu aktivieren, die mit den Viren des Testpanels infiziert waren, allerdings mit unterschiedlicher Effizienz. Die Aktivierung von BW hCD16-ζ Zellen durch Cytotect® war im Allgemeinen effizienter als die Aktivierung von BW hCD32-ζ, während BW hCDCD64-ζ Transfektanten am schwächsten stimuliert wurden. Wesentliche Unterschiede zwischen Viren wurden beobachtet, da hCD32-ζ eindeutig weniger nach co-Kultivierung mit HCMV und EBV-infizierten Zellen aktiviert wurde, als im Vergleich mit HSV oder den beiden Paramyxoviren. Die Titer für HSV-Immun-IgG, die für die Aktivierung aller FcγR-ζ Rezeptoren gemessen wurden, waren im Vergleich zu allen anderen Viren die höchsten in der Cytotect® Präparation. Im Gegensatz zu den FcγR aktivierenden IgG wurde die HSV-neutralisierende Kapazität von Cytotect® in einem ähnlichen Bereich gefunden, im Vergleich zu MV und HCMV, wo die mittels 50% PRNT gemessenen Titer wesentlich höher lagen (RSV: 0,025 mg/ml; MV: 0,018 mg/ml; HCMV: 0,066 mg/ml; 6). Zusammen genommen wurde mittels der FcγR-ζ-basierten Tests gezeigt, dass sie für alle getesteten Viren, d. h. sehr breit und damit auch prinzipiell für andere Oberflächenantigene anwendbar sind. Die Titer von Virus-spezifischem IgG, der innerhalb eines großen Pools aus humanen Seren in der Lage ist, FcγR Antworten hervorzurufen, hängt von dem jeweiligen Virus und dem FcγR Typ ab. Es findet sich keine Korrelation mit der Konzentration an neutralisierenden IgG (siehe nachfolgende Tabellen). Tabelle 1Korrelation zwischen den verschiedenen verwendeten Tests zum Nachweis von MV-IgG

ELISAPRNTBW hCD16-ζBW hCD32-ζBW hCD64-ζELISA1.00PRNT0.761.00BW hCD16-ζ0.940.6U1.00BW hCD32-ζ0.930.670.9U1.00BW hCD64-ζ0.U60.5U0.910.921.00
Tabelle 2Effizienz der FcγR-ζ basierten Tests im Vergleich zu MV IgG ELISAPRNTBW hCD16-ζBW hCD32-ζBW hCD64-ζSensitivity100.0100.0100.096.6Specificity90.0100.0100.090.9Negative Predictive Value100.0100.0100.090.9Positive Predictive Value96.7100.0100.096.6Test Efficiency97.4100.0100.095.0
Tabelle 3Korrelation zwischen den verschiedenen verwendeten Tests zum Nachweis von HCMV-IgGELISAPRNTBW hCD16-ζBW hCD32-ζBW hCD64-ζELISA1.00PRNT0.971.00BW hCD16-ζ0.U50.U71.00BW hCD32-ζ0.U50.UU0.U41.00BW hCD64-ζ0.790.770.6U0.751.00
Tabelle 4Effizienz der FcγR-ζ basierten Tests im Vergleich zu HCMV IgG ELISAPRNTBW hCD16-ζ BW hCD32-ζBW hCD64-ζSensitivity90.595.2U1.095.2Specificity100.092.392.376.9Negative Predictive Value92.996.0U5.795.2Positive Predictive Value100.090.9U9.576.9Test Efficiency95.793.6U7.2U5.1

Es sollte verstanden werden, dass die Merkmale der Erfindung, wie hier beschrieben und offenbart, nicht nur in der jeweiligen angegebenen Kombination, sondern auch auf eine einzelne Weise verwirklicht werden können, ohne sich vom vorgesehenen Bereich der vorliegenden Erfindung zu entfernen.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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