Title:
Antibiotische Peptide
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft Peptid oder Peptidderivat, mit den Formeln:
Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-
I16-Y17-N18-X4-Sub2
Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-
I16-Y17-N18-N19-X4-Sub2
Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-
I16-P17-N18-X4-Sub2
X1 ist ein unpolarer, hydrophober oder ein positiv geladener Rest, D2 ist Aspagaragin oder Glutamin, K3, X2 und X4 sind positiv geladene Reste, X3 ist ein positiv geladener Rest, Prolin oder ein Prolinderivat; L7 und I16 sind unpolare, hydrophobe Reste, Y6 und Y17 sind Tyrosin, R9 und R14 sind Arginin, N18 und N19 sind Asparagin oder Glutamin, P4, P5, P8, P10, P12, P13 und P17 sind Prolin, Hydroxyprolin oder deren Derivate, wobei gegebenenfalls ein oder zwei der Reste ausgewählt aus D2, P4, P5, P8, P10, P12, P13, P17 und Y17 durch einen beliebigen Rest ersetzt und/oder P13 und R14 vertauscht sind, Sub1 ist der freie oder modifizierte N-Terminus und Sub2 der freie oder modifizierte C-Terminus. ...




Inventors:
Hoffmann, Ralf, Prof. Dr. (Großpösna, 04463, DE)
Hansen, Anne Klara Brigitte (Leipzig, 04155, DE)
Knappe, Daniel, Dipl.-Chem. (Leipzig, 04105, DE)
Application Number:
DE102009007381
Publication Date:
08/05/2010
Filing Date:
01/29/2009
Assignee:
AMP-Therapeutics GmbH & Co. KG (Leipzig, 04103, DE)
International Classes:



Foreign References:
WO2009013262A12009-01-29
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Attorney, Agent or Firm:
Vossius & Partner (München, 81675)
Claims:
1. Peptid oder Peptidderivat, welches eine der folgenden Sequenzen enthält: Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-I16-Y17-N18-X4-Sub2Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-I16-Y17-N18-N19-X4-Sub2Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-I16-P17-N18-X4-Sub2X1 ist ein Rest mit einer unpolaren, hydrophoben Seitenkette oder mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette;
D2 ist ein Asparaginsäure- oder Glutaminsäurerest,
K3 ist ein Rest mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette, bevorzugt Lysin oder Arginin,
X2 und X4 sind unabhängig von einander ausgewählt aus Resten mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette;
X3 ist ein Rest mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette oder Prolin oder ein Prolinderivat;
L7 und I16 sind unabhängig von einander ausgewählt aus Resten mit einer unpolaren, hydrophoben Seitenkette, bevorzugt Leucin, Isoleucin und Valin,
Y6 und Y17 sind jeweils Tyrosin, R9 und R14 sind jeweils Arginin, N18 und N19 sind jeweils Asparagin oder Glutamin, P4, P5, P8, P10, P12, P13 und P17 sind unabhängig von einander ausgewählt aus Prolin und Prolinderivaten oder Hydroxyprolin und Hydroxyprolinderivaten, wobei gegebenenfalls P13 und R14 vertauscht sind, und/oder
gegebenenfalls ein oder zwei der Reste ausgewählt aus D2, P4, P5, P8, P10, P12, P13,P17 und Y17 durch einen beliebigen Rest ersetzt sind,
Sub1 ist der freie N-Terminus der Aminosäure X1 oder eine modifzierte N-terminale Aminogruppe;
Sub2 ist die freie C-terminale Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure (-COOH) oder eine modifizierte C-terminale Carboxylgruppe.

2. Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 1, in welchem der N-Terminus direkt oder über einen Linker mit einem weiteren Peptid verknüpft ist.

3. Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Peptid ein Zell-penetrierendes Peptid ist, bevorzugt ausgewählt aus Penetratin, Tat-Peptiden, amphipathischen Modell-Peptiden und Transportans.

4. Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, welches mindestens einen zusätzlichen Rest X5 und/oder X6 in Sub2 enthält, wobei X5 ausgewählt ist aus Prolin oder einem Prolinderivat oder einem Baustein, der eine positive Nettoladung oder eine unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Seitenkette trägt und wobei X6 ausgewählt ist aus Prolin, einem Prolinderivat, einem polaren Baustein oder einem hydrophoben Baustein.

5. Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest X1 ausgewählt ist aus Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, β-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, Nitroarginin, N-Methyl-Arginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, p-Aminobenzoesäure und 3-Aminotyrosin, Valin, Isoleucin, Leucin und Methionin, Alanin, Phenylalanin, N-Methylleucin, tert.-Butylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, 1-Aminocylcohexylcarbonsäure, N-Methylisoleucin, Norleucin, Norvalin und N-Methylvalin.

6. Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest X2 und/oder der Rest X4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Arginin, Lysin, 6-Hydroxylysin, Homoarginin, β-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2,4-Diaminobuttersäure, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, N-Methyl-Arginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, p-Aminobenzoesäure und 3-Aminotyrosin.

7. Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest X3 ausgewählt ist aus Arginin, Lysin, δ-Hydroxylysin, Homoarginin, β-Homoarginin, D-Arginin, Arginal, 2,4-Diaminobuttersäure, β-Homoarginin, 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, Nitroarginin, Nitrosoarginin, N-Methyl-Arginin, ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, p-Aminobenzoesäure, 3-Aminotyrosin, Prolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin und Pseudoprolin.

8. Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 5 bis 9, 14 bis 26, 29, 30, 32, 33, 36, 38, 40, 41, 44 bis 46, 49, 50, 53 bis 59, 61 bis 85, 93, 94, 101, 102.

9. Peptid oder Peptidderivat enthaltend ein anti-bakterielles Peptid und ein Zell-Penetrierendes Peptid, bevorzugt ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID No. 95 bis 102 und 106.

10. Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Peptidbindungen des Peptidrückgrats chemisch modifiziert ist.

11. Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen X6-X7 eine unter physiologischen Bedingungen nicht spaltbare chemische Bindung ist.

12. Peptid oder Peptidderivat gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die chemisch modifizierte Bindung ausgewählt ist aus einer reduzierten Amidbindung, einer alkylierten Amidbindung oder eine Thioamidbindung.

13. Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, welches mit einem Protein verbunden oder an ein Polymer gekoppelt ist oder an einen Träger gebunden ist.

14. Multimer, in dem mindestens zwei Peptide oder Peptidderivate miteinander verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der Peptide oder Peptidderivate ein Peptid oder Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 ist.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Peptid, Peptidderivat oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 enthält.

16. Verfahren zur Herstellung eines Peptid oder Peptidderivat oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid oder Peptidderivat oder Multimer durch chemische Synthese oder mittels rekombinanter Methoden hergestellt wird.

17. Verwendung eines Peptids, Peptidderivats oder Multimers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 in der Medizin, als Antibiotikum, in einem Desinfektions- oder Reinigungsmittel, als Konservierungsmittel oder in einem Verpackungsmaterial.

18. Verwendung nach Anspruch 17 zur Behandlung von mikrobiellen, bakteriellen oder Pilz-Infektionen oder Verunreinigungen mit Mikroben, Bakterien oder Pilzen.

19. Verwendung eines Peptids, Peptidderivats oder Multimers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 in der pharmazeutischen Forschung oder in einem Screeningverfahren.

20. Ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die vorrausichtlich eine antimikrobielle, bakterizide oder antimykotische Wirkung aufweist, welches folgendes umfasst:
(i) Durchführung eines kompetitiven Assays mit:
(a) einem Mikroorganismus der gegenüber einem Peptid, Peptidderivat oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 empfindlich ist;
(b) einem Peptid, Peptidderivat oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 und
(c) mindestens einer zu testenden Substanz
durch in Kontakt bringen von (a) mit (b) und (c); sowie
(ii) Auswahl einer Testsubstanz, welche kompetitiv die Bindung des Peptids, Peptidderivats oder Multimers an den Mikroorganismen verdrängt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählte Substanz anschließend weiter auf eine antimikrobielle oder antimykotische Verwendung getestet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine Spezies ist, die einer der Gattungen ausgewählt aus Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Erwinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti und Haemophilus influenzae angehört.

23. Nukleinsäure codierend für ein Peptid oder Multimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14.

24. Wirtszelle, welche mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 23 transfiziert oder transformiert ist.

Description:

Diese Erfindung betrifft antibiotische Peptide und Peptiderivate insbesondere für die Verwendung in der Medizin.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen und Methoden zum Abtöten von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, und Methoden zur Behandlung mikrobieller Infektionen. Die Erfindung beinhaltet weiterhin eine Methode für das Wirkstoff-Screening.

Das Auftreten ernsthafter Bakterien- und Pilzinfektionen ist ein steigendes Problem trotz bemerkenswerter Fortschritte in der Antibiotikatherapie. Jedes Jahr gibt es mehr als 40 Millionen Krankenhausaufenthalte in den Vereinigten Staaten von Amerika und mehr als 2 Millionen dieser Patienten infizieren sich im Krankenhaus. In 50–60% dieser Fälle sind Antibiotikaresistente Bakterien involviert [1]. Diese im Krankenhaus erworbenen Krankheiten (ihren zu schätzungsweise 60.000–70.000 Todesfällen in den USA und bis zu 10.000 Todesfällen in Deutschland [2]. Während resistente Gram-negative Bakterien in den 70iger Jahren das Hauptproblem darstellten, konnte im letzten Jahrzehnt ein Anstieg der Fälle beobachtet werden, in denen Gram-positive Bakterien, die gegenüber mehreren Antibiotika resistent sind, eine Rolle spielen [3]. Das derzeitige rasante Auftreten resistenter Stämme betrifft sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Pathogene [4]. Hierbei entwickelten sich Resistenzen zuerst in Arten, in denen Einfachmutationen genügten um klinisch wichtige Level zu erreichen z. B. Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa; es folgten Bakterien, in denen multiple Mutationen notwendig waren, wie z. B. E. coli und Neisseria gonorrhoeae. Dies wird vornehmlich durch den häufigen Einsatz von Fluoroquinologen-Antibiotika verursacht [5]. Ein weiterer wichtiger Grund der Resistenzentwicklung in Gram-negativen Bakterien ist das große Spektrum an Laktamasen in Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae [6]. Nahezu die Hälfte der klinisch relevanten Stämme von Haemophilus ducreyi, der Verursacher von Ulcus molle, trägt Gene, die dieses Bakterium gegen Amoxicillin, Ampicillin und eine Reihe anderer β-Laktame resistent machen [7]. Gleichermaßen stieg die Resistenz von Salmonella enterica serovar typhimurium gegenüber Tetrazyklinen von Null Prozent im Jahr 1948 auf 98% im Jahr 1998 [8].

Dies verdeutlicht die Notwendigkeit der weiteren Suche nach neuen Antibiotika. Induzierbare antibakterielle Peptide repräsentieren ein Forschungsfeld, in dem die heutige Biochemie, Immunologie und Wirkstoffforschung zusammentreffen. Peptidantibiotika, mit einer Größe von 13 bis zu mehr als hundert Aminosäuren, wurden aus Pflanzen, Tieren und Mikroben isoliert [9].

Ein einzelnes Tier besitzt ca. 6–10 Peptidantibiotika, wobei jedes Peptid oft ein komplett anderes Aktivitätsspektrum zeigt [10]. Es ist bekannt, dass die überwältigende Anzahl an antibakteriellen Peptiden einschließlich den gut untersuchten Defensinen, Cecropinen und Magaininen, durch einen ”lytischen/ionischen” Mechanismus wirken. Als gemeinsamen Wirkmechanismus dieser ”lytischen” Peptide wird ein permeabilisierender Effekt auf die bakterielle Zytoplasmamembran diskutiert [11–13]. Eine kationische, amphipathische Struktur, die hydrophile Ionen-(Protonen-)Kanäle in einer Lipiddoppelschicht ausbildet, ist Grundlage dieser Aktivität. Durch das Austreten von Protonen wird das für viele grundlegende Lebensprozesse notwendige Membranpotential zerstört und so die Zelle abgetötet. Da die Störung der Membran durch diese Peptide von der Erkennung chiraler Moleküle abhängig ist, wird ein Aminosäureaustausch, der die generelle amphipathische Struktur oder basische Nettoladung nicht aufhebt, funktionell toleriert [14, 15]. Diese lytischen Peptide wirken oft in höheren Konzentrationen toxisch auf Säugetiermembranen, was ihre Eignung als mögliche Arzneimittel einschränkt. Wird Prolin in die Sequenz der α-helikalen antimikrobiellen Peptide eingefügt, so sinkt, in Abhängigkeit von der Anzahl der Prolin-Reste, die Fähigkeit der Peptide die Cytoplasmamembran von E. coli zu permeabilisieren. Bei dieser Betrachtung ist es verblüffend, dass einige der aktivsten, nativen antibakteriellen Peptide, zumindest in Bezug auf einige Gram-negative Pathogene, zu der Familie der Prolin-reichen Peptide gehören [16].

Die oben beschriebenen Nebeneffekte könnten durch antimikrobielle Peptide (AMP) überwunden werden, die ein bakterielles Protein oder andere intra- oder extrazelluläre Komponenten spezifisch erkennen, ohne eine Kreuzreaktivität mit Säugetieranaloga zu zeigen. Dies scheint auf Prolin-reiche antimikrobielle Peptide, einschließlich Apidaecine, Drosocin und Pyrrhocoricin die ursprünglich aus Insekten isoliert wurden, zuzutreffen. Mit der enormen Variation in der Größe und in den biochemischen Eigenschaften, ist es nicht überraschend, dass die Struktur-Wirkungs- und Konformations-Wirkungs-Beziehungen der Fokus der antibakteriellen Peptidforschung ist. Eine komplette Untersuchung des natürlichen, antibakteriellen Peptidrepertoires auf die biologische Stärke ist nicht nur für generelle biochemische Fragestellungen wichtig, sondern auch für die pharmazeutische Industrie von anhaltendem Interesse. Trotz der Probleme von in vitro Tests mit Peptid-basierenden Antibiotika, haben einige natürliche, kationische antibakterielle Peptide schon die klinische Testphase erreicht [9]. Während einige dieser Peptide als topische (örtlich) Mittel in der frühen klinischen Testphase Wirkung zeigten, waren andere in der systemischen Therapie aktiv. Zum Beispiel hat das kationische Protein rBPI 21, das zur parentalen Behandlung von Meningococcaemia eingesetzt wird, die dritte Phase der klinischen Prüfung abgeschlossen [9].

Die Familie der Prolin-reichen Peptide (z. B. Apidaecin, Drosocin und Pyrrhocoricin) töten Bakterien nicht nur durch Permeabilisierung ihrer Membran, sondern binden stereospezifisch an ein oder mehrere Zielproteine. Diese möglichen Interaktionspartner, bisher wurde das Hitzeschock Protein DnaK gut untersucht [17, 18], werden durch die Prolin-reichen Peptide inhibiert und vermutlich die korrekte Proteinfaltung verhindert, was letztendlich zum Zelltod führt. Zudem scheinen Prolin-reiche Peptide, im starken Gegensatz zu AMPs mit definierter Sekundärstruktur wie Melittin oder Gramicidin, in-vitro weder hämolytisch noch toxisch auf eukaryotische Zellen zu wirken. Entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung neuer peptidbasierter Antibiotika hat neben der antimikrobiellen Aktivität vor allem die Stabilität in Säugetierserum (25%). So wird beispielsweise Drosocin innerhalb einer Stunde abgebaut, während Pyrrhocoricin mit Halbwertszeiten von 120 Minuten erheblich stabiler gegenüber Proteasen ist. Dabei werden vermutlich nicht nur die N- und C-Termini durch Amino- und Carboxypeptidasen abgespalten, sondern die Peptide auch durch Endoproteasen verdaut. Die dabei entstehenden Metaboliten sind teilweise stabil gegenüber weiterem Abbau, verlieren allerdings meist die antimikrobielle Aktivität (MHK-Werten ≥ 64 μg/mL).

In biologischen Experimenten von Schneider und Dorn (2001) [19] wurden Nymphen und Puppen der Milchkrautwanze Oncopeltus fasciatus aus der Familie der Lygaeidae mit zwei verschiedenen gram-negativen Pseudomonas Spezies infiziert und deren Immunantwort analysiert. Während eine Infektion der Nymphen von O. fasciatus mit dem humanen Pathogen Pseudomonas aeruginosa, nach 48 h den Tod aller Individuen zur Folge hatte, überlebten 71% der mit weniger pathogenen Pseudomonas putida infizierten Individuen mindestens 96 h. Wurden die Nymphen der Milchkrautwanze nun zuerst mit P. putida und nach 24 h mit P. aeruginosa infiziert, stieg hier die Überlebensrate der doppelt infizierten Individuen innerhalb der ersten 24 h signifikant auf 73%. Die wahrscheinliche Induzierung der Synthese von antibakteriellen Peptiden, durch die sich Insekten im Rahmen ihres angeborenen Immunsystems gegen eindringende Mikroorganismen wehren, wurde anschließend untersucht. Vier Peptide (Oncopeltus antibakterielles Peptid 1–4) wurden mit Molekulargewichten von 15, 8, 5 bzw. 2 kDa identifiziert und für die antibakterielle Wirkung verantwortlich gemacht. Die Sequenzanalyse nach Edman ergab neben einer 34 Aminosäure langen Teilsequenz für Peptid 1 (15 kDa) auch die unvollständige Sequenz des Prolin-reichen 2 kDa Peptids 4. Es war nicht möglich die Aminosäuren an Positionen 11 und die C-terminale Sequenz ab Position 19 eindeutig zu identifizieren. Das genaue Molekulargewicht ist unbekannt.

Eine Auswahl bisher bekannter Sequenzen von antibiotischen Peptiden ist in Tabelle 1 aufgelistet: Tabelle 1:

Nach wie vor besteht ein Bedarf an neuen antibakteriellen und antimykotischen Verbindungen, neuen antibakteriellen und antimykotischen pharmazeutischen Zusammensetzungen, sowie Methoden, welche diese verwenden, sowie Verbindungen, welche für das Wirkstoff-Screnning genutzt werden können, um neue pharmazeutische Antibiotika zu detektieren.

Eine Aufgabe ist es neue antibiotische Peptide zur Verfügung zu stellen, vorzugsweise mit gesteigerter Stabilität. Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, das Wirkungsspektrum der Prolinreichen AMP's auf Gram-positive Bakterien auszuweiten und so moderne Breitband-Antibiotika zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich sollte eine Methode gefunden werden, um Peptide durch Kopplung an einen Träger in eukaryotische Zellen einzuschleusen und so verborgene Bakterien zu bekämpfen.

Die erste Aufgabe wird gelöst durch die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate und mit einer der generellen Formeln 1 bis 3: Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-I16-Y17-N18-X4-Sub2(Formel 1)Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-I16-Y17-N18-N19-X4-Sub2(Formel 2)Sub1-X1-D2-K3-P4-P5-Y6-L7-P8-R9-P10-X2-P12-P13-R14-X3-I16-P17-N18-X4-Sub2(Formel 3)X1 ist ein Rest mit einer unpolaren, hydrophoben Seitenkette oder mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette;
D2 ist ein Asparaginsäure- oder Glutaminsäurerest,
K3 ist ein Rest mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette, bevorzugt Lysin oder Arginin,
X2 und X4 sind unabhängig von einander ausgewählt aus Resten mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette;
X3 ist ein Rest mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette oder Prolin oder ein Prolinderivat;
L7 und I16 sind unabhängig von einander ausgewählt aus Resten mit einer unpolaren, hydrophoben Seitenkette, bevorzugt Leucin, Isoleucin und Valin,
Y6 und Y17 sind jeweils Tyrosin, R9 und R14 sind jeweils Arginin, N18 und N19 sind jeweils Asparagin oder Glutamin, P4, P5, P8, P10, P12, P13 und P17 sind unabhängig von einander ausgewählt aus Prolin und Prolinderivaten oder Hydroxyprolin und Hydroxyprolinderivaten.

Gegebenenfalls sind einer oder zwei der Reste ausgewählt aus D2, P4, P5, P8, P10, P12 P13, P17 und Y17 durch einen beliebigen Aminosäurerest bevorzugt einen neutralen Rest, besonders bevorzugt einen neutralen polaren Rest ersetzt.

Weiter sind gegebenenfalls P13 und R14 vertauscht.

Reste mit einer positiven Nettoladung oder einer unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette sind bevorzugt ausgewählt aus Arginin, Lysin, δ-Hydroxylysin, Homoarginin, 2,4-Diaminobuttersäure, β-Homoarginin, D-Arginin, Arginal (-COOH in Arginin ist ersetzt durch -CHO), 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, Nitroarginin (bevorzugt N(G)-Nitroargenin), Nitrosoarginine (bevorzugt N(G)-Nitrosoarginin), Methylarginin (bevorzugt N-Methyl-Arginin), ε-N-Methyllysin, allo-Hydroxylysin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Ornithin, sym-Dimethylarginin, asym-Dimethylarginin, 2,6-Diaminohexinsäure, p-Aminobenzoesäure und 3-Aminotyrosin und weniger bevorzugt Histidin, 1-Methylhistidin und 3-Methylhistidin. X1, X2 und X3 sind bevorzugt unabhängig voneinander aus dieser Liste ausgewählt.

Der Begriff Prolinderivat steht für einen von Prolin abgeleiteten Aminosäurenrest, der aus Prolin bevorzugt durch strukturelle Veränderung einer funktionellen Gruppe erhalten wird. Bevorzugte Prolinderivate sind ausgewählt aus, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin oder Pseudoprolin. Der Begriff Hydroxyprolin schließt unter anderem cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin und trans-3-Hydroxyprolin mit ein. Der Begriff Hydroxyprolinderivat steht entsprechend für einen von Hydroxyprolin abgeleiteten Aminosäurenrest, der aus Hydroxyprolin bevorzugt durch strukturelle Veränderung einer funktionellen Gruppe erhalten wird. Bevorzugte Hydroxyprolinderivate sind ausgewählt aus Hydroxy-β-Cyclohexylalanin und den oben genannten Prolinderivaten, die mit einer Hydroxylgruppe substituiert sind.

Ein neutraler Rest ist ein Rest mit einer unter physiologischen Bedingungen ungeladenen Seitenkette.

Ein polarer Rest weist bevorzugt mindestens eine polare Gruppe in der Seitenkette auf. Diese sind bevorzugt ausgewählt aus Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Amin-, Amid- oder Estergruppen oder anderen Gruppen, welche die Ausbildung von Wasserstoffbrücken erlauben. Bevorzugte neutrale polare Reste sind ausgewählt aus Asparagin, Cystein, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Citrullin, N-Methylserin, Homoserin, allo-Threonin und 3,5-Dinitrotyrosin und β-Homoserin,

Die Reste mit einer unpolaren, hydrophoben Seitenkette sind unter physiologischen Bedingungen ungeladene Reste, bevorzugt mit einem Hydropathie-Index über 0, besonders bevorzugt über 3. Bevorzugte unpolare, hydrophoben Seitenketten sind ausgewählt aus Alkyl-, Alkylen- Alkoxy-, Alkenoxy-, Alkylsulfanyl- und Alkenylsulfanylresten mit 1 bis 10, bevorzugt 2 bis 6 C-Atomen, oder Arylresten mit 5 bis 12 C-Atomen. Bevorzugte Reste mit einer unpolaren, hydrophoben Seitenkette sind ausgewählt aus Leucin, Isoleucin, Valin, Methionin, Alanin, Phenylalanin, N-Methylleucin, tert.-Butylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, 1-Aminocylcohexylcarbonsäure, N-Methylisoleucin, Norleucin, Norvalin und N-Methylvalin.

Unter physiologische Bedingungen sind ein pH-Wert von pH 6 bis 8 und eine Temperatur von 30°C bis 40°C zu verstehen, bevorzugt eine Temperatur von 37°C, ein pH-Wert von 7,4 und ein osmotischer Druck von 300 mosmol/kg.

Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate enthalten bevorzugt mindestens 19 Aminosäurereste, bevorzugt bis zu 50 Aminosäurereste.

Sub1 ist der freie N-Terminus der Aminosäure X1 oder eine modifzierte N-terminale Aminogruppe. Sub2 ist die freie C-terminale Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure (-COOH) oder eine modifizierte C-terminale Carboxylgruppe. „Modifizierte N-terminale Aminogruppe” und „modifizierte C-terminale Carboxylgruppe” bedeutet, dass die Aminogruppe bzw. Carboxylgruppe verändert ist (z. B. reduziert oder substituiert).

Sub1 stellt somit den freien N-Terminus der Aminosäure X1 oder eine Modifikation der N-terminalen Aminogruppe (welche die N-terminale Aminogruppe der Aminosäure X1 durch Sub1 ersetzt) mit der generellen Formel NR1R2, dar. Sub1 = NR1R2, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander sind und bevorzugt aus Wasserstoff oder aus folgenden Gruppen ausgewählt werden:

  • (i) einer geradkettigen, verzweigten, zyklischen oder heterozyklischen Alkylgruppe, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl oder Cyclohexyl;
  • (ii) einer geradkettigen, verzweigten, zyklischen oder heterozyklischen Alkanoylgruppe, wie z. B. Acetyl oder Methanoyl (Formyl), Propionyl, n-Butyryl, Isobutyryl, Pentanoyl, Hexanoyl oder Cyclohexanoyl;
  • (iii) eine Reportergruppe, bevorzugt ein Fluoreszenzfarbstoff (wie z. B. Fluorescein, Alexa488) oder Biotin;
  • (iv) zusammen mit COR3 (siehe unten) einen Linker zwischen N- und C-Terminus um ein zyklisches Peptid zu erhalten, z. B. basierend auf Guanidin, Ethyleneglycololigomere, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Desmosin oder Isodesmosine.
  • (v) einen Linker zur Kopplung eines weiteren Peptids oder Peptidderivats (Y1) über eine spezifische chemische oder enzymatische Reaktion, z. B. basierend auf Iod-, Brom- oder Chloralkansäuren (z. B. Iodessigsäure) oder Maleimid zur Kopplung an ein Thiol-haltiges Peptid oder auch einer anderen reaktiven Gruppe (z. B. Aminogruppe, Thiolgruppe) zur Kopplung eines zweiten Peptids oder Peptidderivats (z. B. als Aktivester, Aldehyd oder Thioester) als Träger- oder Carrierprotein.
  • (vi) einen wie in (v) genannten Linker, an den ein weiteres Peptid oder Peptidderivat Y1 gekoppelt ist.

Beispiele für N-terminale Modifikationen sind acetylierte, formylierte oder guanylierte N-Termini.

Bevorzugt ist über Sub1 ein weiteres Peptid oder Peptidderivat Y1 gekoppelt. Y1 ist vorzugsweise ein Biopolymer (z. B. Peptid), welches das antimikrobielle Peptid nach Formel 1 in Bakterien einschleust und damit die Aktivität des antimikrobiellen Peptids gegenüber diesem Bakterium erhöht und/oder in Säugerzellen einschleust und damit die Behandlung von Bakterien ermöglicht, die sich in Säugerzellen verstecken. Y1 ist über Sub1 entweder permanent (z. B. Peptid- oder Amidinbindung für Sub1 = NH2 oder Thioether für Sub1 = SH, Iodacetat oder Maleimid) oder durch eine Verbindung, die unter bestimmten Bedingungen spaltbar ist (wie z. B. Disulfidbrücken oder säurelabile Linker), mit X1 des Peptids verknüpft. Bevorzugte Sequenzen für Y1 sind Zell-penetrierende Peptide (CPP, cell penetrating peptides), beispielsweise Penetratin, Tat-Peptide, amphipathischen Modell-Peptiden (model amphipathic peptides) und Transportans [25].

Ein Linker ist eine Bezeichnung für Moleküle oder Molekülgruppen, die zum Verknüpfen von zwei Substanzen herangezogen werden, bevorzugte Linker enthalten zwei reaktive Gruppen (wie z. B. Iodacetat, Maleimid, Imido- oder NHs-Ester oder Hydrazid), die durch eine Molekülbrücke (z. B. Polyethylenglykol) mit bevorzugt 10 bis 20 C-Atomen verbunden sind.

Sub2 ist die freie C-terminale Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure (-COOH) oder eine modifizierte C-terminalen Carboxylgruppe, vorzugsweise mit der allgemeinen Formel COR3 (R3 ersetzt die Hydroxylgruppe der letzten Aminosäure), X5-COR3 oder X6-COR3 oder X5X6-COR3.

COR3 ist vorzugsweise aus der folgenden Gruppe ausgewählt:

  • (i) Carboxyl (R3 ist eine freie Hydroxylgruppe), ein Ester (R3 ist eine Alkoxygruppe), ein Amid (R3 ist ein Amin) oder ein Imid;
  • (ii) ein Linker, der zusammen mit Sub1, die N- und C-Termini zu einem zyklischen Peptid verbrückt;
  • (iii) COR3, worin R3 entweder ein zusätzlicher Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe die Pro, Ile, Leu, Arg und Gln enthält, ausgewählt ist, oder worin R3 ein Peptid, mit bevorzugt zwei bis sechs Aminosäuren ist, wovon mindestens eine Aminosäure aus der Gruppe, die Pro, Ile, Leu, Arg oder Gln enthält, ausgewählt ist, wobei diese mit einem Mitglied aus der Gruppe mit Carboxyl (R3 ist eine freie Hydroxylgruppe), einem Ester (R3 ist ein Alkohol, wie Methanol, Ethanol, Propanol, iso-Propanol oder Butanol), einem Amid (R3 ist ein Amid) oder ein Imid (R3 ist ein Alkylamin oder Dialkylamin, wie Methylamin, Ethylamin, Dimethylamin oder Zyklohexylamin) substituiert ist.
  • (iv) COR3 worin R3 eine zusätzliche, verzweigte Aminosäure ist, um eine Dimer- oder Oligomerstruktur auszubilden, wie beispielsweise Lysin, Hydroxylysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Desmosin, Isodesmosin oder eine Kombination aus diesen verzweigten Aminosäuren.
  • (v) ein Linker zur Kopplung eines weiteren Peptids oder Peptidderivats (Y1) über eine spezifische chemische oder enzymatische Reaktion, z. B. basierend auf Iod-, Brom- oder Chloralkansäuren (z. B. Iodessigsäure) oder Maleimid zur Kopplung an ein Thiol-haltiges Peptid oder auch einer anderen reaktiven Gruppe (z. B. Aminogruppe, Thiolgruppe) zur Kopplung eines zweiten Peptids oder Peptidderivats (z. B. als Aktivester, Aldehyd oder Thioester) als Träger- oder Carrierprotein.
  • (vi) einen wie in (v) genannten Linker, an den ein weiteres Peptid oder Peptidderivat Y1 gekoppelt ist

Auf diesem Weg können C-terminale Peptidderivate als Ester (R3 = Alkoxy), Amid (R3 = Amin, z. B. -NH2 oder Amid, z. B. -NHC3H7) oder Imid oder ein Peptid, das um weitere Aminosäuren verlängert wurde, die aus der Gruppe, die Pro, Ile, Arg und Val enthält, ausgewählt wurde und ebenfalls wieder am C-Terminus als Ester, Amid oder Imid modifiziert sind, erhalten werden. Weitere Peptidderivate können durch Modifikationen der N-terminalen oder C-terminalen Enden der Peptide gebildet werden. Diese Änderungen können beispielsweise eine zusätzliche Alkyl- oder Alkanoylgruppe (entweder mit einer geraden Kette oder verzweigt, zyklisch oder heterozyklisch) oder eine zusätzliche Guanidinogruppe oder ein zusätzliches Makromolekül oder ein Reporterrest sein, der entweder permanent oder durch eine Verbindung, die unter bestimmten Bedingungen spaltbar ist (wie Disulfidbrücken oder säurelabile Linker), verknüpft ist. Bevorzugt erfolgt eine Modifikation des C-Terminus mittels Thioestersynthese und anschließender Substitition mit primären Aminen.

Alle natürlichen Aminosäuren, unnatürlichen Aminosäuren oder Aminosäurederivate (wie z. B. Iminosäuren), welche die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate bilden, können entweder in der L- oder D-Konformation vorliegen. Wenn nicht anders spezifiziert sind die Bausteine in den Sequenzen jedoch bevorzugt in der L-Konformation.

X5 und X6 sind optional zusätzliche Reste. In dem Fall, dass X5 und X6 abwesend sind, hat das letzte Arginin (Arg) in der oben erwähnten Sequenz eine freie C-terminale Carboxylgruppe oder ist mit Sub2 verbunden.

In dem Fall, in dem mindestens ein Rest X5 und X6 vorhanden ist, hat das Peptid beispielsweise eine der folgenden allgemeinen Formeln: Y1-Sub1-X1-D-K-P-P-Y-L-P-R-P-X2-P-P-R-X3-I-Y-N-X4-X5-X6-COR3(Formel 4)Y1-Sub1-X1-D-K-P-P-Y-L-P-R-P-X2-P-P-R-X3-I-Y-N-X4-X5-COR3(Formel 5)Y1-Sub1-X1-D-K-P-P-Y-L-P-R-P-X2-P-P-R-X3-I-Y-N-X4-X6-COR3(Formel 6)

X5 ist aus Prolin, Prolinderivaten oder einem neutralen Rest mit einer polaren Seitenkette (wie Asparagin, Glutamin) ausgewählt. Bevorzugte Reste X5 sind aus den Gruppen ausgewählt, die Prolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin, Pseudoprolin ebenso wie Asparagin, Glutamin, Citrullin, N-Methylserin, N-Methylglycin, Dihydroxyphenylalanin, N-Ethylasparagin, N-Ethylglycin, Homoserin, Penicillamin, Tetrahydropyranylglycin, allo-Threonin und 3,5-Dinitrotyrosin enthalten.

X6 ist aus Prolin, Prolinderivaten, einem polaren Rest (wie Serin) oder einen hydrophoben Rest ausgewählt. Bevorzugte Reste X6 sind aus den Gruppen ausgewählt, die Prolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, cis-3-Hydroxyprolin, trans-3-Hydroxyprolin, β-Cyclohexylalanin, 3,4-cis-Methanoprolin, 3,4-Dehydroprolin, Homoprolin oder Pseudoprolin, Serin, Threonin, 6-Hydroxylysin, Citrullin, Homoserin oder allo-Threonin ebenso Phenylalanin, N-Methylleucin, Leucin, Isoleucin, Valin, Methionin, tert.-Butylglycin, Cyclohexylalanin, Alanin, β-Alanin, 1-Aminocylcohexylcarbonsäure, N-Methylisoleucin, Norleucin, Norvalin, N-Methylvalin enthält oder es ist eine kurze Peptidsequenz mit vorzugsweise einem bis drei Resten, die bevorzugt ausgewählt sind aus Prolin, Isoleucin oder einem der zuvor erwähnten Reste.

Alternativ ist X6 ein verzweigter Linker, der mehrere Peptideinheiten enthält. Dieser wird durch den Rest einer Aminosäure, die mehrere Aminogruppen enthält, wie z. B. Lysin, Hydroxylysin, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,2'-Diaminopimelinsäure, Desmosin, Isodesmosin gebildet.

Die C-terminale Aminosäure ist zum Beispiel X4 in der Formel 1, X5 (in Formel 3) oder X6 (in Formel 2 und 4).

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptiderivate zeigen gegenüber der bisher unvollständig bestimmten Sequenz des Prolin-reichen antimikrobiellen Peptids „Oncopeltus antibakterielles Peptid 4” eine verbesserte anti-bakterielle Aktivität, ein weiteres Wirkungsspektrum und eine erhöhte Proteaseresistenz.

Beispiele der erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate sind ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 5 bis 9, 14 bis 26, 29, 30, 32, 33, 36, 38, 40, 41, 44 bis 46, 49, 50, 53 bis 59, 61 bis 85, 93, 94, 101 und 102 (siehe auch Tabelle 2 in Beispiel 1).

Das besonders bevorzugte Peptid mit der Sequenz VDKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH2 (Seq. ID Nr. 18) wird im Folgenden als Oncocin bezeichnet. Andere erfindungsgemäße Peptide und Peptiderivate werden nachfolgend auch als Oncocin-Derivate bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen Peptide und/oder multimeren Peptidkonstrukte, die modifiziert wurden, um die antimikrobielle oder antimykotische Aktivität zu steigern und das Aktivitätsspektrum auf andere Bakterien oder Pilze zu erweitern und die Stabilität gegen Proteasen und Peptidasen zu verbessern, zeichnen sich durch ihre hohe antibakterielle und/oder antimykotische Wirksamkeit und durch eine gute metabolische Stabilität in Säugetierserum aus.

Geeignete Modifikationen in den Positionen 11 (X2), 15 (X3) und 19 (X4) verbessern die antibakterielle Aktivität der nativen Oncopeltus 4-Sequenz gegen verschiedene Bakterien, wie weiter unten diskutiert und in den Beispielen gezeigt wird.

Weiterhin können die Reste Sub1-X1, X3 und X4 die N- und C-terminalen Peptidsequenzen gegen proteolytischen Abbau zusätzlich stabilisieren und so die Halbwertszeit in Serum erhöhen.

Die erfindungsgemäßen Sequenzen haben einen positiv geladenen Rest X2 (Position 11).

Bevorzugte erfindungsgemäße Beispiele sind Sequenzen mit einem positiv geladenen Rest X3 (Position 15), wie z. B. die Sequenzen, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 18, 29, 32, 33, 46, 50, 54 bis 59, 62, 65 bis 74, 78, 79 und 82 oder mit Hydroxyprolin als Rest X3 (Position 15), wie z. B. die Sequenzen, ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 25 und 63.

Die erfindungsgemäßen Sequenzen haben einen positiv geladenen Rest X4 (Position 19).

Des Weiteren ist die C-terminale Carboxygruppe vorzugsweise modifiziert. Denn dieser Terminus ist anfällig für einen Peptidase- und Proteaseabbau in Serum, Körperflüssigkeiten im Allgemeinen, Gewebe, Organe oder Zellen, was sich kritisch auf die antibiotische Aktivität der Peptide, Peptidderivate und Multimere auswirkt. Eine Steigerung der Proteaseresistenz erhöht die Halbwertszeit der Peptide in Serum.

Die Modifikationen der N- und C-Termini erlauben das Koppeln der Peptide an andere Gruppen, wie zum Beispiel andere Aminosäuresequenzen (dabei werden eventuell multimere Peptide oder Proteine geschaffen) oder andere Biomoleküle, welche die Funktion eines Carriers oder Labels haben, beispielsweise von Y1 über Sub1. In einer speziellen Ausführungsform fungiert das Carriermolekül als Shuttle um die bakterielle Infektion in Säugerzellen zu bekämpfen oder das antibakterielle Peptid und Peptidderivat in Bakterien zu transportieren, in die das antibakterielle Peptid nicht allein eindringen kann (z. B. Gram-positive Bakterien). Beispiele für solche Zell-penetrierenden Peptide (CPP) sind beispielsweise Penetratinen, Tat-Peptide, amphipathischen Modell-Peptiden (model amphipathic peptides) und Transportans. Zudem kann der Ort der Infektion durch die gekoppelte Struktur (Target-Molekül) erkannt werden und dadurch die antibiotische Substanz in die Nähe der (Bakterien-)Zelle gebracht werden, um diese bekämpfen. Solche Target-Moleküle sind z. B. Moleküle, die bekanntermaßen an Lipopolysaccharid(LPS)-Moleküle binden, welche die Außenseite der Gram-negativen Bakterien bilden. Bekannte Verbindungen für diese Anwendung sind beispielsweise Ankerpeptide, wie das AcmA-Motif aus Lactobacillus oder ein gegen Lipopolysaccharid gerichteter Antikörper. Die letztere Variante ist bevorzugt, da sie auch einen intrinsischen antibiotischen Effekt hat und deshalb zur Steigerung der Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide genutzt werden kann.

Es ist vorteilhaft, wenn die N-terminale Aminosäure, d. h. Sub1-X1, ein Rest aufweist, der unter physiologischen Bedingungen, d. h. im menschlichen Körper positiv geladen ist.

Ein Beispiel um die N-terminale Stabilisierung gegen proteolytischen Abbau zu erreichen, ist die Acylierung (Sub1 = Acyl-NH-), wie z. B. Acetylierung (Sub1 = Acetyl-NH-), der α-Aminogruppe einer positiv geladenen Aminosäure, wie Ornithin oder Lysin (Sub1-X1 = Acyl-Orn oder Acyl-Lys). Diese Acylierung (vorzugsweise Acetylierung) lässt die positive Ladung in der Seitenkette der Aminosäure intakt.

Weitere bevorzugte Beispiele der Erfindung sind Sequenzen mit positiv geladenen Resten an X2, X3 und X4 (Position 11, 15 und 19), wie z. B. die Sequenzen, die aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 18, 22, 58, 62, 63, 65 bis 74, 78, 79, 82 und 83 ausgewählt sind.

Weitere bevorzugte Beispiele der Erfindung sind Sequenzen mit Hydroxyprolin statt Prolin, wie z. B. die Sequenzen ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 21, 22 und 24.

Besonders bevorzugte Beispiele sind Peptide, die eine positiv geladene Aminosäure in Positionen 11, 15 und 19 (X2, X3 und X4) tragen (wie Ornithin, Arginin oder Lysin) und einen modifizierten C-Terminus aufweisen, insbesondere die Peptide gemäß SEQ ID Nr. 18, 63, 71, 72, 74.

Ein besonders bevorzugtes Peptid enthält Ornithin in Position 15 (Rest X3), Arginin in Positionen 11 und 19 (Reste X2 und X4) und den C-Terminus als Propylamid (Rest Sub2) gemäß SEQ ID Nr. 71.

Ein anderes besonders bevorzugtes Peptid enthält Ornithin in Position 15 und 19 (Rest X3 und X4 und Arginin in Position 11 (Rest X2) den C-Terminus als Amid (Rest Sub2). Ein derart bevorzugtes Peptid hat die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 72.

Ein weiteres besonders bevorzugtes Peptid enthält Arginin in Position 11 (Rest X2), trans-4-Hydroxyprolin in Position 15 (Rest X3) und Ornithin in Position 19 (Rest X4) und den C-Terminus als Amid (Rest Sub2). Ein derart bevorzugtes Peptid hat die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 63.

Ein anderes besonders bevorzugtes Peptid enthält Ornithin in Position 15 und 19 (Rest X3 und X4, Arginin in Position 11 (Reste X2), in Position 18 Glutamin statt Asparagin und den C-Terminus als Amid (Rest Sub2). Ein derart bevorzugtes Peptid hat die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 74.

An Hand der Beispiele sieht man, dass eine kleine Modifikation des C-Terminus zu einem Amid (Sub = -NH2) die Inhibitoreffekte gegen E. coli und M. luteus signifikant erhöht. Bevorzugte Sequenzen mit einem Amid am C-Terminus sind die SEQ ID Nr. 18, 22, 50, 54 bis 57, 61 bis 63, 65 bis 70, 72 bis 79 und 82.

Ebenso bevorzugt sind Modifikationen, die den C-terminalen Abbau reduzieren, wie z. B. Isopropylamid am C-Terminus (Sub2) gemäß SEQ ID Nr. 58 und 71 sowie trans-4-Hydroxyprolin an (den) Position(en) 8 und/oder 13. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass offenbar die Aminosäuren an Position 6 und 7 ebenfalls sehr wichtig für die antibiotische Wirkung sind. Denn der Austausch einzelner Aminosäuren an diesen Positionen durch Alanin vernichtet die Effektivität im Vergleich zu der antibiotischen Aktivität des Oncocins.

Die am meisten bevorzugten Beispiele der Erfindung sind Peptide, welche die folgenden Vorteile erfüllen:

  • (i) eine gesteigerte Halbwertszeit in Säugetierserum durch eine höhere Proteaseresistenz und
  • (ii) eine gesteigerte antimikrobielle Aktivität gegen einen oder mehrere Bakterienstämme, besonders humane Pathogene, oder Pilze oder andere mikrobielle Infektionen und
  • (iii) die Peptide sind nicht toxisch gegenüber humanen Zellen, einschließlich Erythrozyten.

Die Wirkung von antimikrobiellen Peptiden ist sehr komplex, da sie die Zellmembran durchdringen und in das Zytoplasma eindringen müssen, um ein spezielles intrazelluläres bakterielles Zielmolekül zu inhibieren, ohne jedoch auf Säugetierzellen und Blutzellen toxisch zu wirken. Ein anderer wichtiger Punkt ist die Stabilität der Peptide oder Peptidderivate gegenüber dem Abbau durch Peptidasen oder Proteasen. Daher hat das ideale Peptid eine hohe antibakterielle Aktivität (kleine MHK-Werte), keine Zelltoxizität, keine hämolytische Aktivität und eine Halbwertszeit von mehreren Stunden in Blut. Im Vergleich zur ursprünglich publizierten, nativen Oncopeltus 4-Sequenz zeigen die besten erfindungsgemäßen Peptidderivate eine mehr als zwanzigfach höhere antimikrobielle Aktivität. Dies wurde teilweise durch den Einbau eines basischen Rests, bevorzugt Arginin, Ornithin oder Homoarginin in Positionen 11 und 19 (X2 und X4) und Arginin, Ornithin oder Hydroxyprolin in Position 15 (X3) und/oder eine Amidierung (NH2, NH-Propyl) des C-Terminus erreicht. Da die Halbwertszeit der nativen Peptide in Serum relativ kurz ist, ist der C-Terminus vorzugsweise modifiziert (Amid, Alkylamid, Ester) und der C-terminale Bereich nach Position 14 beispielsweise durch Substitution der Positionen 15 und/oder 19 (X3 und X4) mit nicht-proteinogenen Aminosäuren verändert, um den Abbau durch Aminopeptidasen oder Aminoproteasen zu reduzieren. Am N-Terminus ist eine positive Ladung bevorzugt, um eine gute Aktivität zu erreichen. Das Valin in Position 1 (X1) der nativen Oncopeltus 4-Sequenz ist vorzugsweise frei oder durch einen acetylierten basischen Rest wie Arginin, Lysin oder Ornithin ersetzt. Besonders bevorzugt ist dabei Ornithin, da seine C-terminale Peptidbindung nicht durch Trypsin oder ähnliche Enzyme gespalten wird. Aus demselben Grund werden Positionen 15 und 19 der Oncopeltus 4-Sequenz vorzugsweise substituiert, um die Spaltung der Peptidbindung zwischen Arg-15 (X3) und Leu/Ile-16 und des C-terminalen Säureamids Arg-19-NH2 (X4-Sub2) durch Endoproteasen und im Falle von Arg-19 auch Exoproteasen zu reduzieren. Beispiele sind der Austausch der Positionen 15 und 19 (X3 und X4) gegen trans-4-Hydroxyprolin (X3) und Ornithin (X4) oder beide gegen Ornithin, was die Halbwertszeit in 25% Serum um mehr als den Faktor 10 erhöht, d. h. von weniger als 30 min auf über 6 h. Eine ähnliche Verbesserung der Serumstabilität kann auch durch die Überführung des C-Terminus von der freien Säure zu einem Propylamid erreicht werden. Obwohl keines der erfindungsgemäßen Peptide toxisch auf SH-SY5Y, HeLa Zellen oder rote Blutzellen wirkt, hat der Austausch von Pro-4, Pro-8, und Pro-13 gegen trans-4-Hyp das Potential mögliche Nebenreaktionen weiter zu reduzieren. Polare Austausche reduzieren die Tendenz der Peptide oder Peptidderivate an Säugetierzellmembranen zu binden, ohne dabei die antibakterielle Aktivität herabzusetzen.

Bevorzugt wird an die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate ein Zell-penetrierende Peptidsequenz gekoppelt. Bevorzugt erfolgt diese Kopplung über einen Linker, wie z. B. eine Acetylgruppe oder eine Alkylgruppe. Vorzugsweise erfolgt die Kopplung an den N-Terminus des erfindungsgemäßen Peptids und Peptidderivates. Bevorzugt wird dazu das Prolin-reiche Peptid oder Peptidderivat N-Terminal mit Iodacetat derivatisiert und die Zell-penetrierende Peptidsequenz C-terminal um einen Cysteinrest verlängert. Die Thiolgruppe dieses Cysteins bildet dann mit der Acetylgruppe eine Thioetherbrücke.

Zell-penetrierende Peptide (CPP) sind relativ kurze polykationische oder hydrophobe Peptide, deren Anbindung die Passage durch die Zellmembran von pro- und eukaryontischen Zellen ermöglichen. CPPs können unterschiedliche Sequenzen und Längen aufweisen. In den meisten Fällen enthalten sie jedoch eine Sequenz von ca. 10 bis 40 Aminosäuren und sind reich an positiv geladenen Aminosäuren (z. B. Arg, Lys). Diese kurzen Sequenzen sind verntwortlich für die Passage durch die Zellmembran und werden „protein transduction domains (PTDs)” genannt.

Bevorzugte Zell-penetrierende Peptide sind ausgewählt aus Penetratin, Tat-Peptiden, model amphipathic peptides, Transportan (abgeleitet von Galanin), SynB (abgeleitet von Protegrin) und cis-γ-amino-L-Prolin-haltigen Peptiden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Zell-penetrierenden Peptidsequenzen sind bevorzugt 8 bis 20 Aminosäurereste lang, wobei 30% bis 90% der Reste Seitenketten aufweist, die unter physiologischen Bedingungen positiv geladen sind. Die verbleibenden Reste sind bevorzugt neutral. Bevorzugte Zell-penetrierende Peptidsequenzen sind ausgewählt aus:

Weitere bevorzugte Zell-penetrierende Peptidsequenzen werden in Literaturstelle [25] (Langel, U 2005), [59] (Pujals S 2008) und [60] (Farrera-Sinfreu J 2007) genannt, welche diesbezüglich als Referenzen einbezogen werden.

In bevorzugten Beispiele für derartige Peptidderivate wurden die AMP N-terminal vor Position 1 (X1) um Penetratin-Cystein (Y1) über Iodacetyl (Sub1) unter Ausbildung einer Thioetherbindung verlängert. Derart bevorzugte Beispiele sind vorzugsweise ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 101 und 102.

Durch die Ankopplung einer Zell-penetrierenden Peptidsequenz, wie Penetratin, kann einerseits die Aktivität gegenüber Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien gesteigert bzw. das Wirkungsspektrum auf andere Gram-positive und Gram-negative Bakterien erweitert werden und andererseits die antimikrobiellen Peptide in Säugerzellen eingeschleust werden, so dass auch in diesen Zellen verborgene Bakterien, Pilze oder Viren erreicht werden können.

Penetratin entspricht der Teilsequenz R43 bis K58 der Antennapedia Homöodomäne (DNA-bindende Region eines Transkriptionsfaktors), der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Die Sequenz der Penetratine (bevorzugt RQIKIWFQNRRMKWKK-OH SEQ ID Nr. 105) ist reich an kationischen Aminosäuren und ähnelt darin den Sequenzen vieler AMP [25–28]. Jedoch besitzt Pentratin in wässrigem Medium keine Sekundärstruktur und zeigt erst in hydrophober Umgebung (z. B. Doppellipidschichten) α-helikale oder β-Faltblatt Strukturen [29]. Für dieses Verhalten sind die beiden Phe-Reste und der Trp-Rest essentiell [28]. Dadurch ist das Peptid in der Lage ohne Lyse der Doppellipidschicht spontan in eukaryotische Zellen einzudringen und zeigt dabei nur geringe oder sogar keine toxischen Nebenwirkungen. Für die Internalisierung des Penetratins wird eine Kombination verschiedener Prozesse, wie z. B. Endozytose und ein direkter Rezeptor-unabhängiger Mechanismus, diskutiert, ohne dass der genaue Ablauf bisher aufgeklärt werden konnte [30, 31]. So wurden Penetratine bereits erfolgreich zum Transport organischer Moleküle, Proteine, Oligopeptide und Nukleotide, sowie siRNA und PNA in Zellen angewendet [25, 31].

In dieser Erfindung wird die Zell-penetrierende Peptidsequenz zur Einschleusung von AMP sowohl in Bakterien als auch Säugerzellen genutzt. Gekoppelt an Penetratin werden die AMP in eukaryotische Zellen transportiert, um auch dort Infektionen zu behandeln. Zusätzlich können toxische Effekte durch Interaktion der AMP mit intrazellulären Zielmolekülen untersucht werden.

Bestandteil der Erfindung ist die Kopplung des Penetratins über eine Thioetherbrücke. Dabei wurde der C-Terminus des Penetratins um ein Cystein verlängert und an das N-terminal mit Iodessigsäure markierte antimikrobielle Peptid gekoppelt.

Neben Oncocin und dessen Derivate können erfindungsgemäß auch andere antimikrobielle Peptide, bevorzugt Prolin-reiche Peptide oder Peptidderivate, wie z. B. Apidaecin, Drosocin, Formaecin 1, Pyrrhocoricin und Metalnikowin 1 entsprechend mit einer Zell-penetrierenden Peptidsequenz, wie z. B. Penetratin, modifiziert werden.

Bevorzugte Apidaecin-Derivate werden in PCT/EP2008/059512 (angemeldet am 21.07.2008) genannt, welche diesbezüglich als Referenz einbezogen wird. Bevorzugte Beispiele für derartige Peptidderivate sind ausgewählt aus den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 95 bis 100 und 106.

Der Ausdruck „Peptid”, wie hier verwendet, steht für eine Sequenz von Aminosäuren, die über eine Peptidbindung verknüpft sind, wobei die Aminosäuren bevorzugt aus den zwanzig natürlich vorkommenden Peptid-bildenden Aminosäuren ausgewählt sind und worin die Aminosäuren in der L-Konfiguration oder D-Konfiguration, oder im Fall von Isoleucin und Threonin auch in der D-allo-Konfiguration vorliegen können (nur Inversion eines der beiden chiralen Zentren).

Der in der Erfindungsbeschreibung verwendete Ausdruck Peptidderivat (oder Peptidomimetika) beinhaltet nicht nur Peptide, die am N- oder C-Terminus, wie oben beschrieben, mit Y1, Sub1 und Sub2 modifiziert sind. Er umfasst zudem Peptide, die durch Substitutionen und/oder Modifikationen von einem oder mehreren Aminosäureresten durch chemische Gruppen verändert wurden, wobei diese chemischen Gruppen andere als die natürlichen Protein-bildenden Aminosäurereste sind, wie z. B. nicht-proteinogene α-Aminosäuren, β-Aminosäuren oder Peptide mit verändertem Rückgrat. Der Begriff „verändertes Rückgrat” bedeutet, dass mindestens eine Peptidbindung chemisch modifziert ist, d. h. ersetzt ist durch eine unter physiologischen Bedingungen nicht spaltbare Bindung, die nicht durch Endoproteasen geschnitten werden kann.

Bevorzugt ist die nicht spaltbare Bindung eine modfizierte Peptidbindung wie z. B. eine reduzierte Peptidbindung, eine alkylierte Amidbindung oder eine Thioamidbindung. Eine reduzierte Amidbindung ist eine Peptidbindung in der die Carbonylgruppe (C=O) zu einer Hydroxylgruppe (HCOH) oder einer Methylengruppe (CH2) reduziert ist. Eine alkylierte Amidbindung ist eine entweder am Stickstoff (N-alpha) oder Kohlenstoffatom (C-alpha) alkylierte Peptidbindung. Der Alkylrest hat bevorzugt 1 bis 3 C-Atome. Ein Beispiel ist die N-Methylierung.

Außerdem umfasst der Begriff verändertes Rückgrat andere Gruppen, die geeignet sind, eine kovalente Bindung sowohl mit der COOH-Gruppe des vorangegangenen Aminosäurerestes als auch der NH2-Gruppe des folgenden Aminosäurerestes zu bilden, und die daher nicht notwendigerweise die Peptidrückgrat-Struktur aufrecht erhalten, wie z. B. Zuckeraminosäure-Dipeptid-Isostere, Azapeptide, 6-Homopolymere, gamma-Peptide, V-Lactam-Analoga, Oligo(phenylenethylen)e, vinyloge Sulfonpeptide, poly-N-substituierte Glycine oder Oligocarbamate.

Modifikationen des Rückgrats sind an Positionen bevorzugt, die anfällig für enzymatischen Abbau sind, besonders an den sechs C-terminalen Resten (Positionen 14 bis 19, R-X3-I16-Y17-N18-X4). Daher ist vorzugsweise mindestens eine der Bindungen zwischen X3-I16 (z. B. Arg-Ile), N18-X4 (z. B. Asn-Arg), X4-NH2 (z. B. Arg-NH2), X6-X7 (z. B. Arg-Leu oder Arg-Ile) eine für Proteasen nicht spaltbare Bindung. Diese nicht spaltbare Bindung ist vorzugsweise aus der Gruppe der reduzierten Amidbindungen, alkylierten Amidbindungen oder Thioamidbindungen ausgewählt.

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate können linear sein, d. h. eine Sequenz, in der die erste und die letzte Aminosäure der Sequenz eine freie NH2 und COOH-Gruppe besitzen oder durch Sub1 und Sub2 modifiziert sind. Alternativ sind die Peptide zyklisch, d. h. die erste und die letzte Aminosäure sind über eine Peptidbindung oder einen Linker verknüpft.

Weitere Bestandteile dieser Erfindung sind die Methoden zur Herstellung der oben erwähnten neuartigen antibiotisch wirksamen Verbindungen.

Die Peptide oder Peptidderivate dieser Erfindung können entweder synthetisch oder, wo anwendbar, rekombinant mit konventionellen Methoden hergestellt werden. Spezielle Ausführungsbeispiele der Erfindung werden ausführlich im experimentellen Teil unten offenbart. Vorzugsweise werden die Peptide oder Peptidderivate dieser Erfindung konventionell mit den bekannten Synthesetechniken hergestellt, wie beispielsweise von Merrifield beschrieben [32].

Alternativ werden die in dieser Erfindung beschriebenen Peptide durch rekombinante Techniken hergestellt, indem man ein DNA-Fragment, welches eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für eines der oben beschriebenen Peptide kodiert, kloniert, und z. B. in einem Mikroorganismus oder einer Wirtszelle exprimiert. Die kodierenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt werden [33] oder durch seitenspezifische Mutagenese einer existierenden Nukleinsäuresequenz (z. B. Sequenz die das Wildtyp-Oncopeltus 4 kodiert) gewonnen werden. Die so hergestellte kodierende Sequenz kann von der RNA (oder DNA) mit entsprechend hergestellten Primern in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit bekannten Techniken amplifiziert werden. Nach Reinigung, beispielsweise mittels Agarose-Gelelektrophorese, wird das PCR-Produkt in einen Vektor ligiert und letztlich die Wirtszelle mit dem entsprechenden rekombinanten Plasmid transformiert. Rekombinante Techniken sind für unterschiedliche Wirtszellen bekannt, beispielsweise E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, Säugerzellen (z. B. CHO (Chinese hamster ovary) oder COS-1 Zellen), Hefezellen (z. B. Saccharomyces, Schizophyllum), Insektenzellen oder virale Expressionssysteme (z. B. Baculovirus System). Die Auswahl weiterer geeigneter Wirtszellen und Methoden zur Transformierung, Kultivierung, Amplifizierung, Screening, Produktherstellung und Reinigung können von jedem, der den Stand der Technik beherrscht, aus der Literatur übernommen werden [34]. Nach konventioneller rekombinanter Herstellung können die Peptide dieser Erfindung aus den Wirtszellen isoliert werden, entweder mit klassischen Zellaufschlusstechniken oder vom Zellmedium mit konventionellen Methoden, z. B. Flüssigchromatographie, insbesondere der Affinitätschromatographie. Das antimikrobielle Peptid kann als einzelnes Peptid oder als Oligomer exprimiert werden. Dabei können die Oligomere mehrere Peptidsequenzen enthalten, die über den N- oder C-Terminus verknüpft sind, oder gar einen N- oder C-terminalen Tag enthalten, der die einfachere Reinigung der rekombinanten Peptide oder Proteinkonstrukte erlaubt. Konventionelle molekularbiologische Techniken und seitenspezifische Mutagenese können eingesetzt werden, um die Sequenz weiter zu verändern und so die gewünschten nicht-nativen Peptidsequenzen zu erhalten. Alle diese rekombinaten Techniken sind dem Fachmann bekannt und wurden bereits für viele antimikrobielle Peptide einschließlich Apidaecin [35], Perinerin [36] und Defensin [37] angewandt.

Es ist auch möglich nicht natürlich vorkommende Aminosäuren gentechnisch in die Peptide einzubringen. Dies wurde ausführlich von Noren et al. und Ellman et al. [38, 39] beschrieben.

Anschließend können die Peptide aus der Wirtszellkultur oder dem in-vitro-Translationssystem isoliert werden. Dies kann mit den üblichen Techniken zur Proteinreinigung und -isolierung erreicht werden, die Stand der Technik sind. Solche Techniken können beispielsweise die Immunadsorption oder Affinitätschromatographie beinhalten. Es ist außerdem möglich, die Peptide während der Synthese mit einem Tag zu versehen (z. B. Histidin-Tag), der eine schnelle Bindung und Reinigung gestattet. Der Tag kann nachträglich enzymatisch abgespalten werden, um die aktive Peptidsequenz zu erhalten.

Falls das Peptid selbst nicht kodiert oder exprimiert werden kann, aber sehr ähnlich zu einem kodierbaren oder exprimierbaren Peptid ist, kann die Methode zunächst auf das ähnliche Peptid angewandt werden, um dieses nachträglich in einem oder mehreren Schritten chemisch oder enzymatisch in das gewünschte Peptid oder Peptidomimetika zu überführen. Einige umfassendere Zusammenstellungen dieser Methoden zur Herstellung der hier beschriebenen Peptide sind in der Literatur beschrieben [40–44].

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate können einzeln, in Kombination, als Multimere oder als verzweigte Multimere eingesetzt werden. Sinnvolle Kombinationen der erfindungsgemäßen Peptide umfassen Konkatamere, in denen die erfindungsgemäßen Peptide seriell miteinander oder über Spacer miteinander verknüpft sind, z. B. in der Form eines Peptiddimers oder eines Peptidtrimers usw., indem die einzelnen Peptide aneinander gereiht sind. Dieses Multimer kann aus Peptiden oder Peptidderivaten mit identischen Sequenzen oder verschiedenen Sequenzen gemäß Formel 1 zusammengesetzt sein.

Einzelne Peptide oder Peptidderivate können an ein biokompatibles Protein gekoppelt werden, beispielsweise humanes Serumalbumin, humanisierte Antikörper, Liposomen, Mizellen, synthetische Polymere, Nanopartikel und Phagen. Alternativ können Multimere, in denen die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate individuell kombiniert sind, in der Form von Dendrimeren oder Cluster hergestellt werden, wobei drei oder mehr Peptide an ein Zentrum gebunden sind.

In einer Ausführungsform können mehrere Peptide oder Peptidderivate gemäß oben beschriebener Formel 1 als multimere Konstrukte oder Anordnung hergestellt werden. So können beispielsweise optional Aminosäuren (z. B. Gly-Ser-) oder andere Spacer basierend auf Aminosäuren oder anderen chemischen Verbindungen an den N- oder C-Terminus angehängt werden, um zwei oder mehr Peptide untereinander zu verknüpfen oder an einen Träger zu koppeln. Diese Anordnung kann die Form von einem oder mehreren der oben beschriebenen synthetischen Peptide gekoppelt an ein Trägerprotein annehmen. Alternativ enthält eine Anordnung mehrere Peptide, jedes als multiples antigenes Peptid exprimiert, optional an ein Trägerprotein gekoppelt. In einer weiteren Variante sind die ausgewählten Peptide sequentiell verknüpft und werden als rekombinantes Protein oder Polypeptid exprimiert. In einer Ausführungsform werden mehrere Peptide sequentiell, mit oder ohne Aminosäuren als Spacer dazwischen, verknüpft, um ein größeres rekombinantes Protein zu erhalten. Alternativ kann das rekombinante Protein an ein Trägerprotein fusioniert werden.

In einer anderen Ausführungsform enthalten die multimeren Konstrukte mindestens zwei der oben definierten Peptide (welche dieselben oder unterschiedliche Peptide der Formel 1 sein können), wobei ein Peptid über eine beliebige Aminosäure an die anderen Peptide gekoppelt wird. Eine beliebige Anzahl weiterer Peptide können an beliebige weitere Aminosäuren dieser Peptide angehängt werden. In einer weiteren Ausführungsform einer multimeren Anordnung, welches mindestens zwei Peptide enthält, ist das zweite oder sind die weiteren Peptide an ein verzweigtes Gerüst der anderen Peptide der Grundstruktur gekoppelt. Alternativ ist jedes weitere Peptid kovalent über die Gruppe Sub1 oder Sub2 an ein anderes Peptid der Anordnung verknüpft.

In einer anderen Ausführungsform eines multimeren Konstrukts oder einer Anordnung mit mindestens zwei Peptiden, sind mindestens eins oder mehrere Peptide an einen Träger gebunden.

In einer anderen Ausführungsform sind ein oder mehrere der genannten Peptide ein synthetisches Peptid, das an ein Trägerprotein fusioniert ist. Weiterhin gibt es die Alternative mehrere der oben beschriebenen Peptide mit oder ohne flankierende Sequenzen sequentiell zu einem linearen Polypeptid zu kombinieren. Die Peptide oder das Polypeptid sind entweder an den gleichen Träger gekoppelt oder unterschiedliche Peptide können individuell als Peptide an eins oder unterschiedliche immunologisch inerte Trägerproteine gekoppelt werden.

Geeignete Träger können die Stabilität, die Darreichung oder die Produktion verbessern, oder das Aktivitätsspektrum der Peptide verändern. Beispiele für Träger sind humanes Albumin, Polyethylenglykol oder andere Biopolymere bzw. andere natürlich oder nicht-natürlich vorkommende Polymere. In einer Ausführungsform, ist die Hauptkomponente vorzugsweise ein Protein oder anderes Molekül, das die Peptidstabilität erhöhen kann. Eine erfahrene Person kann einfach eine geeignete Kopplungseinheit auswählen.

In noch einer anderen Ausführungsform sind die Peptide in der Form eines multiplen Antigenpeptides (multiple antigenic Peptide; MAP) angeordnet, die beispielsweise nach dem von Tam et al. [45] beschriebenen „MAP”-Konzept konstruiert werden können. Dieses System nutzt eine zentrale Einheit aus Lysinresten, an die mehrere Kopien des gleichen erfindungsgemäßen Peptids synthetisiert werden [siehe z. B. 46]. Jedes MAP enthält mehrere Kopien eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Peptide. Eine Ausführungsart eines MAP enthält mindestens drei, vorzugsweise aber vier oder mehr Peptide. Ein Fachmann kann einfach eine beliebige Anzahl multimerer Verbindungen gemäß den in obiger Formel identifizierten Peptiden herstellen. Alle derartigen multimeren Arrangements und Konstrukte sollen Bestandteil dieser Erfindung sein.

Weitere Kombinationen in der Form von Multimeren können an der Oberfläche von Partikeln hergestellt werden, wobei die Peptide oder Peptidomimetika an deren Oberfläche präsentiert werden. Der Partikel kann dann als Träger eines Peptids oder Peptidomimetikas fungieren und kann gleichzeitig als detektierbarer Marker wirken. Multimere können beispielsweise durch N-terminale Biotinylierung des N-terminalen Endes der Peptid- oder Peptidomimetika-Ketten und anschließende Komplexbildung mit Streptavidin erhalten werden. Da Streptavidin vier Biotinmoleküle oder -konjugate mit hoher Affinität binden kann, werden mit dieser Methode sehr stabile tetramere Peptidkomplexe erhalten. Multimere können aus identischen oder unterschiedlichen erfindungsgemäßen Peptiden oder Peptidomimetika hergestellt werden. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Multimere zwei oder mehr Peptid oder Peptidomimetika, in welcher jede Komponente einen gewissen Anteil zur bioziden Aktivität beiträgt (Zielerkennung, antimikrobielle Aktivität, Reinigung).

Ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate in der Medizin oder Pharmazie, z. B. zur Therapie mit einem Antibiotikum oder in einer Zusammensetzung mit antimikrobieller (insbesondere bakteriozider) Aktivität.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide bzw. Peptidderivate oder multimere Konstrukte unabhängig von der Anwesenheit anderer pharmazeutischer aktiver Verbindungen enthält.

Bestandteil dieser Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide als Pharmazeutikum und/oder zur Herstellung eines Wirkstoffs, der als Antibiotikum eingesetzt werden kann.

Die Peptide können auch einzeln in pharmazeutischen Produkten eingesetzt werden. Alternativ können ein oder mehrere Peptide, wie oben beschrieben, an eine andere Verbindung fusioniert oder konjugiert werden, um die Pharmakokinetik oder Bioverfügbarkeit zu steigern, ohne dass eine Immunantwort ausgelöst wird. Eine beliebige Anzahl einzelner Peptide oder multimerer Konstrukte können miteinander gemischt werden, um eine einzelne Zusammensetzung herzustellen.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrer Peptide oder Peptidderivate dieser Erfindung. Einmal zusammengestellt, kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dem Subjekt direkt verabreicht werden, um mikrobielle (insbesondere bakterielle) Infektionen zu behandeln. Dazu wird dem zu behandelnden Subjekt eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind dazu bestimmt Infektionen eines mit Bakterien oder Pilzen infizierten Säugetiers einschließlich des Menschen zu behandeln. Mindestens ein oder alternativ auch mehrere erfindungsgemäße Peptide oder multimere Konstrukte können zu einer antimikrobiell (insbesondere antibakteriell oder fungizid) wirksamen Zusammensetzung mit einem pharmakologisch vertretbaren Träger oder anderen Komponenten gemischt werden. Für den Gebrauch einer derartigen Zusammensetzung wird das ausgewählte Peptid vorzugsweise synthetisch oder auch rekombinant, wie oben beschrieben, hergestellt.

Die direkte Verabreichung dieser Zusammensetzung erfolgt entweder topisch (oberflächlich auf die Haut) oder in einer anderen Administrationsroute, wie z. B. oral, parenteral, subkutan, sublingual, intraläsional, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, pulmonal oder interstitiell ins Gewebe.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiter geeignete und pharmazeutisch akzeptable Träger, Streckmittel oder Lösungsmittel enthalten und die Form einer Kapsel, Tablette, Pastille, Dragee, Pille, Tropfen, Zäpfchen, Puder, Spray, Impfstoff, Salbe, Paste, Creme, Inhalat, Pflaster, Aerosol oder ähnlichem aufweisen. Als pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe können Lösungsmittel, Streckmittel oder andere flüssige Bindemittel wie Dispersions- oder Suspensionshilfsmittel, oberflächenaktive Agenzien, isotonische Wirkstoffe, Dickungsmittel oder Emulgatoren, Konservierungsmittel, Umhüllungsmittel (encapsulating agent), feste Bindestoffe oder Gleitmittel eingesetzt werden, je nachdem was für die jeweilige Dosierung am Besten geeignet ist und zugleich mit dem Peptid, Peptidomimetika (Pepidderivat), Peptid-Konjugat oder Peptidmimetika-Konjugat kompatibel ist.

Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält daher vorzugsweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger” umfasst dabei auch einen Träger zur Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung, wie beispielsweise Antikörper oder Polypeptide, Gene oder andere therapeutische Mittel. Der Begriff bezieht sich auf einen beliebigen pharmazeutischen Träger, der selbst nicht die Produktion von Antikörpern auslöst, die für das Individuum, dem die Rezeptur verabreicht wurde, gefährlich sein könnten, und der keine unangemessene Giftigkeit besitzen. Geeignete „pharmazeutisch akzeptable Träger” können große, langsam abbaubare Makromoleküle, wie beispielsweise Proteine, Polysaccharide, Polylactonsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Kopolymere und inaktivierte Virusbestandteile sein. Solche Träger sind dem Fachmann wohlbekannt.

Salze der Peptide oder funktionell äquivalenter Verbindungen können mit bekannten Methoden hergestellt werden, was typischer Weise bedeutet, dass die Peptide, Peptidomimetika, Peptid-Konjugate oder Peptidomimetika-Konjugate mit einer pharmazeutisch akzeptablen Säure zu einem sauren Salz oder mit einer pharmazeutisch akzeptablen Base zu einem basischen Salz gemischt werden. Ob eine Säure oder eine Base pharmazeutisch akzeptabel sind, kann leicht von einem Fachmann in Kenntnis der Anwendung und der Rezeptur festgelegt werden. So sind beispielsweise nicht alle Säuren und Basen, die für ex vivo Anwendungen akzeptabel sind, auch auf therapeutische Rezepturen übertragbar. Abhängig von der jeweiligen Anwendung können pharmazeutisch akzeptable Säuren sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Oxasäure, Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Phosphorsäure und Thiocyansäure, die mit den freien Aminogruppen von Peptiden und funktionell äquivalenten Verbindungen Ammoniumsalze ausbilden. Pharmazeutisch akzeptable Basen, die mit freien Carbonsäuregruppen der Peptide und funktionell äquivalenten Verbindungen Carboxylate ausbilden, beinhalten Ethylamin, Methylamin, Dimethylamin, Triethylamin, Isopropylamin, Diisopropylamin und andere Mono-, Di- und Trialkylamine sowie Arylamine. Ferner sind pharmazeutisch akzeptable Lösungsmittel eingeschlossen.

Pharmazeutisch akzeptable Salze können darin zur Anwendung kommen, wie z. B. Salze von Mineralsäuren, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate und vergleichbare; aber auch Salze organischer Säuren, wie Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate und vergleichbare. Eine ausführliche Diskussion zur pharmazeutisch akzeptablen Inhaltsstoffen findet man in Remington's Pharmaceutical Sciences (hack Pub. Co., N. J., 1991).

Pharmazeutisch akzeptable Träger in den therapeutischen Zusammensetzungen können Flüssigkeiten enthalten, beispielsweise Wasser, Salzwasser, Glycerol und Ethanol. Zusätzlich können Hilfsstoffe zugegeben werden, wie Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren, pH puffernde Substanzen und ähnliche Verbindungen können in solchen Mitteln vorhanden sein. Typischer Weise werden die therapeutischen Zusammensetzungen entweder in flüssiger Form oder als Suspension zur Injektion zubereitet, feste Formen zum Auflösen oder Suspendieren in Trägerflüssigkeiten vor der Injektion sind ebenfalls möglich. Liposomen sind auch in der Definition eines „pharmazeutisch akzeptablen Trägers” enthalten.

Zur therapeutischen Behandlung können Peptide, Peptidderivate, Peptid-Konjugate oder Peptidderivat-Konjugate, wie oben beschrieben, produziert und einem Subjekt, das diese benötigt, verabreicht werden. Das Peptid, Peptidderivat, Peptid-Konjugat oder Peptidderivat-Konjugat kann einem Subjekt in beliebiger, geeigneter Form verabreicht werden, vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung, die der Darreichungsform angepasst ist und in einer für die angestrebte Behandlung angemessenen Dosierung vorliegt.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können weitere aktive Verbindungen enthalten, beispielsweise konventionelle Antibiotika (z. B. Vancomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Penicillin) oder andere antimikrobiell aktive Verbindungen, wie Fungizide, z. B. Intraconazol oder Myconazol. Auch andere Verbindungen, die mit der Infektion einhergehende Symptome wie Fieber (Salizylsäure) oder Hautausschlag lindern, können zugesetzt werden.

Neben der therapeutischen Verwendung zur Behandlung von Infektionen, oder auch bei der biologischen Kriegsführung, ist es weiter möglich, die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate in Desinfektions- oder Reinigungsmitteln (z. B. einer bakterioziden Zusammensetzung) einzusetzen, die zur Desinfektion oder Reinigung von Oberflächen oder Gegenständen verwendet werden können. Ein anderes Anwendungsgebiet sind Verpackungen, wo Peptide an Verpackungsmaterial gebunden oder darin eingebunden werden können, oder als Konservierungsmittel für andere Materialien, die leicht durch Mikroorganismen abgebaut werden können. Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate sind insbesondere zur Verpackung von Lebensmitteln geeignet, da sie weder beim Kontakt noch bei der Aufnahme toxisch wirken.

Ein anderer Bestandteil dieser Erfindung ist eine Methode zur Behandlung von Säugetieren, die mit Mikroben (insbesondere Bakterien oder Pilze) infiziert sind, einschließlich der Verabreichung einer effektiven, therapeutisch wirksamen Menge der pharmazeutisch wirksamen erfindungsgemäßen Zusammensetzung.

Der hier verwendete Begriff „therapeutisch wirksame Menge” bezeichnet die Menge eines Therapeutikums, d. h. eines erfindungsgemäßen Peptids, Peptidomimetikums, Peptid-Konjugats oder Peptidmimetika-Konjugats, welche die Vermehrung und Kolonienbildung der Bakterien zu reduzieren oder ganz zu verhindern oder einen messbaren therapeutischen bzw. prophylaktischen Erfolg zu erzielen vermag. Der Effekt kann beispielsweise für Biopsien in Kultur, durch Test der bakteriellen Aktivität oder mit einer anderen geeigneten Methode zur Beurteilung des Umfangs und des Grads einer bakteriellen Infektion bestimmt werden. Die genaue effektive Menge für ein Subjekt hängt von dessen Größe und Gesundheitszustand, der Art und dem Ausmaß der Erkrankung und den Therapeutika oder der Kombination mehrerer Therapeutika ab, die zur Behandlung ausgewählt wurden. Insbesondere die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können verwendet werden, um baktierielle Infektionen und/oder biologische oder physische Begleiterscheinungen (z. B. Fieber) zu reduzieren oder zu verhindern. Methoden zur Festlegung der Anfangsdosis durch einen Mediziner sind Stand der Technik. Die festgelegten Dosen müssen sicher und erfolgreich sein.

Die Menge eines erfindungsgemäßen Proteins, Peptids oder Nukleinsäure, die für eine antibakteriell effektive Dosis notwendig ist, kann unter Berücksichtigung des Pathogens, das die Infektion auslöst, der Schwere der Infektion, sowie vom Alter, Gewicht, Geschlecht, allgemeiner physischer Kondition usw. des Patienten festgelegt werden. Die notwendige Menge der aktiven Komponente, um effektiv antibakteriell und antimykotisch ohne nennenswerte Nebenwirkungen wirksam zu sein, hängt von der eingesetzten pharamazeutischen Rezeptur und der eventuellen Anwesenheit weiterer Bestandteile wie. Antibiotika, Antimykotika usw. ab. Für die erfindungsgemäßen Einsatzgebiete kann eine effektive Dosis zwischen 0,01 mg/kg und 50 mg/kg liegen, vorzugsweise zwischen 0,5 μg/kg und 10 mg/kg des Peptids, Peptidomimetikas, Pepid-Konjugats oder Peptidomimetik-Konjugats in dem behandelten Individuum.

Anfangsdosen der erfindungsgemäßen Peptide, Peptidomimetika, Multimere, Peptid-Konjugate oder Peptidomimetika-Konjugate können optional durch wiederholte Verabreichung verfolgt werden. Die Häufigkeit der Dosierungen hängt von den oben identifizierten Faktoren ab und beträgt vorzugsweise zwischen ein und sechs Dosen pro Tag über einen Behandlungszeitraum von etwa drei Tagen bis maximal einer Woche.

In einer weiteren, alternativen Zusammensetzung werden die erfindungsgemäßen Peptide, Peptidomimetika, Pepid-Konjugate oder Peptidomimetik-Konjugate oder Mischungen durch eine kontrollierte oder fortwährende Freisetzung aus einer Matrix, die in den Körper des Subjekts eingebracht wurde, verabreicht.

In einer Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Verbindung durch die Haut verabreicht. Diese Art der Gabe ist nicht invasiv und patientenfreundlich, gleichzeitig führt es wahrscheinlich zu einer gesteigerten Bioverfügbarkeit der Verbindung im Vergleich zu einer oralen Aufnahme, insbesondere falls die Verbindung nicht gegenüber dem Milieu im Verdauungssystem stabil ist oder falls es zu groß ist, um vom Darm effizient aufgenommen zu werden. Die Aufnahme durch die Haut ist beispielsweise in der Nase, der Wange, unter der Zunge, am Zahnfleisch oder in der Vagina möglich. Entsprechende Darreichungsformen können mit bekannten Techniken erreicht werden; sie können zu Nasentropfen, Nasenspray, Einlagen, Filmen, Pflaster, Gele, Salben oder Tabletten verarbeitet werden. Bevorzugt wird der Arzneiträger für die Aufnahme durch die Haut eine oder mehrere Komponenten enthalten, die an der Haut haften und dadurch die Kontaktzeit der Darreichungsform mit der adsorbierenden Oberfläche verlängern, um dadurch die Aufnahme durch Absorption zu steigern.

In einer weiteren Ausführungsform werden die Verbindungen pulmunal in einer bestimmten Menge verabreicht, z. B. durch einen Inhalator, Zerstäuber, Aerosolspray oder einen Inhalator für trockenes Pulver. Geeignete Formulierungen können durch bekannte Methoden und Techniken hergestellt werden. Eine transdermale oder rektale Zufuhr mag in einigen Fällen genau wie die Verabreichung in das Auge angebracht sein.

Es kann vorteilhaft sein, die erfindungsgemäßen Substanzen durch fortgeschrittene Formen der Arzneimittelgabe (advanced drug delivery or targeting methods) effektiver zu verabreichen. So kann, falls der Verdauungstrakt umgangen werden soll, die Darreichungsform eine beliebige Substanz oder Mischung enthalten, die die Bioverfügbarkeit steigert. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass der Abbau reduziert wird, z. B. durch einen Enzyminhibitor oder ein Antioxidants. Besser ist es, wenn die Bioverfügbarkeit der Verbindung durch eine Zunahme der Permeabilität der Absorptionsbarriere, meist die Schleimhaut, erzielt wird. Substanzen, die das Eindringen erleichtern, können auf verschiedene Arten wirken; einige erhöhen die Fluidität der Schleimhaut, während andere die Zwischenräume zwischen den Schleimhautzellen erweitern. Wiederum andere reduzieren die Viskosität des Schleims auf der Schleimhaut. Zu den bevorzugten Aufnahmebeschleunigern gehören amphiphile Substanzen wie Cholinsäurederivate, Phospholipide, Ethanol, Fettsäuren, Ölsäure, Fettsäurederivate, EDTA, Carbomere, Polycarbophil und Chitosan.

Indikationen, für welche die erfindungsgemäßen Peptide, Peptidderivate, Konjugate oder Multimere eingesetzt werden können, sind bakterielle Infektionen mit sowohl Gram-positiven als auch Gram-negativen Bakterien, beispielsweise Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Erwinia amylovora, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium tumefaciens, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Haemophilus influenzae.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids, Peptidderivats oder Mutltimers in der biochemischen, biotechnologischen, medizinischen oder pharmazeutischen Forschung oder in Screeningverfahren, insbesondere zur Identifizierung von Substanzen, die eine potentielle antibakterielle oder antimykotische Wirkung aufweisen.

Ein weiterer Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit potentiell antibakterieller oder antimykotischer Wirkung, welches folgendes beinhaltet:

  • (i) Durchführung eines kompetitiven Tests (Assays) mit:
  • (a) einem Mikroorganismus der gegenüber einem erfindungsgemäßen Peptid, Peptidderivat oder Multimer empfindlich ist,
  • (b) ein erfindungsgemäßes Peptid, Peptidderivat oder Multimer,
  • (c) mindestens eine Verbindung die getestet werden soll, indem sie (a) mit (b) und (c) in Kontakt bringt; und
  • (ii) Auswählen einer Testverbindung, die kompetitiv das Peptid, Peptidderivat oder Multimer vom Mikroorganismus verdrängt.

Dieses Screeningverfahren identifiziert Testverbindungen, die mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder dem multimeren Konstrukt kompetitiv um die Bindung an den unbekannten Rezeptor des Pathogens konkurrieren können. Dadurch können kleine Moleküle, die spezifisch an die gleiche Stelle wie das Peptid binden, effektiv in einem Hochdurchsatzscreening identifiziert werden. Dabei weisen die Testverbindungen voraussichtlich den gleichen Wirkmechanismus wie die Originalpeptidsequenz auf und sind daher auch gegen multiresistente Mikroben aktiv, die durch die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate abgetötet werden.

Das Screeningverfahren wird mit bekannten Methoden durchgeführt, macht jedoch von mindestens einem erfindungsgemäßen Peptid, Peptidderivat oder Multimer Gebrauch. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Peptid, Peptidderivat oder Multimer dazu mit einem fluoreszierenden, radioaktiven oder anderweitig detektierbaren Marker versehen. Das Bindungsverhalten des markierten Peptids Peptidderivats oder Multimers an den Mikroorganismus wird in Anwesenheit und Abwesenheit der zu testenden Substanz(en) verglichen.

Vorzugsweise werden die Testverbindungen, die mit dem erfindungsgemäßen Peptid oder einem multimeren Konstrukt um die Bindung konkurrieren, danach identifiziert und auf ihre antibakterielle oder antimykotische Wirkung getestet.

In einer Ausführungsform wird die Fluoreszenz nach der Bildung eines Dimers (BIFC; bimolecular fluorescence complementation) in einem kompetitiven Assay gemessen. Die Methode ermöglicht die direkte Visualisierung intrazellulärer Proteinwechselwirkungen, was am Beispiel der SH3-Domäne aus der c-Abl Tyrosinkinase mit natürlichen und künstlichen Zielmolekülen in E. coli gezeigt wurde [47]. Dieses Testsystem ist sensitiv genug, um sogar die Wechselwirkungen zwischen in E. coli niedrig exprimierten Proteine nachweisen zu können. Es basiert auf der Anlagerung von zwei Fragmenten des gelb fluoreszierenden Proteins (YFP), nachdem die SH3 Domäne an ihren Partner gebunden hat. Sobald diese beiden Proteine aneinander gebunden haben, bilden die beiden Fragmente von YFP einen Komplex, dessen Struktur dem nativen Protein sehr nahe kommt. Dies kann über die beobachtete Fluoreszenz des YFP-Kompexes beobachtet werden, da die einzelnen Fragmente nicht fluoreszieren. Ein ähnliches Konstrukt kann auch entworfen werden, um nach Verbindungen zu suchen, die mit den in dieser Erfindung beschriebenen Peptide und Peptidderivate um die Bindungsstelle konkurrieren. Ein Hochdurchsatzscreening kann einfach von einem Fachmann auf eine Mikrotiterplatte im 386er Format übertragen werden.

In einer anderen Ausführungsform werden die Peptide in einem geeigneten kompetitiven Assay verwendet, um die Fähigkeit der zu testenden Verbindungen, die Peptide kompetitiv von dem unbekannten Rezeptor der Pathogene zu verdrängen, zu ermitteln. Wo gewünscht, können (abhängig von dem gewählten Assay) Mikroorganismen (z. B. Bakterium, Virus oder Pilz), die bekannter Maßen an das oder die ausgewählte(n) Peptid(e) binden, z. B. E. coli oder K. pneumoniae Stämme, direkt oder indirekt auf einer geeigneten Oberfläche immobilisiert werden, z. B. in einem ELISA-Format. Entsprechende Oberflächen zur Immobilsierung sind wohlbekannt. Beispielsweise kann ein inerter Partikel („Bead”) verwendet werden. Der Ligand kann aber auch an eine 96er Mikrotiterplatte gebunden sein. Danach werden ausgewählte Mengen der zu testenden Verbindungen und der erfindungsgemäßen Peptide mit den immobilisierten Mikroorganismen in Kontakt gebracht und die Verbindungen ausgewählt, die mit den Peptiden um die Bindung an die Mikroorganismen konkurrieren. Wenn diese Testverbindungen, die mit den Peptiden um die Rezeptorbindung an Bakterien oder Pilze konkurrieren, identifiziert sind, können sie mit weiter auf ihre antibakterielle oder antimykotische Wirkung untersucht werden. Dazu geeignete Methoden werden weiter unten in den Beispielen beschrieben.

In einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, dessen Sequenz für ein erfindungsgemäßes Peptid oder Multimer kodiert. Die für das erfindungsgemäße antibakterielle oder antimykotische Peptid oder multimere Konstrukt kodierende Nukleinsäure steht dabei in operativer Verbindung mit einer regulatorischen Sequenz, die dessen Expression in der Wirtszelle steuert. Ein weiterer Bestandteil der Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit dem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül transfiziert oder transformiert ist.

Die Erfindung wird nachfolgend durch folgende Ausführungsbeispiele erläutert, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken:

Beispiel 1 Peptidsynthese

Alle Chemikalien für die Peptidsynthese wurden, wenn nicht anders angegeben, von Fluka Chemie GmbH (Buchs, Schweiz) in der größtmöglichen Reinheit bezogen.

Alle Peptide und Peptidderivate wurden mittels konventioneller Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung der Fmoc/tBu-Strategie [48] an einem multiplen Peptidsyntheseroboter Syro 2000 (MultiSynTech GmbH, Witten, Deutschland) synthetisiert. Alle Standard-Fmoc-Aminosäuren wurden von MultiSynTech GmbH (Witten, Deutschland) bzw. Orpegen Pharma GmbH (Heidelberg, Deutschland) bezogen. Als spezielle Arginin-Homologe wurden 2-Amino-3-guanidinopropionsäure (Agp; Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Deutschland), β-Homoarginin (βHar, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz), Homoarginin (Har), N-Methylarginin (N-Me-Arg) und Nitroarginin (Arg(NO2), Bachem AG, Bubendorf, Schweiz) verwendet. Trans-4-Hydroxyprolin (t-4-Hyp) und 2,3-Diaminopropionsäure (Dap) wurden von Novabiochem (Merck Biosciences GmbH, Darmstadt, Deutschland) bezogen.

Die Peptide wurden entweder als Säure an Wang-Harz (1,23 mmol/g) oder als Säureamid an Rink-Amid 4-Methylbenzylhydrylamin (MBHA) Harz (0,67 mmol/g), der Firma MultiSynTech GmbH (Witten, Deutschland) synthetisiert. Zur späteren Funktionalisierung mit primären Aminen wurden Peptide als Peptidthioester derivatisiert und dazu die erste Aminosäure an 4-Sulfamino-butyryl-aminomethyl Harz (SAB AM, 1,1 mmol/g; Novabiochem, Merck Biosciences GmbH, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt.

An Wang Harz wurde die erste C-terminale Aminosäure (5 eq) mit 5 eq 2,6-Dichlorbenzoylchlorid (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und 8,25 eq Pyridin in Dichlormethan (DCM; Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) gekoppelt [49]. Die Funktionalisierung des SAB AM Harzes mit der C-terminalen Aminosäure (5 eq) erfolgte bei –20°C durch Aktivierung mit 5 eq (Benzotriazol-1-yloxy)-tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphat (PyBOP, Novabiochem, Merck Biosciences GmbH, Darmstadt, Deutschland) und 10 eq N-Ethyldiisopropylamin (DIPEA) in DCM [50].

Die erste Aminosäure wurde an Rink-Amid Harz durch Aktivierung von jeweils 8 eq Aminosäure gelöst in 0,5 mol/L 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) mit 8 eq N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) in Dimethylformamid (DMF; Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) gekoppelt, wie bei der automatischen Synthese an vorher beladenes Wang und SAB AM Harz beschrieben.

Als Seitenkettenschutzgruppen wurden Triphenylmethyl (trityl) für Cys, Asn, His und Gin, tert.-Butylether (tBu) für Tyr, Ser und Thr, tert.-Butylester (OtBu) für Asp und Glu, ω-N-2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) für Arg, ω-N-2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) für βHar und Har, tert.-Butyloxy-carbonyl (Boc) für Lys, Orn, und Agp bzw. ω-N-4-Methoxy-2,3-6-trimethylphenyl-sulfonyl (Mtr) für N-Me-Arg eingesetzt. Die temporäre Fmoc-Schutzgruppe wurde mit 40% Piperidin (Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) in DMF (v/v) für 5 min und erneut mit frischen 20% Piperidin in DMF (v/v) für 10 min abgespalten.

Die N-Termini der Peptide oder Peptidderivate wurden acetyliert, formyliert bzw. iodacetyliert indem 8 eq Essigsäure, Ameisensäure bzw. Iodessigsäure in 0,5 mol/L HOBT/DMF gelöst und mit 8 eq DIC in DMF aktiviert wurden. Der N-Terminus der Peptide oder Peptidderivate wurde nach Gausepohl et al. [51] mit je 10 eq 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphat (HBTU, MultiSynTech GmbH, Witten, Deutschland) und DIPEA in DMF guanidiert. Die N-Termini wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5,6-Carboxyfluorescein (5 eq) mit 5 eq HBTU und 10 eq DIPEA in DMF modifiziert.

Die Vollständigkeit N-terminaler Modifikationen wurde mittels Kaisertest überprüft. Dazu wurde etwas Harz mit 0,28 mol/L Ninhydrin (Riedel de Haen, Seelze, Deutschland) in Ethanol (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland), 0,2 mmol/L Kaliumcyanid in Pyridin und 76% Phenol in Ethanol im Verhältnis (1:1:2) bei 95°C inkubiert. Falls eine Blaufärbung auftrat, was auf freie primäre Aminogruppen hindeutet, wurde die Kopplung nochmals wiederholt.

Nach Beendigung der Synthese der Peptide oder Peptidderivate wurden die Harze sorgfältig mit DMF und DCM gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die Harz-gebundenen Peptide wurden mit einer Mischung aus Wasser, m-Kresol, Thioanisol und Ethandithiol (5:5:5:2,5) in 87,5% Trifluoressigsäure (TFA) bei Raumtemperatur für 4 h abgespalten und zugleich die Seitenketten entschützt. Die Peptide und Peptidderivate wurden mit kaltem Diethylether präzipitiert und bei 3000 × g abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit kaltem Ether gewaschen, getrocknet und in 0,1% wässriger TFA (UV-Spektroskopie) gelöst. Die Proben wurden bei –20°C gelagert.

Vor der Abspaltung der Peptide am SAB AM Harz, wurde der N-Terminus nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe mit 20 eq Di-tert-butyldicarbonat (Boc2O, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz) und 10 eq DIPEA in DMF geschützt. Zum gewaschenen Harz wurden 100 eq Iodacetonitril und 20 eq DIPEA in DMF gegeben um den Sulfamyl-Linker durch Alkylierung zu aktivieren [52]. Zur Abspaltung des Peptids wurde das Harz mit 50 eq Propylamin in DMF (10% v/v) versetzt. Nach dem Entfernen des DMF wurde das Rohpeptid in einer Lösung aus Wasser, m-Kresol, Thioanisol und Ethandithiol (5:5:5:2,5) in 87,5% TFA gelöst und alle Seitenschutzgruppen und die N-terminale Boc-Schutzgruppe abgespalten. Die Peptide wurden mit kaltem Diethylether präzipitiert und bei 3000 × g abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde zweimal mit kaltem Ether gewaschen, getrocknet und in 0,1% wässriger TFA (UV-Spektroskopie) gelöst. Die Proben wurden bei –20°C gelagert.

Die abgespaltenen Peptide und Peptidderivate wurden mittels RP-HPLC an einem Äkta HPLC System (Amersham Bioscience GmbH, Freiburg, Deutschland) mit einer Jupiter C18 5 μm 300 Å, 250 × 10 mm bzw. Jupiter C18 15 μm, 300 Å, 250 × 21 mm Säule (Phenomenex Inc., Torrance, USA) gereinigt.

Als Laufmittel wurde jeweils 0,1% wässrige TFA (Eluent A) und 60% wässriges Acetonitril (Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) mit 0,1% TFA (Eluent B) verwendet. Ein typischer linearer Gradient begann bei 5% B und die Elution erfolgte bei einer Steigung von 1% B pro Minute mit einer Flussrate von 10 mL/min (250 × 21 mm Säule) bzw. 5 mL/min (250 × 10 mm Säule). Detektiert wurde bei 220, 230 und 240 nm. Die Analytik der gereinigten Peptide erfolgte mit dem gleichen HPLC System mit einer Jupiter C18 5 μm, 300 Å, 150 × 4,6 mm Säule (Phenomenex Inc., Torrance, USA). Eluiertwurde bei einer Flussrate von 1 mL/min mit einem linearen Gradienten von 5–95% B in 30 min und detektiert bei 220 nm. Zusätzlich wurde die Reinheit mittels Matrix-unterstützter Laser Desorption/Ionisierung mit Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS; 4700 Proteomic Analyzer, Applied Biosystems GmbH, Darmstadt, Deutschland) bestimmt. Dafür wurde 0,5 μL Peptidlösung mit 0,5 μL α-Cyanohydroxyzimtsäure (Bruker Daltonik GmbH; Bremen, Deutschland) als Matrix (5,3 mg/mL in 50% Acetonitril in 0,1% wässriger TFA) co-kristallisiert.

Die Thioether-Verknüpfung der Penetratin-Derivate erfolgte durch Inkubation des gereinigten Penetratin-Cys-Monomers mit 4 eq gereinigtem iodacetyliertem AMP in entgaster phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) bei 4°C unter Stickstoff. Die Reaktion wurde mittels RP-HPLC verfolgt und das Penetratin-Konstrukt nach vollständiger Umsetzung des Penetratin-Cys-Monomers aufgereinigt. Hierbei wurde parallel das (Penetratin-Cys)2-Dimer gewonnen.

Ausgehend von der unvollständig bestimmten Sequenz des Prolin-reichen antimikrobiellen Peptids „Oncopeltus antibakterielles Peptid 4” wurden zunächst erste Derivate von Peptid 4 (Tabelle 2) wurden mit den C-terminalen Aminosäuren N18N19R20 synthetisiert und die Carboxyfunktion nicht verändert. Unter den Modifikationen an Position 11 waren die kationischen Aminosäuren Lys und Arg viel versprechend. Die Derivate zeigten antibakterielle Aktivität gegenüber E. coli und M. luteus im unteren mikromolaren Bereich. Zur weiteren Derivatisierung des C-Terminus wurde deshalb die mit Arg11 derivatisierte Sequenz ausgewählt und Derivate mit unterschiedlicher Anordnung von Asn und Arg synthetisiert. Das am C-Terminus um Asn verkürzte Derivat (Seq. ID Nr. 18) zeigte eine hohe Aktivität. Als C-terminales Säureamid erreichte es zudem eine hohe Serumstabilität. Das Peptid mit der Sequenz VDKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH2 (Seq. ID Nr. 18) wird im folgenden als Oncocin bezeichnet und wurde vor allem bezüglich der Serumstabilität aber auch der antimikrobiellen Aktivität weiter verbessert. Tabelle 2:

  • *Vergleichsbeispiel.
Tabelle 3: Übersicht der synthetisierten Peptidsequenzen
  • Propyl steht für ein Propylamid am C-Terminus (Sub2 = OR3 = NHC3H7); Ac = Acetyl-, for = Formyl-, guan = Guanidino-Gruppe und CF = 5,6-Carboxyfluorescein sind Beispiele für modifizierte N-Termini (modifizierte alpha-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure, Sub1 = Acetyl-NH, Formyl-NH, Guanidino oder 5,6-Carboxyfluorescein),
  • βHar: β-Homoarginin, die beta-Aminosäure-Homologe zur Arginin,
  • Agp: 2-Amino-3-guanidinopropionsäure, Har: Homoarginin und Arg(NO2): Nitroarginin sind Homologe des Arginin
  • N-Me-Arg: N-Methyl-Ariginin – ein an der Peptidbindung methyliertes Arginin,
  • 4tHyp: trans-4-Hydroxyprolin
  • Dap(Ac): 2,3-Diaminopropionsäure mit acetylierter Aminofunktion in der Seitenkette
  • (CH2CO): Acetyl-Linker an SHGruppe des Cystein
  • f: a-Aminocapronsäure,
  • mit * sind Vergleichsbeispiele markiert.

Beispiel 2: Serumstabilität

Die Serumstabilitätsstudien wurden als Doppelbestimmung nach Hoffmann et al. [53] in Mausserum und 25% wässrigem Mausserum (PAA Laboratories GmbH; Pasching, Österreich) durchgeführt. Dazu wurden die Peptide und Peptidomimetika in Wasser gelöst, Mausserum zugegeben und eine Peptidkonzentration von 75 μg/mL eingestellt. Unter ständigem Schütteln wurde die Mischung bei 37°C inkubiert. Nach 0, 30, 60, 120, 240 und 360 Minuten wurde jeweils ein Aliquot entnommen und mit 15%iger wässriger Trichloressigsäure (Carl Roth GmbH & Co. KG; Karlsruhe, Deutschland) gemischt. Nach weiteren 10 Minuten Inkubation auf Eis wurden die präzipitierten Serumproteine abzentrifugiert (5 min, 13400 rpm, MiniSpin, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland). Der Überstand wurde abgenommen, mit 1 mol/L wässriger Natriumhydroxidlösung (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweitz) neutralisiert und bis zur Analyse bei –20°C gelagert.

Die Überstände wurden mittels RP-HPLC mit einem linearen Acetonitrilgradienten (Biosolve BV, Valkenswaard, Niederlande) in Gegenwart von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA, UV-grade, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweitz) als Ionenpaarreagenz analysiert. Die Fraktionen wurden mit α-Cyanohydroxyzimtsäure (Bruker Daltonik GmbH; Bremen, Deutschland) als Matrix (5,3 mg/mL in 50% Acetonitril in 0,1% wässriger TFA) co-kristallisiert und mit einem Tandem-Massenspektrometer (MALDI-TOF/TOF-MS, 4700 Proteomics Analyzer; Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland) im Positiv-Ionenreflektor-Modus analysiert. Der Anteil der intakten Peptide und deren Abbauprodukte bzw. Metabolite konnten so zu den einzelnen Zeitpunkten identifiziert und quantifiziert werden. Als Kontrolle diente 25%iges wässriges Mausserum, das parallel für die gleichen Zeitintervalle analysiert wurde.

In Tabelle 4 sind die Halbwertszeiten von Oncocin (SEQ ID Nr. 18) und ausgewählter Oncocin-Derivate in 25% Mausserum angegeben. Die aufgeführten Oncopeltus 4 Derivate mit Seq. ID Nr. 14 und 19 haben aufgrund der freien Carboxylfunktion mit weniger als 30 min Halbwertszeit die geringste Stabilität. Hier wird zuerst die labilste Spaltstelle das Arginin an Position 19 (Rest X4) wahrscheinlich durch Endoproteasen ungehindert gespalten. Die Stabilität des Abbauproduktes VDKPPYLPRPRPPRRIYN-OH (Seq. ID Nr. 28) erhöht sich danach auf 120 min, jedoch besitzt dieses Fragment nur noch sehr geringe antimikrobielle Aktivität (64 μg/mL E. coli). Mit der Amidierung des C-Terminus (Sub2) im Oncocin erhöht sich neben der Aktivität gegen E. coli und M. luteus (4 bzw. 8 μg/mL) auch die Stabilität auf 60 min, einen für Peptidderivate relativ hohen Wert. Durch die Amidierung mit Propylamid (Seq. ID Nr. 58) verlängerte sich die Halbwertszeit des Oncocins sogar auf 120 min. Ein zusätzliches Asn20 am C-Terminus in Seq. ID Nr. 17 destabilisiert Arg19 wiederum und reduziert die Halbwertszeit auf 45 min. Tabelle 4: Serumstabilität: Halbwertszeiten von Oncocin und ausgewählten Oncocin-Derivaten in 25% Mausserum.

  • * Vergleichsbeispiele.

Die Substitution von Position 19 (Rest X4) gegen die nicht proteinogene Aminosäure Ornithin (Seq. ID Nr. 61) erhöhte die Stabilität auf 120 min Halbwertszeit. Im Oncocin konnte mit Arg14↓Arg15 (Rest X3) eine weitere Spaltstelle und VDKPPYLPRPRPPR-OH (Seq. ID. Nr. 114) als entsprechendes Abbauprodukt identifiziert werden. Die Substitution Arg15 gegen Ornithin erhöhte die Stabilität diese Oncocin-Derivates (Seq. ID Nr. 50) auf 90 min Halbwertszeit. Die Derivate mit Prolin (Seq. ID Nr. 60) oder β-Homo-Arginin (Seq. ID Nr. 62) an Position 15 (Rest X3) waren sogar erst nach 120 bzw. 150 min zur Hälfte abgebaut. Die Substitution des Prolins an Position 13 in 4-trans-Hydroxyprolin (Seq. ID Nr. 24) hatte keinen Effekt auf die Stabilität des Oncocins.

Durch Kombination dieser Modifikationen an Position 15 und 19 (Reste X3 und X4) war es möglich sehr stabile Peptidderivate zu synthetisieren, für die Halbwertszeiten von über 360 min bestimmt wurden. Dabei war die Aktivität der bevorzugten Beispiele Seq. ID Nr. 63 und 72 mit Orn19 und Hyp15 bzw. Orn15 mit MHK-Werten von 4 bzw. 8 mg/mL gegen E. coli vergleichbar mit Oncocin. Die Kombination Orn15 mit propylamidiertem C-terminus (Seq. ID Nr. 71) stellt ein weiteres sehr bevorzugtes Beispiel der Erfindung dar.

Beispiel 3: Antibakterielle Tests3.1 Hemmzonentest (Agar-Diffussions-Test)

Die gereinigten Peptide und Peptidderivate wurden in Wasser auf eine Endkonzentration von 500 μg/mL verdünnt. Die Testkeime wurden aus einer Kultur in logarithmischer Wachstumsphase in einer Konzentration von ca. 3 × 105 Zellen/mL in 1% Tryptic Soy Broth und 1,2% Agarose (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz) ausplattiert. In Abständen von 3 cm wurden je 10 μL wässrige Peptidlösung (500 μg/mL) bzw. 10 μL Wasser und Antibiotikalösung als Kontrollen aufgetropft. Nach 20 h Inkubationszeit bei 37°C wurden die Hemmzonendurchmesser (HZD) bestimmt. Alle Tests wurden unter aeroben Bedingungen durchgeführt.

Mit dem Alanin-Scan der Oncocin-Sequenz konnten verschiedene Reste identifiziert werden, deren Austausch gegen Alanin zu einer deutlichen Abnahme der antimikrobiellen Aktivität gegen E. coli BL21A1(1) und M. luteus 10240 (2) führte.

1 zeigt die antibakterielle Aktivität der Oncocin-Analoga (Ala-Scan) gegen E. coli BL21AI in Agar-Diffusions-Tests. Gestreifte Balken zeigen partielle Inhibierung an.

2 zeigt die antibakterielle Aktivität von Oncocin-Analoga (Alanin Scan) gegen Micrococcus luteus ATCC 10240 in Agar-Diffusions-Tests

In 1 und 2 ist die Sequenz des Oncocins VDKPPYLPRPRPPRRIYNR (Seq. ID Nr. 18) auf der X-Achse aufgetragen. Jede Aminosäure repräsentiert das entsprechende Peptid mit dem an dieser Postion ausgetauschten Alanin. So steht zum Beispiel der Balken Val1 für das Peptid ADKPPYLPRPRPPRRIYNR-NH2 (Seq. ID Nr. 29), dem der Wert des HZD auf der Y-Achse zugeordnet ist. Je größer der Durchmesser der Hemmzone, umso höher ist die Aktivität des Peptids.

In den Agar-Diffusions-Tests gegen E. coli BL21AI (1) zeigte sich, dass sowohl der Alanin-Austausch an den Positionen Lys3, Tyr6-Arg9 und Arg11 die Aktivität im Vergleich zum Oncocin (HZD 1,7 cm) deutlich reduzierte. Diese Derivate (Seq. ID Nr. 31, 34 bis 37, 39) inhibieren das Wachstum von E. coli auf der Agar-Platte nur partiell mit teilweise bewachsenen Hemmzonen mit 1,0 bis 1,2 cm Durchmesser. Die kleinste, nicht bewachsene Hemmzone hatte das Peptid Ala15 (1,3 cm; Seq. ID Nr. 43), diese Position ist auf Grund der Proteasestabilität interessant und sollte nur gegen ebenfalls kationische Aminosäurederivate ausgetauscht werden. Alle anderen Postionen können wahrscheinlich verändert werden ohne die Aktivität zu reduzieren, wobei aber eine Aktivitätssteigerung, Erweiterung des Spektrums, Stabilisierung gegenüber Proteasen und eine bessere in-vivo-Verteilung erreicht werden können. Positive Effekte wurden hier vor allem am N-terminalen Val1 und am C-terminalen Arg19 erwartet, wenn proteasestabile Aminosäuren eingebaut und so die Serumstabilität erhöht werden kann ohne die antimikrobielle Aktivität zu verlieren.

Die Agar-Diffusions-Tests gegen das Gram-positive Bakterium M. luteus (2) zeigten, dass durch den Alanin-Austausch sowohl positive als auch negative Effekte auf die antimikrobielle Aktivität erzielt werden. Für die Aktivität wichtige Positionen sind über die gesamte Sequenz verteilt, die Peptide inhibieren das Wachstum hier komplett mit minimal kleineren Hemmzonen gegenüber dem Oncocin (1,8 cm). Vor allem der Austausch von Lys bzw. Arg und damit der Verlust einer positiven Ladung im Peptid reduziert die antimikrobielle Aktivität. Die mit 0,7 cm größte Steigerung der Aktivität konnte mit dem Austausch von Ile16 und Asn18 erreicht werden (Seq. ID Nr. 45, 46). Änderungen an diesen Positionen finden sich in Beispielen mit jeweils Orn15 und Orn19 sowie einer Substitution in Position 16 gegen Leu (Seq. ID Nr. 73) bzw. Position 18 gegen Gin (Seq. ID Nr. 74) wieder. Seq ID. Nr. 74 erreicht durch diese drei Substitutionen eine Aktivität die der des Oncocins entspricht, wobei das Gln18 den geringen negativen Effekt der Ornithin-Substitution kompensieren kann.

3.2 Wachstumsinhibitionsassay

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der antimikrobiellen Peptide und Peptidderivate wurden in Mikrodilutionstests bestimmt. Dabei wurde eine fortlaufende Peptidverdünnung in sterilen 96-well Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Polystyren, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland) und einem Gesamtvolumen von 100 μL pro Vertiefung eingesetzt. Die wässrigen Peptid- oder Peptidomimetika-Lösungen wurden mit 1% TSB Wasser verdünnt, um eine Endkonzentration von 256 μg/mL zu erhalten. 50 μL der Peptid- oder Peptidomimetika-Lösung wurden in die erste Vertiefung jeder Reihe pipettiert und gemischt. Von dieser Lösung wurden 50 μL in die zweite Vertiefung transferiert, gemischt und erneut 50 μL in die nächste Vertiefung transferiert, usw. Dabei wird eine zweifache Verdünnungsserie erhalten, beginnend bei 256 μg/mL in der ersten Vertiefung bis zu 125 ng/mL in der zwölften Vertiefung. Die Bakterien, z. B. E. coli BL21AI, wurden in Nährboullion (NB, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) bei 37°C über Nacht kultiviert. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte wurden 50 μL einer 5 × 106 Bakterien/mL Suspension in 1% TSB gegeben und so eine Endkonzentration der Peptide oder Peptidomimetika von 128 μg/mL (Vertiefung 1) bis zu 62,5 ng/mL (Vertiefung 12) in jeder Reihe eingestellt. Die Platten wurden für 20 h bei 37°C inkubiert und danach die Absorption bei 595 nm mit einem TECAN Mikrotiterplatten Spektralfotometer (Tecan Trading AG, Mannedorf, Schweiz) gemessen. Die MHK-Werte aller Peptide und Peptidomimetika wurden dreifach bestimmt. Steriles Wasser wurde als Negativkontrolle eingesetzt. Der MHK-Wert stellt die kleinste Peptidkonzentration dar, bei der nach einer Inkubationzeit von 20 h bei 37°C kein Bakterienwachstum beobachtet werden kann.

Die MHK-Werte der Peptide und Peptidderivate gegen Escherichia coli BL21AI und Micrococcus luteus ATCC 10240 sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5: Antimikrobielle Aktivität gegen E. coli BL21AI und M. luteus 10240. Minimale Hemmkonzentration (MHK) bestimmt in 1% TSB.

Die Seq. ID Nr. 2 entspricht der nativen Oncopeltus 4 Sequenz. Seq. ID Nr. 1 ist ein N-terminal verkürztes Derivat der nativen Oncopeltus 4 Sequenz. Die Sequenzen mit den Seq. ID Nr. 1, 2, 3, 4, 10 bis 13, 17, 28, 31, 34, 35, 39 und 48 sind Vergleichsbeispiele, diese und weitere sind in der Tabelle 5 mit * markiert. Die Sequenzen mit den Seq. ID. Nr. 8 bis 9, 80, 81 und 85 sind weniger bevorzugte Beispiele der Erfindung. Die anderen in Tabelle 5 gezeigten Sequenzen sind erfindungsgemäß bevorzugte Peptide oder Peptidderivate. Am meisten bevorzugte Beispiele sind die Seq. ID Nr. 18, 22, 24, 26, 29, 58, 62, 63, 65 bis 71, 74, 79 und 82.

Durch den Austausch des Pro11 (Rest X2) in der Ausgangssequenz (Seq. ID Nr. 2) gegen die kationischen Aminosäuren Lys und Arg (Seq. ID Nr. 8, 14) konnte eine höhere Aktivität gegen E. coli BL21AI und M. luteus 10240 erreicht werden. Ein Austausch gegen His (Seq. ID Nr. 5) und ein in Prolin-reichen AMP häufig an dieser Position vorkommendes Thr (Seq. ID Nr. 4) hatte keinen positiven Effekt. Das Derivat mit Arg an Position 11 hatte mit 8 μg/mL (E. coli), die bis dahin niedrigste MHK und wurde daraufhin C-terminal verändert. Die Amidierung des C-Terminus veränderte die Aktivität nur gegen M. luteus negativ um eine Verdünnungstufe. Peptidderivate ohne Arg und damit fehlender positiver Ladung an letzter oder vorletzter Position (Seq. ID Nr. 27, 28, 47, 51) verloren 8 bis 16fach an Aktivität, vor allem gegenüber M. luteus und gehören nicht zu den bevorzugten Beispielen.

Seq. ID Nr. 16 mit Arg an Position 19 (Rest X4) und Asn an 20 war in gleichem Maß aktiv wie Seq. ID Nr. 14. Die Amidierung des C-Terminus (Sub2) hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivität (Seq. ID Nr. 15). Wurde dieses Peptidderivat ohne Asn20 (Seq. ID Nr. 19) synthetisiert nahm die Aktivität um zwei Verdünnungsstufen ab. Durch Amidierung des C-terminus (Sub2) konnte die Aktivität dieser Sequenz (Seq. ID Nr. 18) allerdings wieder hergestellt und sogar um eine Verdünnungstufe gegenüber Seq. ID Nr. 14 gesteigert werden. Die C-terminale Amidierung hat zusätzlich einen signifikant positiven Effekt auf die Proteasestabilität. Amidierte Peptidderivate haben so eine bis zu 30 min längere Halbwertszeit als das entsprechende Peptid mit freier Säurefunktion (Beispiel 2). Das Peptidderivat Seq. ID Nr. 18 hatte mit 4 bzw. 8 μg/mL gegen E. coli bzw. M. luteus die niedrigsten MHK-Werte, bei einer Halbwertszeit von 60 min in 25% wässrigem Mausserum und wurde als Oncocin bezeichnet (Tabelle 4).

Im Serumstabilitätstest wurde Oncocin C-terminal an Position 15 (Rest X3) und 19 (Rest X4) gespalten und die Peptide VDKPPYLPRPRPPR-OH (entspricht Seq. ID Nr. 114) und VDPPYLPRPRPPRRIYN-OH (entspricht Seq. ID Nr. 28) als Hauptabbauprodukte identifiziert. Das um Arg19 verkürzte Derivat hatte mit einer MHK von 64 μg/mL nur noch sehr geringe antimikrobielle Aktivität gegenüber E. coli. Um diese Position vor Proteaseabbau zu schützen wurden Derivate des Arginins und andere kationische Aminosäuren an Position 19 (Rest X4) eingebaut. Ein weniger bevorzugtes Beispiel war ein Peptid mit His an Position 19 (Rest X4; Seq. ID Nr. 53), das mit einer MHK von 16 μg/mL gegen E. coli eine 4mal geringere Aktivität hatte als Oncocin. Bevorzugte Beispiele sind Substitutionen mit Agp, Arg(NO2), N-Me-Arg und Har (Seq. ID Nr. 54–57) an Position 19 (Rest X4) substituierte Peptidderivate deren MHK-Werte innerhalb der Fehlergrenze des Test den Werten des Oncocins entsprechen. Das bevorzugte kostengünstigste Beispiel war die Substitution des Arg19 gegen Ornithin in Seq. ID Nr. 50. Dieses Derivat hat nur eine geringfügig niedrigere Aktivität von einer Verdünnungsstufe, war aber mit der doppelten Halbwertszeit (120 min) in 25% Mausserum deutlich stabiler als Oncocin (60 min). Ein weiteres bevorzugtes Beispiel für die Stabilisierung des C-Terminus war die Amidierung der Carboxylfunktion (Sub2) als Propylamid (Seq. ID Nr. 58). Die antimikrobielle Aktivität bleibt erhalten und die Halbwertszeit beträgt ebenfalls mehr als 120 min.

In den an Position 19 (Rest X4) stabilisierten Derivaten wurde in weiteren Beispielen die Position 15 (Rest X3) durch Argininderivate oder andere kationische Aminosäuren substituiert. Bevorzugte Beispiele sind Seq. ID Nr. 65–70, mit unterschiedlichen Kombinationen von Agp, Arg(NO2), N-Me-Arg, Har und Orn. Das kostengünstigste bevorzugte Beispiel ist Seq. ID Nr. 72) mit Ornithin an Position 15 und 19 (Rest X3 und X4) und einer Halbwertszeit von mehr als 360 min, bei gegenüber Oncocin vergleichbarer Aktivität (MHK 8 μg/mL E. coli). Seq. ID Nr. 74 wurde zusätzlich zu Orn15 und Orn16 mit eine Substitution von Glutamin an Position 18 gegen Asparagin vorgenommen, was in einer geringfügig höheren Aktivität (MHK 4 μg/mL E. coli) resultierte. Die Kombination von Orn an Position 15 (Rest X3) und der Amidierung des C-Terms (Sub2) mit Propylamin in Seq. ID NR. 71 ist ein weiteres sehr bevorzugtes Beispiel mit hoher Aktivität (4 μg/mL E. coli) und sehr hoher Serumstabilität (> 360 min). Eine nicht-kationische Substitution an Position 15 (Rest X3) mit Hydroxyprolin wurde in der bevorzugten Seq. ID Nr. 63 in Kombination mit Orn an Position 19 (Rest X4) durchgeführt. Dieses Derivat besitzt ebenfalls eine hohe Aktivität (4 μg/mL E. coli, 8 μg/mL M. luteus) und hervorragende Stabilität (> 360 min). Die Substitution des Prolins in Position 4, 8 oder 13 (Seq. ID Nr. 21–24) des Oncocin durch Hydroxyprolin hat weder einen Einfluss auf die MHK-Werte innerhalb der Fehlergrenze des Tests, noch reduziert es die Proteaseresistenz der zweiten labilen Spaltstelle an Position 15 (Rest X3). Während dieser Austausch durch Hydroxyprolin weder einen Effekt auf die MHK-Werte noch einen Effekt auf die Serumstabilität hat, sollte die höhere Polarität zusätzlich die Zelltoxizität und die Hämolyse reduzieren, da polarere Peptide schwächer an die hydrophoben Zellmembranen binden.

Ein bevorzugtes Beispiel für Modifikation des N-Terminus im Oncocin ist Seq. ID Nr. 82 mit Substitution von Position 1 (Rest X1) in Cm, mit gleicher Aktivität gegenüber Oncocin im Fehlerbereich des Tests. Acetylierung, Methanoylierung (Formylierung) oder Guanidierung der N-terminalen Aminofunktion (Sub1; Seq. ID Nr. 80, 81, 83, 84, 85) reduzierten die Aktivität auf z. B. 128 μg/mL bzw. 32. (E. coli bzw M. luteus; Seq. ID Nr. 81).

Die Kopplung des Penetratins erfolgte über eine Thioetherbrücke an die Aminofunktion der N-Termini der antimikrobiellen Peptide. Diese Modifikation konnte das Aktivitätsspektrum der bis dahin gegen M. luteus wenig aktiven Peptide auf dieses Bakterium erweitern. Am meisten wurde der MHK-Wert für Pyrrhocoricin (Seq. ID Nr. 91) von 128 μg/mL auf 4 μg/mL für Penetratin-Pyrrhocoricin (Seq. ID Nr. 98) reduziert, was einer 32fachen Steigerung der Aktivität entspricht.

Auch das Penetratin-Apidaecin (8 μg/mL, Seq. ID Nr. 94) war 8fach aktiver als das unmodifizierte Apidaecin 1b (64 μg/mL Seq. ID Nr. 87). Für Oncocin (Seq. ID Nr. 18) mit einem MHK-Wert von 8 μg/mL konnte noch eine 2fache Steigerung der Aktivität auf 4 μg/mL für Penetratin-Oncocin (Seq. ID Nr. 100) beobachtet werden. Die hohe Aktivität des Drosocins (0,5 μg/mL, Seq. ID Nr. 89) blieb beim Pentetratin-Drosocin-Konstrukt (1 μg/mL, Seq. ID Nr. 96) in den Grenzen des Fehlerbereichs erhalten.

In Tabelle 7 sind die MHK-Werte einiger Peptide und Peptidderivate gegen multiresistente Bakterienstämme angegeben. Die Tests wurden dabei in dem zu 1% TSB äquivalenten Mueller-Hinton-Medium (1/4 konzentriert) durchgeführt. Einige der getesteten resistenten Bakterienstämme sind in Tabelle 6 und die gestesteten Peptide in Tabelle 8 angeführt. Tabelle 6: Getestete Multi-resistente Gram-negative Bakterien

E. coli D31 (J. Wilson)β-Lactamase-Überproduzent (ESBL+) – resistent gegenβ-Lactamase-InhibitorenE. coli ATCC BAA-457Trimethoprim-Sulfomethoxazol-resistentE. coli 045-849 SENTRYCiprofloxacin- und Trimethoprim-Sulfomethoxazol-resistentK. pneumoniae ATCC 27799Gentamicin-, Cephalothin- und Naladixinsäure-resistentK. pneumoniae ATCC 700603produziert β-Lactamase SHV-18 (ESBL+) – resistent gegenβ-Lactamase-InhibitorenK. pneumoniae 012-3132Fluoroquinolon-resistentS. typhimurium ATCC 700408multi-resistent (z. B. Ampicilin, Chloramphenicol)S. typhimurium S5 (J. Weiser)multi-resistent (z. B. Cefotaxim, Tobramycin)
Tabelle 7: Antimikrobielle Aktivität gegen multiresistente Bakterien. MHK in ¼ Muller-Hinton Medium.
  • n. b: nicht bestimmt
  • * Apidaecin 1b (Seq. ID Nr. 87) und Drosocin (Seq. ID Nr. 89) zum Vergleich.

Tabelle 8: Getestete Sequenzen

Die bevorzugten Beispiele Seq. ID Nr. 18, 22 und 24 zeigten vergleichbare und teilweise hohe Aktivität gegenüber den drei verschiedenen Gram-negativen multi-resistente Bakterienspezies E. coli, Klebsiella pneumonia und Salmonella typhimurium. Das Oncocin (Seq. ID Nr. 18) hatte unter anderem MHK-Werte von 2 μg/mL gegen β-Lactamase-überproduzierende E. coli D31, 4 μg/mL gegen Fluoroquinolon-resistente K. pneumoniae 012-3132 und 0,25 μg/mL gegen multiresistente S. typhimurium ATCC 700408 Bakterien. Die um ein Asn an Position 19 verlängerte Sequenz ID Nr. 15 war unter den getesteten amidierten Peptiden gegen die E. coli und K. pneumoniae Stämme mit MHK-Werten um 32 μg/mL am wenigsten aktiv. Nach der Veränderung der Oncopeltus 4 Sequenz (Seq. ID Nr. 2) durch Substitution mit qArg11 (Rest X2), ist die Deletion des Asn19 die zu Oncocin (Seq. ID Nr. 18) führte, entscheidend für die hohe Aktivität des Derivates. Die insgesamt niedrigere Aktivität der Peptidderivate mit freier Carboxyfunktion am C-Terminus (Sub2; Seq. ID Nr. 5, 14, 16, 20, 21 und 23) gegen E. coli und K. pneumoniae zeigt, dass die Amidierung an dieser Stelle (Sub2) grundsätzlich positiven Einfluss auf Aktivität und Stabilität der Oncopeltus 4 bzw. Oncocin Derivate hat.

Mit Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis und Proteus vulgaris wurden weitere Gramnegative Bakterien getestet und die Aktivität der bevorzugten Beispiele Seq. ID Nr. 18, 24 bestimmt. Oncocin (Seq. ID Nr. 18) war sowohl gegen P. aeruginosa 39324 (MHK 4 μg/mL) als auch schwach gegen P. mirabilis und P. vulgaris (128 μg/mL) aktiv. Gegen Gram-positive Staphylococcus saprophyticus 15305 Bakterien war Oncocin mit 16 μg/mL moderat aktiv.

Beispiel 4: Fluoreszenzmikroskopie

HeLa- und SH-SY5Y-Zellen wurden in 96 Well Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland) ausplattiert und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden mit 5,6-Carboxyfluorescein-markierte Peptide oder Penetratinkonstrukte in frischem Medium gelöst (40 μmol/L) und die Zellen darin 2 h inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in PBS mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Parameter für die Fluoreszenzmikroskopie

Mikroskop:Leica DMI6000B (Leica Mikrosystems GmbH, Wetzlar, Deutschland)Lichtquelle:Leica EL6000 mit Metall-Halogen-LampeObjektiv:N PLAN L 20 × 0,40 corrSoftware:Leica Application Suite 2.1.8.; Adobe Photoshop CS

3 zeigt Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von HeLa- und SH-SY5Y-Zellen nach Inkubation mit 5,6-Carboxyfluorescein-markiertem Oncocin (CF-Oncocin Seq. ID Nr. 94) und Penetratin-Oncocin (CF-Penetratin-Oncocin Seq. ID Nr. 102). Obere Reihe: Phasenkontrast; Untere Reihe: Fluoreszenz (517 nm Emission). A, B: SH-SY5Y inkubiert mit CF-Oncocin; C, D: SH-SY5Y mit CF-Penetratin-Oncocin; E, F: HeLa inkubiert mit CF-Oncocin; G, H: HeLa inkubiert mit CF-Penetratin-Oncocin. Balken entsprechen 20 μm.

Die fluoresenzmikroskopischen Aufnahmen in 3 zeigen, dass nach Inkubation mit 40 μmol/L 5,6-Carboxyfluorescein-markiertem Oncocin (Seq. ID Nr. 94) weder in HeLa- noch in SH-SY5Y-Zellen eine Fluoreszenz nachweisbar ist (3B und F). Auch für 5,6-Carboxyfluorescein-markiertes Apidaecin 1b, Pyrrhocoricin und Drosocin (Seq. ID Nr. 88, 90, 92) konnte keine Fluoreszenz und somit keine Internalisierung dieser antimikrobiellen Prolinreichen Peptide nachgewiesen werden. Nach Inkubation beider Zelllinien mit dem 5,6-Carboxyfluorescein-markiertem Penetratin-Oncocin (Seq. ID Nr. 102) konnte dagegen in den mikroskopischen Aufnahmen eine starke Fluoreszenz im Zellinneren beobachtet werden (3 D und E), was die Internalisierung des gesamten Konstruktes belegt.

Die Penetratinkonstrukte mit Apidaecin 1b, Pyrrhocoricin und Drosocin (Seq. ID Nr. 96, 98, 100) internalisieren ebenfalls in beide Zelllinien und zeigen deutliche Fluoreszenz. In 3C und G wird gleichzeitig sichtbar, dass beide Zelllinien durch die Penetratinkonstrukte bei einer Konzentration von 200 μg/mL geschädigt werden. Im Gegensatz zu den mit antimikrobiellem Peptid behandelten Zellen (3A und E) sind in beiden Fällen die Zellen nicht ausgestreckt und glatt abgegrenzt, sondern zeigen Anzeichen von Apoptose. Die Zytotoxizität der Penetratinkonstrukte wird in Beispiel 6 näher untersucht.

Beispiel 5: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie5.1 Bakterien

Eine über Nacht kultivierte Bakteriensuspension wurde auf 150 × 106 Zellen/mL verdünnt und die die 5,6-Carboxyfluorescein-markierten Peptide und Penetratinkonstrukte wurden zugegeben (Endkonzentration von 30 μmol/L). Um die Fluoreszenz der Moleküle außerhalb der Bakterien zu quenchen wurden 60 eq 5,6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA; Merck, Darmstadt, Deutschland) zugegeben. Die durch die Internalisierung der markierten Peptide in den Bakterien entstehende Fluoreszenz wurde sofort mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop TCS SP5 der Firma Leica Microsystems GmbH (Wetzlar, Deutschland) untersucht.

Nach 20 min Inkubation mit 5,6-Carboxyfluorescein-markiertem Oncocin, hatte sich das Peptid in der Bakterienmembran angereichert (4B). Der Quenching-Effekt durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FREI) zwischen 5,6-Carboxyfluorescein und TAMRA, das ausserhalb der Zelle verbleibt, geht dadurch verloren und ein Fluoreszenzsignal kann detektiert werden. Nach weiteren 30 min hatte sich das Peptid im Inneren der Zelle angereichert (4D). Die 5,6-Carboxyfluorescein-markierten Apidaecin 1b, Pyrrhocoricin und Drosocin Sequenzen (Seq. ID Nr. 96, 98, 100) internalisieren ebenfalls in E. coli und erzeugen eine deutliche Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu erreichen die markierten Penetratinkonstrukte langsamer das Zellinnere und verursachen nach vergleichbaren Inkubationszeiten eine wesentlich schwächere Fluoreszenz (4F). Diese Beobachtung korreliert mit den bestimmten minimalen Hemmkonzentrationen. So hatte das Penetratinkonstrukt des Oncocins mit 32 μg/mL (Seq. ID Nr. 100) eine 8mal höheren MHK-Wert als das Oncocin (4 μg/mL; Seq. ID Nr. 18) und damit wesentlich geringere Aktivität gegenüber E. coli (Tabelle 5). Der Eintritt des Penetratin-Homodimers konnte mittels Fluoreszenzmikroskopie auch nach 90 min nicht nachgewiesen werden (4H). Daraus lässt sich schließen, dass im Penetratinkonstrukt die jeweilige Prolinreiche Peptidsequenz das Penetratin als Kargo in die Bakterienzelle transportiert.

4 zeigt Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Aufnahmen von E. coli BL21AI. Peptidkonzentration 30 μmol/L; TAMRA Konzentration 180 μmol/L. Obere Reihe: Phasenkontrast; untere Reihe: Fluoreszenz. A, B: 20 min Inkubation mit CF-Oncocin; C, D: 50 min Inkubation mit CF-Oncocin; EF: 50 min Inkubation mit CF-Penetratin-Oncocin; G, H: 90 min Inkubation mit CF-Penetratin-Homodimer. Balken entsprechen 5 μm.

Im Gegensatz dazu, gelangt das 5,6-Carboxyfluorescein-markierte Penetratin-Homodimer in Gram-positive M. luteus Zellen und gibt dort nach 1 h Inkubation ein deutliches Fluoreszenzsignal (5J). Das markierte Pyrrhocoricin kann nach der gleichen Inkubationszeit nicht in M. luteus nachgewiesen werden (5B). Mit Penetratin als Transporter im markierten Penetratin-Pyrrhocoricin reichert sich das Derivat in M. luteus an und gibt ein starkes Fluoreszenzsignal (5D). Der MHK-Wert sinkt von 128 μg/mL für Pyrrhocoricin auf 4 μg/mL für Penetratin-Pyrrhocoricin, was einer 32fachen Zunahme der Aktivität entspricht (Tabelle 5). Parallel dazu konnte eine 8fache Steigerung der Aktivität für Apidaecin 1b (64 μg/mL) im Penetratin-Apidaecin Derivat (8 μg/mL) bestimmt werden. Ein Unterschied der Fluoreszenzaufnahmen von markiertem Drosocin und Penetratin-Drosocin ist nicht sichtbar (5F und H). Drosocin hat ein hohes Potential in M. luteus einzudringen, was auch durch den niedrigsten MHK-Wert aller vier AMP von 0,5 μg/mL belegt wird. Die Kopplung des Penetratins an Drosocin hat offensichtlich nur geringen Einfluß auf den Zelleintritt und erniedrigt die Aktivität leicht um eine Verdünnungsstufe.

5 zeigt Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Aufnahmen von M. luteus 10240. Peptidkonzentration 30 μmol/L; TAMRA Konzentration 180 μmol/L. Obere Reihe: Phasenkontrast; untere Reihe: Fluoreszenz. A, B: CF-Pyrrhocoricin; C, D: CF-Penetratin-Pyrrhocoricin; E, F: CF-Drosocin; G, H: CF-Penetratin-Drosocin; I, J: CF-Penetratin-Homodimer. Balken entsprechen 5 μm

5.2 HeLa- und SH-SY5Y-zellen

Die Zellen wurden auf Glasboden Kulturschalen der Firma MatTek Corporation (Ashland, MA, USA) kultiviert und mit 5,6-Carboxyfluorescein-markierten Penetratinkonstrukten (10 μmol/L für SH-SY5Y oder 7 μmol/L für HeLa) für 2 h oder 24 h inkubiert. Das Medium wurde entfernt, zweimal mit PBS gewaschen und neues Medium zugefügt. Zur Färbung des Zellkerns wurde der Farbstoff Hoechst 33342 (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz) zugefügt und weitere 15 min inkubiert. Die Fluoreszenz wurde sofort mit dem konfokalen Laser Scanning Mikroskop TCS SP5 analysiert. Alle Bilder wurden in einem sequentiellen Scan Modus aufgenommen und die Bilderstapel mit dem Leica Application Suite Advanced Fluorescence 1.7.1 Programm (Leica Microsytems) und Adobe Photoshop CS (Adobe Systems GmbH, München, Deutschland) analysiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass die antimikrobiellen Peptide, die N-terminal um 5,6-Carboxyfluorescein-Penetratin verlängert wurden, innerhalb von 2 Stunden in die Zellen eindringen. Dagegen waren die nur mit 5,6-Carboxyfluorescein markierten antimikrobiellen Peptide ohne die Penetratin-Sequenz nicht in den Zellen nachweisbar, d. h. dass diese Peptide nicht durch die äußere Zellmembran in die getesteten Zelllinien eindringen können, was auch erklärt, warum diese Peptide nicht toxisch auf Säugerzellen wirken. Der Transport ins Zellinnere erfolgt nur über die Penetratin-Sequenz. Die Färbung der Zellkerne mit dem Farbstoff Hoechst 33342 und der Mitochondrien mit dem Farbstoff MitoTracker Red CMXRos konnte eine Lokalisierung der Peptide in diesen Kompartimenten ausgeschlossen werden. Nach längerer Inkubationszeit (24 h) konzentrierte sich die vom 5,6-Carboxyfluorescein emittierte Fluoreszenz in der Nähe des Zellkerns. Durch Färbung des Golgi konnte eine partielle Co-Lokalisierung nachgewiesen werden.

Beispiel 6 Zytotoxizität6.1 MTT-Tests mit HeLa- und SH-SY5Y-Zellen

Die Zytotoxizität der Peptide, Peptidomimetika und Penetratinkonstrukte wurde mit dem „Cell Proliferation Kit I” der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) bestimmt. Das Verfahren beruht auf der Reduktion des gelben Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium Bromids (MTT) durch zelluläre Oxidoreduktasen metabolisch aktiver Zellen [54–56]. Die Bildung des wasserunlöslichen purpurfarbene Formazan Produkts ist proportional zur Zahl der lebensfähigen Zellen und kann nach Lyse der Zellen photometrisch detektiert werden.

Die Zellkultivierung erfolgte in Zellkulturflaschen (25 cm2) mit Filterkappe bzw. in 96-well Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland) bei 37°C unter 5% CO2 und 95% Luftfeuchte. Alle Medien und Zusätze wurden von PAA Laborstories (Pasching, Österreich) bezogen. MEM/Glutamin Medium mit 5% föltalem Kälberserum (HeLa) bzw. DMEM/HAM's F-12 Medium mit 15% fötalem Kälberserum (SH-SY5Y) wurde jeweils 1% nicht essentielle Aminosäuren und 1% Penicillin/Streptomycin zugesetzt.

HeLa bzw. SH-SY5Y Zellen wurden in sterilen 96-well Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 2 × 104 Zellen/well ausplattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit sterilem PBS gewaschen und die Peptide in 100 μL frischem Medium gelöst zugegeben. Als Negativ- bzw. Positivkontrolle diente 12% PBS bzw. 12% DMSO in Medium.

Nach Inkubation (24 h) wurden 10 μL MTT-Reagenz zugegeben um eine Endkonzentration von 0,5 mg zu erreichen und für weitere vier Stunden bei 37°C inkubiert. Mit einer 10%igen Natriumdodecylsulfat-Lösung in 0,01 mol/L Salzsäure wurden die Zellen und das kristalline Formazan gelöst und die Absorption nach 16 h bei 590 und 650 nm mit dem ParadigmTM Mikroplatten Reader (Beckman Coulter GmbH, Wals, Österreich) bestimmt.

Keines der getesteten antimikrobiellen Prolin-reichen Peptide zeigte bei 600 μg/mL toxische Effekte auf SH-SY5Y- oder HeLa-Zellen (6). Die Experimente wurden dreimal unabhängig als Dreifachbestimmung durchgeführt und der Anteil metabolisch aktiver Zellen auf die Negativkontrolle 12% PBS in Medium normalisiert. Die Ergebnisse werden dadurch bestätigt, dass die fluoreszenzmarkierten Derivate dieser Peptide nach einer Inkubationszeit von einer Stunde im Inneren dieser Zellen nicht nachgewiesen werden konnten (siehe Beispiel 5). Eine Interaktion mit extrazellulären Zielmolekülen oder Rezeptoren in der äußeren Zellmembran konnte so für SH-SY5Y- und HeLa-Zellen ebenfalls ausgeschlossen werden.

6 zeigt die Ergebnisse des Zytotoxizitätstest für die antimikrobiellen Peptide gegenüber SH-SY5Y- (gestreifte Balken) und HeLa-Zellen (schwarze Balken) bestimmt mit dem „Cell Proliferation Kit I”. Test nach 24 h Inkubation mit 600 μg/mL Oncocin, Oncocin R15O R19O, Drosocin und Apidaecin 1b (Seq. ID Nr. 18, 72, 89 und 87) in Medium. Positivkontrollen 12% DMSO und 100 μg/mL Melittin. Normalisiert auf Negativkontrolle 12% PBS.

Die Zytotoxizitätstests der Penetratin-Konstrukte wurden in drei unabhängigen Experimenten einer Verdünnungsreihe 50–400 μg/mL als Dreifachbestimmung durchgeführt. Das Penetratin-Monomer (Seq. ID Nr. 105) und eine Penetratin-Tau Sequenz, die als Kontrolle diente, zeigte bis zur höchsten Konzentration von 400 μg/mL keine toxische Wirkung gegen HeLa Zellen (6). Bei den Penetratin-Konstrukten mit antimikrobiellen Peptiden konnten zwischen 100 und 400 μg/mL schwach toxische Effekte beobachtet werden. Der Anteil lebender HeLa-Zellen sank nach 24 h Inkubation mit 400 μg/mL z. B. auf 60% für Penetratin-Drosocin und 30% für Penetratin-Oncocin (Seq. ID Nr. 97 und 101). Das Penetratin-Homodimer (Seq. ID Nr. 103) war bei 400 μg/mL fast 100% toxisch, vergleichbar zur DMSO-Kontrolle. In den Untersuchungen mit SH-SY5Y-Zellen reduzierte das Penetratin-Monomer und das Penetratin-Tau-Konstrukt bei 400 μg/mL den Anteil wachsender Zellen auf 70%. Bis zu einer Konzentration von 100 μg/mL wirkten auch alle Penetratin-AMP Konstrukte nicht toxisch. Bei einer Konzentration von 200 μg/mL sank der Anteil lebender Zellen auf 20% bzw. 30% für Penetratin-Apidaecin und Penetratin-Pyrrhocoricin. Penetratin-Drosocin und Penetratin-Oncocin zeigten bei 200 μg/mL eine Zytotoxizität vergleichbar zu 12% DMSO.

7 zeigt die Ergebnisse des Zytotoxizitätstest für die Penetratin-Konstrukte gegenüber HeLa-Zellen bestimmt mit dem „Cell Proliferation Kit I”. Test nach 24 h Inkubation mit 50–400 μg/mL Penetratin-Drosocin (Seq. ID Nr. 96), Penetratin-Apidaecin 1b (Seq. ID Nr. 94), Penetratin-Pyrrhocoricin (Seq. ID Nr. 98), Penetratin-Oncocin (Seq. ID Nr. 100), Penetratin-Homodimer (Seq. ID Nr. 102), Penetratin (Seq. ID Nr. 105) in Medium. Negativkontrolle 12% PBS und Positivkontrolle 12% DMSO.

8 zeigt die Ergebnisse des Zytotoxizitätstest für die Penetratin-Konstrukte gegenüber SH-SY5Y-Zellen bestimmt mit dem „Cell Proliferation Kit I”. Test nach 24 h Inkubation mit 50–400 μg/mL Penetratin-Drosocin (Seq. ID Nr. 96), Penetratin-Apidaecin 1b (Seq. ID Nr. 94), Penetratin-Pyrrhocoricin (Seq. ID Nr. 98), Penetratin-Oncocin (Seq. ID Nr. 100), Penetratin-Homodimer (Seq. ID Nr. 102), Penetratin (Seq. ID Nr. 105), Penetratin-Tau (Seq. ID Nr. 106) in Medium. Als Negativkontrolle wurde 12% PBS und als Positivkontrolle 12% DMSO eingesetzt.

6.2 Hämolysetest

Eine weitere Möglichkeit die Zytotoxizität der Peptide und Peptidderivate zu untersuchen ist der Hämolysetest. Die hämolytische Aktivität wird dabei an humanen Erythrozyten untersucht [57], die das Leipziger Universitätskrankenhaus (Deutschland) als humanes Erythrozyten-Konzentrat in Natriumchlorid-Adenin-Glukose-Mannitol-Puffer (Lagerung 4°C) zur Verfügung stellte. Die Erythrozyten wurden bei 1000 G abzentrifugiert und drei Mal mit dem zehnfachen Volumen an kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen. Die Erythrozyten wurden auf eine Endkonzentration von 1% in PBS verdünnt. Einhundert Mikroliter Erythrozytensuspension wurde in jede V-förmige Vertiefung einer 96-well Polypropylen-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One GmbH) pipettiert. In jede Position wurden dann 100 μL der in PBS gelösten Peptide hinzugefügt, um eine Verdünnungsreihe von 600 μg/mL bis zu 4,7 μg/mL in sieben Verdünnungsstufen zu erhalten. Die Mikrotiterplatte wurde für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend bei 1000 G zentrifugiert. Vom Überstand wurden 100 μL abgenommen, in eine 96-well Polystyrol-Mikrotiterplatte mit Flachboden überführt (Greiner Bio-One GmbH) und die Absorption bei 405 nm in einem Sunrise Mikrotiterplatten Reader (Tecan Trading AG, Mannedorf, Schweiz) bestimmt, um die Freisetzung der Hämgruppe auszuwerten. PBS bzw. 0,1% Triton X-100® ((p-tert-Octylphenoxy) polyethoxyethanol; Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz) und Melittin (SIGMA-Aldrich-Laborchemikalien, Taufkirchen, Deutschland) wurden als Negativ- bzw. Positivkontrollen eingesetzt. Alle Hämolysetests wurden zweimal unabhängig als Doppelbestimmung durchgeführt und der Hämolysegrad mit folgender Gleichung bestimmt [58]: (EPeptid – EPBS)/(ETriton – EPBS) × 100% E = Extinktion bei 405 nm

9 zeigt die Ergebnisse des Hämolyse-Test für die Peptide Oncocin, Drosocin und Apidaecin 1b (Seq. ID Nr. 18, 89 und 87). Peptidverdünnungsreihe 4,7–600 μg/mL. Positivkontrollen: Melittin und TritonX-100®, Negativkontrolle PBS.

Keines der analysierten antimikrobiellen Prolin-reichen Peptide zeigte hämolytische Aktivität bis zu einer Konzentration von 600 μg/mL (Tabelle 9). Das bedeutet selbst bei der 100fach höheren Konzentration als die bestimmten MHK-Werte konnte keine Lyse der humanen Erythrozyten beobachtet werden. Die Hämolyseraten aller Peptide betrugen relativ gesehen zum Triton X-100® nur etwa 1%, was innerhalb der Fehlergrenzen dieses Tests liegt. Das nicht-ionische Tensid Triton X-100® wurde als Positivkontrolle eingesetzt, da es rote Blutzellen in dem Versuchsaufbau innerhalb einer Stunde komplett zerstört. Melittin, das Gift der Honigbiene, hat als α-helikales Peptid stark lytische Wirkung auf biologische Membranen und zerstört sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellmembranen bereits in Konzentration von 5 μg/mL. Dieser Zelltest zeigt, dass die Peptide und Peptidderivate in hohen Konzentrationen im Blut eingesetzt werden können, ohne Nebeneffekte auf humane Erythrozyten zu haben. Tabelle 9: Hämolysegrad ausgewählter antimikrobieller Peptide.

Seq. ID Nr.NameHämolysegrad [%] bei 600 μg/mL18Oncocin1,587Apidaecin 1b1,289Drosocin1,1Melittin96,3Triton X-100®100

Die folgende Nichtpatentliteratur wird in der Erfindungsbeschreibung zitiert:

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • - EP 2008/059512 [0072]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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