Title:
Multifunktionaler Laborprozessbeutel für die Reinherstellung von Biomolekülen
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur beliebig oft wiederholbaren Bereitstellung von Teilmengen aufgereinigter Biomoleküle oder Biologicals einer Gesamtheit derselben klonalen Herkunft zu Qualitätstests oder Funktionstests mit den Schritten
a) Einbringen mindestens einer aufteilbaren Trägermatrix enthaltend die bereitzustellenden Biomoleküle in ein zusammenhängendes, unterteilbares Volumen, das von einem Laborbeutel oder Prozessbeutel geformt wird,
b) steriler Verschluss unter Reinraumbedingungen durch Schliessen,
c) Zuführen von Aufbewahrungsflüssigkeit, Reinigungslösung oder Aufschlusslösung zur Trägermatrix,
d) Herstellung der Lagerbarkeit, Reinigen und/oder Aufschliessen der Biomoleküle, wobei die Biomoleküle in der Trägermatrix in einer aufbewahrbaren oder gereinigten Form verbleiben,
e) Lagern oder Aufbewahren der Biomoleküle in ihrer Trägermatrix innerhalb von separierbaren oder abtrennbaren Bereichen des Labor- oder Prozessbeutels, wobei auch die Trägermatrix selbst aufgeteilt wird,
f) steriles Abtrennen von Teilbereichen des Labor- oder Prozessbeutels enthaltend die zu bereitstellenden Biomoleküle in ihrer Trägermatrix, ohne dass das verbleibende Material verunreinigt wird.




Inventors:
gleich Patentinhaber
Application Number:
DE102008063592
Publication Date:
01/12/2012
Filing Date:
12/18/2008
Assignee:
Schindelhauer, Dirk, Dr., 80796 (DE)



Other References:
MANIATIS, T., FRITSCH, E.F. und SAMBROOK, J.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 164 bis 165
SCHINDELHAUER, D. & LANER, A: Visible transient expression of EGFP requires intranuclear injection of large copy numbers. Gene Ther. (2002) 9 (11) 727-30
Claims:
1. Verfahren zur beliebig oft wiederholbaren Bereitstellung von Teilmengen aufgereinigter Biomoleküle oder Biologicals einer Gesamtheit derselben klonalen Herkunft zu Qualitätstests oder Funktionstests mit den Schritten
a) Einbringen mindestens einer aufteilbaren Trägermatrix enthaltend die bereitzustellenden Biomoleküle in ein zusammenhängendes, unterteilbares Volumen, das von einem Laborbeutel oder Prozessbeutel geformt wird,
b) steriler Verschluss unter Reinraumbedingungen durch Schliessen,
c) Zuführen von Aufbewahrungsflüssigkeit, Reinigungslösung oder Aufschlusslösung zur Trägermatrix,
d) Herstellung der Lagerbarkeit, Reinigen und/oder Aufschliessen der Biomoleküle, wobei die Biomoleküle in der Trägermatrix in einer aufbewahrbaren oder gereinigten Form verbleiben,
e) Lagern oder Aufbewahren der Biomoleküle in ihrer Trägermatrix innerhalb von separierbaren oder abtrennbaren Bereichen des Labor- oder Prozessbeutels, wobei auch die Trägermatrix selbst aufgeteilt wird,
f) steriles Abtrennen von Teilbereichen des Labor- oder Prozessbeutels enthaltend die zu bereitstellenden Biomoleküle in ihrer Trägermatrix, ohne dass das verbleibende Material verunreinigt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich als Schritt 9) ein Gewinnen der Biomoleküle, ggf. durch Elution, anschließt.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche, bestehend aus mindestens einem Laborbeutel oder Prozessbeutel, kombinierbar über Ports oder als Einheit verbunden mit mindestens einem
a) Siebrahmen zur Herstellung der aufteilbaren Trägermatrix im Labor- oder Prozessbeutel,
b) Zulaufbeutel oder Zuführungsbeutel zum Zuführen von Aufbewahrungsflüssigkeit, Reinigungslösung oder Aufschlusslösung,
c) Elutionsbeutel, ggf. verbunden mit einer Eluatkammer, einem schlauchförmigen Transportbehälter oder einem Transportröhrchen,
d) Elektroden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei Schliessen bedeutet Zuklemmen, Zuschrauben, Zudrücken, reversibles oder irreversibles Schliessen, Zukleben, Zuschweißen,

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, wobei die Biomoleküle oder Biologicals ausgewählt sind aus definierte Molekülspezies, Proteine, Antikörper, Gerinnungsfaktoren, Enzyme, Kohlehydrate, Proteinkomplexe, Enzymkomplexe, Faktoren, Stoffwechselprodukte, Strukturproteine (z. B. Kollagen) und Moleküle und Molekülkomplexe des Zellkerns, Erbmaterial, Chromosomen, Chromatinfraktionen, Gendomänen, Gene, Zentromere Telomere, DNA, RNA, genomische DNA, artifizielle DNA Konstrukte, lange DNA Moleküle, klonierte DNA Moleküle, modifizierte Nukleinsäuren, Moleküle aus Klonbanken, BACs, PACs, pTAT Klone und Banken, in E. coli klonierte DNA Moleküle und Produkte aus klonierten DNA Molekülen, und im engeren Sinne DNA Moleküle, lange DNA Moleküle (> 20 kb) in Grad 1 Qualität, d. h. keine Brüche in beiden Strängen der Doppelhelix in der Mehrheit der Moleküle einer Präparation, bevorzugt in > 50%, bevorzugt in > 90%, in > 95%, in > 99% der Gesamtzahl der Moleküle einer Präparation/eines Genlagers, physikalisch intakte DNA Konstrukte, physikalisch und funktionell intakte Konstrukte für künstliche Chromosomen, PACs, BACs, pTAT Klone in E. coli, intakte Genlager, gereinigte DNA Präparationen ohne E. coli DNA, intakte Präparationen in denen die Mehrzahl der Moleküle funktionell ist, d. h. enthaltene Gene oder chromosomale Elemente funktionieren in > 50% der gelagerten Moleküle, bevorzugt in > 70% der gelagerten Moleküle, bevorzugt in > 85% der gelagerten Moleküle, bevorzugt in > 90% der im Genlager vorhandenen Moleküle.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 5, wobei die Biomoleküle insbesondere Reinformen einer im biologisch möglichen Rahmen der Molekülkonformität definierten Molekülspezies darstellen, die aus Material eines lebenden Systems stammen, aus einer eingebrachten Biomasse, tierische, pflanzliche, menschliche, mikroorganismale Massen und Flüssigkeiten, lebend oder tot, inclusive Umweltproben, Sedimente, Schlämme.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 6, wobei die Biomoleküle insbesondere Reinformen einer definierten, kleinen Zahl von 1 oder 2 oder wenigen einzelnen wesensverwandten Biomolekülspezies (z. B. Gene, Kollagene) inclusive der vielfachen biologischen Varianten einer Biomolekülspezies (z. B. Genallele, Kopiezahlvarianten, Spleissvarianten, Kettenlängenvarianten, Kollagenformen etc.) darstellen, und wobei die zu isolierenden Moleküle (z. B. tausende medizinisch relevante Gensegmente, tausende medizinisch relevante Genprodukte, Proteine, Enzyme, Antikörper, Faktoren, Biomoleküle) in großer Vielfalt vorkommen, vor allem in Form von Banken, die hunderttausende potentiell relevante Biomoleküle enthalten können.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 7, wobei ausgenommen sind hergestellte Biomoleküle in Form ungereinigter Biomassen, grobe Sedimente, Zentrifugate und Zentrifugationsüberstände, Filtrate, Säulenfraktionen, bei denen keine weitere Isolierung oder deutliche Anreicherung einzelner bestimmter Molekülspezies zu einer Molekülreinform im Vordergrund steht, vorbestehende, nur aufkonzentrierte Mischungen vieler Moleküle, einfache Zellaufschlüsse, Zellkulturen, einfache Zelllysate, Zellaufschlüsse oder Plasmafraktionen mit einer komplexen Molekülzusammensetzung (z. B. Plasmafraktionen der Transfusionsmedizin, die diverse Gerinnungsfaktoren enthalten), Zellkulturen, Zellkulturen die Stammzellen enthalten, Zellfraktionen mit Stammzellen (Knochenmark, adulte Stammzellen), Blut und Blutprodukte, Blutzellen, die nicht bis zur Reinform einer Molekülspezies oder eng umschriebener Molekülgruppen aufgereinigt werden, oder Molekülanteile, die nicht mit dem Ziel einer wesentlichen Anreicherung zu einer Reinform prozessiert werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 8, wobei eine Trägermatrix in Form eines
– Gels
– Kolloids
– Gelmatrix
– Agarosegel
– LMP Agarose (low melting point Agarose)
– Bakterien in Gelmatrix
– E. coli Klone in LMP Agarosematrix
– BAC/PAC/pTAT-Klone in E. coli in LMP Agarosematrix
– gebunden an eine Bindungsmatrix aus anderen Trägermaterialien
– mit bestimmter Porengröße
– mit bestimmter Oberfläche
– -Silikate
– -Schwamm, Flies
– -Keramik
– -Sieb
– Lamellen, Flächen, Fäden, Netze
– beschichteten Trägermaterialien mit
– Antikörpern, Bindungsmolekülen
– Rezeptorbindungsstellen, Rezeptoren
– Nukleinsäuren, DNA Sequenzen
– DNA bindenden Proteinen, Histonen, Materialien
vorliegt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 9, wobei das Einbringen einer Trägermatrix, die das zu reinigende Biomolekül enthält, umfasst
– die Verwendung eines wiederverschliessbaren Einfüllkanals, durch den die flüssige Gelmatrix vor dem Erstarren in ihre im Beutel befindliche Giessform eingebracht wird, durch Pipettieren, durch Befüllen eines Schlauchs, mit einem Trichter, über einen angeschlossenen Bakterien-Gel-Mischer
– das Einbringen des gegossenen Gels durch eine einseitig steril öffenbare Beutelseite/Einschuböffnung.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 10, wobei das Einbringen einer Trägermatrix und ggf. die Fixierung innerhalb der zurechtgeschnittenen, mit Schweissnähten (oder Wänden) räumlich begrenzten Beutelkammer erfolgt durch
– ”lose Fixierung” im Beutel in einem weiteren durchlässigen Kolloid/Gel, in einem durchlässigen, dreidimensionalen Netz, in einer dreidimensionalen Gewebestruktur,
– in einen durchlässigen Halterahmen (flexibler Siebrahmen),
– in einen durchlässigen, formstabilen Halterahmen (z. B. Kunststoff-Siebrahmen),
– in einem einteiligen oder mehrteiligen Spritzgusshalterahmen mit klappbarem Deckel.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 11, wobei das Zuführen nach Anspruch 1c) die Befüllung aus Zuführungsbeuteln mit multiplen Kammern und Pufferkaskaden umfasst.

13. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei ein Zuführbeutel nach Anspruch 3b) hergestellt wird, durch
Befüllung des Zuführungsbeutels durch Füllen über einen Port in einen Einkammerbeutel, bevorzugt ein langer Schlauchbeutel, und nachträgliches Setzen der Peelnähte, um multiple Kammern mit gleichem Inhalt zu erzeugen. Diese sind dann einzeln nach und nach durch Eröffnen der Peelnähte über den an einer Seite angebrachten Auslaufport zu entleeren, wodurch die Waschlösungen/Elektrophoreselösungen schrittweise dem Prozessbeutel zugeführt werden.
– Unterteilung multipler Kammern mit einer wässrigen Lösung durch Durchschweissen nach dem Befüllen.
– Unterteilung der Zuführungsbeutel in multiple Kammern für die Prozesskontrolle und Dokumentation durch Sichtbarkeit bereits geleerter Kammern (Inkubationsstufen).
– Verfahren zur Unterteilung durch Anbringen von Peelnähten nach einer lockeren Befüllung, indem durch Verdrängung der wässrigen Füllung und Durchschweissen einer geeigneten Folie eine Peelnaht durch den befüllten Beutel geschweisst wird,
– bevorzugt durch Verdrängen der wässrigen Lösung auf einem hohen Steg, durch den die Füllung im Schweissbereich nach links und rechts abläuft, wobei durch die Vertiefung und den Abstand der Stege eine Dosierung in die Kammern erfolgt
– bevorzugt durch moderates Vorwärmen der Schweisszone zum weitestgehenden Trocknen vor dem Durchschweissen der Peelnaht.
– Wahlweise, Zuführungsbeutel mit multiplen Kammern ohne Trockendepots mit einem Y Port oder anderen geeigneten Anschlüssen/Zugängen, für das nachträgliche Zuführen/Applizieren von Enzymen zur Waschlösung/Pufferlösung im geschlossenen System.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13, wobei der Zuführungsbeutel mit multiplen Kammern mit Waschlösungen/Puffern, angebrachten Trockendepots (in geeigneter Folie, ggf. überklebt) mit lyophilisierten Enzymen, Reinigungssubstanzen, Pulvern nach dem Autoklavieren der Inkubationspuffer, die bevorzugt in der Reinigungskaskade einen festen Platz einnehmen und ”automatisch” durch Öffnen der Peelnähte der nachfolgenden Kammern eingespült und gelöst werden (Prozesskontrolle, erfolgte Inkubation, Stoffapplikation) ausgestattet ist.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 14, wobei der Prozessbeutel mit Blindbeutelkammern für die geschlossene Probenentnahme durch Abschweissen/Abtrennen ausgestattet ist, wobei Aussackungen/Ecken im Prozessbeutel der Aufnahme von Abschnitten der Trägermatrix dienen, wobei die Trägermatrix oder das Gel des Genlagers in einem Halterahmen entlang vorgesehener Bruchlinien abgeknickt ist.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 15, wobei Zuführungsbeuteln über an den Laborbeutel oder Prozessbeutel passende Ports angeschossen sind, für die sterile Aufbewahrung und Applikation von Reinigungslösungen, Puffern, Waschlösungen, für mikrobiologische, biochemische, molekulargenetische Inkubationen, Reaktionen, Reinigungskaskaden durch Diffusion, Reinigungszyklen durch Elektrophorese, wobei
– Zuführungsbeutel mit bevorzugt multiplen Kammern mit Lösungen, Puffern,
– eine Unterteilung der Kammern durch Klemmen oder bevorzugt durch Anbringen einer Peelnaht nach Befüllen mittels Durchschweißen vorgesehen sind.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 16, wobei Prozessbeutel zur Durchführung mehrstufiger Verfahren im geschlossenen System vorgesehen sind, umfassend das Einbringen einer Biomasse in Form einer Trägermatrix, Aufreinigung von Biomolekülen, geschützte Lagerung der Biomoleküle während Prozessstufen, Gewinnung von Proben im geschlossenen System, Identifizierung der Funktionalität der gelagerten Biomoleküle anhand entnommener Proben, Abtrennen von Teilen eines Moleküllagers im geschlossenen System, Isolierung und Reinpräparation der steril gelagerten Biomoleküle, Abtrennen und Abfüllen der gewünschten Fraktion im geschlossenen System.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 17, wobei ein steriler Beutel/Container mit Vorkehrungen für eine Kaskade von biologischen, biochemischen, elektrochemischen, biophysikalischen, chemischen Inkubationen und Prozeduren im geschlossenen System zur Vermeidung von Kontaminationen bei der Durchführung komplexer Laborverfahren, für die sichere Lagerung von Molekülen, für das Anlegen von stabilen Genlagern, für das Lagern langer DNA Moleküle aus Klonbanken, für die Lagerung von Klonbanken bei Raumtemperatur in einer funktionell charakterisierbaren Form, für die Charakterisierung eines sterilen Genlagers zur späteren Isolierung von Molekülen in Grad 1 Qualität, für die Bereitstellung qualitativ hochwertiger, reiner, funktioneller DNA Moleküle, für die Bereitstellung von Grad 1 DNA für die Anwendung am Menschen und/oder Tier, für die Herstellung künstlicher Chromosomen, für die Untersuchung von genomischen Genen und Genbanken und Gendosis/Wirkungsrelationen, für die Identifizierung von Krankheitsgenen/Schutzgenen in Genbanken, für das Anlegen funktionell charakterisierter Genlager für die Konstruktion künstlicher Chromosomen, für die Herstellung von künstlichen Chromosomen für die Gentherapie, für die Herstellung eines Arzneimittels aus einer aufgereinigten Biomolekülfraktion, für die Herstellung eines DNA-Arzneimittels, für den Gentransfer, für die Gentherapie ausgestattet ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 18, wobei der Prozessbeutel
a) mit einem Zugang für das Einbringen einer Trägermatrix mit dem zu reinigenden Biomolekül in den Beutel und sterilen Verschluss unter Reinraumbedingungen durch reversibles Schliessen, Zuklemmen, Zuschrauben, Zudrücken, oder irreversibles Schliessen, Zukleben, Zuschweissen,
b) mit verschliessbaren/wiederöffenbaren Einsteckkanälen für Elektroden für Reinigungspulsfeldelektrophoresen, elektrophoretische Aufreinigung, Elektroelution,
c) mit Elektrodeneinsteckkanälen und einer oder mehreren Pufferbrücken für die Elektroelution der gereinigten Biomoleküle von der Trägermatrix,
d) mit Elektroelutionsvorrichtung und Eluatkammer für das Einschleusen/Abfüllen der gereinigten Moleküle in ein Transportröhrchen und geschlossenes Abschweissen der Eluatkammer oder des Transportröhrchens (Eluatkammer und Transportröhrchen können der gleiche oder verschiedene Beutelbereiche sein) mittels Durchschweißen,
e) mit Zugängen für die Elektrophorese, die ein Entweichen elektrophoretischer Gase und/oder einen gerichteten Pufferfluss gewährleisten und steril verschweissbar/wiederverschliessbar sind, alternativ mit verschliessbaren Elektrodeneinsteckadaptoren (verschraubbar, steckbar) und Ports für eine Gasablassöffnung gemeinsam mit Pufferauslauf (nach oben gelenkt, um Pufferstand/-druck zu regulieren),
f) mit mehrfachen steril wiederverschliessbaren Ports/Abläufen für die Zuführung und Ableitung von Inkubationspuffern, Enzymen, Elektrophoresepuffern, Pufferbrücken, Elektroden,
g) mit Einlauf, bevorzugt unten (kalt) für Elektrophoresepuffer und bevorzugt Ablauf oben (warm), bei bevorzugt druckreguliertem Blähen des Beutels durch Puffervolumen und Regulierung der Ein-/Ablauf-Wassersäulendifferenz oder Blähen des Beutels durch Pumpendruck oder durch starre Stützen/Wandung, durch die Bauart (Setzen von Schweissnähten, Spannungen, Doppellagen),
h) mit Ablaufkanal/Port und Schlauch und wiederverschliessbarem Verschluss nach unten zur Entleerung des Inkubationspuffers, bevorzugt zur schnellen Entleerung durch Schwerkraft,
i) mit Einlaufzugang/Zugängen für das Anstecken von Reinigungspufferkaskaden und den Zulauf von gekühltem Elektrophoresepuffer/Elutionspuffer,
k) mit Zugängen für die gesonderte Applikation von Enzymen und Enzymlösungen, alternativ mit Mutifunktionszugängen/Ports,
l) wahlweise das Anschliessen von Enzymdepots (z. B. Trockenkammern für Nukleasen, RNase, Lysozym, Proteinasen, Nukleasen) bevorzugt zur sterilen Anbringung nach der Dampfsterilisation des Beutels,
m) mit Einsteckkanälen für Elektroden/Einmalelektroden, alternativ im Prozessbeutel integrierte Elektroden/Elektrodenfolie, angepasste Elektrodenmaterialien im Prozessbeutel,
n) mit mindestens einem Ablasskanal/Schlauch nach oben für Gas/Elektrophoresepufferablauf,
o) mit Halterungen, Fixierungen, Schweissnähten, Formzonen, Klemmzonen, Umschnürungen innerhalb oder ausserhalb des Beutels für die Platzierung der Trägermatrix im Prozessbeutel,
p) mit Vorkehrungen zum Einsatz verschieden großer Füllmengen, z. B nur Befüllen einer vertieften Mulde, z. B. durch Lagerung des Beutels auf einer Fläche mit Mulde, damit in der Beutelmitte nur die Trägermatrix bedeckt ist, um mit kleinen Volumina zu inkubieren (z. B. 100 ml bei Genlager-Enzymreaktionen, oder 1 ml und weniger bei Miniaturbeuteln, oder 1 l und mehr bei größeren Ausführungen), oder Befüllen des Beutels unter Aufblähen (z. B. durch Schwerkraft gegen Ablaufwassersäulendruck), um große Puffervolumina zu erreichen (z. B. 3000 ml bei Genlager-Elektrophoresen, oder 30 ml und weniger bei Miniaturbeuteln, oder 30 l und mehr bei größeren Ausführungen). ausgestattet ist.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 19, wobei mindestens drei Ports am Prozessbeutel (für den gleichzeitigen Auslass von Elektrophoresepuffer und Gas, Anschluss einer Pufferbrücke zum Elutionsbeutel und Anschluss einer Eluatkammer und für andere Verwendungen der gleichen Ports zu anderen Zeiten) und drei Ports am Elutionsbeutel (für den gleichzeitigen Einlass von Elektrophoresepuffer, Anschluss einer Pufferbrücke zum Prozessbeutel und Anschluss der Eluatkammer) und mindestens drei Elektrodeneinsteckkanäle im Prozessbeutel (bevorzugt 4 oder mehr) und mindestens ein Elektrodeneinsteckkanal (bevorzugt 2 oder mehr) im Elutionsbeutel vorgesehen sind.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 20, wobei ein in den Beutel einzubringender Rahmen/durchlässiger Containereinsatz, Siebhülle, Vorkehrung zur Befestigung der Trägermatrix in einer für Enzyme, Diffusion, und Strom durchlässigen Hohlform, folgendermaßen ausgestattet ist:
a) einteilige geklappte (bevorzugt bei der Ausführung mit Gelgiessen im Prozessbeutel) oder zweiteilige Hohlform, Boden mit Seiten und Klappdeckel oder getrenntem Deckel (bevorzugt bei Ausführung mit Gelgiessen ausserhalb),
b) durchlässige Hohlform/Rahmen mit Stützen, Rahmen mit ausklappbaren Stützen (Abstandshalter nach oben und nach unten) und
c) Hohlform/Rahmen mit Vorrichtungen für das Fixieren/Einstecken von Elektroden, ausklappbare Elektrodenhalterungen,
d) Rahmen mit Abtrenn-/Knick-/Brechvorrichtung zur Entnahme von Teilen der Trägermatrix,
e) Rahmen mit einer herausnehmbaren Bodenfolie/Dichtung um während dem Giessen der Trägermatrix ein Auslaufen durch den Siebboden zu vermeiden (nachträglich Entfernen der Folie/Dichtung durch Herausziehen/Herausnehmen oder durch Auflösen über Tage im wässrigen, tensidhaltigen Milieu bei 37–55°C, bei der Ausführung mit einer Trägermatrix aus Low Melting Point Agarose, LMP-Agarose bis zu 55–60°C),
f) Siebrahmen für die Stabilisierung der Trägermatrix bei gleichzeitiger Zugänglichkeit für Puffer, Enzyme, Reinigungslösungen, Waschpuffer, Elektrophoresepuffer, Elektroelutionspuffer, Strom, durchlässig für Makromoleküle, aus festem Kunststoff, aus reibungsarmem Kunststoff, aus Kunststoff mit geringer thermischer Verformung, mit geringer Spannung, mit Stosselastizität, bevorzugt innen geglättet, reibungsarme Innen- und Aussenflächen des Siebrahmens, bevorzugt transparent, bevorzugt als eine Spritz-Giessform hergestellt und zusammenklappbar, bevorzugt durch leichten Druck durch den verschweissten Beutel hindurch zusammensteckbar,
g) Siebbodenabmessungen nur geringfügig größer als die Trägermatrix,
h) Einbringen von extern gegossenen Trägermatrices/Gelmatrices in die durchlässigen Siebrahmen,
i) alternativ direktes Einbringen der Gelmatrix ohne Rahmen und Versperrung durch begrenzte Beutelgröße, Schweissnahtverhältnisse für die interne Fixierung der Matrix im Zentrum des Prozessbeutels,
k) alternativ direktes Einbringen der Gelmatrix in die im Prozessbeutel vorbestehende, sterilen Siebrahmen, bevorzugt einteilig klappbar, der Siebrahmendeckel ist nach Giessen der Gelmatrix im Beutel zu arretieren,
l) Siebrahmendeckel bei zweiteiliger Ausführung mit eindeutiger Orientierung steckbar, mehrere Knick-/Trennlinien jeweils beidseitig parallel von Stegen begrenzt, die nach Abbrechen die neue Seitenbegrenzung für die darin enthaltene Gelmatrix bilden und beim Zusammenklappen/Zusammenstecken von Deckel und Boden in das Gel eindringen und dabei das Gel einklemmen oder anschneiden/durchtrennen und in mehrere Kammerflächen unterteilen, oder eine Unterteilung vorbereiten,
m) Bodensieb durch Folie abgedeckt, die eingelegt wurde, eingeklebt wurde, bevorzugt mit einem wasserlöslichen Kleber eingeklebt wurde, bevorzugt eine Dichtungsfolie aus wasserlösslichem Material,
n) Deckel/Bodenstege in jeder Unterkammer, damit kleine transportstabile, das Gel ummantelnde Abschnitte abgebrochen werden können (durch Abknicken). Knickzonen für verschieden große Abschnitte der Trägermatrix (für Zwischenanalysen, Analysen, als Verpackungsgröße, als Lagerabschnitte etc),
o) Da die Abschnitte im Beutel auseinanderbewegt werden, und dann einzelne Abschnitte in einer Beutelecke/einem Beutelteil abgeschweisst werden, entstehen aus jedem Abschnitt geschlossene, Verpackungsgrößen in Form eingeschweisster Minilagerbeutel (geschlossenes System),
p) Die jeweiligen abzuschweissenden Beutelsektoren sind jeweils mit den laufenden Nummern/Barcodes bedruckt.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 21, wobei eine Siebbodendichtungsfolie, sterilisierbare, wasserlösliche Folie, die für mindestens 1, bevorzugt 10, bevorzugt 20 Minuten den Boden des Siebrahmens abdichtet, damit die (ca. 37–40°C) warme Gelmatrix (bei Genlagern) eingegossen werden kann und das Gel bis zum Erstarren nach wenigen Minuten (bei ca < 25–30°C) nicht auslaufen kann, vorgesehen ist, und wobei danach die allmähliche Auflösung der Folie im wässrigen Milieu beginnt, damit die Siebporen des Bodens für die nachgeschalteten Reinigungsprozeduren durchlässig sind,
– oder eine herausziehbare Folie mit von aussen greifbarer Lasche (unlöslich) vorgesehen ist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 22, wobei der ansteckbare Zuführungsbeutel
– Zuführungsbeutel mit an den Prozessbeutel passenden Ports für die sterile Aufbewahrung und Applikation von Reinigungslösungen, Puffern, Waschlösungen, für mikrobiologische, biochemische, molekulargenetische Inkubationen, Reaktionen, Reinigungskaskaden durch Diffusion, Reinigungszyklen durch Elektrophorese,
– Zuführungsbeutel mit bevorzugt multiplen Kammern mit Lösungen, Puffern,
– Unterteilung der Kammern durch Klemmen oder bevorzugt durch Anbringen einer Peelnaht nach Befüllen mittels Durchschweißen ausgebildet ist.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 23, wobei der Elutionsbeutel mit Eluatkammer/Transportschlauch mit Dialysemembran, Filtereinsätzen, Elektrodeneinsteckkanälen oder integrierten Elektroden, eingeschweissten Elektroden, elektrisch leitfähigen Folienelektroden, Zulauf für Elektrophoresepuffer (unten), Ablauf Elektrophoresepuffer und Gasablass (oben), bevorzugt unter Fülldruck durch angehobenes Einlaufpufferniveau (z. B. durch einen gegenüber dem Ablaufniveau angehobenen Zulauftropf mit Elektroelutionspuffer unter Schwerkraft) ausgestattet ist.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 24, wobei die Elektrodenmaterialien der Elektroden nach Anspruch 3d) ausgewählt sind aus
– Kohlenstoffmodifikationen für die rückstandsfreie Zersetzung der Elektrode in Gas
– Glaskohlenstoff
– fullerenartiger Glaskohlenstoff
– Graphit (natürlich, künstlich)
– Graphitkomposite
– Kohlenstoff
– Kohlestäbe
– Kohlenstoffkomposite (reiner, gebundener Kohlenstoffruss in einem Material)
– elektrisch leitfähige Folien
– elektrisch leitfähige Lacke, Folienschichten, Kleber, Keramik
– Platin, Platinkomposite, Legierungen für die Verwendung im Prozessbeutel
– fest in die Beutelwand integrierte Kabel und Elektrodenmaterialien, leitfähige Folienschichten, leitfähige Lacke, leitfähige Klebemittel, aufgedampftes Metall/Platin, Mischmaterialien auf Folie, Legierungen, Glaskohlenstoff, Graphit, Kohle, Kohlestaub, reiner Kohlenstoffruss in Form von Mischmaterialien, Keramik, Folienkomposite, Laminate mit leitfähigen Bahnen oder Schichten

26. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 zur Bereitstellung von Biomolekülen.

27. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 zum Anlegen von Genlagern.

28. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 für die Aufreinigung von Grad 1 DNA.

29. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 zur Durchführung einer elektrophoretischen Reinigung.

30. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 für die Durchführung einer pulsfeldgelelektrischen Reinigung.

31. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 für die Durchführung einer Elektroelution.

32. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 für die Gewinnung von Produkten durch Abschweissen im geschlossenen System (Durchschweissen).

33. Durchschweissen unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 in Verbindung mit Reinraumprozessbeuteln für die Verpackung, Lagerung, und den Transport haltbaren Materials im geschlossenen System.

34. Schlauchförmiger Transportbehälter, Transportröhrchen oder Eluatkammer nach Anspruch 3 hergestellt zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 oder 2.

35. Schlauchförmige Transportbehälter aus Folie nach Anspruch 34, die aus einem geschlossenen Prozessbeutelsystem befüllt und durch Durchschweissen/Abschweissen gewonnen werden,
– Abgeschweisste Transportröhrchen mit einem geringen Durchmesser und großer Länge (ähnlich einem Strohhalm) um turbulente Strömungen während Transporterschütterungen zu minimieren,
– Pseudomehrkammriges Transportröhrchen mit teilschliessenden Zwischenwänden, Folienlagen, um Strömungen und Schwerkräfte beim Transport zu minimieren,
– Transportschlauch mit einem
– Pseudogel, Netz, Vlies, Kolloid um wässrige DNA Lösungen bis zu großen Volumina schüttelfrei (unter Vermeidung von Scherkräften und turbulenten Strömungen) aufzunehmen.

36. Durchschweißen oder Durchsiegeln zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 oder 2 durch eine wässrige Lösung in einem mässig befüllten Kunststoffbeutel als Verfahren zur Trennung, Absonderung, Unterteilung, Abtrennen durch Schweissnähte und Schneiden, vorübergehende Unterteilung mit Peelnähten, Isolierung von Anteilen unter Reinraumbedingungen mit
– thermoplastischen
– Heizelement-
– Vibrations-
– Hochfrequenz-
– Ultraschall-
– Laser-
– Infrarot-
– Verfahrenskombinationen und anderen Schweissverfahren.

37. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25 im Genbereich (genomische Genklone, BACs/PACs, pTAT Vektoren für künstliche Chromosomen) für die
– Bestimmung funktioneller Genabschnitte (Screening, Krankheitsgene, Schutzgene, Gentherapiegene, Impfstoffe auf der Basis genomischer Konstrukte und künstlicher Chromosomen)
– Anwendung multipler Gene auf künstlichen Chromosomen
– Konstruktion künstlicher Chromsomen
– Herstellung arzneimitteltauglicher Grad 1 DNA
– für die Herstellung eines zuverlässigen Ausgangsmaterials für die Gentransferforschung
– tierklinische und klinische Studien (Genwirkung, Gendosiswirkungstests, Gentransfer, Gentherapie)
– Weiterverarbeitung/Mischung/Komplexierung des Materials für DNA/Genmedikament-Applikationen im Prozessbeutel
– Weiterverarbeitung/Mischung/Komplexierung des Materials für DNA/Genmedikament-Applikationen der Grad 1 DNA aus einem Prozessbeutel
– Weiterverarbeitung/Mischung/Komplexierung des Materials für DNA/Genmedikament-Applikationen der Grad 1 DNA aus einem abgeschweissten Transportröhrchen
– Vertrieb gelagerter, charakterisierter DNA an Anwenderlaboratorien
– Vertrieb von Leerbeutel-kits und Geräten für das disseminierte Anlegen von Genlagern und Herstellung von Grad 1 DNA für die Genomforschung, breite Versorgung vieler Forschungsstätten und medizinischen Zentren mit der neuen DNA Qualität und Technologie
– kostengünstige Langzeitlagerung von langem DNA Material aus Genbanken, Banken mit künstlichen Chromosomen
– Rückklonierung der isolierten DNA Moleküle (z. B. BACs, PACs, pTAT Vektoren in E. coli) aus einer kleinen Probe eines charakterisierten Genlagers mit funktioneller Zusammensetzung, z. B. 1 Jahr, 5 Jahre, bevorzugt bis nach > 10 Jahren Lagerung eines Genlagerbeutels bei Raumtemperatur
– Weiterklonierung eines DNA Konstrukts aus einer kleinen Probe eines charakterisierten Genlagers mit funktioneller Zusammensetzung, um eine weitere DNA Komponente aus einem anderen Genlager (z. B. weiteres Gen, Gengrenze, Replikator, Genvariante, Fragment zur Ergänzung eines Genlocus, Zentromer) anzufügen und daraus die nächste gelagerte Konstruktstufe zu erzeugen (z. B. ein künstliches Chromosom mit multiplen Genabschnitten für die Erzeugung multitransgener Tiere für die Xenotransplantation)
– Zusammenführen von Komponenten aus verschiedenen Genlagern mittels biochemischer Methoden, die durch Grad 1 DNA möglich werden (in gel site specific recombination, very long PCR) zu einem Konstrukt
– Transfer langer intakter DNA.

38. Verwendung einer aufgereinigten Grad 1 DNA nach Anspruch 28 zur Durchführung von Funktions- oder Qualitätstests nach Anspruch 1.

39. Verwendung nach Anspruch 38 zum Durchführen sehr langer PCRs (very long PCR), oder für Reaktionen mit Template DNA (in Form von Grad 1 innerhalb der Agarosegelmatrix).

40. Verwendung nach Anspruch 38 in IGSSR Reaktionen aus DNA Material zweier Komponenten, von denen mindestens eine Komponente aus einem Prozessbeutel stammt, und in Form von Grad 1 DNA innerhalb der Agarosegelmatrix eingesetzt wird, um quantitativ ohne weitere Klonierung lange DNA Moleküle aus charakterisierten funktionellen Komponenten zu erzeugen.

41. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25, wobei Prozessbeutel für die funktionelle Erschliessung genomischer Banken, für die Lagerung testfähigen DNA Materials aus Banken, und für die kostengünstige Lagerung einer genomischen Bank und Sicherheitskopien (ohne Kühlenergie) verwendet werden.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 12, wobei eine Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung und quantitativen Reindarstellung spezifischer Biomoleküle und entsprechende Beutelausführungen, inklusive Großkammerbeutel, miniaturisierte Beutelausführungen, serielle oder parallele Multibeutelanordnungen, Beutelanordnungen innerhalb fester Gehäuse eingeschlossen ist.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 12, wobei eine Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die chemische und biochemische Analytik oder für die Synthese von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen eingeschlossen ist.

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 12, wobei eine Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die medizinische und tiermedizinische Identifizierung, Charakterisierung, Gewinnung, Messung von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen eingeschlossen ist.

45. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 12, wobei eine Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die Untersuchung von Umweltproben und entsprechende Beutelausführungen eingeschlossen ist.

46. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 12, wobei eine Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die biotechnologische Analytik, Identifizierung, Charakterisierung, Gewinnung, Messung von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen eingeschlossen ist.

47. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 12, wobei eine Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die ärztliche und tierärztliche Diagnostik, Identifizierung, Charakterisierung, Gewinnung, Messung von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen eingeschlossen ist.

48. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25, wobei Durchschweissgeräte (Einzelgeräte oder Kombinationsgeräte und Anlagen) für Prozessbeutelzwecke zum Peelnahtdurchschweissen (Zulaufkaskaden mit wässrigen Lösungen) umfaßt sind.

49. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 13 bis 25, wobei Spannungsgeräte und Pulsfeldspannungsgeräte ausgebildet sind, die bei einer Prüfspannung den Widerstand der Elektrophoresekammer über die Elektroden messen, und bei zu großem oder plötzlichem Anstieg gegenüber dem Anfangswert eine Reduzierung der Spannung oder eine Strompause schalten, oder bei allmählichem Widerstandsabfall eine Spannungserhöhung schalten, um eine einfache Temperaturregulierung im Prozessbeutel zu Erreichen, wobei
– die Sicherheitsausrüstung bei starken Schwankungen durch schadhaftes Elektrodenmaterial/Steckverbindungen, oder Leckage, die Stromzufuhr terminiert und ein Warnsignal gibt,
– Spannungsgeräte vorgesehen sind, die den Stromfluss aufzeichnen, um eine Dokumentation zu ermöglichen,
– Spannungsgeräte vorgesehen sind, die einfach wahlweise im Pulsfeldelektrophoresemodus, Elutionsmodus und im Umpolmodus (Kurzimpuls mit Quittungston) betrieben werden können.

Description:

Millionen Genabschnitte des menschlichen Genoms und vieler Tiergenome stehen in redundanter Ausfertigung als Gefrierkulturen von E. coli Klonen (BACs, PACs, Shizuya et al. 1992, Ioannou et al. 1994) in Ressourcenzentren zur Verfügung. Diese zumeist strukturell und funktionell weitgehend uncharakterisierten Genabschnitte sind zunächst nur in Form von Bakterien eingefroren und können in dieser Form nicht eingesetzt werden. Herkömmliche DNA Isolierungsmethoden (alkalische Lyse, Säulen etc), liefern bei langen genomischen Klonen (> 20 kb) sehr wenig DNA, die nur in einer kleinen Fraktion von maximal wenigen Prozent intakt vorliegt und bei der Lagerung schnell degradiert. Solche Genabschnitte können nach einem neuen DNA Isolierungsverfahren des Erfinders (Schindelhauer and Cooke 1997, US 6331397, DE 19720839B4) mit Vektoren für künstliche Chromosomen verbunden werden, wie die pTAT-Vektoren des Erfinders, mit Beschreibungen für pTAT (US 6331397 B1/DE 197 20 839 B4, Laner 2004), pTT (Doktorarbeit Laner 2004, online http://edoc.ub.uni-muenchen.de/4286, Laner et al. 2004) pTTE1 (Laner 2004, Laner et al., 2004, Laner et al., 2005) und Anwendungen in primären Zellen und Tieren in PCT/EP2008/007422, die als Referenzen in der Gesamtheit hier miteingeschlossen werden. Mit dem neuen DNA Herstellungsverfahren kann aus E. coli Klonen ein zuverlässiges, langmoleküliges Genbaumaterial (> 20 kb, bevorzugt > 100 kb) mit höchstem Intaktheitsgrad gewonnen und gelagert werden, so dass funktionelle Genorte und multigene Konstruktionen als künstliche Chromosomen (human artificial chromosome) und künstliche Chromosomen mit gentherapeutisch relevanten Genen (Gene Mendelischer Erbkrankheiten und nicht-Mendelischer Krankheitsgene, Schutzgene bei Volkskrankheiten) mit umliegenden Regulatoren und allen für eine stabile Vererbung erforderlichen, selbstreplizierenden Sequenzelementen als verlässliches Baumaterial bereitgestellt werden können. Damit können aus einer Vielzahl medizinisch relevanter Genmoleküle Genmedikamente für medizinische innere (z. B. Injektion, Inhalation, intraoperiativ) und äussere (z. B. primäre Zellen, Zellkultur) somatische Applikationsformen hergestellt werden.

Allerdings wird für klinisch und tierklinisch relevante Funktionsanalysen eine Menge und Qualität benötigt, die normale Laborkapazitäten vielfach übersteigt. Für lange DNA Moleküle und künstliche Chromsomen können aussagekräftige Gentherapiestudien mit genomischen Genabschnitten nicht durchgeführt werden, weil in der praktischen Anwendung kein adäquates Verfahren zur Herstellung großer Mengen arzneimitteltauglicher DNA (> 20 kb) existiert. Konstruktionen für die Forschung sind nur eingeschränkt möglich, weil langes, intaktes Genmaterial nicht in ausreichender Zahl und Menge zur Verfügung steht und nicht routinemässig, oder nur mit enormem Aufwand hergestellt werden kann (vgl. Multigenkonstrukte für die Xenotransplantation).

Vom Erfinder wurde die neue, bisher bei Längen > 20 kb unerreichte DNA Qualität ”Grad 1 DNA” genannt, was bedeutet, dass bei Längen > 20 kb kein Einzelstrangbruch in der Gesamtheit der Moleküle einer Präparation vorliegen. Grad 2 DNA enthält zusätzlich eine Molekülfraktion mit Einzelstrangbrüchen, und Grad 3 DNA enthält zusätzlich eine Fraktion mit Doppelstrangbrüchen, wie das mit herkömmlichen DNA Herstellungsverfahren > 20 kb, z. B. bei alkalischer Lyse oder bei Lagerung in wässriger Lösung oder bei Einfrieren oder bei Alkoholpräzipitation der Fall ist.

Für die Herstellung der neuen Grad 1 DNA Qualität, bei der in E. coli klonierte Genmoleküle und genomische Konstrukte für künstliche Chromosomen mit Längen > 20 kb ohne Strangbrüche bereitgestellt und viele Jahre verlustfrei gelagert werden können, kommt ein aufwändiger Laborprozess zum Einsatz, der bevorzugt enzymatische, chemische, und elektrophysikalische Methoden zur Reiningung und Abtrennung von E. coli Resten und Ausschussmolekülen vorsieht (Schindelhauer and Cooke, 1997, DE 197 20 839 B4 und US 6331397 B1 des Erfinders). Dabei kommen prolongierte Inkubations-, Diffusions-, Wasch- und Reinigungsschritte zum Einsatz, die in der Summe mehrere Wochen überschreiten (vorwiegend Inkubations- und Wartezeiten bei Raumtemperatur). Im Anschluss können Genanalysen und Funktionstests für die funktionelle Zusammensetzung der Molekülpräparation aus der längst abgeschlossenen Bakterienanzucht durchgeführt werden. Eine dringende Notwendigkeit für die zugrundeliegende Erfindung, die in der bevorzugten Ausführung eine einfache und stabile Lagerung einer Herstellungszwischenstufe unter Reinraumbedingung ermöglicht, ist die Tatsache, dass erst auf dieser (ersten) Lagerstufe, die dann ohne weitere Massnahmen im gleichen Beutel auch für Langzeitgenlager von > 5 Jahren und > 10 Jahren geeignet ist und problemlos bei Raumtemperatur erfolgt, von vielen redundant in E. coli angezogenen Klonen, diejenigen Klonanzuchten mit funktionell einwandfreien Molekülen identifiziert werden. Dafür werden kleine Proben eines Genlagers für strukturelle und funktionelle Analysen im geschlossenen System entnommen. Parallel zur Lagerung werden die richtigen Klone identifiziert. Durch das Anlegen größerer Genlager stehen die charakterisierten Moleküle (d. h. der Anteil strukturell und funktionell charakterisierter Moleküle an der Gesamtheit der Moleküle eines Genlagers wird charakterisiert) dann für die Weiterreinigung und Isolierung bis zur arneimitteltauglichen Qualität im Prozessbeutel zur Verfügung. So konnte nach 7 Jahren Lagerung durch quantitatives Funktionieren einer 64 kb genomischen PCR (very long PCR) des menschlichen Mukoviszidosegens kein Abbau der Einzelstrangmoleküle gegenüber der Lagerung von 1 Jahr festgestellt werden (Noerenberg 2006). Very long PCR, die mit Grad 1 input DNA möglich geworden ist und in DE 10 2004 025 650 A1 des Erfinders beschrieben wurde, wird hier als Referenz in ihrer Gesamtheit mitaufgenommen. Very long PCR dient darüberhinaus dem Nachweis der Grad 1 Qualität aus Genlagern und liefert mittels einer sehr geringen Fehlerrate klonierbare, funktionelle, genomische Gene (Kraner et al. 2007). Nach erfolgtem Klonidentitätsnachweis und Kenntnis der funktionellen Fraktion von der Gesamtheit der Moleküle im Genlager, kann das wertvolle Material den fortgeschrittenen Reinigungsprozeduren bis hin zur Isolierung reiner Grad 1 DNA Moleküle (das heisst unter praktisch vollständiger Vermeidung einer gebrochenen Fraktion) weiter aufgereinigt werden. Gebrochene Moleküle, die bei jeder Herstellung von DNA oder Biomolekülen primär vorhandenen sind, werden im Reinigungsprozess praktisch vollständig aus der Trägermatrix entfernt, so dass die Gesamtheit der verbleibenden Moleküle intakt ist (im bevorzugten Verfahren DNA Moleküle > 20 kb, aber auch > 50 kb, > 100 kb und länger). DNA Moleküle deutlich unter 20 kb können mit diesem speziellen Verfahren und den beschriebenen Materialien nicht aufgereinigt werden, weil sie in der Elektrophorese zusammen mit der gebrochenen Fraktion die Agaroseträgermatrix verlassen, selbst wenn sie Grad 1 Qualität haben. Je nach Bedarf und Lagergröße kann nach weiteren mehrschrittigen Verfahren ein Teil oder das gesamte DNA Material aus dem Prozessbeutel isoliert werden. Die Moleküle in wässriger Lösung müssen steril verpackt werden und bei 0–4°C ohne Einfrieren gelagert werden. in der vorliegenden Erfindung wird berücksichtigt, dass die Abfüllung für eine Applikation ausserhalb des Prozessbeutels als reine, wässrige Lösung erfolgt und die weitere Lagerung für eine zeitnahe Applikation direkt aus dem Herstellungsprozess im Beutel heraus vorgenommen wird und im geschlossenen System erfolgt, wobei eine geeignete, schüttelarme Verpackung zum Einsatz kommt, wodurch Kontaminationen und Scherkräfte durch Schütteln oder Pipettieren und den Transport minimiert werden. Alternativ können Transportscherkräfte gänzlich vermieden werden, indem die Grad 1 Moleküle durch weitergehende Inkubationen noch im Beutel zu einer applikationsfähigen Form weiterverarbeitet und verpackt werden.

Die bei dem gesamten DNA Reinigungsprozess im molekularen Labor zu verwendenden Kammern, Lösungen, Pipetten, Röhrchen, Medienwechsel und der hohe zeitliche Aufwand steilen eine enorme Anforderung an die Einhaltung kontinuierlicher Reinraumbedingungen. Für die parallele Produktion mehrerer Testkonstruktchargen mit Molekülzahlen von > 1015 bis 1018 Molekülen, wie sie für funktionelle Genanalysen und kleinere klinische oder tierklinische Testanwendungen benötigt werden, oder von größeren Produktionen > 10t8, die für klinische und tierklinische Applikationen und Transfer/Wirkungsstudien an mehreren Zentren/Forschungseinrichtungen benötigt werden, oder für die Deckung des Gesamtbedarfs eines gentherapeutischen Medikaments von z. B. > 1020 funktionellen Molekülen, existieren zur Zeit keine geeigneten Methoden, unter denen eine realistische Reinraumbedingung erzielt werden könnte. Damit stellt der Prozessbeutel für die Herstellung eines DNA Medikaments in ausreichender Menge einen entscheidenden Schritt für die Gentherapie dar. Da es sich hier um besonders lange DNA Moleküle handelt, und Gene in der Regel auf längeren chromosomalen Abschnitten liegen und im Chromatinkontext funktionieren, wird mit der Erfindung des Prozessbeutels auch die Herstellung von DNA Arzneistoffen für die Gentransferforschung und weitergehende Wirkungsanalysen mit einer Vielzahl von Genen und Konstrukten ermöglicht. Das Verfahren im Prozessbeutel erlaubt ebenfalls eine dezentralisierte Herstellung vieler verschiedener DNA Abschnitte in der neuen, bislang nicht erreichten Qualität und Menge, so dass erwartet werden kann, dass mehrere Speziallabors weltweit eine größere Zahl von Genen für Forschungszwecke in Prozessbeuteln und mitgelieferten, oder mit vor Ort befüllten Inkubationskits und vertriebenen Apparaten herstellen, lagern, charakterisieren, und verbrauchen werden.

Somit bestehen multiple Ebenen der Beutelanwendungen, von der Erforschung funktioneller Gene und Genwirkungen über Anwendungen multipler Gene in künstlichen Chromosomen (vgl Xenotransplantation) durch das einfache Verfügbarmachen von funktionellen Genabschnitten für funktionelle Konstruktionen, über klinisch relevante Studien mit gentherapeutischen Konstrukten und künstlichen Chromosomen mit korrigierten, genomischen, selbstreplizierenden Genen, hin zur Herstellung von DNA Medikamenten, aber auch den Vertrieb an Anwenderlaboratorien für ein dezentralisiertes Anlegen von Genlagern (in Form vorgefertigter Prozessbeutel) für Genomforschungszentren aus existierenden und weiterentwickelten genomischen Genbanken (PAC, BAC, pTAT Vektoren künstlicher Chromosomen), und für die Entwicklung von Spezialbeuteln für andere Arzneimittelentwicklungen aus Biomolekülen und ihre Herstellung.

Die im Genlabor verwendeten Methoden finden bisher vornehmlich in offenen Systemen statt, die nicht beliebig vergrößerbar sind und aufgrund eines enormen Kosten und Platzbedarfs praktisch nicht lückenlos oder nur in geringer Anzahl in einem klassischen Reinraum durchgeführt werden könnten und insbesondere einer erforderlich werdenden Produktionserhöhung nicht standhielten. Die herkömmliche Miniaturisierung und Aufarbeitung von Biomolekülen, etwa für die DNA Analyse etc durch Pipettierroboter, wie sie bei DNA für analytische Zwecke eingesetzt wird, kommt in der bekannten Form (Multiwell, Mikrotiterplatten) praktisch nicht in Frage, weil erheblich größere Volumina bearbeitet werden müssen und die herzustellende Lagerform z. B. bei der langmoleküligen Grad 1 DNA in einer schützenden Agarosegelmatrix nicht für das Pipettieren geeignet ist.

Um Reinraumkriterien selbst bei dem komplexen Verfahren der Herstellung langer DNA Moleküle kostengünstig zu gewährleisten, und eine flexible Vergrößerung der Produktion zu ermöglichen, sieht die Erfindung vor, das Herstellungsverfahren in kostengünstige, automatisiert herstellbare Module/Container/Beutel/Mehrkammerbeutel einzuschliessen, so dass Reinraumbedingungen für den gesamten Prozess geschaffen werden können, eine Produktionssteigerung durch Erhöhung der Stückzahl einfach möglich ist, und gleichermassen die verschiedenen Material- und Sterilisations- und Sauberkeitsanforderungen und Lagerzeiten der Beutelteile und Ansteckkammern und der Verfahrenslösungen/Medien berücksichtigt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist damit der Einschluss eines komplexen Laborablaufs in einen multifunktionalen Kunststoffbehälter/Beutel, in dem praktisch alle für den Prozess benötigten Schritte, Bewegungen, Zugaben von Lösungen und Enzymen, Inkubationen, und Lagerungen im geschlossenen System erfolgen. Lediglich bei der Ausführung mit dem Einbringen der Bakterienmasse, z. B. in Form einer Agarosegelmatrix in einer externen Giessform/Siebrahmen ist eine Seite zum anschliessenden Verschweissen geöffnet. Bei interner Giessform wird nur ein steriler Port geöffnet. Während der elektrophoretischen Reinigung wird das Beutelsystem unter Reinraumbedingungen (Filterboxen, Laminar flow module) vorübergehend an den Elektrodenzugängen oder über einen Port geöffnet, um Gas und verbrauchten Puffer abzulassen. Diese oder zusätzliche Zugänge dienen auch dem Entweichen von Elektrophoresegasen und werden anschliessend wieder steril verschlossen (oder verschweisst).

Somit kann selbst in einem begrenzter Reinraumareal einer Produktionsstätte die Produktion eines DNA Medikaments selbst bei großen zu lagernden Chargenzahlen (verschiedene Gene, mehrere Testkonstrukte für klinische Studien) durchgeführt werden. Bei Bedarf einer größeren Menge eines DNA-Medikaments kann die Produktion einfach und flexibel mit größeren Beutelzahlen hochgefahren werden.

Voraussetzung für die Reinigung innerhalb eines Prozessbeutels mit einer Trägermatrix ist die selektive Bindung der zu gewinnenden Biomoleküle (durch Einfangen in einem Gelgitter, durch Bindungseigenschaften wie kovalente Bindung oder Rezeptoren, Antikörper etc) innerhalb der Trägermatrix, während einer Reihe von Reinigungsschritten zur Absonderung aller verunreinigender anderer Bestandteile der eingebrachten Biomasse (z. B. Bakterien, Medien, Gewebeaufschlüsse, Zellkulturen usw). Nach Erreichen der vorgesehenen Reinheit und Verdünnen unerwünschter Bestandteile findet eine Lagerung und Prüfung einer Probe statt. Anschliessend wird das Biomolekül gezielt behandelt, um es aus der Trägermatrix herauszulösen und innerhalb des geschlossenen Systems zu verpacken.

Als Stand der Technik war von medizinischen Infusionslösungen und Mischlösungen für die parenterale Ernährung bekannt, dass durch die Verwendung von Mehrkammerbeuteln (z. B. EP 0776649 A2, US 4997083 A, DE 32 38 649 A1, US 5296242 A, DE 94 01 288 U1, EP 0790051 A2, EP 0875231 A2, US 5176634 A, US 5308334 A, US 6231559 A) verschiedene Stoffe mit unterschiedlichen Sterilisationsverfahren oder für die Aufrechterhaltung der Stabilität erst kurz vor der Applikation im geschlossenen System gemischt werden können (z. B. DE 697 36 909 T2, DE 600 30 682 T2, US 4997083 A, US 5560403 A, US 6468259 A, DE 100 41 295 A1). Ebenfalls wird Spenderblut nach der Entnahme innerhalb des Beutels durch Zentrifugation grob fraktioniert und Plasma oder Zellfraktionen in angeschlossene Beutel mittels Schläuchen überführt, filtriert und gelagert (diverse Systeme, z. B. US 4425114 A, US 4098456 A, US 4915847 A, US 4637813 A, US 5382526 A) oder es werden Zellen kultiviert (z. B. DE 10 2006 026 179 A1).

Bisher ist aber nicht bekannt, dass Mehrkammersysteme mit Puffern für Inkubations- und Reinigungskaskaden von Laborprozessabläufen inclusive Elektrophoresen für den molekularen Aufschluss, die Lagerung und die Reindarstellung von Biomolekülen in einem Prozessbeutel, inklusive dem Durchschweissen und der Probengewinnnung und Verpackung einer Reinform eines Biomoleküls verwendet werden. Aus den bereits existierenden Beutel und Anschlusslösungen und Ports der Ernährungs-, Infusions- und Transfusionsmedizin ergeben sich mehrere flexible Lösungen für die Zuführung von Puffern und Medien in einen geschlossenen Prozessbeutel. So können Puffer und Reaktionslösungen mittels herkömmlicher Infusionssysteme aus autoklavierten Einzelkammerbeuteln oder Mehrkammerbeuteln zugefügt werden. Für die diversen Ausführungen existieren automatisierte, auf verschiedene Materialien abgestimmte, geprüfte Verfahren zur Befüllung/Herstellung und das Sterilisieren, Autoklavieren von Lösungen und der späteren Applikation von Medikamenten oder Nährstoffen über verschiedene Port Systeme, wie es in vielfachen Ausführungen von Infusionsbeuteln, Blutbeuteln, oder Mehrkammerbeuteln für die parenterale Ernährung bekannt ist. Die konkreten Materialanforderungen an Prozessbeutel sind vielfältig und benötigen mitunter weitere Entwicklungen, die von dem know how mit Beutelmaterialien herkömmlicher Systeme profitieren können.

Allerdings ist die Füllung und Unterteilung von Mehrkammerbeuteln technisch immer noch schwierig, weil nach heutigem Stand jede Kammer einen eigenen Zugang zur Füllung benötigt, und damit räumlich und technisch automatisierbare Anzahl von Kammern rasch begrenzt ist.

Peelnähte von Mehrkammerbeuteln werden z. B. eingesetzt, wenn verschiedener Inhalt erst kurz vor der Anwendung vermengt werden soll. So werden nach dem heutigen Stand die Kammern über eigene Zugänge bereits vor der Füllung durch Peelnaht-Schweisstechniken voneinander getrennt. Bei den in dieser Erfindung an den Prozessbeutel anzuschliessenden Zuführungsbeuteln mit Lösungskaskaden wird eine viel größere Anzahl relativ kleiner Volumina benötigt, so dass nach heutigem Stand der Technik eine große Zahl von Schlauchstücken/Befüllstutzen angeschweisst werden müsste, wodurch technisch schwierige Platzverhältnisse sowie Erhöhung des Ausschusses und der Kosten in einem automatisierten Herstellungsvorgang auftreten würden. Ein Ausführungsaspekt des her beschriebenen Prozessbeutels, insbesondere eines oder mehrerer Zuführungsbeutel sieht deshalb ein neues Verfahren für das Anbringen von Peelnähten vor, bei dem eine lange Schlauchkammer zunächst über einen Port locker mit wässrigem Puffer befüllt wird, und dann die befüllte Kammer an den zu schweissenden Steilen leergedrückt wird, und dann die Schichten zusammengeschweisst werden (Durchschweissen durch einen gefüllten Beutel). Dabei wird einfach durch die verbleibenden wässrigen Spuren/Tröpfchen hindurchgeschweisst, um eine größere Anzahl mit gleicher Flüssigkeit gefüllte Kammern in einem Multikammerbeutel zu erhalten (4). In einer Ausführung wird die zu verschweissende Stelle über einer Kantenfläche/Erhöhung hoch gelagert, wobei der Kammerinhalt rechts und links davon nach unten abläuft. Das zu verschweissende Areal der übereinanderliegenden, für eine Peelnaht geeigneten Folie (z. B. interne Polyolefinschicht) wird nötigenfalls vorgewärmt, um eine weitgehende Trocknung vor dem Setzen der Foliennaht zu erhalten und erst anschliessend wird die Peelnaht geschweisst. Ebenfalls können auseinanderweichende Walzen/Druckstege im Bereich der Peelnaht vor dem Druchschweissen aufgesetzt und auseinanderbewegt werden, damit Flüssigkeit nach aussen gedrückt wird und anschliessend dazwischen die Peelnaht gesetzt werden kann. Auf diese Weise wird ein kostengünstiger Zulaufbeutel, mit praktisch unbegrenzt schaltbarer Kammerzahl mit gleichem Inhalt erzeugt, der für die mehrstufigen Reaktions- und Verdünnungskaskaden eingesetzt werden kann. Die Beladung aber auch die Verbindung von dem Multikammerbeutel (zum Beispiel mit 8 × 200 ml wässriger Reinigungslösung, oder 6 × 200 ml hintereinandergeschalteter Tensidlösung für den chemischen Aufschluss, oder 8 × 400 ml Elektrolytlösung etc) zum Prozessbeutel kann nun über einen einzigen Einfüll und Auslaufstutzen erfolgen, wodurch die Herstellung und Sterilisierung zunächst als langer Einkammerschlauch und die Befüllung stark vereinfacht wird. Durch die Unterteilung wird zudem ein günstiger Effekt auf die Transportfähigkeit der Pufferkaskaden erzielt, weil große Volumina unterteilt wesentlich höhere Beschleunigungs/Bremskräfte aushalten, als eine große, gemeinsame Kammer. Damit werden ebenfalls Dehnungsbelastungen im Material gesenkt, wodurch indirekt eine längere sterile Lagerbarkeit gewährleistet werden kann. Der Multikammerbeutel für Reaktionskaskaden erfüllt dabei einen weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung, weil auf jeder Stufe der über Wochen durchgeführten Reaktionskaskaden, Reinigungen, Inkubationen, eine automatische Kontrolle anhand der bereits geleerten und noch gefüllten Zulaufkammern durch einfaches Hinsehen und Abzählen realisiert wird. So können in einer weiteren Ausführung, um alle erfolgten Enzym/Puffer/Zugaben sichtbar am Beutel zu dokumentieren, zusätzlich kleinere Trocken-/Lichtschutz-/Nebenkammern eingebracht werden, die als Pulver lagerbare Enzyme (RNasen, Proteinasen, Nukleasen etc) oder Puffersubstanzen enthalten und z. B. nachträglich nach der Sterilisation am Beutel angebracht und in den Hauptpuffer eingebracht werden. Techniken für das Schützen und Einsetzen von Medikamenten in Kunststoffbehälter existieren (Bruchröhrchen, nachträgliches steriles Einsetzen von Peelkammern, steriles Verkleben, Aufbringen von Gas- und Dampfschutzschichten, Alu beschichtete Folien durch Bekleben von Infusionsbeutelfolien von aussen etc). Durch entsprechende Ausfertigung des Reinraumprozessbeutels werden weitere Kontaminationsquellen bei der Zuführung externer Substanzen vermieden, die Anwendung erleichtert, die Überprüfung/Dokumentation des Prozesses vereinfacht und ein Risiko der Verwechslung oder Falschdokumentation gesenkt (5).

Ebenfalls sind mit chemischen substanzen für die Pufferherstellung vorgefüllte Beutel möglich, die in Form von Leerbeuteln als Reinraumprozessbeutel-Kits erst vor Ort mit Wasser aufgefüllt und autoklaviert werden.

Ein Beispiel für die Ausführungsgröße eines z. B. 30 × 40 cm Prozessbeutels (vgl Modell 11) und einen Siebrahmen mit 20 × 10 cm × 5 mm, dessen Boden flach, plan, verwindungsarm, bevorzugt zwischen 0°C und 65°C verformungsarm (bei nachträglich in den Prozessbeutel eingebrachter Giessform/Trägermatrix), bevorzugt verformungsstabil bei Leerlagerung und beim Autoklavieren, verformungsstabil bei Dampfautoklavieren (bei Einbringen in den Beutel in geöffneter Form vor dem Autoklavieren des Leerbeutels), bevorzugt transparent ist.

Für das Giessen des flüssigen Agarosegels in die Giessform innerhalb des Beutels, über einen kleinen Zugang für eine externe Pipette oder einen Port/Schlauchadapter (1, 2).

Dabei ist der im Beutel vorgelegte Giessrahmen (2A) mittig am Beutelboden entlang einer Mittellinie des Siebrahmens und entlang einer Mittellinie des Beutelbodens vorbefestigt. Die Befestigung ist nicht ganzflächig, damit der Beutel blähen kann und umgebende Elektroden (3 oder mehr) räumlich oberhalb und unterhalb der Gelmatrix angeordnet werden können (3, 6), oder einseitig zwei Elektroden in Kombination mit weiteren Elutionselektroden (1 oder mehr) in einer angeschlossenen Elutionsbeutelkammer, für die Isolierung der Grad 1 DNA und Überführung in ein Transportröhrchen im geschlossenen System, räumlich angeordnet werden können (7).

Ein wesentlicher Aspekt der Lagerung von Biomolekülen in dem Prozessbeutel betrifft die sterile Entnahme von Proben zu verschiedenen Zeiten der Herstellung und Lagerung, bis hin zur Entnahme von Teilen des Lagers. In einer Ausführung ist die Trägermatrix durch den Beutel hindurch leicht brechbar, so dass kleinere oder größere Anteile von der Gesamtfläche des Genlagers im Beutel getrennt werden. Die Waschlösung wird für diesen Schritt über den Auslauf entfernt. Die abgetrennte Trägermatrix wird nun in eine Ecke des Beutels bewegt, in der keine Anschlüsse bestehen. Zwischen der Probe in der Ecke (von z. B. 1 × 1 cm) und dem verbleibenden, grossflächigen Biomoleküllager befinden sich nur noch kleine Mengen einer wässrigen Waschlösung, so dass unter Zuhilfenahme von Stäben/Rollen oder Gleitschienen oder einer Ablauferhöhung ein quasi trockener Bereich gebildet werden kann, der durch eine einfache Schweissnaht (gegebenenfalls mit zuvor erfolgter vorsichtiger Erwärmung zum sollständigeren Trocknen), geschlossen wird, so dass die Beutelecke mit der Probe abgschweisst/getrennt wird (6).

Die Spuren der wässrigen, dünnen Salzlösung, die sich im Bereich der Naht befinden könnten (ausgefallene Salzkristalle/Dampftröpfchen etc) werden einfach in der grosszügig gesetzten, wiedererstarrenden Naht oder Doppelnaht (etwa mit einer Handwärmzange, oder in einer HF-Schweissvorrichtung, oder mit einem Laser, je nach Material in einer handelsüblichen Folienschweissvorrichtung zum Schweissen mit/ohne Trennen, gegebenenfalls doppelt, oder mit einer speziell an die Prozessbeutelfolien und Vorwärmzeiten angepassten Schweisszange/Tischgerät für Prozessbeutel) mit eingeschlossen. Damit bleibt die Stabilität des verbleibenden Lagerbeutels erhalten, die entnommene Probe befindet sich ebenfalls in einem geschlossenen Beutel und kann problemlos transportiert und für die Analyse geöffnet werden. Die Bedruckung der entsprechenden Beutelecken und weiterer für spätere Entnahmen vorgesehener Abschnitte des Beutels sowie des verbleibenden Beutels mit laufenden Nummern und/oder den Informationen des gelagerten Inhalts gewähreistet zudem eine verwechslungsfreie Probenentnahme und ein einfaches Handling. Auf diese Weise können auch bei der Entnahme und dem Verschicken von Analyseabschnitten der Chargen und der wertvollen Materialabschnitte Kontaminationsquellen vermieden werden. Im gesamten Prozess werden keine herkömmlichen Röhrchen (50 ml) und Einmalpipetten (10 ml, 25 ml) mehr zum zahlöreichen Ab- und Umfüllen von Puffern verbraucht, die bisher pro Genlager im normalen Laborablauf erhebliche Kosten und durch zahlreiches Öffnen/Verschliessen eine erhebliche Kontaminationsquelle darstellten. Zusätzlich kann auf zahlreiche Glasgefässe und ihre Reinigung vor und nach Autoklavieren verzichtet werden.

Andere Ausführungen sehen herkömmliche Kunststoffbeutel und Adaptoren vor, wie sie für Infusionslösungen eingesetzt werden und in beliebigen Größen von z. B. 100 ml oder 5000 ml aus verschiedenen Folienmaterialien hergestellt werden (z. B. Polypropylenbeutel für die Infusion). Dabei kann jede einzelne Kammer unabhängig befüllt, verschlossen und sterilisiert werden und als geschlossenes System an den Prozessbeutel angeschlossen werden.

Von solchen Beuteln ist ebenfalls bekannt, dass einer Infusionslösung nachträglich eine weitere Komponente zugefügt werden kann, die in einem anderen Behälter gelöst wird und im geschlossenen System mittels einer Vielzahl möglicher Ventil/Injektionssysteme/Ports hinzugegeben wird. Andere bekannte Anwendungen verwenden Sollbruchstellen (Bruchröhrchen, Peelnähte zwischen Beutelkammern) zwischen zwei oder mehr Kammern, um Komponenten zusammenzuführen, und damit die endgültige Applikationsform (antibiotische Lösung, Ernährungslösung etc) für die unmittelbare Anwendung zu erhalten. So können pulverisierte Komponenten, etwa Enzyme oder Antibiotika in Kunststoff eingeschweisst und durch Aufbringen von Sauerstoffsperrschichten bei der Folienherstellung oder durch nachträgliches Aufkleben angebracht werde. Solche zuschaltbaren Kapseln/Kammern können gegebenenfalls auch nachträglich (zum Beispiel nach dem Autoklavieren eines Beutels mit einer anderen Komponente/Lösung) und gegebenenfalls automatisiert in den Kunststoffbeutel eingebracht/angeschweisst werden. In ähnlicher Weise existieren Methoden zur nachträglichen Verbindung von Kammern, die entweder über Schlauch und Ventilsysteme oder durch Peelnaht- oder -Adapteranordnungen sekundär verschweisst oder verbunden werden können.

Aufbauend auf dem Stand der Technik, dass sterile medizinische Lösungen in Kunststoffbehältern und Beuteln hergestellt und > 1 Jahr gelagert werden können, und eine spätere Zuführung weiterer Komponenten möglich ist, und aus der Notwendigkeit einer GMP DNA Herstellung für die Gentherapie entstand die Erfindung, nicht nur ein medizinisches Endprodukt und deren Mischung zum Verbrauch der Applikationsform in einem kostengünstigen und sauberen Kunststoffbeutel durchzuführen, sondern einen komplexen molekulargenetischen und biochemischen Reinigungsprozess in speziell an die Prozessabläufe abgestimmten Prozessbeuteln aus Kunststoffen durchzuführen. Durch die Verlegung des vielschrittigen Prozesses bis zum Erhalt hochgradig gereinigter, intakter und funktioneller Biomoleküle in einen Kunststoffbeutel wird eine kostengünstige Massenfertigung unter Reinraumbedingungen erzielt und die dem Verfahren mit zahlreichen Genlagern zugrundeliegende Notwendigkeit einer Langzeitlagerbarkeit geschaffen. Ein ganzes Laborverfahren mit Reinigung, Lagerung, Probengewinnung, funktionelle Charakterisierung, elektrophoretischen Reinigungsstufen und Elution bis hin zur Verpackung in einem multifunktionellen Kuststoffbeutel durchzuführen ist neuartig und bringt erhebliche Vorteile, wie hier für die Herstellung von Genlagern mit Grad 1 DNA Qualität dargestellt wird, um lange DNA Abschnitte für Gentherapeutika bereitzustellen.

Laborprozessbeutel können aber auch auf andere, ähnliche Verfahren zur Isolierung von Biomolekülen unter Reinbedingungen angewendet werden. Ebenso können wahlweise bestimmte Teilprozesse, insbesondere Teilabläufe des Prozesses der hier bevorzugten Anwendung in einem Prozessbeutel, besser und sauberer als bisher durchgeführt werden. So stellt allein die im Beutel durchgeführte Elektrophorese/pulsfeldgelelektrophoretische Reinigung ein Novum dar, das eine Reihe ähnlicher elektrochemischer Anwendungen in anderen Bereichen der Biomolekülgewinnung nahelegt. Ebenso stellt die einfache Elektroelution von Biomolekülen aus Trägermaterialien im Beutel unter Reinraumbedingungen eine leistungsstarke Alternative zu bisherigen Systemen dar, die in der Regel aus offenen Elektrophoresekästen mit eingesteckten Elutionskammern und Dialysemembranen/Filtermembranen bestehen. Durch die geringen Kosten gegenüber einem herkömmlichen Reinraum und die schnelle Steigerbarkeit der Herstellungsmenge durch Verwenden und Lagern mehrerer Beutel, sowie die schnelle Realisierung der Automatisierung für größere Zahlen, der kostengünstigen Herstellung zuschaltbarer Pufferlösungen, Waschlösungen, Enzymbeigaben, ermöglicht das Herstellungsverfahren von Genlagern im Prozessbeutel den Einsatz von Genen in einer größeren, sauberen Herstellungsform und schafft damit die Voraussetzungen für klinische Studien und die Entwicklung von Gen-Medikamenten und deren Herstellung.

Vorzugsweise kann auch das neu entwickelte Verfahren zur Herstellung einer sprunghaft höheren DNA Qualität (Grad 1 DNA) für die Herstellung von DNA Medikamenten im Prozessbeutel durchgeführt werden. Durch die Erfindung des eingeschlossenen Laborablaufs im Beutel kann somit erstmals eine medizinisch relvante DNA Produktion unter Reinraumbedingungen realisiert werden, die auch geeignet ist, bei einer schnell wachsenden Nachfrage die Produktionsmenge zu steigern. Damit stellt das Verfahren ein Schlüsselverfahren für den Einsatz einer neuen DNA Technologie mit hochwertigen, langen DNA Molekülen ganzer Genorte und den Einsatz künstlicher Chromosomen dar.

Die in nur einem einzigen Beutel (mit z. B. 10 × 20 cm Trägermaterial) herstellbare und lagerbare DNA Menge übertrifft bereits, bei deutlicher Kostenreduktion, die üblicherweise in einem modernen Genlabor zur Verfügung stehende Menge und ermöglicht eine relevante Lagerhaltung. Die Lagerung der zunächst präparierten DNA Moleküle als Genlager ist absolut notwendig, damit zusätzlich zur hohen physikalischen Integrität und Intaktheit der hergestellten DNA Moleküle, auch die funktionell intakte Fraktion der Gesamtheit der Moleküle in der aktuellen Produktionseinheit bestimmt werden kann. Da keine andere geeignete Vermehrungsmethode als die Klonierung von DNA Konstrukten in low copy Vektoren für die Herstellung künstlicher Chromosomen (PACs, BACs, pTAT-Vektoren) in Grad 1 DNA Qualität zur Verfügung steht, als die Klonierung in Bakterien (bevorzugt E. coli oder theoretisch auch als zirkuläre Moleküle in Hefezellen, mit um mehrere Größenordnungen geringeren Ausbeuten als bei Bakterien), ist biologisch durch die vielen Zellteilungen während des Wachstums bedingt, in jeder individuellen Präparation ein real existierendes, neues Risiko vorhanden, dass einzelne oder viele der Moleküle von Rekombinationen, Deletionen, Mutationen der DNA Sequenzen betroffen sein könnten.

So tragen z. B. die Tandemrepeatsequenzen der Telomere und Zentromere und die verteilt auftretenden repetitiven Abschnitte in genomischen Sequenzen eines künstlichen Chromosoms ein Risiko für Rekombinationen, so dass in der Regel sicherheitshalber zwei bis vier Einzelzellanzuchten einer geeigneten Masterkultur des gleichen Bakterienklons durchgeführt werden, um nach prolongiertem Wachstum in einer Kultur von 1015 und mehr Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit eine hochwertige Präparation zu erhalten. Dabei können manche problematische Genomstellen höhere Kulturzahlen benötigen. In der Regel sind die meisten Abschnitte sehr gut in den erwähnten low copy Systemen in E. coli klonierbar, zumal redundante Klonsammlungen mit einer oft über 10-fachen Genrepräsentation mit zufällig angeordneten Abschnitten zugrunde liegen, woraus in der Regel einzelne funktionelle Abschnitte erhalten werden können, und durch die Präparation hochqualitativer DNA weitere Methoden zur Ergänzung und Weiterklonierung unvollständiger Klone verfügbar sind, z. B. very long PCR des Erfinders (z. B. Kraner et al. 2007).

Bei der Vermehrung der Bakterienkultur hat nach prolongiertem Wachstum prinzipiell jedes Molekül aus jeder der 1015 bis > 1020 E. coli Zellen eine potentiell andere Mutationsvergangenheit. Überspitzt gesagt, konnte jedes DNA Molekül eine andere Mutation tragen. Da diese bei einer Sequenzierung einer Probe der Molekülgesamtheit nicht auffallen würden, und die Sequenz/Funktionsrelationen für die weitaus größeren Anteile eines genomischen Genabschnitts nicht bekannt sind (so fallen nur etwa 10% der Sequenzen auf kodierende Genabschnitte, Splicesites und Regulatorbindungsstellen, während die anderen 90% zwar auch die Genfunktionen wesentlich beeinflussen (Chromatinkontext) können, aber jede potentielle Variante a priori nicht auf Sequenzebene erfasst werden kann), müssen zusätzlich zu strukturellen Untersuchungen für die Beurteilung eines Genlagers immer auch Einzelmolekültransfer/Funktionsexperimente durchgeführt werden (oder Sequenzierungen von Einzelmolekülsubklonierungen, im Falls einer bekannten Sequenz eines funktionellen Konstrukts, um die funktionelle Rate der hergestellten DNA Moleküle einer Präparation zu erfassen. Aus diesem Grund kann die Funktionalität eines Genlagers erst nach der Herstellung des Lagers, in der Regel nicht vor 1–3 Monaten und/oder erst nach 1 Jahr und später bestimmt werden, wobei mit dem funktionellen Nachweis mit einer kleinen Probe, der Wert des gelagerten Materials drastisch steigt und andere Genlager, die in einer kleinen Probe der geforderten Qualität nicht entsprechen, ausgemustert und verworfen werden (oder, bei zumindest weitgehend struktureller Intaktheit, z. B. zu sehr sauberer Sonden-DNA für die Herstellung markierter Proben für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) verarbeitet werden). Die Erfolgsquote für ein funktionelles Genlager hängt dabei von Konstrukteigenschaften und E. coli Wachstumsbedingungen der künstlichen Chromosomen und von der intrinsischen Klonierstabilität eines jeden enthaltenen Genabschnitts ab.

Damit werden zwei Herstellungsphasen des Prozesses unterschieden. Während einer anfänglichen Phase zur Identifizierung geeigneter Klone bis zum Anlegen und dem Ablegen des Genlagers sind demnach andere Anforderungen an die Materialien notwendig, als in der später, mitunter erst nach Jahren zu erfolgende, eigentliches Aufreinigung zur Grad 1 DNA und der Isolierung freier DNA Moleküle für eine gezielte Applikation.

Die Erfindung beinhaltet das Verwenden unterschiedlicher Kunststoffe, entsprechend der gewünschten Eigenschaften für die entsprechende Phase des Prozesses. Hier sei darauf hingewiesen, dass die Erfindung sich nicht auf die Verwendung oder Reihenfolge von bestimmten Kunststoffen, Folienmaterialien, Konnektormaterialien etc. festlegt, wie sie in den Ausführungsbeispielen vorliegen. Mit dem Verfügbarwerden neuer Kunststoffe, Kunststoffkombinationen oder von Kunststoffen mit neuen Additiven oder dem Verwenden verschiedener mehrschichtiger Folien und Laminate, aber auch mit Erfahrungen aus den Anwendungen, wird es dem Fachmann möglich sein, Beutel in anderen Ausfertigungen und Größen herzustellen, die für die speziellen Anforderungen des jeweiligen Laborprozesses geeignet sind. Im Ausführungsbeispiel werden die zurzeit massgeblich für Infusionslösungen oder Blutbeutel verwendeten Materialien PVC, EVA und PP eingesetzt. Dabei wird weitgehend auf PVC verzichtet, das weniger als ca. 10% der eingesetzten Kunststoffmasse ausmacht, aber für die Langzeitlagerung der DNA zum Einsatz kommt. Aus den Eigenschaften der Beispielmaterialien ergeben sich spezifische Vorteile für die jeweilige Prozessphase und für die Kontrolle und Senkung freiwerdender Stoffe (Weichmacher, Extender, Abbrecher, Metalle aus Stabilisatoren, Stoffe aus dem Prozess, UV Absorber, Füllstoffe, Metalle aus Wärmestabilisatoren oder Katalysatoren).

Flexible PVC Beutel enthalten in der Regel Phtalat-haltige Weichmacher in großer Menge, von denen vermutet wird, dass sie in größeren aufgenommenen Mengen und bei kontinuierlichem Kontakt in der Summe schädliche Wirkungen auf den Menschen aufweisen. Besonders durch den Verdacht, dass der über viele Jahrzehnte eingesetzte Weichmacher DEHP und andere Phtalate Infertilität beim Menschen hervorrufen könnten, wurde zunehmend auf die Verwendung von Phtalat-haltigem PVC für Kinderspielzeug und für die Medizintechnik verzichtet, zumindest wenn die medizinisch notwendige Versorgung mit anderen Materialen sichergestellt werden konnte. Darüberhinaus wurden andere, nicht-Phtalat-haltige Weichmacher für PVC in der Medizintechnik und andere sensitive Bereiche entwickelt (DINCH und andere). So werden Blutbeutel bevorzugt aus PVC gefertigt, weil Blut darin stabil ist. PVC halt einer Dampfsterilisiation gut Stand und hat eine ausgesprochen hohe Langzeitstabilität. Zudem kann es in dickeren Folienlagen (0,4 mm und mehr) gut verschweisst werden, wodurch sehr lange Lagerzeiten von weit über 5 Jahren erreichbar sind. Ein Beispiel für die enorme Langzeitfestigkeit von PVC Folien stellen Teichfolien in der freien Witterung dar, die üblicherweise mit einer Garantie von mindestens 10 Jahren angeboten werden. PVC ist ein weiches, haftbares, gut bedruckbares, auch bei Kälte gut lagerbares und Sauerstoff-/Wasserdampf-dichtes oder zusätzlich versperrbares Material, das eine lange Sterilität gewährleistet. PVC erfüllt damit speziell für die Langzeitlagerung von Biomolekülen und für die unterschiedlichen Inkubationen innerhalb einer Agarosegelmatrix bei 0°C bis 65°C die erforderlichen Stabilitätsparameter bei gleichzeitiger Temperaturbeständigkeit über das 121°C Dampfautoklavieren hinaus, so dass auch Leerbeutel ohne Verkleben der Flächen autoklavierbar sind.

Da bisher Genpräparationen/Genlager auf herkömmliche Weise vordringlich in dickwandigen 50 ml Falconröhrchen (aus glasartigem Polypropylen oder modifiziertem Polystyrol erhältlich) gelagert wurden und Langzeitgenlager mit Chelatbildnern nach 7 Jahren Lagerung bei Raumtemperatur keine spürbare Qualitätsverschlechterung aufwiesen, ist es durchaus denkbar, dass die Genlager in stärkerwandigen Beuteln mit einer dichten Barrierefunktion bis weit über 10 Jahre intakt und steril bleiben, wodurch eine zeitversetzte, kostengünstige Nachlieferung geprüften Materials und sehr große Genlager gewährleistet werden können, wodurch DNA Arzneimittel für Massenanwendungen herstellbar werden.

Es ist zu bedenken, dass bei der sehr langen Lagerung, die angestrebt wird, herkömmliche Erfahrungswerte mit potentiell aus der Containerwand austretenden Stoffen nicht einfach auf Beutelfolien übertragen werden können. Zum einen ist die Kontaktoberfläche vergleichsweise groß, wodurch schnell releativ hohe Konzentrationen der Substanzen anfallen können, zum anderen ist die Gesamtmasse bei der Verwendung einer dünneren Folie verhältnismässig klein (vielfach kleiner als bei konventionellen Präparationen und Containern und mehrfachem Containerwechsel), so dass bei der Langzeitlagerung im dünnwandigen Beutel, in dem der gesamte Prozess stattfindet, kaum noch mit Nachschub aus dem Material gerechnet werden muss, zumal die Waschprozesse zu Beginn mit Tensiden stattfinden, die stärker als in den späteren, rein wässrigen Reinigungsschritten und Elektrophoresen, die fettlöslichen Weichmacher aufnehmen und aus den innersten Schichten herausspülen können. Netto könnte somit die Verwendung von dünnen Folien (oder Kombinationen mit dünnen Folien mit unterschiedlichen Eigenschaften und kombinierte Folienmaterialien), zu einer deutlich geringeren Belastung führen, als die Verwendung dickwandiger Container der gleichen Materialien, insbesondere bei den vielfachen Pufferwechseln, die der eigentlichen Isolierung des Arzneimittels vorangehen und den weitaus größten Teil an potentiell anfallenden Substanzen herausschwemmen.

Darüberhinaus werden Kontakte mit anderen Materialien, wie Glas, Elektrophoresekammern, Kühlschläuche, Elutionskammer, Einmalpipetten etc, komplett vermieden, so dass die gesamte Menge des in Kontakt tretenden Containermaterials durch den Einsatz eines Prozessbeutels auf ein Minimum gesenkt wird.

Inzwischen werden Weichmacherersatzstoffe, z. B. DINCH, das in Wasser schwer löslich ist, eine geringere Migrationsrate aufweist, und typischerweise keine Metallrückstände enthält (Technisches Merkblatt Januar 2008 M6168d, BASF) in PVC verwendet, von denen bislang keine medizinischen Nachteile für den Menschen bekannt sind oder bei viel höheren Testkonzentrationen keine fruchtschädigende Wirkung nachweisbar war (Welle et al. 2005; Ref. Scientific Commettees 2008, SCENIHR Opinion,
http://ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/04_scenihr/docs/scenihr_o_014.pdf).

Dennoch ist bekannt, dass die zum Teil in größeren Mengen im PVC eingesetzten Weichmacher über einen längeren Zeitraum hinweg leicht im Kunststoff migrieren können und damit bei einer Langzeitlagerung, besonders bei lipophiler Füllung, auch in die zu Lagernden Substanzen diffundieren (K. Inoue et al. 2005). Auch wenn in den ersten Tagen und Wochen des Reinigungsprozesses mehrfach die tensidhaltigen Puffer im Prozessbeutel erneuert werden, würde mit Sicherheit nach der anschliessenden Langzeitlagerung wieder Weichmacher in die tensidhaltige Lagerlösung nachwandern, auch wenn anfangs schon eine gewisse Menge der innersten Schicht weggewaschen wurde. In Anlehnung an die Lagerbarkeit von Blutzellen in PVC wäre aber nicht zu erwarten, dass die Bakterien und die daraus resultierende Biomasse und letztlich die enthaltenen, biologisch inerten DNA Moleküle durch den Weichmacher geschädigt werden würden. Weichmacherfreies EVA hat ebenfalls eine hohe Widerstandsfähigkeit mit einer hohen Wasserdampfsperre und ist gut verschweissbar.

Da bei den anzuschliessenden Puffer-Mehrkammerbeuteln auch eine gewisse Lagerung durchgeführt werden muss, diese aber nicht die übliche Lagerzeit von Infusionslösungen von Monaten bis wenige Jahre übersteigt, und die Beutel nicht den vielen Manipulationen standhalten müssen, wird in einer Ausführung bevorzugt für alle Beutel der Nachfüllösungen, die nach der Lagerung zum Einsatz kommen, und für alle kurzfristigen Prozessbeutel (Elutionsbeutel, Elutionskammer, Transportschlauch etc.) ein weichmacherfreier Polyolefinkunststoff verwendet. PP Beutel werden vermehrt für Infusionslösungen eingesetzt und können durch zusätzliche Schichten mit einer höheren Gas- und Dampfbarriere hergestellt werden. Darüberhinaus bieten z. B. Spezialpolyolefinfolien mit Peelnaht-Eigenschaften die Möglichkeit der Herstellung von Multikammerbeuteln mit Kaskaden wässriger Lösungen nach dem hier vorgeschlagenen Verfahren.

Da Gentherapieapplikationen auch verstärkt an Neugeborenen und Kleinkindern zum Einsatz kommen werden, muss die Materialwahl mit besonderer Vorsicht und mit einem besonders günstigen Nutzen-Risiko Verhältnis erfolgen. So ist im Hinblick auf Verunreinigungen in der zu applizierenden DNA Lösung bevorzugt ein weichmacherfreies Material/Beutelsystem, etwa nur Polyolefine, anzustreben, oder auf phtalathaltige Weichmacher zu verzichten.

Allerdings ist zu berücksichtigen, dass Zusatzstoffe, die bei der Polyolefinpolymerisation zum Einsatz kommen können, wie Katalysatoren und Co-Katalysatoren (oder andere Additive in anderen Kunststoffen), im hergestellten Beutel (hier Polypropylen) vorhanden sind und geringe Spuren in die Lösungen geraten können. Solche wären zwar für den Menschen (bei Infusion, Nahrungsverpackung etc) wegen der höchstens spurenhaften Menge und Art der Stoffe und dem nicht-migrierenden Verhalten gesundheitlich unbedenklich und wären bei herkömmlichen Verpackungen und mässigen Lagerzeiten kaum nachweisbar, aber konnten während der Langzeitlagerung dennoch eine nachteilige Wirkung auf enthaltene inerte, nicht-biologische DNA Moleküle haben (direkt chemisch versus potentiell genotoxisch im komplexen lebenden System). So könnten z. B. die bei der Polypropylenherstellung verwendeten Ziegler-Natta-Katalysatoren, die in der Regel metallorganische Verbindungen darstellen (Cobalt, Eisen, Nickel, etc), oder Co-Katalysatoren, ein Problem speziell für die Stabilität der freien DNA Doppelhelix darstellen, selbst wenn nur Spuren über längere Zeit in der Lagerlösung vorhanden sein würden, obwohl solche Substanzen in diesen Mengen keinerlei nachteilige, oder sogar vorteilige Wirkungen auf lebende biologische Systeme hätten, wie das für Eisen und viele Metalle und andere Spurenelemente der Fall ist.

Ein wesentlicher Aspekt der Erfindung in der Ausführung eines Prozessbeutels für die Grad 1 DNA Produktion ist die absolute Vermeidung von Metallkontakt und die Ausschaltung kleinster Mengen freier Metallionen/Schwermetalle, wie sie etwa in sauberem Leitungswasser oder Mineralwasser vorkommen oder aus Glasbehältern austreten können, da diese im nicht-biologischen System schädigend auf freie DNA Moleküle wirken können. So werden durch den Einsatz eines Kunststoff-Prozessbeutels durch das neue Verfahren und durch das Material metallische Konaktoberflächen, wie sie in herkömmlichen Kühlkreisläufen der Elektrophoresekammern auftreten, durch Verzicht auf einen Kühlkreislauf verbannt. Damit gelingt auch der Verzicht auf herkömmliche Kühlkreisläufe in Glasgefässen/Wärmetauschern/Glaswendeln/Kühlfallen/Schläuchen, aus denen zusätzlich Metallionen herausgewaschen werden können. Zum Ansetzen der Pufferlösungen wird ausschliesslich Wasser aus einer Quarzglasbidistille verwendet. Platindrahtelektroden werden bei der elektrophoretischen Aufreinigung durch Kohlenstoffmodifikationen, insbesondere Glaskohlenstoff oder andere ersetzt, die sich elektrochemisch praktisch rückstandsfrei in entweichendes Gas und nicht in Feststoffe und Metallionen zersetzen.

Damit wird ebenfalls vermieden, dass im Platin vorhandene andere Metalle anfallen. PVC mit Weichmacher ist seit dem Verzicht auf Blei und dem Einsatz von Zink und Calcium für Stabilisatoren praktisch schwermetallfrei. Somit ist eine Lagerung der Genlager, unabhängig von der Anwesenheit von Weichmachern, in haltbarem PVC oder anderen geeigenten Folienmaterialen vorzunehmen, bis nach mitunter vielen Jahren die eigentliche, verbrauchsnahe Reinigung mit Pufferkaskaden aus weichmacherfreien Materialien erfolgt. Da nach der Langzeitlagerung der Genlager (Jahre) das vielstufige Reinigungsverfahren fortgesetzt wird, und eine längere Serie frischer Pufferlösungen zugeführt wird, kann eine weitestgehend vollständige Abreicherung aller im Lagerbeutel vorhandenen, beweglichen Substanzen erreicht werden, wodurch die anfängliche Anwesenheit von Weichmachern und anderen Substanzen, solange sie der Haftbarkeit des Prozessbeutels und damit der sterilen Langzeitlagerbarkeit der DNA Moleküle dienen, wünschenswert oder akzeptierbar sind.

Zum Zeitpunkt der Wiederaufnahme der Reinigung des Langzeitlagers zum medizinischen Endprodukt hat eine fortgeschrittene Auswaschung des Weichmachers aus dem PVC Beutel stattgefunden, wodurch die dann nur noch für kurze Zeiten vorhandenen Lösungen (Tage), nur noch vernachlässigbar kleine Weichmacherkonzentrationen aufnehmen können. Damit ab dem Zeitpunkt der Fortsetzung der Reinigung bis zur endgültigen Isolierung der freien DNA Moleküle in der angeschlossenen Elutionskammer keine erneute Weichmacherzufuhr stattfindet, erfolgt ein Wechsel des Materials der anzuschliessenden Pufferbeutel auf andere autoklavierbare Materialien, z. B. Polyolefine, bevorzugt das Polypropylen ohne Weichmacher. Bei diesen relativ kurzen Verweildauern ist von den zugeführten Lösungen mit potentiell spurenartigen metallischen Verunreinigungen keine relevante DNA Schädigung mehr zu befürchten (bestimmbar im Langzeittest).

Damit bestehen prinzipiell unterschledliche Anforderungen an das Beutelmaterial wärend zwei verschiedener Prozessphasen. Während der Phase 1 von der Einbringung der Biomatrix bis zur Lagerung der Genlager müssen vor allem DNA-schädigende Verunreinigungen ausgeschaltet werden, während für den Menschen kritische, aber materialtechnisch günstige Stoffe akzeptiert werden können, weil sie später herausgewaschen und stark verdünnt werden. Während der Phase 2 wird aus den funktionell charakterisierten Genlagern in einer mehrwöchigen, vielstufigen Isolierung reine Grad 1 DNA hergestellt, oder in hohem Masse funktionelle DNA für eine Applikation als Arzneimittel in wässriger Lösung isoliert. Insbesondere wenn die DNA zu einem Arzneimittel verarbeitet werden soll, muss während der Phase 2 die weitestgehend vollständige Reduzierung von für den Menschen kritischen Verunreinigungen erreicht werden (allen voran muss Sterilität, Partikel- und Pyrogenfreiheit gewährleistet werden, aber auch Weichmacher in hohen Konzentrationen, z. B. aus Überleitungssystemen und Schläuchen vermieden werden). Aus diesem Grund kommen andere Materialien für die zugeführten Waschlösungen in der Phase 2 zum Einsatz.

Es soll hier zum Stand der Technik darauf hingewiesen werden, dass nicht bekannt ist, ob Metallspuren aus entsprechenden Kunststoffen überhaupt messbar in wässrigen Lösungen anfallen und ob daraus eine direkte DNA schädigende Wirkung ausgehen könnte. Es ist bekannt, dass Polyolefine besonders gute, saubere Folien für die Verpackung darstellen, aus denen im Vergleich zu Weichmachern, praktisch keine Substanzmengen austreten. Bei der hier geschilderten Materialabwägung handelt es sich also um ein Beispiel, wie die bestmögliche Stabilität des intakten Genlagers, und damit eine hohe Wirksamkeit pro Molekül für ein DNA Arzneimittel erreicht werden kann, und dabei gewährleistet werden kann, dass das endgültige DNA Arzneimittel in einem optimalen, rückstandsfreien, gesundheitlich unbedenklichen Medium zur Verfügung steht.

Eine weitere Massnahme zur Reduzierung enzymaktiver Metallionen sind Zusätze von Chelatbildnern in die Waschlösungen, wie des häufig verwendete EDTA (1–500 mM, in einer möglichst schwermetallfreien Spezifikation) oder das hier vorgeschlagene, speziell für die zusätzliche Komplexierung von zweiwertigen Metallionen (z. B. Zn, Ca aus Stabilisatoren) und Schwermetallen in kleiner Konzentration während aller Stufen der Verwendung des im Prozessbeutels für die Grad 1 DNA Herstellung obligat zugegebene EGTA (0,1 mM).

In anderen Ausführungen eines Reinraumprozessbeutels werden andere und neue Materialien gezielt eingesetzt, um den jeweiligen Anforderungen zu entsprechen. Ebenso ist denkbar, sollte sich eine > 5 jährige, bevorzugt > 10 jährige Lagerbarkeit langer DNA Moleküle in einem weichmacherfreien Folienmaterial demonstrieren lassen, dass der Prozess-/Lagerbeutel und die Zuführungsbeutel aus einem Material sein können.

Ähnliche Materialabwägungen werden für die Adaptoren, Zuführungsschläuche, ggf. Kleber, Kunststoffdruckfarben und für den Halterahmen/die Gelgiessform getroffen. Dabei kommen geprüfte Materialien für die Medizintechnik zum Einsatz, wobei je nach Anwendung spezielle Anforderungen an die Festigkeit, Transparenz, Hitzestabilität, Verklebbarkeit oder Verarbeitbarkeit (z. B. Spritzgussformen aus Polykarbonaten usw) gestellt werden, oder besonders für die Sterilitätserhaltung über lange Anwendungszeiten ausgelegte Ventilverschlüsse und Ports verwendet werden.

Durch den Einsatz eines Beutellabors können auf einfache Weise herkömmliche Verfahren, Puffer, und der Einsatz elektrophoretischer Reinigungsverfahren stark vereinfacht, Ausbeuten vervielfacht, Abfall minimiert, und wechselnde oder weiterentwickelte Materialparameter auf den Bedarf abgestimmt werden. Eine besondere Situation stellt die Pulsfeldreinigungselektrophorese im Beutel dar. Dabei ist die Besonderheit, dass nicht wie bisher das zu reinigende Material in ein Agarosegel eingebracht wird, das dann in eine spezielle Pulsfeldgelektrophoresekammer mit Pufferkühlanlage/Kreislauf eingebracht wird, sondern dass nur das zu reinigende Gelmaterial/die Trägermatrix in dem verschlossenen Beutel vorliegt und dort alle Schritte (unter Reinraumbedingungen) stattfinden (unter drastischer Einsparung von Agarose).

In den Beutel werden für die elektrochemischen Reinigungsschritte sterile Elektroden eingeschoben, wobei die Einschubzugänge längere schlauchförmige Aussackungen darstellen, die nach der Entnahme der Elektroden mit einer einfachen, thermo- und/oder zeitregulierten Handschweisszange wieder verschweisst werden können. Dabei wird unterhalb der Zersetzungstemperatur des Materials gearbeitet, um schädliche Reaktionsprodukte zu vermeiden. In einer Ausführung werden während des Strombetriebs die Elektrodenkanäle der schlauchartigen Beutelaussackungen, über die Elektroden mit flexiblen Elektrodenkabeln eingesteckt werden, schräg nach oben gewinkelt nach oben offen betrieben (10, Kanäle E1–4). Damit kann Gas der Elektrophorese aus dem Puffer nach aussen entweichen, während die zu reinigende Gelmatrix weiterhin im Prozessbeutel verweilt.

Alternativ werden die einsteckbaren Elektrodenmaterialien mit einem Adapter in den Beutel eingesteckt und damit fest verbunden (9). Dabei werden die Elektroden ausserhalb des Adapters an die Stromkabel angeschlossen (leitfähig verklebt, oder geschraubt, geklemmt) und mit einer Isolierschicht versehen (bevorzugt aufgeschrumpfter thermoplastischer Überzug, der sterilisierbar ist). Die Elektrodenstäbe werden entsprechend ihres Durchmessers bevorzugt im Steckaddapter gegen Pufferaustreten abgedichtet, so dass nur das Elektrodenmaterial selbst, und nicht die Kabel oder der Kabel- und Elektrodenanschluss den Puffer im Innenbereich berühren. Bei dieser Lösung mit gas- und pufferdichter Elektrodeneinsteckung wird ein zusätzlicher Pufferablauf/Gasablasskanal, der eine druckregulierende Wassersäule formt, so geöffnet, dass das nach oben strömende Gas und der nach oben abgeleitete Puffer (warm, verbraucht) nach oben abgeleitet wird, in dem die Öffnung über dem Beutelniveau angebracht wird. Dafür kann der Beutel speziell konzipiert werden, oder während der Elektrophorese schräg gelagert werden, so dass der Innenbereich durch Puffer aufgebläht ist, und der Ablaufkanal/Gasablasskanal den höchsten Punkt des Beutels darstellt, und der Kanal weiter nach oben abgeleitet wird, so dass der Pufferstand im Ablasskanal den Beuteldruck weiter erhöht, bevor der Puffer und das Gas am Ende des Kanals entweichen (6, 7).

Die Elektrodenmaterialien können je nach Anforderung an das Genlager variiert werden. So stellen beispielsweise kostengünstige Graphitelektroden für eine rückstandsarme Zersetzung der Elektrode in Gas, eine metallfreie Lösung mit möglicher Einmalverwendung der sterilen Elektrode dar. Allerdings besteht bei Graphit die Gefahr von Kohlenstoffabrieb beim Einsetzen/Einschieben. Da Graphitabriebpartikel biologisch inert sind (vgl. sauber applizierte Tatoo Farbe) und die Elutionskammer, die zur Gewinnug der freien DNA Moleküle mit einem Partikelfilter/Filtermembran bestückt wird (7, 8), wird keine nachteilige Wirkung durch den Einsatz von Graphit erwartet und damit ein kostengünstiges Einmalelektrodenmaterial mit gleichzeitiger Kostensenkung und Ausschaltung von Kontaminationsquellen eingesetzt. Die Verwendung von Graphitelektroden und hochreinen Graphitelektroden und Graphitkomposite frei von Verunreinigungen im Reinraumprozessbeutel ist Gegenstand der Erfindung.

Gegenstand der Erfindung des Verfahrens mit einem Prozessbeutel schliesst in der Ausführung der Grad 1 DNA Präparation und Anlegung von Genlagern für ein DNA Arzneimittel zur inneren Anwendung am Menschen den Einsatz von Glaskohlenstoffelektroden ein, die eine rückstandsfreie Reinigungselektrophorese ermöglichen. Glaskohlenstoff mit fullerenartigem Aufbau stellt ein extrem hartes, glattes, hitzebeständiges, autoklavierbares, und partikelfreies Material dar, das sich bei der Elektrolyse quasi rückstandsfrei in Gas auflöst. Damit können Platinabsonderungen und Absonderungen von anderen metallischen Platinverunreinigungen und elektrochemische Reaktionsprodukte an der Oberfläche herkömmlicher Elektroden in Pulsfeldelektrophoreseanlagen vermieden werden, die der Stabilität von gelagerten Biomolekülen entgegenwirken könnten. Damit ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Glaskohlenstoffelektroden und anderen Kohlenstoffmodifikationen im Reinraumprozessbeutel, die je nach Ausgangsmaterial für die spezielle Anwendung gefertigt werden können und eine sehr saubere Lösung zu allen verfügbaren elektrophoretischen Aufreinigungen darstellen.

Andere in der Erfindung miteingeschlossene Elektrodenmaterialien für die Verwendung im Prozessbeutel sind Kohlestäbe.

Ein weiteres, neues Elektrodenmaterial der Erfindung zur Verwendung als Elektrode in einem Reinraumprozessbeutel, entweder fest integriert/verschweisst, oder sekundär eingesetzt, stellt Kohlenstoff/Graphit/reiner Russ/nicht-metallische Einschlüsse in fein dispersierter, gebundener Form dar, wie er in elektrisch leitfähigen Kunststofffolien verwendet wird. Herstellungsverfahren (z. B. DE 695 25 902 T2) für ähnliche Folien sind bekannt für die Verwendung als antistatische Verpackung von elektronischen oder explosiven Materialien entwickelt, oder werden für die Stromversorgung kompakter elektronischer Geräte verwendet. Der Einsatz als Elektrodenmaterial für molekulare Aufschlüsse und elektrophoretische Reinigungsschritte oder Elektroelutionen in Reinraumprozessen ist nicht bekannt. Damit ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung elektrisch leitfähiger Kunststoffolien als Elektrodenmaterial in einem Reinraumprozessbeutel und die Verwendung anderer gemischter leitfähiger Elektrodenmaterialien im Prozessbeutel, z. B. Silikate, Keramik und Ligierungen oder auf die Innenseite des Prozessbeutels aufgebrachte leitfähige Schichten, Folien, Laminate, Lacke.

In anderen Ausführungen kommen je nach Anforderungen an die zu erwartende Verweildauer der Biomoleküle im Folgepuffer nach einer elektrophoretischen Reinigung oder nach der Elektroelution andere oder wechselnde Elektrodenmaterialien in Betracht.

So können wahlweise Platinelektroden, Graphitelektroden, Glaskohlenstoffelektroden, oder Kohlestäbe oder andere Elektrodenmaterialien zum Einsatz kommen, und die Elektroden für mehrfache Sterilisation/Verwendung vorgesehen sein oder als Einmalartikel.

In die Erfindung eingeschlossen sind sterilisierbare, elektrisch nicht leitende Ummantelungen der Elektrodenenden und angeschlossenen Elektrokabel, um ein Eintauchen der Kabel in den Betriebspuffer zu ermöglichen, wobei das zuführende Kabel in den Puffer eintauchen kann (Ausführung mit offenen Elektrodenkanälen). Demnach werden die Elektrodenenden und Kabel mit einer nichtleitfähigen Schicht/Lack/Folie (z. B. schrumpfende Eigenschaft) ummantelt. Die Verbindung von Kabel zu Elektrode ist bevorzugt reversibel und wird vor (also unterhalb) der isolierenden Ummantelung angebracht, gesteckt, geklemmt, geschraubt, oder leitfähig verklebt.

Darüberhinaus wird durch den Reinraumprozessbeutel eine gegenüber den bekannten Pulsfeldelektrophoreseverfahren und Elektrophoresekammersystemen mit Puffer-Kühlumwälzung eine neue, reinere Elektrophoresesituation erzeugt, die einen kontinuierlichen Zulauf aus einem Zulaufbeutel (etwa ein großvolumiger Polypropyleninfusionsbeutel (z. B. 3000 ml, 5000 ml), mit sterilisiertem, vorgekühlten (4°C) Elektrophoresepuffer (etwa ein Tris-Acetat-EDTA Puffer) und einem getrennten, kontinuierlichen Ablauf des erwärmten, gegebenenfalls nach oben steigenden, verbrauchten Puffers unter Überlaufdruck ermöglicht, wodurch eine übermässige Vermischung/Kreislaufsituation vermieden wird, und der Beutel unter mässigem Druck vollständig gefüllt wird und sich von selbst aufbläht. Im geblähten Zustand wird die notwendige räumliche Elektrodenanordnung gewährleistet. In verschiedenen Ausführungen werden die Elektroden entweder aussen fixiert und der Beutel entsprechend gelagert, oder sie werden in einer dem Einsteckschacht gegenüberliegenden Führung im Beutel verankert, oder sie werden z. B. in Führungsvorrichtungen am Siebrahmen der Trägermatrix eingesteckt.

Durch die Einwegrichtung des neu nachlaufenden Puffers werden die während der Reinigungselektrophorese in den Puffer transportierten Abfallmoleküle (E. coli Reste, Peptidreste aus Proteinase-Abbau, DNA und Restriktionsenzymabbauprodukte, Lagerpufferanteile, Rückstände aus den Vorstufen, Restseifen etc) nicht in einen Kühlkreislauf eingespeist, sondern werden zügig aus dem Beutel abgeschieden. Durch diese Massnahme wird die Belastung des Reinigungspuffers mit elektrophoretischen Reaktionsprodukten und mit herausgereinigten Biostoffen und Reinigungsrückständen gegenüber einer herkömmlichen, pulsfelgelektrophoretischen Isolierung stark reduziert, So werden elektrochemische Reaktionen zirkulierender Abfallstoffe an den Elektroden auf ein Minimum gesenkt. Ausserdem kann nach dem Endpunkt der Elektrophorese, bei der eine vollständige Reinigung des Gels stattgefunden hat, aber noch Abfallmoleküle im Puffer vorhanden sind, ein vollständiger Pufferwechsel vorgenommen und eine zweite Elektrophorese durchgeführt werden, wodurch restliche Abfallmoleküle wirksam entfernt werden (6, 7). Durch kühle Lagerung des Prozessbeutels und gekühltem Zulaufpuffer kann bei einer geeigneten, angelegten Spannung zwischen 1,5–9 V/cm auf eine zusätzliche Kühlung mit einem Pumpenkreislauf verzichtet werden, wodurch für den Prozess eine weitere erhebliche Kontaminationsquelle der herkömmlichen Laborverfahren ausgeschaltet wird. So fallen keine mehrfach zu verwendenden Elektrophoresekammern an, auf zusätzliche meterlange Schläuche, Kühlleitungen und Kühlaggregate mit Flüssigkeitsumlauf und auf Pumpen kann verzichtet werden, Pufferkammern/Toträume an Schlauchverbindungsstellen werden vermieden, eine aufwändige Sterilisation separater Elektrophoresekammern, mit zum Teil schwer zugänglichen Nischen und Toträumen wird komplett vermieden. Damit stellt der hier erfundene Reinraumprozessbeutel mit integriertem Elektrophoresevorrichtung und Elutionsbeutel und der zuschaltbaren Eluatkammer eine grundsätzlich neue, sprunghaft bessere Methode für den gesamten Prozess der Biomolekülisolierung, insbesondere der Isolierung von Grad 1 DNA Molekülen für den medizinischen und tiermedizinischen Einsatz dar. Darüberhinaus wird eine technische Vereinfachung erreicht, die selbst in Fällen, in denen Reinraumbedingungen nicht zwingend benötigt werden (Verfügbarkeit relevanter Mengen an hochqualitativen Genfragmenten für die Forschung), eine deutliche Kostensenkung bei drastischer Qualitätssteigerung gegenüber den herkömmlichen, offenen Systemen ermöglicht.

Während der pulsfeldelelektrophoretischen Reinigung im Beutel werden, anders als bei bekannten Pulsfeldelektrophoresen, die der Längenbestimmung langer DNA Fragmente dienen, keine analytischen Eigenschaften benötigt. Die angestrebten Laufweiten sind geringer (z. B. < 1 cm) als in herkömmlichen Pulsfeldgelanlagen, die zudem auch für eine gute Trennschärfe und Auflösung für 10 cm Laufweiten und mehr konzipiert wurden und z. B. durch computergesteuerte Regulierung der Spannung vieler (>> 4) Elektroden eine Laufausrichtung der Trennbahnen und ein gleichförmiges Analysebild gewährleisten (vgl die vorherrschende CHEF Technik, etwa im BioRad CHEF DR II, III etc.). Diese in einer analytischen Gelelektrophorese benötigten Eigenschaften werden in der Reinigungselektrophorese nicht benötigt. Hier kommt lediglich das Prinzip zum Einsatz, dass zirkuläre Moleküle mit einer Länge > 20 kb nicht in der Pulsfeldgelelektrophorese laufen, wenn sie ohne Einzel- und Doppelstrangbrüche mit plektonemischen Supercoils vorliegen. Geschädigte Moleküle oder linearisierte E. coli Genomfragmente verlassen hingegen die Gelmatrix und treten direkt in den Elektrophoresepuffer über. Dafür ist kein analytisches Gelbild notwendig, sondern lediglich eine Registrierung der Spannung, Stromstärke und Zeit des Stromflusses, um eine vollständige Reinigung zu gewährleisten. Es wurde herausgefunden, dass die Rückhaltung der intakten Moleküle gleichermassen bei verschiedenen Spannungswerten von 1,5–9 V im eingesetzten Reinigungspuffer stattfindet, sodass bei einer Ausführung der Erfindung der elektrophoretischen Reinigung im Prozessbeutel eine einfache, die Kühlung kontrollierende Temperaturregulierung über die Spannungszufuhr/Stromstärke zum Einsatz kommt. Damit kann einer übermässigen Wärmeentwicklung/Kühlung (z. B. gewünscht zwischen 8–20°C) entgegengewirkt werden, wobei in einer Ausführung die optimale Reinigungsbedingung (um 12°C) nur über die Widerstandsmessung und gekoppelte Spannungsregulierung ohne weitere Temperaturfühler erfolgt, indem bei im Verlauf auftretender zu hoher Widerstandserhöhung gegenüber dem Anfangswert eine Strompause oder Spannungsreduzierung geschaltet wird. Die umschaltenden Stromfelder mit einer Anordnung der kreuzversetzten Pole der parallel angeordneten Elektroden über und unter der Reinigungsmatrix lieben in einem Schaltwinkel zwischen 0 und 180° vor, bevorzugt 90–120°, und werden durch Einstecken von vier Elektroden (Minimum 3) in den Prozessbeutel sichergestellt.

Eine Ausführung der Elektrodeneinsteckkanäle sieht vor, dass für die Elektroelution weiter entfernt liegende, oder in einem weithalsig angeschlossenen weiteren Beutel (Elutionsbeutel) gelegene Elektroden der (netto) Pluspole zum Einsatz kommen, um das Eluat in eine dazwischen liegende Abfüllkammer (Transportschlauch, Eluatkammer) zu überführen. Diese ist auf einer Seite mit einer Elektroelutionsmembran/Dialysemembran verschlossenen, an der DNA Moleküle hängenbleiben. Auf der anderen Seite ist sie mit einem DNA durchlässigen Partikelfilter versehen, durch den die aus dem Gel eluierten DNA Moleküle durchtreten (vgl. die zum Stand der Technik bekannte Anordnung zweier Membranen bei Biometra/Schleicher-Schuell Elutionskammern im offenen System) und Trägermatrix/Agarosereste und gegebenenfalls materialabhängig anfallende Elektrodenpartikel aufgehalten werden. Zusätzliche Pufferbrücken werden ausserhalb des Bereichs in dem sich die eluierten Moleküle in Richtung Elutionsmembran/Verpackungsbehälter bewegen, dazugeschaltet, um elektroosmotische Effekte (pH, Pufferstandverschiebungen etc.) zu verhindern. Durch Abschweissen der Eluatkammer/des Transportschlauchs von dem Elutionsbeutel und dem Prozessbeutel hat der Reinraumprozessbeutel seinen Zweck erfüllt (7). Die herausgenommenen Elektroden werden gegebenenfalls gereinigt und wiederverwendet. Geeigneterweise werden die freien DNA Moleküle in der wässrigen Lösung, die den filtrierten Elutionspuffer ohne Zusätze darstellt, bei 0–4°C ohne Frieren gelagert, weil Grad 1 DNA > 20 kb beim Einfrieren in Grad 2 und Grad 3 Moleküle zerfällt. In anderen Ausführungen können der Eluatkammer/dem Transportröhrchen stabilisierende Zusätze zugefügt werden (zur Erhöhung der Viskosität, für die DNA Doppelhelixstabilisierung, z. B. 100 mM NaCl, oder mit komplexierenden Stoffen, oder mit Stoffen für die Vorbereitung einer Transfektionsmischung (vgl. Lipofectamin, Lipoplexe, Polyplexe etc) oder zur direkten Injektion in Organs, Zelloberflächen, Gefäße. Die Transportschläuche haben geeigneterweise eine lange, dünne Form, um eine hohe Konzentration des Eluats zu erhalten und um Scherkräfte bei Transporterschütterungen nicht in turbulante Strömungen umzuwandeln. Eine Ausführung des Transportschlauchs ist mit einem berührungsfreien Reiss/Öffnungsmechanismus zur sterilen Entnahme ausgestattet. in einer anderen Ausführung mit einem grosslumigen, seitlichen Schraubverschluss (8), oder mit verschiedenen Entnahmestellen, Sterilports, die an Kanülen/Infusionsbesteck angeschlossen werden, um einen Transfer in eine Transferlösung oder eine Injektion/Dosierung/Weitermischung zu ermöglichen. Ein Seitenport im Transportschlauch dient ebenfalls dem Potential/Pufferausgleich, indem eine nach oben offene Puffersäule nach oben gegen die Schwerkraft aufgebaut wird.

Die Transportschläuche sind geeigenterweise lichtgeschützte, lange, dünne Röhrchen, die ein Durchschweissen erlauben und durch ihre Form beim Transport und bei der Entnahme turbulenten Strömungen entgegenwirken, etwa wie ein auf beiden Seiten verschweisster Strohhalm (8). Durch den beidseitigen Schweissverschluss des Röhrchens, in dem sich das Eluat befindet, wird die kontaminationsfreie Verpackung gewährleistet. Vor dem Abschweissen des Behälters wird durch Umpolen der Stromrichtung das Eluat von der ausserhalb der Schweissnaht liegenden Dialysemembran gelöst und einige cm zurück in das Röhrchen bewegt (Zeitpuls), woraufhin der Schweissvorgang erfolgt. Dabei wird auf einer Seite die Membran entfernt und auf der anderen Seite der restliche Prozessbeutel abgetrennt, so dass nur noch der Transportschlauch vorliegt.

Mit der vorliegenden Erfindung des Prozessbeutelverfahrens kann für Nachschub identischen, funktionell charakterisierten DNA Materials höchster Qualität und für eine reibungslose Versorgung mit einem genomischen DNA Arzneimittel gesorgt werden. Damit stellt das Verfahren den notwendigen technologischen Entwicklungssprung für die klinische und tierklinische Entwicklung einer Gentherapie bis hin zur Deckung des Gesamtbedarfs eines Gentherapiekonstrukts dar.

Beschreibung einzelner Ausführungsmöglichkeiten und Laborprozesse

  • 1. Prozessbeutel zur Durchführung mehrstufiger Verfahren im geschlossenen System. Einbringen einer Biomasse in Form einer Trägermatrix, Aufreinigung von Biomolekülen, geschützte Lagerung der Biomoleküle während Prozessstufen, Gewinnung von Proben im geschlossenen System, Identifizierung der Funktionalität der gelagerten Biomoleküle anhand entnommener Proben, Abtrennen von Teilen eines Moleküllagers im geschlossenen System, Isolierung und Reinpräparation der steril gelagerten Biomoleküle, Abtrennen und Abfüllen der gewünschten Fraktion im geschlossenen System.
  • 2. In einem Prozessbeutel aufgereinigte Biomoleküle sind allgemein gefasst definierte Molekülspezies, Proteine, Antikörper, Gerinnungsfaktoren, Enzyme, Kohlehydrate, Proteinkomplexe, Enzymkomplexe, Faktoren, Stoffwechselprodukte, Strukturproteine (z. B. Kollagen) und Moleküle und Molekülkomplexe des Zellkerns, Erbmaterial, Chromosomen, Chromatinfraktionen, Gendomänen, Gene, Zentromere Telomere, DNA, RNA, genomische DNA, artifizielle DNA Konstrukte, lange DNA Moleküle, klonierte DNA Moleküle, modifizierte Nukleinsäuren, Moleküle aus Klonbanken, BACs, PACs, pTAT Klone und Banken, in E. coli klonierte DNA Moleküle und Produkte aus klonierten DNA Molekülen,
    und im engeren Sinne DNA Moleküle, lange DNA Moleküle (> 20 kb) in Grad 1 Qualität, d. h. keine Brüche in beiden Strängen der Doppelhelix in der Mehrheit der Moleküle einer Präparation, bevorzugt in > 50%, bevorzugt in > 90%, in > 95%, in > 99% der Gesamtzahl der Moleküle einer Präparation/eines Genlagers, physikalisch intakte DNA Konstrukte, physikalisch und funktionell intakte Konstrukte für künstliche Chromosomen, PACs, BACs, pTAT Klone in E. coli, intakte Genlager, gereinigte DNA Präparationen ohne E. coli DNA, intakte Präparationen in denen die Mehrzahl der Moleküle funktionell ist, d. h. enthaltene Gene oder chromosomale Elemente funktionieren in > 50% der gelagerten Moleküle, bevorzugt in > 70% der gelagerten Moleküle, bevorzugt in > 85% der gelagerten Moleküle, bevorzugt in > 90% der im Genlager vorhandenen Moleküle.
    – Gemäss des Verfahrens sind Biomoleküle insbesondere Reinformen einer im biologisch möglichen Rahmen der Molekülkonformität definierten Molekülspezies, die aus Material eines lebenden Systems stammt, aus einer eingebrachten Biomasse, tierische, pflanzliche, menschliche, mikroorganismale Massen und Flüssigkeiten, lebend oder tot, inclusive Umweltproben, Sedimente, Schlämme, mit dem Ziel der Herstellung in möglichst hoher Reinheit isoliert wird.
    – Insbesondere Reinformen einer definierten, kleinen Zahl von 1 oder 2 oder wenigen einzelnen wesensverwandten Biomolekülspezies (z. B. Gene, Kollagene) inclusive der mitunter vielfachen biologischen Varianten einer Biomolekülspezies (z. B. Genallele, Kopiezahlvarianten, Spleissvarianten, Kettenlängenvarianten, Kollagenformen etc.). Dabei ist der Vielfalt der zu isolierenden Moleküle (z. B. tausende medizinisch relevante Gensegmente, tausende medizinisch relevante Genprodukte, Proteine, Enzyme, Antikörper, Faktoren, Biomoleküle) praktisch keine Grenze gesetzt, vor allem in Form von Banken, die hunderttausende potentiell relevante Biomoleküle enthalten können.
    – Ausgenommen sind hergestellte Biomoleküle in Form ungereinigter Biomassen, grobe Sedimente, Zentrifugate und Zentrifugationsüberstände, Filtrate, Säulenfraktionen, bei denen keine weitere Isolierung oder deutliche Anreicherung einzelner bestimmter Molekülspezies. zu einer Molekülreinform im Vordergrund steht, vorbestehende, nur aufkonzentrierte Mischungen vieler Moleküle, einfache Zellaufschlüsse, Zellkulturen, einfache Zelllysate, Zellaufschlüsse oder Plasmafraktionen mit einer komplexen Molekülzusammensetzung (z. B. Plasmafraktionen der Transfusionsmedizin die diverse Gerinnungsfaktoren enthalten), Zellkulturen, Zellkulturen die Stammzellen enthalten, Zellfraktionen mit Stammzellen (Knochenmark, adulte Stammzellen), Blut und Blutprodukte, Blutzellen, die nicht bis zur Reinform einer Molekülspezies oder eng umschriebener Molekülgruppen aufgereinigt werden, oder Molekülanteile, die nicht mit dem Ziel einer wesentlichen Anreicherung zu einer Reinform prozessiert werden.
  • 3. Steriler Beutel/Container mit Vorkehrungen für eine Kaskade von biologischen, biochemischen, elektrochemischen, biophysikalischen, chemischen Inkubationen und Prozeduren im geschlossenen System zur Vermeidung von Kontaminationen bei der Durchführung komplexer Laborverfahren, für die sichere Lagerung von Molekülen, für das Anlegen von stabilen Genlagern, für das Lager langer DNA Moleküle aus Klonbanken, für die Lagerung von Klonbanken bei Raumtemperatur in einer funktionell charakterisierbaren Form, für die Charakterisierung eines sterilen Genlagers zur späteren Isolierung von Molekülen in Grad 1 Qualität, für die Bereitstellung qualitativ hochwertiger, reiner, funktioneller DNA Moleküle, für die Bereitstellung von Grad 1 DNA für die Anwendung am Menschen und/oder Tier, für die Herstellung künstlicher Chromosomen, für die Untersuchung von genomischen Genen und Genbanken und Gendosis/Wirkungsrelationen, für die Identifizierung von Krankheitsgenen/Schutzgenen in Genbanken, für das Anlegen funktionell charakterisierter Genlager für die Konstruktion künstlicher Chromosomen, für die Herstellung von künstlichen Chromosomen für die Gentherapie, für die Herstellung eines Arzneimittels aus einer aufgereinigten Biomolekülfraktion, für die Herstellung eines DNA-Arzneimittels, für den Gentransfer, für die Gentherapie.

Entscheidend ist der räumlich begrenzte und geschlossene Container und die damit erreichte Vereinfachung und kostengünstige Realisierung kontinuierlicher Reinraumbedingungen über den gesamten molekularen Prozess hinweg von der Einbringung einer Biomasse bis zur Abfüllung des gereinigten, charakterisierten Biomoleküls.

Ein geschlossenes Containersystem, das bevorzugt als Einmalartikel zum Einsatz kommt, Vorkehrungen für die unterschiedlichen Prozesstufen enthält und während des Prozesses das Containermaterial selbst das Verpackungsmaterial für Probenentnahme, die Lagerung, und die Verpackung des gewonnenen Produkts unter ”Verbrauch” des Containers darstellt. Der Beutel/Container kann so konzipiert sein, dass er während des Prozesses verbraucht, verkleinert, abgebaut, zerlegt, oder wieder erweitert wird. Es soll hier darauf hingewiesen werden, dass die Wandbeschaffenheit des Beutels/Containers nicht auf das bevorzugte, flexible, transparente ”Folien- und Beutelmaterial” beschränkt ist, sondern auch teilfeste oder feste Gehäusewandungen vorsehen kann und geschlossene Kammern/Zonen und Anschlussmöglichkeiten enthalten kann, in denen die verschiedenen Prozesse hintereinander durchgeführt werden können, so dass ein Prozessieren des Molekülaufschlusses im geschlossenen System erfolgt. Damit sind auch Verfahren zur Auskleidung fester Behälterwandungen mit einer dichten Folie oder Laminaten für einen Reinraumprozessbeutel Gegenstand der Erfindung.

Prozessbeutel

  • a) mit einem Zugang für das Einbringen einer Trägermatrix mit dem zu reinigenden Biomolekül in den Beutel und sterilen Verschluss unter Reinraumbedingungen durch reversibles Schliessen, Zuklemmen, Zuschrauben, Zudrücken, oder irreversibles Schliessen, Zukleben, Zuschweissen.
  • b) mit verschliessbaren/wiederöffenbaren Einsteckkanälen für Elektroden für Reinigungspulsfeldelektrophoresen, elektrophoretische Aufreinigung, Elektroelution
  • c) mit Elektrodeneinsteckkanälen und einer oder mehreren Pufferbrücken für die Elektroelution der gereinigten Biomoleküle von der Trägermatrix
  • d) mit Elektroelutionsvorrichtung und Eluatkammer für das Einschleusen/Abfüllen der gereinigten Moleküle in ein Transportröhrchen und geschlossenes Abschweissen der Eluatkammer oder des Transportröhrchens (Eluatkammer und Transportröhrchen können der gleiche oder verschiedene Beutelbereiche sein) mittels Durchschweissen.
  • e) mit Zugängen für die Elektrophorese, die ein Entweichen elektrophoretischer Gase und/oder einen gerichteten Pufferfluss gewährleisten und steril verschweissbar/wiederverschliessbar sind, alternativ mit verschliessbaren Elektrodeneinsteckadaptoren (verschraubbar, steckbar) und Ports für eine Gasablassöffnung gemeinsam mit Pufferauslauf (nach oben gelenkt, um Pufferstand/-druck zu regulieren).
  • f) mit mehrfachen steril wiederverschliessbaren Ports/Abläufen für die Zuführung und Ableitung von Inkubationspuffern, Enzymen, Elektrophoresepuffern, Pufferbrücken, Elektroden.
    Davon mindestens drei Ports am Prozessbeutel (für den gleichzeitigen Auslass von Elektrophoresepuffer und Gas, Anschluss einer Pufferbrücke zum Elutionsbeutel und Anschluss einer Eluatkammer und für andere Verwendungen der gleichen Ports zu anderen Zeiten) und drei Ports am Elutionsbeutel (für den gleichzeitigen Einlass von Elektrophoresepuffer, Anschluss einer Pufferbrücke zum Prozessbeutel und Anschluss der Eluatkammer) und mindestens drei Elektrodeneinsteckkanäle im Prozessbeutel (bevorzugt 4 oder mehr) und mindestens ein Elektrodeneinsteckkanal (bevorzugt 2 oder mehr) im Elutionsbeutel. Bei dieser Ausführung läuft der Elektrophoresepuffer vom Elutionsbeutelanteil über die Pufferbrücke und verlässt das System über den Prozessbeutel. Damit auch das Gas durch die Pufferbrücke in den Prozessbeutel gelangen und diesen über den Prozessbeutelauslass verlassen kann, wird der Elutionsbeutelanteil unten gelagert und der Prozessbeutel oben, wobei der Prozessbeutelauslass am oberen Pol des Prozessbeutels angebracht wird und der Elutionsbeuteleinlass am unteren Pol des Elutionsbeutels und der Port des Elutionsbeutels zur Pufferbrücke am oberen Pol des Elutionsbeutels angebracht wird.
    Während der pulsfeldelektrophoretischen Reinigung dient der Port des Prozessbeutels für die Pufferbrücke dem Einlass des Elektrophoresepuffers und während dem Einbringen der Gelmatrix in den internen Siebrahmen dient dieser Port (bevorzugt grosslumig) dem Gelgiessen.
    Ein weiterer Port im Transportschlauch/in der Eluatkammer wurde hier nicht berücksichtigt (vgl. 10)
  • g) mit Einlauf, bevorzugt unten (kalt) für Elektrophoresepuffer und bevorzugt Ablauf oben (warm), bei bevorzugt druckreguliertem Blähen des Beutels durch Puffervolumen und Regulierung der Ein-/Ablauf-Wassersäulendifferenz oder Blähen des Beutels durch Pumpendruck oder durch starre Stützen/Wandung, durch die Bauart (Setzen von Schweissnähten, Spannungen, Doppellagen)
  • h) mit Ablaufkanal/Port und Schlauch und wiederverschliessbarem Verschluss nach unten zur Entleerung des Inkubationspuffers, bevorzugt zur schnellen Entleerung durch Schwerkraft
  • i) mit Einlaufzugang/Zugängen für das Anstecken von Reinigungspufferkaskaden und den Zulauf von gekühltem Elektrophoresepuffer/Elutionspuffer
  • k) mit Zugängen für die gesonderte Applikation von Enzymen und Enzymlösungen, alternativ mit Mutifunktionszugängen/Ports
  • l) wahlweise das Anschliessen von Enzymdepots (z. B. Trockenkammern für Nukleasen, RNase, Lysozym, Proteinasen, Nukleasen) bevorzugt zur sterilen Anbringung nach der Dampfsterilisation des Beutels
  • m) mit Einsteckkanälen für Elektroden/Einmalelektroden, alternativ im Prozessbeutel integrierte Elektroden/Elektrodenfolie, angepasste Elektrodenmaterialien im Prozessbeutel
  • n) mit mindestens einem Ablasskanal/Schlauch nach oben für Gas/Elektrophoresepufferablauf
  • o) mit Halterungen, Fixierungen, Schweissnähten, Formzonen, Klemmzonen, Umschnürungen innerhalb oder ausserhalb des Beutels für die Platzierung der Trägermatrix im Prozessbeutel
  • p) mit Vorkehrungen zum Einsatz verschieden großer Füllmengen, z. B nur Befüllen einer vertieften Mulde, z. B. durch Lagerung des Beutels auf einer Fläche mit Mulde, damit in der Beutelmitte nur die Trägermatrix bedeckt ist, um mit kleinen Volumina zu inkubieren (z. B. 100 ml bei Genlager-Enzymreaktionen, oder 1 ml und weniger bei Miniaturbeuteln, oder 1 l und mehr bei größeren Ausführungen), oder Befüllen des Beutels unter Aufblähen (z. B. durch Schwerkraft gegen Ablaufwassersäulendruck), um große Puffervolumina zu erreichen (z. B. 3000 ml bei Genlager-Elektrophoresen, oder 30 ml und weniger bei Miniaturbeuteln, oder 30 l und mehr bei größeren Ausführungen).
  • 4. Einbringen und mehrstufiges Prozessieren der Moleküle innerhalb einer Trägermatrix in einem abgeschlossenen Prozessbeutel in dem die Biomasse in Form eines
    – Gels
    – Kolloids
    – Gelmatrix
    – Agarosegel
    – LMP Agarose (low melting point Agarose)
    – Bakterien in Gelmatrix
    – E. coli Klone in LMP Agarosematrix
    – BAC/PAC/pTAT-Klone in E. coli in LMP Agarosematrix
    – gebunden an eine Bindungsmatrix aus anderen Trägermaterialien
    – mit bestimmter Porengröße
    – mit bestimmter Oberfläche
    – -Silikate
    – -Schwamm, Flies
    – -Keramik
    – -Sieb
    – Lamellen, Flächen, Fäden, Netze
    – beschichteten Trägermaterialien mit
    – Antikörpern, Bindungsmolekülen
    – Rezeptorbindungsstellen, Rezeptoren
    – Nukleinsäuren, DNA Sequenzen
    – DNA bindenden Proteinen, Histonen, Materialien
    eingebracht wird.
  • 5. Einbringen einer Trägermatrix, die das zu reinigende Biomolekül enthält
    – durch einen wiederverschliessbaren Einfüllkanal, durch den die flüssige Gelmatrix vor dem Erstarren in ihre im Beutel befindliche Giessform eingebracht wird, durch Pipettieren, durch Befüllen eines Schlauchs, mit einem Trichter, über einen angeschlossenen Bakterien-Gel-Mischer
    – durch Einbringen des gegossenen Gels durch eine einseitig steril offenbare Beutelseite/Einschuböffnung.
  • 6. Einbringen einer Trägermatrix und Fixierung innerhalb der zurechtgeschnittenen, mit Schweissnähten (oder Wänden) räumlich begrenzten Beutelkammer durch
    – ”lose Fixierung” im Beutel in einem weiteren durchlässigen Kolloid/Gel, in einem durchlässigen, dreidimensionalen Netz, in einer dreidimensionalen Gewebestruktur
    – in einen durchlässigen Halterahmen (flexibler Siebrahmen)
    – in einen durchlässigen, formstabilen Halterahmen (z. B. Kunststoff-Siebrahmen)
    – in einem einteiligen oder mehrteiligen Spritzgusshalterahmen mit klappbarem Deckel
  • 7. In den Beutel einzubringender Rahmen/durchlässiger Containereinsatz, Siebhülle, Vorkehrung zur Befestigung der Trägermatrix in einer für Enzyme, Diffusion, und Strom durchlässigen Hohlform,
    a) einteilige geklappte (bevorzugt bei der Ausführung mit Gelgiessen im Prozessbeutel) oder zweiteilige Hohlform, Boden mit Seiten und Klappdeckel oder getrenntem Deckel (bevorzugt bei Ausführung mit Gelgiessen ausserhalb)
    b) durchlässige Hohlform/Rahmen mit Stützen, Rahmen mit ausklappbaren Stützen (Abstandshalter nach oben und nach unten) und
    c) Hohlform/Rahmen mit Vorrichtungen für das Fixieren/Einstecken von Elektroden, ausklappbare Elektrodenhalterungen
    d) Rahmen mit Abtrenn-/Knick-/Brechvorrichtung zur Entnahme von Teilen der Trägermatrix
    e) Rahmen mit einer herausnehmbaren Bodenfolie/Dichtung um während dem Giessen der Trägermatrix ein Auslaufen durch den Siebboden zu vermeiden (nachträglich Entfernen der Folie/Dichtung durch Herausziehen/Herausnehmen oder durch Auflösen über Tage im wässrigen, tensidhaltigen Milieu bei 37–55°C, bei der Ausführung mit einer Trägermatrix aus Low Melting Point Agarose, LMP-Agarose bis zu 55–60°C)
    f) Siebrahmen für die Stabilisierung der Trägermatrix bei gleichzeitiger Zugänglichkeit für Puffer, Enzyme, Reinigungslösungen, Waschpuffer, Elektrophoresepuffer, Elektroelutionspuffer, Strom, durchlässig für Makromoleküle, aus festem Kunststoff, aus reibungsarmem Kunststoff, aus Kunststoff mit geringer thermischer Verformung, mit geringer Spannung, mit Stosselastizität, bevorzugt innen geglättet, reibungsarme Innen- und Aussenflächen des Siebrahmens, bevorzugt transparent, bevorzugt als eine Spritz-Giessform hergestellt und zusammenklappbar, bevorzugt durch leichten Druck durch den verschweissten Beutel hindurch zusammensteckbar
    g) Siebbodenabmessungen nur geringfügig größer als die Trägermatrix.
    h) Einbringen von extern gegossenen Trägermatrices/Gelmatrices in die durchlässigen Siebrahmen
    i) alternativ direktes Einbringen der Gelmatrix ohne Rahmen und Versperrung durch begrenzte Beutelgröße, Schweissnahtverhältnisse für die interne Fixierung der Matrix im Zentrum des Prozessbeutels.
    k) alternativ direktes Einbringen der Gelmatrix in die im Prozessbeutel vorbestehende, sterilen Siebrahmen, bevorzugt einteilig klappbar, der Siebrahmendeckel ist nach Giessen der Gelmatrix im Beutel zu arretieren
    l) Siebrahmendeckel bei zweiteiliger Ausführung mit eindeutiger Orientierung steckbar, mehrere Knick-/Trennlinien jeweils beidseitig parallel von Stegen begrenzt, die nach Abbrechen die neue Seitenbegrenzung für die darin enthaltene Gelmatrix bilden und beim Zusammenklappen/Zusammenstecken von Deckel und Boden in das Gel eindringen und dabei das Gel einklemmen oder anschneiden/durchtrennen und in mehrere Kammerflächen unterteilen, oder eine Unterteilung vorbereiten.
    m) Bodensieb durch Folie abgedeckt, die eingelegt wurde, eingeklebt wurde, bevorzugt mit einem wasserlöslichen Kleber eingeklebt wurde, bevorzugt eine Dichtungsfolie aus wasserlösslichem Material
    n) Deckel/Bodenstege in jeder Unterkammer, damit kleine transportstabile, das Gel ummantelnde Abschnitte abgebrochen werden können (durch Abknicken). Knickzonen für verschieden große Abschnitte der Trägermatrix (für Zwischenanalysen, Analysen, als Verpackungsgröße, als Lagerabschnitte etc).
    o) Da die Abschnitte im Beutel auseinanderbewegt werden, und dann einzelne Abschnitte in einer Beutelecke/einem Beutelteil abgeschweisst werden, entstehen aus jedem Abschnitt geschlossene Verpackungsgrößen in Form eingeschweisster Minilagerbeutel (geschlossenes System).
    p) Die jeweiligen abzuschweissenden Beutelsektoren sind jeweils mit den laufenden Nummern/Barcodes bedruckt.
  • 8. Siebbodendichtungsfolie, sterilisierbare, wasserlösliche Folie, die für mindestens 1, bevorzugt 10, bevorzugt 20 Minuten den Boden des Siebrahmens abdichtet, damit die (ca. 37–40°C) warme Gelmatrix (bei Genlagern) eingegossen werden kann und das Gel bis zum Erstarren nach wenigen Minuten (bei ca < 25–30°C) nicht auslaufen kann. Danach beginnt die allmähliche Auflösung der Folie im wässrigen Milieu damit die Siebporen des Bodens für die nachgeschalteten Reinigungsprozeduren durchlässig sind
    – oder herausziehbare Folie mit von aussen greifbarer Lasche (unlöslich)
  • 9. Geschlossen ansteckbare Zuführungsbeutel
    – Zuführungsbeutel mit an den Prozessbeutel passenden Ports für die sterile Aufbewahrung und Applikation von Reinigungslösungen, Puffern, Waschlösungen, für mikrobiologische, biochemische, molekulargenetische Inkubationen, Reaktionen, Reinigungskaskaden durch Diffusion, Reinigungszyklen durch Elektrophorese.
    – Zuführungsbeutel mit bevorzugt multiplen Kammern mit Lösungen, Puffern.
    – Unterteilung der Kammern durch Klemmen oder bevorzugt durch Anbringen einer Peelnaht nach Befüllen mittels Durchschweissen
  • 10. Verfahren für die Befüllung mutipler Kammern mittels Durchschweissen
    Befüllung des Zuführungsbeutels durch Füllen über einen Port in einen Einkammerbeutel, bevorzugt ein langer Schlauchbeutel, und nachträgliches Setzen der Peelnähte, um mutiple Kammern mit gleichem Inhalt zu erzeugen, Diese sind dann einzeln nach und nach durch Eröffnen der Peelnähte über den an einer Seite angebrachten Auslaufport zu entleeren, wodurch die Waschlösungen/Elektrophoreselösungen schrittweise dem Prozessbeutel zugeführt werden.
    – Unterteilung multipler Kammern mit einer wässrigen Lösung durch Durchschweissen nach dem Befüllen.
    – Unterteilung der Zuführungsbeutel in multiple Kammern für die Prozesskontrolle und Dokumentation durch Sichtbarkeit bereits geleerter Kammern (Inkubationsstufen).
    – Verfahren zur Unterteilung durch Anbringen von Peelnähten nach einer lockeren Befüllung, indem durch Verdrängung der wässrigen Füllung und Durchschweissen einer geeigneten Folie eine Peelnaht durch den befüllten Beutel geschweisst wird,
    – bevorzugt durch Verdrängen der wässrigen Lösung auf einem hohen Steg, durch den die Füllung im Schweissbereich nach links und rechts abläuft, wobei durch die Verteifung und den Abstand der Stege eine Dosierung in die Kammern erfolgt
    – bevorzugt durch moderates Vorwärmen der Schweisszone zum weitestgehenden Trocknen vor dem Durchschweissen der Peelnaht.
    – Wahlweise, Zuführungsbeutel mit multiplen Kammern ohne Trockendepots mit einem Y Port oder anderen geeigneten Anschlüssen/Zugängen, für das nachträgliche Zuführen/Applizieren von Enzymen zur Waschlösung/Pufferlösung im geschlossenen System.
  • 11. Zuführungsbeutel mit multiplen Kammern mit Waschlösungen/Puffern, Anbringen von Trockendepots (in geeigneter Folie, ggf überklebt) mit lyophilisierten Enzymen, Reinigungssubstanzen, Pulvern nach dem Autoklavieren der Inkubationspuffer, die bevorzugt in der Reinigungskaskade einen festen Platz einnehmen und ”automatisch” durch Öffnen der Peelnähte der nachfolgenden Kammern eingespült und gelöst werden (Prozesskontrolle, erfolgte Inkubation, Stoffapplikation auch ohne weitere Dokumentation sofort sichtbar, überprüfbar).
  • 12. Prozessbeutel mit Blindbeutelkammern für die geschlossene Probenentnahme durch Abschweissen/Abtrennen.
    Aussackungen/Ecken im Prozessbeutel dienen der Aufnahme Von Abschnitten der Trägermatrix. Dazu wird die Trägermatrix/das Gel des Genlagers in einem Halterahmen entlang vorgesehener Bruchlinien abgeknickt, Alternativ wird ein Gelfragment durch Druck mit einer Kante von aussen durch den Beutel abgequetscht. Das Puffervolumen wird abgelassen und der Abschnitt wird im Beutel bewegt, bis er in einer mit Barcodes/Nummern etc. bedruckten Beutelecke/Kammer zu liegen kommt. Der Beutelabschnitt wird mit einer regulierten Hand- oder Tischschweisszange abgeschweisst (z. B. halbautomatische thermoplastische Tischschweissgeräte mit Doppelschweissnaht und Trennmesser). Dabei wird durch kleine wässrige Pufferreste zwischen den Beutellagen hindurchgeschweisst. Die Menge an Puffer/Feuchtigkeit wird für das Setzen der Schweissnaht im Bereich der Naht reduziert, indem der Beutel (rechts) und der Abschnitt (links) über einer Kante gelagert werden, Restpuffer damit beidseits aus dem Bereich der Schweissnaht abläuft, und gegebenenfalls durch mässiges Vorheizen der Schweissnahtstelle eine weitgehende Trocknung der Innenflächen erfolgt, bevor die Schweissnaht/Trennung durchgeführt wird.
    Für sukzessive Probenentnahmen und für die wiederholte Bereitstellung von Teilen des Genlagers sind mehrere Blindbeutelkammern vorgesehen, die bei Bedarf komplett oder nach und nach abgeschweisst werden. Die Gelabschnitte befinden sich ohne äusseren Kontakt im abgeschweissten Beutelstück, das problemlos verschickt und weitergelagert werden kann, um an einem anderen Ort Analysen durchzuführen, oder nach öffnen die enthaltene DNA Reinigungsstufe einem Zweck zuzuführen (Verwendung in einem anderen Labor, Material für die Forschung, Beurteilung der Funktion und Qualität, Weiterverarbeitung zu einem Gentransfermedikament, DNA Impfstoff etc).
    Wird die Probe im Lagerzustand vor der Aufreinigung zu Grad 1 DNA entnommen, steht das im Genlagerbeutel verbliebene Gel weiterhin für die spätere Aufreinigung zur Grad 1 DNA zur Verfügung.
    Eine Probe kann zu jedem Zeitpunkt entnommen werden, um Qualitätstests durchzuführen, kann aber auch in Form einer zu Grad 1 DNA aufgereinigten DNA innerhalb des Agarosegels (d. h. rein, gut lagerbar, unempfindlich für Scherkräfte) abgeschnitten werden, womit große Mengen charakterisierter Genabschnitte (z. B. 20–400 kb (und längere) Molekülpräparationen von BACs/PACs, pTAT Vektoren (pTAT, pTAT-BS, pTT, pTTE1 und Derivate), künstliche Chromosomen, Klone von Banken für funktionelle Analysen für die Untersuchung von Genwirkungen, Krankheitsgene, Schutzgene, für die verschiedensten Anwendungen verfügbar und nachlieferbar werden.
    Ein großer Teil der gelagerten, funktionell charakterisierten DNA wird somit bereits auf dieser leicht transportierbaren und weiterlagerbaren Stufe bereitgestellt, die so auch direkt in Klonierungen, Konstruktionen als intaktes Genmaterial innerhalb der Agarosegelmatrix in biochemische Reaktionen eingesetzt werden kann. Des so gewonnene, qualitativ und funktionell herausragende DNA Material dient allen Bereichen der Biotechnologie (Pflanzengene, Tiergene, Menschengene) und ermöglicht damit den breiten Einsatz von Genmaterial auf einer neuen technologischen Stufe (funktionell charakterisiertes Genlager in Grad 1 Qualität als zuverlässiges Baumaterial für künstliche Chromosomen). Für eine direkte medizinische oder tiermedizinische Anwendung, oder eine Weiterverarbeitung zum DNA-Arzneimittel, wird die DNA weiter im geschlossenen System aus dem Grad 1 DNA Lager (Agarosegelmatrix) eluiert und in Form einer wässrigen DNA Lösung bereitgestellt. Die Erfindung steht Ausführungen vor, bei denen die wässrige DNA Lösung noch im Prozessbeutel durch weitere Zuschaltung von Inkbationslösungen im geschlossenen System zu einer Applikationsform (etwa Komplexierung mit Trägersubstanzen, Einkapselung, Mischung mit Transferagentien, etc) weiterverarbeitet wird (zum Beispiel durch Überführung in eine angeschlossene Kammer aus der Eluatkammer oder aus dem Transportschlauch (vgl. 7, 8, 10).
  • 13. Elutionsbeutel mit Eluatkammer/Transportschlauch
    mit Dialysemembran, Filtereinsätzen, Elektrodeneinsteckkanälen oder integrierten Elektroden, eingeschweissten Elektroden, elektrisch leitfähigen Folienelektroden, Zulauf für Elektrophoresepuffer (unten), Ablauf Elektrophoresepuffer und Gasablass (oben), bevorzugt unter Fülldruck durch angehobenes Einlaufpufferniveau (z. B. durch einen gegenüber dem Ablaufniveau angehobenen Zulauftropf mit Elektroelutionspuffer unter Schwerkraft).
    Gewinnung des Elektroeluats durch Aufhalten der DNA an einer Dialysemembran am linken Ende eines dünnen Transportschlauchs, Filtrierung des Eluats an einer DNA druchlässigen Membran am rechten Ende des Transportschlauchs (Rückhalten von Makrokomplexen, ggf. Elektrodenpartikel, ggf. Kunststoffpartikel des Siebrahmens, ggf. Agarosestückchen aus dem angeschlossenen Prozessbeutel mit dem Grad 1 DNA Genlager). Für die Elektrodenanordnung werden links vom Transportschlauch in einen Pufferbeutel, der über mindestens eine weitere, offene Pufferbrücke mit dem Prozessbeutel in Verbindung steht, die netto Pluspole eingesteckt. Die Elutionskammer besteht damit aus zwei Beuteln mit Verbindungen/Pufferbrücken, wobei eine Verbindung das Transportröhrchen darstellt, mindestens eine weitere Verbindung eine bevorzugt großlumige Pufferbrücke ist, und die Beutel einen oder mehrere nach oben offene Kanäle für den Pufferablauf/Pufferüberlauf/Gasablass haben.
    Die aus dem Genlager überführten Moleküle werden durch kurzes Umpolen von der Dialysemembran abgelöst und pipettierfrei in den Transportschlauch zurückgeführt (Zeit/Strom gesteuert). Der bevorzugt dünne, lange, strömungsarme Transportschlauch mit einem Seitenport für eine sterile Entnahme am Applikationsort (und wahlweise für den Ausgleich elektroosmotischer Druck/Pufferverschiebungen im Transportschlauch während dem Betrieb als Elutionskammer mittels nach oben aufgesetztem Ausgleichsschlauch) wird an beiden Enden von den Filtern/Membranen und anhängenden Beuteln (links Elutionsbeutel, rechts Prozessbeutel) durch Durchschweissen durch die wässrige Lösung abgetrennt und damit im geschlossenen System gewonnen. Die aus den Grad 1 Genlagern gewonnenen, langen DNA Moleküle in der wässrigen Lösung werden in den strömungsarmen Transportschläuchen bei 4°C gelagert und zeitnah eingesetzt (Tage bis Wochen).
    Für den Elutionsvorgang der Grad 1 DNA Moleküle aus der Gelmatrtix und Überführung in einen Transportschlauch wird eine Kombination aus dem Prozessbeutel mit einseitig gesteckten Elektroden, einer durch Membranen getrennten Elutionskammer, und einem Elutionsbeutel mit Elektroden eingesetzt. Prozessbeutel und Elutionsbeutel sind über mindestens eine weitere Pufferbrücke miteinander verbunden.
    Prozessbeutel aus thermoschweissbaren, langzeitstabilen Folienmaterialien, gekennzeichnet durch Elektrodeneinsteckkanäle und Puffer/Gasablasskanäle und Anschlüsse für einen Transportschlauch und weitere Pufferbrücken (bevorzugt grosslumig). Elutionsbeutel aus thermoschweissbaren Folienmaterialien (weichmacherfrei) gekennzeichnet durch Elektrodeneinsteckkanäle und Puffer/Gasablasskanäle (oder gemeinsamen Ablasskanal mit Prozessbeutel), Anschlüsse für einen Transportschlauch/Eluatkammer und für weitere Pufferbrücken (bevorzugt grosslumig).
  • 14. Elektrodenmaterialien für einen Prozessbeutel
    – Kohlenstoffmodifikationen für die rückstandsfreie Zersetzung der Elektrode in Gas
    – Glaskohlenstoff
    – fullerenartiger Glaskohlenstoff
    – Graphit (natürlich, künstlich)
    – Graphitkomposite
    – Kohlenstoff
    – Kohlestäbe
    – Kohlenstoffkomposite (reiner, gebundener Kohlenstoffruss in einem Material)
    – elektrisch leitfähige Folien
    – elektrisch leitfähige Lacke, Folienschichten, Kleber, Keramik
    – Platin, Platinkomposite, Ligierungen für die Verwendung im Prozessbeutel
    – fest in die Beutelwand integrierte Kabel und Elektrodenmaterialien, leitfähige Folienschichten, leitfähige Lacke, leotfähige Klebemittel, aufgedampftes Metall/Platin, Mischmaterialien auf Folie, Ligierungen, Glaskohlenstoff, Graphit, Kohle, Kohlestaub, reiner Kohlenstoffruss in Form von Mischmaterialien, Keramik, Folienkomposite, Laminate mit leitfähigen Bahnen oder Schichten
  • 15. Anbringen von Elektrodenadaptoren und Kabel an die Prozessbeutelelektroden
    Für die Ausführung mit dicht verschlossenen Elektrodeneinsteckkanälen werden die sterilen Elektroden vor dem Füllen des Prozessbeutels mit Elektrodenpuffer in die vier (mindestens zwei, in anderen Ausführungen mehr als vier) Elektrodenzugänge gesteckt/geschraubt, verriegelt.
    Dicht verschliessbare Elektrodeneinsteck/Schraubadaptoren aus hartem, sterilisierbaren Material, bevorzugt aus thermoplastisch auf das Elektrodenmaterial, auf den Elektrodenstab aufsteckbare, aufformbare Kunststoffhülse, bevorzugt verklebbar, bevorzugt mit einer Dichtung versehen, bevorzugt mit hoher Bruchfestigkeit und Zähigkeit, bevorzugt mit einer hohen Steifigkeit, bevorzugt mit einer hohen Wärmeformstabilität, Sterilisierbarkeit, bevorzugt splitter- und partikelfrei brechend, bevorzugt dampfsterilisierbar, bevorzugt transparent, bevorzugt mit Graphit, mit Glaskohlenstoff, mit Platindraht verklebbar, abdichtbar, aufformbar, bevorzugt mit eingepasster Elektrode sterilisierbar, Lumen und innere Elektrodendichtung bevorzugt für verschiedene Elektrodendurchmesser anpassbar, (z. B. 1 mm, 3 mm, 4 mm oder großer je nach Ausführungsgröße des Prozessbeutels). In einer Ausführung ragt das Elektrodenmaterial (z. B. ein Elektrodenstab mit 30 cm Länge und einem Durchmesser von 3 mm) auf der Aussenseite des Elektroden-Beuteladapters ein paar cm heraus, um einen Stromkabelstecker auf die Elektrode aufzustecken. Dabei schliesst der Kabelstecker zusammen mit dem Adapter und einer Dichtung die Elektrode trocken und dicht ein, bevorzugt mit einem ”klick” oder fest verschraubt, so dass keine Flüssigkeit von aussen zwischen Adapter und Stecker (z. B. Kondeswasser durch die Kühlung, oder Abfallpuffer etc) eindringen kann. In einer Ausführung, z. B. mit wiederverwendbaren, autoklavierbaren Glaskohlenstoffelektroden werden die Elektroden, sobald sie an Durchmesser verloren haben, innerhalb der Adapterdichtung steckend nachgeschoben, so dass der Duchmesserverlust ausgeglichen werden kann, und einem Undichtwerden des Adapters entgegengewirkt wird. Dafür muss der einzuschiebende Bereich der Aussenseite der Elektrode steril bleiben, was bevorzugt durch breite Dichtringe oder äussere Ummantelung erreicht werden kann, oder durch ein Schraubgewinde (extern oder Elektrode selbst) millimetergenau durchgeführt werden kann.
  • 16. Herstellen und Verwenden Von Prozessbeuteln für die Herstellung von Biomolekülen
  • 17. Herstellen und Verwenden von Prozessbeuteln für das Anlegen von Genlagern
  • 18. Herstellen und Verwenden von Prozessbeuteln für die Aufreinigung von Grad 1 DNA
  • 19. Herstellen und Verwenden von Prozessbeuteln zur Durchführung einer elektrophoretischen Reinigung
  • 20. Herstellen und Verwenden von Prozessbeuteln für die Durchführung einer pulsfeldgelelektrischen Reinigung
  • 21. Herstellen und Verwenden von Prozessbeuteln für die Durchführung einer Elektroelution
  • 22. Herstellen und Verwenden von Prozessbeuteln für die Lagerung gereinigter Biomoleküle/Genlager/Grad 1 DNA
  • 23. Herstellen und Verwenden von Prozessbeuteln für die Gewinnung des Produkts durch Abschweissen im geschlossenen System (Durchschweissen)
  • 24. Durchschweissen in Verbindung mit Reinraumprozessbeuteln für die Verpackung, Lagerung, und den Transport haltbaren Materials im geschlossenen System
  • 25. Im geschlossenen System aus einem Prozessbeutel in eine Elektroelutionskammer befüllte und geschlossen abgetrennte, abgeschweisste, abgeklemmte, abgeschraubte etc. Transportröhrchen/Eluatkammern und ihre Herstellung und Verwendung
  • 26. Herstellung und Verwendung langer, schlauchförmiger Transportbehälter aus Folie, die aus einem geschlossenen Prozessbeutelsystem befüllt und durch Durchschweissen/Abschweissen gewonnen werden.
    – Abgeschweisste Transportröhrchen mit einem geringen Durchmesser und großer Länge (ähnlich einem Strohhalm) um turbulente Strömungen während Transporterschütterungen zu minimieren.
    – Pseudomehrkammriges Transportröchrchen mit teilschliessenden Zwsichenwänden, Folienlagen, um Strömungen und Schwerkräfte beim Transport zu minimieren.
    – Transportschlauch mit einem
    – Pseudogel, Netz, Vlies, Kolloid um wässrige DNA Lösungen bis zu großen Volumina schüttelfrei (unter Vermeidung von Scherkräften und turbulenten Strömungen) aufzunehmen.
  • 27. Durchschweissen, Durchsiegeln durch eine wässrige Lösung in einem mässig befüllten Kunststoffbeutel als neues Verfahren zur Trennung, Absonderung, Unterteilung, Abtrennen durch Schweissnähte und Schneiden, vorübergehende Unterteilung mit Peelnähten, Isolierung von Anteilen unter Reinraumbedingungen mit
    – thermoplastischen
    – Heizelement-
    – Vibrations-
    – Hochfrequenz-
    – Ultraschall-
    – Laser-
    – Infrarot-
    – Verfahrenskombinationen und anderen Schweissverfahren.
  • 28. Anwendung von Prozessbeuteln im Genbereich (genomische Genklone, BACs/PACs, pTAT Vektoren für künstliche Chromosomen) für die
    – Erforschung funktioneller Genabschnitte (Screening, Krankheitsgene, Schutzgene, Gentherapiegene, Impfstoffe auf der Basis genomischer Konstrukte und künstlicher Chromosomen)
    – Anwendung multipler Gene auf künstlichen Chromosomen
    – Konstruktion künstlicher Chromsomen
    – Herstellung arzneimitteltauglicher Grad 1 DNA
    – für die Herstellung eines zuverrlässigen Ausgangsmaterials für die Gentransferforschung
    – tierklinische und klinische Studien (Genwirkung, Gendosiswirkungstests, Gentransfer, Gentherapie)
    – Weiterverarbeitung/Mischung/Komplexierung des Materials für DNA/Genmedikament-Applikationen im Prozessbeutel
    – Weiterverarbeitung/Mischung/Komplexierung des Materials für DNA/Genmedikament-Applikationen der Grad 1 DNA aus einem Prozessbeutel
    – Weiterverarbeitung/Mischung/Komplexierung des Materials für DNA/Genmedikament-Applikationen der Grad 1 DNA aus einem abgeschweissten Transportröhrchen
    – Vertrieb gelagerter, charakterisierter DNA an Anwenderlaboratorien
    – Vertrieb von Leerbeutel-kits und Geräten für das disseminierte Anlegen von Genlagern und Herstellung von Grad 1 DNA für die Genomforschung, breite Versorgung vieler Forschungsstätten und medizinischen Zentren mit der neuen DNA Qualität und Technologie
    – kostengünstige Langzeitlagerung von langem DNA Material aus Genbanken, Banken mit künstlichen Chromosomen
    – Rückklonierung der isolierten DNA Moleküle (z. B. BACs, PACs, pTAT Vektoren in E. coli) aus einer kleinen Probe eines charakterisierten Genlagers mit funktioneller Zusammensetzung, z. B. 1 Jahr, 5 Jahre, bevorzugt bis nach > 10 Jahren Lagerung eines Genlagerbeutels bei Raumtemperatur
    – Weiterklonierung eines DNA Konstrukts aus einer kleinen Probe eines charakterisierten Genlagers mit funktioneller Zusammensetzung, um eine weitere DNA Komponente aus einem anderen Genlager (z. B. weiteres Gen, Gengrenze, Replikator, Genvariante, Fragment zur Ergänzung eines Genlocus, Zentromer) anzufügen und daraus die nächste gelagerte Konstruktstufe zu erzeugen (z. B. ein künstliches Chromosom mit multiplen Genabschnitten für die Erzeugung multitransgener Tiere für die Xenotransplantation)
    – Zusammenführen von Komponenten aus verschiedenen Genlagern mittels biochemischer Methoden, die durch Grad 1 DNA möglich werden (in gel site specific recombination, very long PCR) zu einem Konstrukt
    – Transfer langer intakter DNA
  • 29. Anwendung von Grad 1 DNA aus einem Prozessbeutel
  • 30. Verschicken/Vertreiben von Grad 1 DNA aus einem Prozessbeutel
  • 31. Verschicken/Vertreiben von Grad 1 DNA in lagerbarer Form in einem Prozessbeutelabschnitt
  • 32. Durchführen sehr langer PCR (very long PCR) Reaktionen mit Template DNA (in Form von Grad 1 innerhalb der Agarosegelmatrix) aus einem Prozessbeutel oder einem verschickten Prozessbeutelabschnitt.
  • 33. IGSSR Reaktionen aus DNA Material zweier Komponenten, von denen mindestens eine Komponente aus einem Prozessbeutel stammt, und in Form von Grad 1 DNA innerhalb der Agarosegelmatrix eingesetzt wird, um quantitativ ohne weitere Klonierung lange DNA Moleküle aus charakterisierten funktionellen Komponenten zu erzeugen.
  • 34. Prozessbeutel für die funktionelle Erschliessung genomischer Banken, für die Lagerung testfähigen DNA Materials aus Banken, und für die kostengünstige Lagerung einer genomischen Bank und Sicherheitskopien (ohne Kühlenergie).
  • 35. Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung und quantitativen Reindarstellung spezifischer Biomoleküle und entsprechnde Beutelausführungen, inklusive Großkammerbeutel, miniaturisierte Beutelausführungen, serielle oder parallele Multibeutelanordnungen, Beutelanordnungen innerhalb fester Gehäuse.
  • 36. Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die chemische und biochemische Analytik oder für die Synthese von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen.
  • 37. Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die medizinische und tiermedizinische Identifizierung, Charakterisierung, Gewinnung, Messung von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen.
  • 38. Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die Untersuchung von Umweltproben und entsprechende Beutelausführungen.
  • 39. Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die biotechnologische Analytik, Identifizierung, Charakterisierung, Gewinnung, Messung von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen.
  • 40. Durchführung komplexer, vielschrittiger Laborprozesse innerhalb eines Reinraumprozessbeutels mit dem Ziel der Aufreinigung, Dokumentation und wiederholten Probenentnahme von Biomolekülen unter Reinraumbedingungen für die ärztliche und tierärztliche Diagnostik, Identifizierung, Charakterisierung, Gewinnung, Messung von Biomolekülen und entsprechende Beutelausführungen.
  • 41. Herstellung, Bereitstellung, Vertrieb von Durchschweissgeräten (Einzelgeräte oder Kombinationsgeräte und Anlagen) für Prozessbeutelzwecke zum
    – Peelnahtdurchschweissen (Zulaufkaskaden mit wässrigen Lösungen)
  • 42. Herstellung, Bereitstellung, Vertrieb von Durchschweissgeräten für Prozessbeutelzwecke in Verbindung mit Prozessbeutel Kits zum
    – Probenentnahme Abschweissen
    – Peelnahtdurchschweissen (Transportschlauch Abschweissen)
    – wahlweise mit Drucker (Barcodes)
    – als Kombigeräte
  • 43. Herstellung, Bereitstellung, Vertrieb von Spannungsgeräten und Pulsfeldspannungsgeräten, die bei einer Prüfspannung den Widerstand der Elektrophoresekammer über die Elektroden messen, und bei zu großem oder plötzlichem Anstieg gegenüber dem Anfangswert eine Reduzierung der Spannung oder eine Strompause schalten, oder bei allmählichem Widerstandsabfall eine Spannungserhöhung schalten, um eine einfache Temperaturregulierung im Prozessbeutel zu Erreichen.
    – die als Sicherheitsausrüstung bei starken Schwankungen durch schadhaftes Elektrodenmaterial/Steckverbindungen, oder Leckage, die Stromzufuhr terminieren und ein Warnsignal geben.
    – Spannungsgeräte, die den Stromfluss aufzeichnen, um eine Dokumentation zu ermöglichen
    – Spannungsgeräte, die einfach wahlweise im Pulsfeldelektrophoresemodus, Elutionsmodus und im Umpolmodus (Kurzimpuls mit Quittungston) betrieben werden können.

Beschreibung der Figuren

4 Schema Siebrahmen für ein LMP-Agarosegel (bei Ausführung mit Siebrahmen).

  • A Siebrahmen mit Boden und Deckel aus fomstabilem Kunststoff und adichtender Bodenfolie (z. B. mit Stärke oder wasserlöslichem Kleber aufgebrachte Folie aus wasserlöslichem Polymer, z. B. Polyvinylalkohol). Gegen Verrutschen und Undichtigkeit ist die Folie eingepasst und mit dem Siebboden verbunden.
  • B Der Siebrahmen wird mit geschmolzener Gelmatrix befüllt. Bis zum Erstarren des Gels und Aushärten dichtet die Folie den Boden gegen auslaufen ab. Anschliessend wird die Folie entfernt, bevorzugt in dem sie sich im Laufe des nächsten Tages bei 37°C im wässrigen, tensidhaltigen Inkubationspuffer auflöst, oder sie wird innerhalb eines Tages für Inkubationspuffer durchlässig und löst sich darin innerhalb mehrerer Tage bei z. B. 55°C vollständig auf.
  • C Durch Zuklappen des Siebdeckels und Einrasten befindet sich das Agarosegel geschützt innerhalb des flachen Siebrahmens. Durch die zahlreichen Siebporen können Reinigungssubstanzen eindringen, frei in das Gel diffundieren und abtropfen. Ebenso kann ein Elektrophoresepuffer eindringen und Luft/Gasblasen entweichen, so dass ein elektrisches Feld ungehindert im Gel wirken kann. Durch Sollbruchlinien, die an unterteilenden Stegen entlang im Rahmen verlaufen, können kleine Teile des Gels durch Knicken abgebrochen werden. Die geschützten Gelstücke können vom Genlager wegbewegt werden. Das große Agarosegel des Genlagers befindet sich weiterhin geschützt in dem verbeleibenden Siebrahmen. Das Material des Siebrahmens hat bevorzugt ein größeres spezifisches Gewicht als Wasser, damit das Gel in wässrigen Puffern untertaucht.

2 Schema Befüllen des Siebrahmens bei entsprechender Ausführung.

  • A Bei der Ausführung mit dem im Prozessbeutel bereits steril verpackten, noch nicht zugeriegelten Siebrahmen dient ein weitlumiger Port der direkten Einbringung des geschmolzenen Agarosegels.
    Dabei wird das geschmolzene Gel entweder von Hand pipettiert, oder von einem Bakterien-Agarose-Misch- und Dosiergerät mit einem geeigneten Einfüllstutzen abgefüllt.
  • B Bei der Ausführung mit externer Giessform wird diese nach dem Befüllen und Aushärten durch eine unverschlossene Seite des Prozessbeutels eingebracht. Die Beutelseite wird anschliessend durch eine Thermoschweissnaht verschlossen.

3 Schema Reinigungsverfahren durch Inkubation mit Pufferkaskaden

Das im Beutel eingeschlossene Gel wird einer vielschrittigen Behandlung mit Reinigungspuffern etc ausgesetzt. Dabei kommen pro Inkubationsschritt ausreichende Puffermengen zum Einsatz, die das Gel gerade bedecken (Teilfüllung, gegebenenfalls durch Schaffen einer Beutelmulde durch eine äussere Form, so dass das Gel am tiefsten Punkt zu liegen kommt und nicht der ganze Geutel gefüllt werden muss, nicht gezeigt). Über einen steril verschliessbaren Ablauf (durch nach unten hängenden Schlauch mittels Schwerkraft und zweitem Rücklaufventil) wird der verbrauchte Puffer entfernt, der die bei der Reinigung durch Diffusion anfallenden Substanzen enthält. Durch sukzessives Öffnen von Peelnähten läuft jeweils ein nächstes, frisches Puffervolumen für die nächste Reinigungsstufe nach. Ein Y Port ermöglicht gegebenenfalls die sterile Zuführung weiterer Komponenten (Enzyme, Wirkstoffe).

4 Schema Durchschweissverfahren zum Setzen von Peelnähten in einem befüllten Zuführungsbeutel

Ein mit wässrigem Puffer gefüllter, autoklavierter, schlauchartiger Beutel aus Peelnahtgeeignetem Folienmaterial wird in eine vielkammrige Pufferkaskade unterteilt.

  • A Der Schlauchbeutel (z. B aus peelnahtfähiger Polyolefinfolie) wird über einen Port am Ende des Schlauchs mässig befüllt und autoklaviert.
  • B Der Schlauch wird über einen oder mehrere Stege mit dem Schweisswerkzeug und der Gegenseite so gelagert, dass der Puffer rechts und links in die unteren Aussackungen abläuft und sich beide Folienlagen berühren. Restpuffer im Bereich der Schweissnähte wird durch Vorwärmen weitestgehend getrocknet, worauf die Peelnaht durch den befüllten Beutel hindurch geschweisst wird.
  • C Das Ergebnis ist ein steriler Mehrkammerbeutel, der einfach und kostengünstig über einen einzigen Port befüllt wurde. Im Einsatz wird die jeweilige Reinigungsstufe, die sich im Prozessbeutel befindet, durch die Anzahl der entleerten und noch gefüllten Kammern einfach dokumentiert und kann jederzeit ohne weitere Dokumentation überprüft werden.

5 Schema Pufferkaskaden, diverse Beispiele für Zuführungsbeutel

Gezeigt sind drei Beispiele für Zuführungsbeutel mit Pufferkaskaden für verschiedene Anwendungsstufen. Mit der linken Beutelkaskade werden primäre Genlager aus uncharakterisierten Bakterienklonen bestimmter E. coli Klone (Einzelkolonien eines bestimmten Masterklons für eine Anwendung, oder Klonnummern aus Banken) angelegt und bis zur Lagerstufe vorgereiningt. In der Ausführung wird die gesamte Prozedur durch Öffnen der Peelnähte der einzelnen Stufen automatisch dokumentiert. Enzymgaben und Puffer können nicht vertauscht werden und befinden sich im geschlossenen System. Der Beutel, der bevorzugt an einem Ständer eines fahrbaren Rollwagens über dem Prozessbeutel hängt, ist zusätzlich mit der entsprechenden Inkubationstemperatur für das Einbringen in den entsprechenden Ofen/Raum bedruckt. Die angegebenen Verdünnungsfaktoren (jeweils oben rechts) stellen nur einen Richtwert für frei diffundierende Substanzen in einem entsprechenden Gelvolumen dar. Die tatsächliches Verdünnungsstufen unterscheiden sich in Abhängigkeit der zersetzenden Wirkung der Reinigungslösungen und dem Migrationsverhalten und können stark differieren. Die letzte Pufferkaskade wird nur für die Langzeitlagerung benötigt und kommt im Beispiel nach 180 Tagen zum Einsatz. Bereits nach 8–14 Tagen können erste Proben entnommen werden, um die strukturelle Zusammensetzung zu erfassen. Lager, die der erwarteten Molekülform nicht entsprechen werden entsorgt. Im Laufe der Lagerung können weitere funktionelle labortests durchgeführt werden, um ein Genlager weiterzucharakterisieren. Werden funktionelle Moleküle festgestellt, kommt die mittlere Pufferkaskade zum Einsatz. Je nach Anforderungen werden mitunter 2–10 mal weniger mittlere Kaskaden benötigt, als primäre Kaskaden. Im Fall einer Genbank ist bis zur Identifizierung weniger wertvoller Klone aus tausenden unbekannten Klonen eine geringere Fortsetzungsrate zu erwarten. Allerdings stellt das Genlager eine nahezu unverwüstliche, unmittelbar anzapfbare Form von Molekülen dar, die nach einer Charakterisierung in identischer Funktionalität sofort verfügbar werden.

Mit der mittleren Kaskade wird eine spätere Enzymbehandlung durch Vorwaschen mit einem neutralen wässrigen Puffer erreicht. Dabei sinkt im Beispiel die Konzentration an EDTA auf 1–2 mM, so dass Enzymreaktionen in spezifischen Puffern durchgeführt werden können. Nach der Enzymbehandlung wird durch erneuten Proteinabbau das entsprechende Enzym beseitigt und anschliessend einer zweiten, im Beispiel vierstufig dargestellten Reinigung unterzogen. Die Verdünnungsreihen haben inzwischen die ursprünglich frei diffundierbaren Substanzen in der Biomatrix auf ppm Konzentrationen reduziert.

Im rechten Beispielbeutel wird eine elektrophoretische Reinigung vorbereitet, wobei ein neutraler Elektrophoresepuffer den Lagerpuffer ersetzt, was eine weitgehende Verdünnung der EDTA (angegebene Werte), Salz-, und Tensidkonzentrationen bewirkt, so dass im Anschluss durch Einstecken der Elektroden und Anschluss eines Einkammerbeutels mit z. B. 2 l Elektrophoresepuffer eine Pulsfeldreinigungselektrophorese durchgeführt werden kann. (die Volumenangaben und Verdünnungswerte stellen nur Beispielgrößen dar)

6 Schema Pulsfeldreinigungselektrophorese im Prozessbeutel und Abschweissen einer Probe

Über einen Einkammer-Zulaufbeutel mit Elektrophoresepuffer mit höhenverstellbarem Tropf/Port läuft kontinuierlich Puffer in den gefüllten Prozessbeutel nach. Der gekühlte Puffer läuft in die untere Beutelebene ein und verdrängt den vorhandenen Puffer nach oben. Das in der Mitte des Beutels platzierte Gel wird einem gepulsten elektrischen Feld ausgesetzt. Dafür werden über vier Ports Stabelektroden parallel zur Gelfläche in den Prozessbeutel eingesteckt und mittels Elektrodenadaptoren dicht an den Beutel angeschlossen und verkabelt. In der gezeigten Ausführung wird das bei der Elektrolyse entstehende Gas über einen oben liegenden Port zusammen mit dem unter Druck nach oben ablaufenden Puffer abgeleitet. Die im Puffer anfallenden Reinigungsprodukte, die unter Stromeinfluss die Gelmatrix verlassen, reichern sich im Puffer nach oben hin an und werden abgeschieden. Bei übermässiger Erwärmung wird die Spannung reduziert oder unterbrochen, so dass kein Kühlkreislauf benötigt wird. Durch geeignete Elektrodenmaterialien und Vermeidung der Umwälzung in einem Kühlkreislauf wird ein sofortiges Abscheiden der anfallenden Substanzen erreicht, wodurch unerwünschte Elektrolyseprodukte vermieden werden und ein hoher Reinigungsgrad realisiert wird. Der Fülldruck des Beutels und Kühlmengeneinlauf wird über höhenverstellbare Zulauf- und Ablaufniveaus reguliert, so dass in dieser Ausführung keine Pumpen zum Einsatz kommen.

Ein weiterer Vorteil des Prozessbeutels aus einem thermoschweissbaren Folienmaterial ist die einfache Abtrennung einer Probe (links oben am Prozessbeutel dargestellt). Dabei wird im Zustand mit entleertem Puffer ein im Beutel durch die Wand hindurch abgetrenntes Gelstückchen in eine Ecke oder Blindkammer des Beutels bewegt. Auf der innen gelegenen Seite der Probe wird anschliessend mit einem Thermoschweissgerät eine kleine Beutelecke/tasche durch Setzen von bevorzugt zwei Schweissnähten und Trennschneiden abgetrennt. Der Prozessbeutel ist nach wie vor steril verschlossen. Der Beutelabschnitt mit der Probe ist ebenfalls steril verschlossen und kann bequem gelagert, verschickt, oder funktionellen Analysen zugeführt werden.

Durch eine entsprechende Beutelbedruckung mit Barcodes und laufenden Nummern der vorgesehenen Plätze des Prozessbeutels für die Probenentnahme und das verbleibende Genlager kann das Risiko eine Verwechslung der Proben und Genlager wirksam gesenkt werden.

7 Schema Betrieb des Prozessbeutels mit einem Elektroelutionsbeutel, Überführung in einen Transportschlauch

Der Prozessbeutel wird an einen Elutionsbeutel angeschlossen, indem ein Port mit einem Partikelfilter und einer dahinter liegenden Eluatkammer und die Eluatkammer wiederum über eine zwischengesteckte Dialysemembran mit einem Port des Elutionsbeutels verbunden wird. Der Elutionsbeutel stellt damit eine kleine Version eines Prozessbeutels dar, der dazu dient, den puffertragenden Bereich des Prozessbeutels auszudehnen. Dafür wird zusätzlich zur Verbindung über die Eluatkammer mindestens eine großlumige Pufferbrücke angeschlossen. Für den Ausgleich des elektroosmotischen Pufferpotentials dient zusätzlich ein im Eluatschlauch befindlicher Seitenport (der später als Entnahmestelle dienen kann), an dem während der Elution (volle Leistung) ein Schlauch nach oben angeschlossen wird, der ein höheres Pufferniveau der Eluatkammer ermöglichen kann. Vor dem Umpolen dient eine Phase schwacher Leistung dem Rücklauf des Ausgleichspuffers, ahne dabei Eluat an der Dialysemembran zu verlieren. Das Eluat wird durch Umpolen zurück in den freien Eluatschlauch befördert. Anschliessend wird der Schlauch an beiden Enden mittels der thermoplastischen Durchschweisstechnik geschlossen und abgetrennt. In der dargestellten Ausführung dient der steril verschlossene Seitenport der späteren Entnahme des Eluats (vgl Detail Transportschlauch/Eluatkammer in 8). Andere Ausführungen leiten das Eluat elektrisch über den Seitenportder Eluatkammer in weitere Reaktionsbehälter weiter.

8 Schema Transportschlauch und Eluatkammer mit Membranen

Verschraubbare Adaptorenhälften mit formstabilen Dichtungsringen (schwarz) klemmen die DNA durchlässige Filtermembran (weisses Kästchen) und die DNA rückhaltende Dialysemembran (unterbrochene Kästchen) fest und verbinden die Beutelports mit der Eluatkammer.

9 Schema Stabelektroden, Elektrodenadapter, Elektrodenstecker

Glaskohlenstoffelektroden mit dünnem Durchmesser und glatter Oberfläche werden fest mit einem Adapterdeckel verbunden, und durch Adapterports, die mit einer Pufferdichtung ausgestattet sind, eingeschoben. Durch weiteres Einschrauben kann bei längerem Betrieb einem Undichtwerden durch Dünnerwerden der Elektroden im Bereich der Dichtung entgegengewirkt werden. Ausserhalb des Adapterdeckels wird direkt auf die herausragende Elektrode eine Kabelsteckverbindung aufgesetzt, die mit einer Isolierhülle mit Abdichtung nach aussen ausgestattet ist und den Port, Adapter und die Elektrode vor eindringender Flüssigkeit von aussen abschirmt. A Dicht eingesteckte Elektroden verhindern ein Auslaufen des Elektrophoresepuffers. Das Elektrodenmaterial der Stabelektroden ragt aus dem Port/Adapter heraus. B Auf die trockene Seite der Elektrode wird ein Stecker mit Kontaktfedern aufgesetzt, der zusätzlich die Elektrode vor von aussen eindringender Nässe schützt.

10 Schema Reinraumprozessbeutel mit Hauptkomponenten (ohne Geräte)

Darstellung einer Ausführung eines Reinraumprozessbeutels mit einer (möglichst kleinen) Zahl von 6 Ports Z1-6 (plus einem Port Z7 der Eluatkammer), Z1-3 am Prozessbeutel und Z4-6 am Eluatbeutel, und einer kleinen Zahl von 4 Elektrodeneinsteckkanälen und gemeinsamem Gas/Pufferablass während dem Elektroelutionsbetrieb (im Schaltkreis rechts mit Belegung der Zugänge).

Während anderer Reinigungsstufen sind Elutionsbeutel und Eluatkammer abgeklemmt und die Ports werden anders belegt (siehe Beschriftung der Komponenten links und oben). Durch gedrehte Beutellagerung während der Elektrophorese wird bei dieser Prozessbeutelausführung Z1 zum Einlauf unten und Z2 zum Gas/Pufferablauf oben (nicht dargestellt). Über Z3 werden Reinigungspuffer und Kaskaden angeschlossen. Der Siebrahmen im Prozessbeutel wird über Port Z1 befüllt.

11 Foto Trockenmodell Prozessbeutel

Zweilagige Ausführung aus einer gefalteten, 1 m breiten Schlauchfolie. Der Prozessbeutel besitzt 6 Probenentnahmestellen (drei Blindsäcke in jeder Ebene, links), 8 Zuführungsports (Z1 grosslumig hinten, Z2 grosslumig vorne, Z3-5, kleinlumig rechts obere Ebene, Z6-8 kleinlumig rechts untere Ebene) und 4 Elektrodeneinsteckkanälen (E1-4) mit eingesteckten Graphitstabelektroden (einfache Ausführung mit offener Elektrodensteckung ohne Dichtungsadapter mit einer Gas- und Pufferableitung über die nach oben gelenkten Elektrodenkanäle, die aus Beutelmaterial gefertigt werden). A flache Darstellung, B gestützter räumlicher Aufbau mit Elektrodenkanälen nach oben.

12 Schema Herstellung langer intakter DNA in einer Agarosematrix

Reinigungsprinzip für lange DNA Moleküle mit Grad 1 DNA Qualität und für dauerhafte Genlager, aus denen verschiedenste Genanwendungen viel besser durchgeführt werden können, Gegenstand der Erfindung ist das Beutelverfahren, wodurch der komplexe Laborablauf im geschlossenen System durchgeführt werden kann. Dadurch können nun sprunghaft mehr und sogleich unerreicht saubere, funktionell charakterisierte Moleküle (GMP) kostengünstig bereitgestellt werden. Die neue Technologie kann funktionelle Genbanken mit künstlichen Chromosomen generieren und den Gesamtbedarf an genomischen DNA Arzneimitteln decken.

Referenzen

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