Title:
Evaluating the qualities of egg cells, comprises analyzing follicular fluid of the egg cells to be evaluated, and applying the analyzed results for the evaluation of the individual qualities
Kind Code:
A1


Abstract:
The process comprises analyzing follicular fluid of the egg cells to be evaluated, and applying the analyzed results for the evaluation of the individual qualities. The follicular fluid of the egg cells is spectrometrically analyzed upon the existence and the intensity of masses of proteins present in the follicular fluid and not mass-spectrometrically evaluatable in the serum, masses of proteins contained in the follicular fluid to be analyzed but rarely present in the serum, and/or masses of proteins mass-spectrometrically evaluatable in the serum but not present in the follicular fluid. The process comprises analyzing follicular fluid of the egg cells to be evaluated, and applying the analyzed results for the evaluation of the individual qualities. The follicular fluid of the egg cells is spectrometrically analyzed upon the existence and the intensity of the masses of proteins present in the follicular fluid and not mass-spectrometrically evaluatable in the serum, masses of proteins contained in the follicular fluid to be analyzed but rarely present in the serum, and/or masses of proteins mass-spectrometrically evaluatable in the serum but not present in the follicular fluid in normal case. The evaluation of the individual qualities takes place from the presence/absence of protein masses and their intensities in the spectrum of follicular fluid. The spectrometric detection is carried out upon the existence and the intensity of the protein present in the follicular fluid by surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry and by another mass spectrometric evaluation methods e.g. matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight. A comparison of mass spectrometric detection results of the follicular fluid takes place with data of a computerized electronic database for the evaluation of the individual qualities.



Inventors:
Markert, Udo, Dr. (Jena, 07743, DE)
Hoppe, Ines, Dr. (Jena, 07743, DE)
Neubeck, Stefan (Leutenberg, 07338, DE)
Starker, Wolfgang, Dr. (Jena, 07743, DE)
Eggeling, Ferdinand von, Dr. (Kleinebersdorf, 07646, DE)
Application Number:
DE102008062789
Publication Date:
07/01/2010
Filing Date:
12/19/2008
Assignee:
Friedrich-Schiller-Universität Jena Universitätsklinikum Jena (Jena, 07743, DE)
International Classes:



Other References:
Datenbank PubMed b.NCBI.Adresse www.ncbi.nlm.nih.gov,Zusammenf.zu : Hanrieder, J.,et.al.: Proteomic analysis of human follicular f
Datenbank PubMed bei NCBI. Adr.www.ncbi.nlm.nih.gov,Zusammenf.zu:ANGELUCCI,S.:Proteome analysis of human follicular fluid.Biochim.Biophys.Acta,2006,1764,11,S.1775-1785 MALDI-TOF Follikelflüssigkeit gegen Plasma
ESchG. Hinweis zu S.12,Z.13."In beiden Fällen ist davon auszugehn , dass die Eizellqualität reduziert ist,vgl.§2 PatG i.V.m.§1,Abs 2 ESchG
Claims:
1. Verfahren zur Beurteilung der Qualität einer Eizelle, bei dem die Follikelflüssigkeit der zu beurteilenden Eizelle analysiert sowie das Untersuchungsergebnis zur Beurteilung der Eizellqualität herangezogen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Follikelflüssigkeit der Eizelle auf das Vorhandensein und die Intensität der Massen
– von ein oder mehreren in der Follikelflüssigkeit vorhandenen und im Serum massenspektrometrisch nicht nachweisbaren Proteinen, insbesondere der Proteinmassen: Bezeichnung des ProteinsMassebereich des ProteinsFFSP14569–4579 DaFFSP24586–4597 DaFFSP316517–16558FFSP419886–19927 DaFFSP520063–20140 DaFFSP642788–43193 DaFFSP72500–2510 DaFFSP82555–2565 DaFFSP92630–2640 DaFFSP102764–2774 DaFFSP112927–2937 DaFFSP122950–2960 DaFFSP133448–3458 DaFFSP144607–4617 DaFFSP158278–8298 DaFFSP1610185–10205 Da
– und/oder von in der zu untersuchenden Follikelflüssigkeit enthaltenen, jedoch selten im Serum vorhanden Proteinen, beispielsweise der Proteinmassen: Bezeichnung des ProteinsMassebereich des ProteinsFFAP12760–2766 DaFFAP23076–3084 DaFFAP33175–3185 DaFFAP46174–6190 Da
– und/oder von im Serum massenspektrometrisch nachweisbaren, jedoch im Normalfall in der Follikelflüssigkeit nicht vorhandenen Proteine, beispielsweise der Proteinmassen: Bezeichnung des ProteinsMassebereich des ProteinsPNFF12127–2133 DaPNFF22217–2219 DaPNFF32714–2721 DaPNFF43266–3272 DaPNFF53283–3291 DaPNFF63676–3679 DaPNFF73765–3772 DaPNFF84062–4070 DaPNFF95064–5069 DaPNFF105080–5087 DaPNFF115172–5179 DaPNFF125334–5342 DaPNFF135539–5550 DaPNFF146141–6150 DaPNFF156851–6862 DaPNFF167765–7776 DaPNFF178127–8138 DaPNFF188142–8154 DaPNFF1910262–10287 DaPNFF2010292–10304 DaPNFF2110630–10647 DaPNFF2210650–10660 DaPNFF2312451–12467 DaPNFF2412606–12625 DaPNFF2513543–13569 DaPNFF2616698–16717 DaPNFF2717062–17081 DaPNFF2817864–17890 Da
spektrometrisch untersucht wird und dass aus dem Vorhandensein/Nichtvorhandensein dieser Massen sowie deren Intensität im Spektrum der Follikelflüssigkeit die Beurteilung der Eizellqualität erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der spektrometrische Nachweis auf das Vorhandensein und die Intensität der in der Follikelflüssigkeit vorhandenen Proteine durch die SELDI-TOF Massenspektrometrie („Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization – Time Of Flight) erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der spektrometrische Nachweis auf das Vorhandensein und die Intensität der in der Follikelflüssigkeit vorhandenen Proteine durch andere massenspektrometrische Untersuchungsmethoden, beispielsweise MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionisation – Time of Flight) durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Beurteilung der Eizellqualität ein Vergleich der massenspektrometrischen Nachweisergebnisse der Follikelflüssigkeit mit Referenzwerten, insbesondere mit Daten einer rechnergestützten elektronischen Datenbank, erfolgt.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung der Qualität einer Eizelle anhand der zugehörigen Follikelflüssigkeit in einer Probe. Die Beurteilung dient beispielsweise zur Bewertung, ob die betreffende Eizelle für eine Fertilisation geeignet wäre, zur Entscheidung über die weitere Verwendung der bewerteten Eizelle und/oder zur Optimierung von Zellkulturbedingungen.

Bislang werden Eizellen nahezu ausschließlich morphologisch mittels Mikroskopie beurteilt (Ubaldi F, Rienzi L: Morphological selection of gametes, Placenta, 2008, 29, 115–20). Diese Bewertung ist subjektiv und setzt eine große Erfahrung des Beurteilenden voraus. Über objektive Gesichtspunkte bei einer solchen visuellen Beurteilung ist in der Fachwelt nichts bekannt geworden. Darüber hinaus ist bei der Untersuchung der Eizelle das Risiko einer Beschädigung gegeben.

Es wurde ebenfalls versucht, statt der Eizelle selbst, die Follikelflüssigkeit der betreffenden Eizelle zu analysieren, um dadurch Rückschlüsse auf die Eizellqualtität treffen zu können, bzw. um Erkenntnisse zu gewinnen, welche zur Beurteilung der Eizellqualität mit herangezogen werden können. Dabei wurden mehrere darin in der Follikelflüssigkeit enthaltene bekannte Proteine (beispielsweise IGF-1 („Insulin-like Growth Factor-1”), IGFBP-1 („IGF Binding Protein-1”), IGFBP-4, IGFBP-5, Inhibin, Activin A, die Oestradiol/Testosteron-Ratio, Oestradiol, Progesteron, LH (Luteinisierendes Hormon), Prolaktin, Leptin) mittels ELISA-Technik („Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay”) oder ähnlichen Antikörper-basierten Messverfahren gemessen (Wang Q, Sun QY: Evaluation of oocyte quality: morphological, cellular and molecular predictors, Reprod Fertil Dev 19, 200), 1–12).

Es wurde darüber spekuliert, dass die Konzentration einzelner Proteine eine Aussage über die Qualität der Eizelle geben könnte. Dabei wurde gezeigt, dass die Konzentration von G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) mit dem Erfolg der in der entsprechenden Follikelflüssigkeit gereiften Eizelle, erfolgreich befruchtet zu werden und zu einer Schwangerschaft zu führen, korreliert. Die Messung von G-CSF in der Follikelflüssigkeit zu diesem Zweck wurde zu einem bisher nicht veröffentlichten Patent angemeldet. In diesem Zusammenhang wurde aus der Konzentration von G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) in der untersuchten Follikelflüssigkeit eine Aussage getroffen, ob die zugehörige Eizelle, erfolgreich befruchtet werden und zu einer Schwangerschaft führen kann. Über die Richtigkeit dieser Aussage und/oder einen Erfolg dieser Methode ist in der Fachwelt allerdings noch nichts bekannt geworden.

In einer 2007 erschienenen Publikation wurden zahlreiche bisher untersuchte und als brauchbar eingeschätzte Parameter zur Beurteilung der Eizellqualität, auch anhand von Follikelflüssigkeit, in einer Übersicht dargestellt (Wang Q, Sun QY: Evaluation of oocyte quality: morphological, cellular and molecular predictors, Reprod Fertil Dev 19, 2007, 1–12). Die Analyse der morphologischen Qualität der Eizelle erfolgt hiernach durch definierte Kriterien, wie der Granularität vom Ooplasma (Zellplasma der Eizelle), der Verteilung der Zellorganellen, Dicke und Organisation der Zona Pellucida und anderen. Als Qualitäts-Parameter der Eizelle in der Follikelflüssigkeit werden IGF-1 („Insulin-like Growth Factor-1”), IGFBP-1 („IGF Binding Protein-1”), IGFBP-4, IGFBP-5, Inhibin, Activin A, die Oestradiol/Testosteron-Ratio, Oestradiol, Progesteron, LH (Luteinisierendes Hormon), Prolaktin, Leptin sowie Faktoren des oxidativen Stresses aufgelistet. Die meisten dieser Faktoren werden mit Antikörper-basierten Verfahren gemessen (z. B. ELISA).

Ein anderes Nachweisverfahren zur Analyse von Proteinen in Körperflüssigkeiten ist die Massenspektrometrie (Zhou M, Veenstra T: Mass spectrometry: m/z 1983–2008, Biotechniques, 2008, 44(5), 667–8, 670).

Eine verfeinerte massenspektrometrische Methode ist die SELDI-TOF („Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization – Time Of Flight) Massenspektrometrie (Wright GL Jr: SELDI proteinchip MS: a platform for biomarker discovery and cancer diagnosis, Expert Rev Mol Diagn 2002, Vol. 2, No. 6, 549–563).

Hierbei werden die zu untersuchenden Proben zunächst auf unterschiedlich beschichtete Oberflächen („Protein-Chips”) aufgetragen, durch die jeweils nur ein Teil der in der Probe enthaltenen Proteine gebunden wird. Diese gebundenen Proteine werden dann massenspektrometrisch untersucht. Hierdurch können im Gegensatz zur herkömmlichen Massenspektrometrie auch Proteine detektiert werden, die in sehr geringen Mengen vorkommen. Eine Arbeitsgruppe aus Berlin und Potsdam hat 2006 eine Arbeit publiziert, in der mittels SELDI-TOF Follikelflüssigkeiten von Eizellen untersucht wurden (F. J. Schweigert et al.: Peptide and Protein profiles in serum and follicular fluid of women undergoing IVF, Human Reproduction 21(11), 2006, 2960–2968). Es fanden drei unterschiedliche Protein-Chips Anwendung: erstens ein starker Anionen-Austauscher, zweitens ein schwacher Kationen-Austauscher und drittens eine normale Phase. Allerdings wurden lediglich Proteine beschrieben, die graduell unterschiedlich stark exprimiert werden. Die Beurteilung ist nach wie vor eingeschränkt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, mit dem die Eizellqualität ohne Beeinträchtigung der Eizelle verbessert und insbesondere objektiviert beurteilt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die der Eizelle zugehörige Follikelflüssigkeit in einer Probe massenspektrometrisch auf das Vorhandensein und die Intensität der Massen

  • – von ein oder mehreren in der Follikelflüssigkeit vorhandenen und im Serum massenspektrometrisch nicht nachweisbaren Proteinen, insbesondere der Proteinmassen:
Bezeichnung des ProteinsMassebereich des ProteinsFFSP14569–4579 DaFFSP24586–4597 DaFFSP316517–16558FFSP419886–19927 DaFFSP520063–20140 DaFFSP642788–43193 DaFFSP72500–2510 DaFFSP82555–2565 DaFFSP92630–2640 DaFFSP102764–2774 DaFFSP112927–2937 DaFFSP122950–2960 DaFFSP133448–3458 DaFFSP144607–4617 DaFFSP158278–8298 DaFFSP1610185–10205 Da
  • – und/oder von in der zu untersuchenden Follikelflüssigkeit enthaltenen, jedoch selten im Serum vorhanden Proteinen, beispielsweise der Proteinmassen:
Bezeichnung des ProteinsMassebereich des ProteinsFFAP12760–2766 DaFFAP23076–3084 DaFFAP33175–3185 DaFFAP46174–6190 Da
  • – und/oder von im Serum massenspektrometrisch nachweisbaren, jedoch im Normalfall in der Follikelflüssigkeit nicht vorhandenen Proteine, beispielsweise der Proteinmassen:
Bezeichnung des ProteinsMassebereich des ProteinsPNFF12127–2133 DaPNFF22217–2219 DaPNFF32714–2721 DaPNFF43266–3272 DaPNFF53283–3291 DaPNFF63676–3679 DaPNFF73765–3772 DaPNFF84062–4070 DaPNFF95064–5069 DaPNFF105080–5087 DaPNFF115172–5179 DaPNFF125334–5342 DaPNFF135539–5550 DaPNFF146141–6150 DaPNFF156851–6862 DaPNFF167765–7776 DaPNFF178127–8138 DaPNFF188142–8154 DaPNFF1910262–10287 DaPNFF2010292–10304 DaPNFF2110630–10647 DaPNFF2210650–10660 DaPNFF2312451–12467 DaPNFF2412606–12625 DaPNFF2513543–13569 DaPNFF2616698–16717 DaPNFF2717062–17081 DaPNFF2817864–17890 Da
spektrometrisch untersucht. Aus dem Vorhandensein/Nichtvorhandensein dieser Massen sowie deren Intensität im Spektrum der Follikelflüssigkeit erfolgt die Beurteilung der Eizellqualität.

Hierbei handelt es sich um den Nachweis von Massen von Proteinen im Spektrum der Follikelflüssigkeit, die jeweils unterschiedlich in der Follikelflüssigkeit und im Serum (unter normalen Bedingungen jeweils nur in der Follikelflüssigkeit oder im Serum bzw. in beiden) vorkommen, ohne dass diese Proteine der Fachwelt bekannt sein müssen oder bekannt wären. Die besagten Proteine, die zur Kennzeichnung der Proteinmassen in den vorstehenden Tabellen eigens bezeichnet sind, wurden aufgrund der spektrometrischen Massen in keiner der eingangs angeführten Methoden untersucht oder gar mit anderen Daten verglichen. Es gibt auch keinerlei Hinweis, ob diese Proteine an sich bereits bekannt sind. Es ist Gegenstand der Erfindung, aber genau diese Proteine mit ihren Massen gemeinsam oder vereinzelt auf das Vorhandensein und ihre Intensität im Spektrum der Follikelflüssigkeit zu untersuchen und daraus eine Aussage über die Eizellqualität zu liefern.

Mit der Erfindung wird nicht die Eizelle analysiert, sondern die zugehörige Follikelflüssigkeit, so dass die Eizelle von dieser Analyse unberührt und somit auch unbeeinträchtigt bleibt.

Erstmals ist es gelungen, die Beurteilung der Eizelle zu objektivieren und mit der spektrometrischen Untersuchung der Follikelflüssigkeit auf eine oder mehrere der besagten Proteinmassen (Vorhandensein und Intensität der Proteinmassen) Bewertungskriterien festzulegen, die zuverlässig und sogar rechentechnisch durch einen Vergleich mit einer Datenbank schnell sowie mit verfahrenstechnisch geringem Aufwand anwendbar sind.

In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Methode angeführt.

Der Schutzumfang des Patents ist nicht auf die beispielhaft genannten Proteinmassen beschränkt.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Es zeigen:

: Ablaufplan zur Vorbereitung und Durchführung der massenspektrometrischen Probenuntersuchung von Follikelflüssigkeit (FF) bzw. Serum

: Massenspektrometrische Messergebnisse mittels SELDI-TOF für die Proteinmassen FFSP1 und FFSP2

: Massenspektrometrische Messergebnisse mittels SELDI-TOF für die Proteinmassen FFSP3, FFSP4 und FFSP5

: Massenspektrometrische Messergebnisse mittels SELDI-TOF für die Proteinmasse FFSP6

: Massenspektrometrische Messergebnisse mittels SELDI-TOF für die Proteinmassen PNFF1, PNFF2, PNFF3 und PNFF4

Mit der Erfindung wird die als Probe vorliegende Follikelflüssigkeit (FF) der zu beurteilenden Eizelle auf Proteinmassen untersucht, welche unter normalen Bedingungen jeweils unterschiedlich in der Follikelflüssigkeit und im Serum nachweisbar sind. Dabei müssen die Proteine dieser untersuchten Proteinmassen nicht zwingend bekannt sein.

Zur Untersuchung der Probe wurde die Follikelflüssigkeit verdünnt und 200 μl auf einen kupferbeschichteten IMAC30 Protein-Chip („IMAC-Kupfer”) aufgetragen sowie an einem SELDI-TOF („Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization – Time Of Flight”, PCS 4000) Massenspektrometer gemessen. zeigt einen detaillierten Ablaufplan zur Vorbereitung und Durchführung der massenspektrometrischen Probenuntersuchung von Follikelflüssigkeit (FF) bzw. Serum.

Um auszuschließen, dass die Follikel- oder Serum-spezifischen Proteine in der jeweils anderen Körperflüssigkeit mit anderen als den IMAC-Kupfer-Chips nachweisbar sind, wurden einige Proben auch auf Q10 und CM10 Protein-Chips untersucht.

Als Ergebnis erhält man eine Kurve mit dem Profil aller an den Protein-Chip gebundener Proteine. Das Massenspektrometer gibt dabei Auskunft über das jeweilige Molekülgewicht und die relative Menge an Protein dieses Gewichts.

Auf diese Weise konnten erstmalig 16 Proteinmassen definiert werden, die ausschließlich in der Follikelflüssigkeit, aber im Normalfall nie im Serum zu finden sind und welche bisher nicht zur Begutachtung der Eizellqualität untersucht wurden.

Außerdem wurden vier Proteinmassen definiert, die in den meisten Follikelflüssigkeiten, aber fast nie im Serum gefunden werden sowie 28 Proteinmassen, die ausschließlich im Serum, aber im Normalfall nie in der Follikelflüssigkeit nachgewiesen werden.

Die Probe der zur Eizelle gehörenden Follikelflüssigkeit wird auf das Vorhandensein sowie auf die Intensität bzw. auf das Nichtvorhandensein einer oder mehrerer dieser Massen untersucht. Anhand der besagten massenspektrometrischen Ergebnisse wird die Eizellqualität beurteilt.

Die Untersuchung der Follikelflüssigkeit erfolgt in drei Stufen:

1. Massenspektrometrische Messung der Follikelflüssigkeit der Eizelle auf das Vorhandensein und die Intensität der in Tabelle 1 aufgeführten Massen von ein oder mehreren in der Follikelflüssigkeit vorhandenen und im Serum im Normalfall massenspektrometrisch nicht nachweisbaren Proteinen:

Tabelle 1: Protein-Peaks in Follikelflüssigkeit. Die Masse wurde bei einem Röhrendruck von 150 μPa bestimmt. Höhere Drücke können zu höheren Abweichungen führen. Keines dieser Proteine wurde im Serum nachgewiesen. FFSP7–16 wurden durch eine einzelne sensitivere Messung unter Benutzung von „Equalizer Beads” detektiert.

ProteinMassenbereich, in dem das Protein mittels SELDI-TOF Massenspektrometrie detektiert wird (± % möglicher Fehler)Prozentualer Anteil der Follikelflüssigkeit-Spektren, in denen das Signal detektiert wurdeFFSP14569–4579 Da (±0,3%)96%FFSP24586–4597 Da (±0,3%)70%FFSP316517–16558 Da (±0,2%)96%FFSP419886–19927 Da (±0,2%)96%FFSP520063–20140 Da (±0,2%)100%FFSP642788–43193 Da (±0,2%)99%FFSP72500–2510 (±0,5%)FFSP82555–2565 (±0,5%)FFSP92630–2640 (±0,5%)FFSP102764–2774 (±0,5%)FFSP112927–2937 (±0,5%)FFSP122950–2960 (±0,5%)FFSP133448–3458 (±0,5%)FFSP144607–4617 (±0,5%)FFSP158278–8298 (±0,3%)FFSP1610185–10205 (±0,3%)

Die Expression der in Tabelle 1 aufgeführten 16 Proteine, von denen bislang nur die Masse bekannt ist, werden mittels SELDI-TOF-Massenspektrometrie in der Follikelflüssigkeit gemessen. Da sie nicht im Serum nachweisbar sind, sollen diese als Follikelflüssigkeit-spezifische Proteine 1–16 (FFSP1–16) bezeichnet werden. Die Stärke des SELDI-TOF Signals, gemessen in μA, korreliert mit der relativen Konzentration des jeweiligen Proteins. Diese Erkenntnisse wurden bei der Analyse von 112 Follikelflüssigkeiten und 18 Serumproben gewonnen.

Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die in der Tabelle 1 aufgeführten FFSP1–16 bereits unter anderen Namen bekannt sind. Es ist jedoch der Fachwelt nicht bekannt, Follikelflüssigkeiten auf Proteine mit den angegebenen Massen zum Zweck des hier vorgeschlagenen Verfahrens massenspektrometrisch zu untersuchen.

Die zeigt Beispiele der massenspektrometrischen Messergebnisse mittels SELDI-TOF für die beiden Proteinmassen FFSP1 und FFSP2 (vgl. Tabelle 1). Die Punktwolken der Diagramme der oberen Reihe zeigen die Signalstärke der jeweiligen Proteinmassen von einzelnen Messungen aller punktierten Follikel sowie des Serums von 4 Patientinnen. Es ist deutlich ersichtlich, dass die Konzentrationen der Proteinmassen im Serum im „Rauschbereich” der Messung liegen, während ausschließlich in der Follikelflüssigkeit (FF) Werte oberhalb des Rauschbereichs gemessen werden. In den unteren beiden Diagrammen ist dargestellt, dass im Serum kein spezifischer Masse-Peak vorhanden ist, sondern nur unspezifisches „Rauschen” (zu erkennen an der unregelmäßig gezackelten Linie), während im selben Massebereich in der Follikelflüssigkeit deutliche Massepeaks erscheinen.

und zeigen entsprechende Messergebnisse mittels SELDI-TOF für die Proteinmassen FFSP3, FFSP4 und FFSP5 bzw. für die Proteinmasse FFSP6 (vgl. ebenfalls Tabelle 1).

2. Massenspektrometrische Messung der Follikelflüssigkeit der Eizelle auf das Vorhandensein und die Intensität der in Tabelle 2 aufgeführten Massen von ein oder mehreren Follikelflüssigkeit-assoziierten Proteinen, die im Normalfall mit der gleichen Methode in deutlich geringerer Konzentration im Serum nachweisbar sind:

In der nachstehenden Tabelle 2 sind vier Proteine aufgeführt, von denen bislang nur die Masse bekannt ist. Die Expression dieser Proteine wird mittels SELDI-TOF-Massenspektrometrie in der Follikelflüssigkeit gemessen. Sie werden Follikelflüssigkeit-assoziierte Proteine 1–4 (FFAP1–4) genannt. Die Stärke des SELDI-TOF Signals, gemessen in μA, korreliert mit der relativen Konzentration des jeweiligen Proteins. Diese Erkenntnisse wurden bei der Analyse von 112 Follikelflüssigkeiten und 18 Serumproben gewonnen. Tabelle 2: Protein-Peaks in Follikelflüssigkeit. Die Masse wurde bei einem Röhrendruck von 150 μPa bestimmt. Höhere Drücke können zu höheren Abweichungen führen. Die Tabelle zeigt den jeweiligen Anteil der Follikelflüssigkeiten und Seren, in denen die Massen gefunden wurden.

ProteinMassenbereich, in dem das Protein mittels SELDI-TOF Massenspektrometrie detektiert wirdProzentualer Anteil der Spektren, in denen das Signal detektiert wurdein FFim SerumFFAP12760–2766 Da (±0,5%)79%13%FFAP23076–3084 Da (±0,5%)86%35%FFAP33175–3185 Da (±0,5%)95%14%FFAP46174–6190 Da (±0,3%)98%14%

Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die in der Tabelle 2 aufgeführten FFAP1–4 bereits unter anderen Namen bekannt sind. Es ist jedoch der Fachwelt nicht bekannt, Follikelflüssigkeiten auf Proteine mit den angegebenen Massen zum Zweck des hier vorgeschlagenen Verfahrens massenspektrometrisch zu untersuchen.

3. Massenspektrometrische Messung der Follikelflüssigkeit der Eizelle auf das Vorhandensein und die Intensität der in Tabelle 3 aufgeführten Massen von ein oder mehreren Proteinen, die zwar im Serum vorkommen, aber im Normalfall nie in Follikelflüssigkeit exprimiert werden:

In der nachstehenden Tabelle 3 sind insgesamt 28 Proteine aufgeführt, von denen bislang nur die Masse bekannt ist. Die Expression dieser Proteine wird mittels SELDI-TOF-Massenspektrometrie in der Follikelflüssigkeit untersucht. Sie werden als „Proteine Nie in Follikel-Flüssigkeit 1–28” (PNFF1–28) bezeichnet. Die Stärke des SELDI-TOF Signals, gemessen in μA, korreliert mit der relativen Konzentration des jeweiligen Proteins. Diese Erkenntnisse wurden bei der Analyse von 112 Follikelflüssigkeiten und 18 Serumproben gewonnen. Tabelle 3: Protein-Peaks in Serum. Die Masse wurde bei einem Röhrendruck von 150 μPa bestimmt. Höhere Drücke können zu höheren Abweichungen führen. Die fettgedruckten Proteine wurden mit keinem der oben aufgeführten Chips in der Follikelflüsigkeit nachgewiesen. Alle genannten Proteine wurden mit dem IMAC-Kupfer Chip in keiner Follikelflüssgkeit gefunden.

ProteinMassenbereich, in dem das Protein mittels SELDI-TOF Massenspektrometrie detektiert wirdProzentualer Anteil der Serum-Spektren, in denen das Signal detektiert wurdePNFF12127–2133 Da (±0,5%)69%PNFF22217–2219 Da (±0,5%)50%PNFF32714–2721 Da (±0,5%)75%PNFF43266–3272 Da (±0,5%)100%PNFF53283–3291 Da (±0,5%)63%PNFF63676–3679 Da (±0,5%)38%PNFF73765–3772 Da (±0,5%)88%PNFF84062–4070 Da (±0,5%)81%PNFF95064–5069 Da (±0,3%)88%PNFF105080–5087 Da (±0,3%)94%PNFF115172–5179 Da (±0,3%)69%PNFF125334–5342 Da (±0,3%)50%PNFF135539–5550 Da (±0,3%)63%PNFF146141–6150 Da (±0,3%)75%PNFF156851–6862 Da (±0,3%)94%PNFF167765–7776 Da (±0,3%)100%PNFF178127–8138 Da (±0,3%)100%PNFF188142–8154 Da (±0,3%)100%PNFF1910262–10287 Da (±0,3%)94%PNFF2010292–10304 Da (±0,3%)69%PNFF2110630–10647 Da (±0,3%)69%PNFF2210650–10660 Da (±0,3%)81%PNFF2312451–12467 Da (±0,2%)100%PNFF2412606–12625 Da (±0,2%)94%PNFF2513543–13569 Da (±0,2%)81%PNFF2616698–16717 Da (±0,2%)75%PNFF2717062–17081 Da (±0,2%)88%PNFF2817864–17890 Da (±0,2%)75%

Sollten abnormer Weise die Massen von ein oder mehreren der Proteine PNFF1–28 in der Follikelflüssigkeit nachgewiesen werden, so könnte dies insbesondere mit nachstehenden Ursachen verknüpft sein:

  • a) Follikelflüssigkeit ist bedingt durch Follikelpunktion mit Blut kontaminiert, das PNFF enthält. In diesem Fall müssen die Analysen der Follikelflüssigkeit, z. B. der Expression von FFSP (vgl. Tabelle 1), mit spezieller Aufmerksamkeit durchgeführt werden.
  • b) Eine pathologische Situation trägt dazu bei, dass Blut in die Follikelflüssigkeit eingedrungen ist oder dass einzelne PNFF (vgl. Tabelle 3) durch gestörte Membranfunktionen in die Follikelflüssigkeit gelangt sind. In diesem Fall wäre keine Rotfärbung der Follikelflüssigkeit durch Blutbestandteile sichtbar.

In beiden Fällen ist davon auszugehen, dass die Eizellqualität reduziert ist.

zeigt Beispiele der Messergebnisse mittels SELDI-TOF für vier in Tabelle 3 aufgeführten Proteinmassen PNFF1–4. Die Box Plots zeigen die Wertebereiche der Signalstärke der jeweiligen Proteinmassen von einzelnen Messungen aller punktierten Follikel von 4 Patientinnen. Es ist deutlich ersichtlich, dass die Konzentrationen der Proteinmassen in der Follikelflüssigkeit (FF) im „Rauschbereich” der Messung liegen, während ausschließlich im Serum Werte oberhalb des Rauschbereichs gemessen werden.

Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die in der Tabelle 3 aufgeführten PNFF1–28 bereits unter anderen Namen bekannt sind. Es ist jedoch der Fachwelt nicht bekannt, Follikelflüssigkeiten auf Proteine mit den angegebenen Massen zum Zweck des hier vorgeschlagenen Verfahrens massenspektrometrisch zu untersuchen.

Die Beurteilung der Eizellqualität erfolgt im Ergebnis der nach den Massen der in der Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 massenspektrometrisch untersuchten Follikelflüssigkeit.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • - Ubaldi F, Rienzi L: Morphological selection of gametes, Placenta, 2008, 29, 115–20 [0002]
  • - Wang Q, Sun QY: Evaluation of oocyte quality: morphological, cellular and molecular predictors, Reprod Fertil Dev 19, 200), 1–12 [0003]
  • - Wang Q, Sun QY: Evaluation of oocyte quality: morphological, cellular and molecular predictors, Reprod Fertil Dev 19, 2007, 1–12 [0005]
  • - Zhou M, Veenstra T: Mass spectrometry: m/z 1983–2008, Biotechniques, 2008, 44(5), 667–8, 670 [0006]
  • - Wright GL Jr: SELDI proteinchip MS: a platform for biomarker discovery and cancer diagnosis, Expert Rev Mol Diagn 2002, Vol. 2, No. 6, 549–563 [0007]
  • - F. J. Schweigert et al.: Peptide and Protein profiles in serum and follicular fluid of women undergoing IVF, Human Reproduction 21(11), 2006, 2960–2968 [0008]