Title:
Vorrichtung und Verfahren zur Analyse von Zellen
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung stellt ein Trägersubstrat zur unspezifischen Immobilisierung lebender bakterieller und/oder eukaryotischer Zellen bereit, insbesondere tierischer Zellen, die als Einzelzellen, Zellagglomerate oder Gewebsschnitte vorliegen können. Die Oberfläche des Trägersubstrats ist zumindest abschnittsweise mit einer Oligonukleinsäuren aufweisenden oder daraus bestehenden Schicht versehen, vorzugsweise mit kovalent an das Trägermaterial gekoppelten Ribonukleinsäuren, beispielsweise RNA, vorzugsweise ein- oder zweisträngige DNA.




Inventors:
Hennig, Christian, Dr. (Hannover, 30659, DE)
Hansen, Gesine, Prof. Dr. (Hannover, 30625, DE)
Application Number:
DE102008053270
Publication Date:
05/12/2010
Filing Date:
10/27/2008
Assignee:
Medizinische Hochschule Hannover (Hannover, 30625, DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE19709348A1N/A1997-12-04



Foreign References:
WO2007106598A22007-09-20
WO2000043552A22000-07-27
200200950732002-07-18
WO1999057323A11999-11-11
WO2001042501A12001-06-14
WO2007101706A12007-09-13
61501732000-11-21
WO2007024701A22007-03-01
200201282342002-09-12
200801388482008-06-12
Other References:
Kumar, A. [u.a.]: Silanized nucleic acids: a general platform for DNA immobilization. Nucleic Acids Research (2000), Vol. 28, Nr. 14, S. e71 i-vi
Attorney, Agent or Firm:
Taruttis, S., Dipl.-Ing. Dr.rer.nat., Pat.-Anw. (Hannover, 30159)
Claims:
1. Vorrichtung zur optischen Analyse von auf einem silikathaltigen Trägersubstrat immobilisierten Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat mit Oligonukleinsäuren beschichtet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat von einem beabstandeten Deckel überdeckt ist, wobei das Trägersubstrat und/oder der Deckel optisch transparent ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Oligonukleinsäuren beschichtete Oberfläche des Trägersubstrats horizontal und oberhalb des Deckels angeordnet ist.

4. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat Silikatglas ist.

5. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleinsäuren kovalent an das Trägersubstrat gebunden sind.

6. Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen Trägersubstrat (3) und Deckel (5) beabstandete Abstandshalter (4) angeordnet sind, die mit dem Trägersubstrat (3) und dem Deckel (5) einen Kanal begrenzen, der eine Einlassöffnung (6a) und eine beabstandete Auslassöffnung (6b) aufweist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Abstandshalter (4) zwischen sich eine Ausnehmung, deren Oberflächen etwa senkrecht zum Trägersubstrat (3) angeordnet sind und einen zumindest abschnittsweise zu einem Gewebsstück (1) formschlüssigen Rahmen (2) zwischen Trägersubstrat (3) und Deckel (5) zur Aufnahme eines Gewebsstücks (1) bilden.

8. Verfahren zur Analyse eukaryotischer Zellen mit den Schritten der Kontaktierung von Zellen oder Gewebsstücken mit einem Abschnitt eines Trägersubstrats, der in einem Kanal mit einer Einlassöffnung und einer Auslassöffnung angeordnet ist,
Kontaktierung der auf dem Abschnitt des Trägersubstrats angeordneten Zellen mit einem ersten Antikörperkonjugat, das eine erste Antigenspezifität und einen Fluorochromanteil hat,
Einstrahlen von Licht einer Anregungswellenlänge für den Fluorochromanteil, Detektieren der vom Fluorochromanteil emittierten Strahlung,
Speichern des Abbilds der detektierten Strahlung,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Abschnitt des Trägersubstrats mit Oligonukleinsäuren beschichtet ist und die Zellen unspezifisch in diesem Abschnitt immobilisiert sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat zusätzlich oder alternativ zu der Beschichtung mit Oligonukleinsäuren einen zu einer Gewebsprobe formschlüssigen Rahmen aufweist, der sich bis in einen Abstand zum Deckel erstreckt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gewebsstück formschlüssig in dem Rahmen angeordnet ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an die Detektion der vom Fluorochromanteil emittierten Strahlung das Unwirksammachen der optischen Aktivität des Fluorochromanteils erfolgt, und wiederholt die
Kontaktierung der auf dem Abschnitt des Trägersubstrats angeordneten Zellen mit einem weiteren Antikörperkonjugat, das eine weitere Antigenspezifität und einen Fluorochromanteil hat,
das Einstrahlen von Licht einer Anregungswellenlänge für den Fluorochromanteil, das Detektieren der vom Fluorochromanteil emittierten Strahlung,
das Speichern des Abbilds der jeweils detektierten Strahlung und das Unwirksammachen des Fluorochromanteils des weiteren Antikörperkonjugats erfolgt,
wobei für jeweils eine Kontaktierung mit einem Antikörperkonjugat gespeicherte Abbilder virtuell positionsgenau übereinandergelagert dargestellt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Unwirksammachen des Fluorochromanteils durch Bestrahlung erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbilder, die jeweils nach Kontaktierung mit einem Antikörperkonjugat detektiert wurden, in jeweils einer für das Antikörperkonjugat spezifischen Farbe dargestellt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluorochromanteile der Antikörperkonjugate identisch sind.

15. Verfahren zur Herstellung eines mit Oligonukleinsäuren beschichteten silikathaltigen Trägersubstrats mit den Schritten
des Bereitstellens eines silikathaltigen Trägersubstrats mit reaktionsfähigen Hydroxylgruppen,
Kontaktieren des Trägersubstrats mit Oligonukleinsäure, die eine mit Hydroxylgruppen reaktionsfähige Gruppe aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Bereitstellen der reaktionsfähigen Hydroxylgruppen des Trägersubstrats das Kontaktieren der Oberfläche des Trägersubstrats mit Flusssäure, das Entfernen der Flusssäure und Kontaktieren der Oberfläche mit einem aprotischen Lösungsmittel umfasst.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxylgruppen reaktionsfähige Gruppe der Oligonukleinsäure eine Alkoxysilangruppe ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkoxysilangruppe eine C1- bis C6-Alkoxysilangruppe ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleinsäure eine Alkoxysilangruppe mit der folgenden Struktur aufweist:

20. Silikatglas zur Verwendung als Trägersubstrat in einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder einem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Silikatglas oberflächlich gebundene Oligonukleinsäuren aufweist, und erhältlich ist durch Kontaktieren der Silikatglasoberfläche mit Flusssäure, Kontaktieren der Silikatglasoberfläche mit einem aprotischen Lösungsmittel, und Kontaktieren der Silikatglasoberfläche mit Oligonukleinsäuren, die eine Alkoxysilangruppe aufweisen.

21. Silikatglas nach Anspruch 20, dadurch kennzeichnet, dass die Alkoxysilangruppe eine Methoxysilangruppe ist.

Description:

Die Erfindung betrifft Vorrichtung und Verfahren zur Analyse immobilisierter Zellen, insbesondere lebender prokaryotischer und eukaryotischer Zellen, besonders bevorzugt tierischer und menschlicher Zellen. Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung mit einem zumindest teilweise optisch transparenten Kanal bereitgestellt, der im Strahlengang einer optischen Detektionseinrichtung, z. B. eines optischen Mikroskops und/oder einer optischen Abtasteinrichtung mit Laserstrahl (Laserscanner) anzuordnen ist, wobei eine zumindest abschnittsweise Oberflächenbeschichtung des Kanals die effektive, nicht zellspezifische Adsorption bzw. Immobilisierung lebender Zellen, z. B. aus Kultur, medizinischen Proben oder Biopsien ermöglicht. Die effektive Immobilisierung von Zellen unabhängig vom Zelltyp auf zumindest einem Abschnitt der Oberfläche des Kanals erlaubt die Kontaktierung der immobilisierten Zellen mit Farbstoff – gekoppelten Sonden, insbesondere Farbstoff – gekoppelten Antikörpern, die optische Detektion des Farbstoffs, Inaktivierung des Farbstoffs, und die wiederholte Kontaktierung der immobilisierten Zellen mit einem weiteren Farbstoff – gekoppelten Antikörper zur aufeinander folgenden Detektion verschiedener Analyten, insbesondere von oberflächengebundenen und/oder zellinternen Antigenen durch Antikörper.

Stand der Technik

Mahnke und Roederer, (Clin Lab Med. 2007, 27 (3) (2007)) beschreiben, wie für die Durchflusszytometrie eine Mehrzahl von Antikörperkonjugaten für den Nachweis von Antigenen auf Zellen aufeinander abgestimmt werden können, um bei deren gleichzeitigen Einsatz Interferenzen der Fluorochromanteile zu vermeiden, die jeweils unterschiedliche Emissionsspektren haben. Zur Trennung überlappender Emissionsspektren, insbesondere bei unspezifischer Anregung eines Fluorochroms durch Energietransfer von einem anderen Fluorochrom, wird eine rechnergestützte Auswertung der Signale vorgeschlagen, bei der unspezifische Emissionssignale als Hintergrund abgezogen werden können.

Laffers et al. (Cytometry Part A 69A: 127–130 (2006)) beschreiben die Analyse von lebenden Zellen per FACS oder Mikroskopie von lysierten, denaturierten Zellen, die nach Inkubation in Suspension mit einem markierten Antikörper auf einen Objektträger aufgetragen und durch Trocknen immobilisiert wurden. Die Antikörper-Fluorochrom-Konjugate wiesen jeweils unterschiedliche Fluorochrome auf. Für die Auswertung wurden die Daten aus der Durchflusszytometrie (FACS) oder Mikroskopie mit Fluoreszenzdetektion computergestützt überlagert.

Tárnok (Cytometry Part A 69A: 555–562 (2006)) erwähnt neben der Zytometrie unter Verwendung von Antikörperkonjugaten mit verschiedenen Fluorochromen die nacheinander folgende Anwendung von Antikörper-Fluorochrom-Konjugaten, das Ausbleichen von Fluorochromen mittels Bestrahlung, die Aktivierung und die Zerstörung von Fluorochromen mittels Strahlung.

Perfetto et al. (Nature 648–654 (2004)) beschreiben Durchflusszytometer für die Detektion einer Vielzahl von Fluorochromen durch jeweils sehr kurz nacheinander erfolgende spezifische Anregung und Wellenlangen-spezifische Detektion emittierten Lichts, was als gleichzeitige Messung bezeichnet wird. Es wird gezeigt, dass verschiedene Fluorochrome, die gleichzeitig in einer Probe vorliegen, bei Anregung mit einer Wellenlänge, die Fluorochromospezifisch ist, dennoch unspezifische Emissionen zeigen, was auf einen Energietransfer unter den Fluorochromen zurückgeführt wird. Zur Vermeidung unspezifischer Signale wird die Abstimmung der gleichzeitig einzusetzenden Antikörper-Fluorochrom-Konjugate in einem empirischen Verfahren vorgeschlagen. Zur weiteren Verminderung unspezifischer Emissionssignale wird ein mathematische Kompensation vorgeschlagen, mit der Emissionen herausgerechnet werden, die auf den unspezifischen Energietransfer zwischen Fluorochromen zurückgehen können.

Die US 6,150,173 beschreibt einen rechnergesteuerten Pipettierautomaten, mit dem jeweils nacheinander Antikörper-Fluorochrom-Konjugate mit einer Probe inkubiert werden, nach Einstrahlung einer Anregungswellenlänge die emittierte Strahlung gemessen wird, anschließend das Fluorochrom durch Bestrahlung mit UV zerstört wird, und ein neues Antikörper-Fluorochrom-Konjugat zu der selben Probe gegeben wird. Als Probe werden durch Trocknen, Fixieren mit Aceton und neuerliches Trocknen auf einem Objektträger immobilisierte Zellen verwendet.

Die DE 197 09 348 und die WO 2007/101706 A1 beschreiben, dass vor der Detektion eines spezifischen Antikörper-Fluorochrom-Konjugats die biologische Probe durch Bestrahlung behandelt wird, um unerwünschte Fluoreszenz zu verringern.

Die WO 2007/024701 beschreibt eine Durchflusskammer zur mikroskopischen Beobachtung, innerhalb der halbschalenförmige Erhebungen einen Teil der Querschnittsfläche überdecken und als Reusen zur Aufnahme von Mikropartikeln oder Zellen dienen. Die Agglomeration von Nanopartikeln hält diese an den Reusen fest, sodass die Agglomeration als optischer Indikator verwendet wird.

US 2008/0138848 A1 beschreibt die besondere Gestalt einer Durchflusszelle, in der beispielsweise Hefezellen stationär in der Strömung gehalten werden und mikroskopisch analysiert werden können.

Die WO 2007/106598 beschreibt die Beschichtung von Oberflächen mit spezifischen Bindemolekülen, beispielsweise Antikörper, um eine Wechselwirkung mit einem Analyten herzustellen, und erwähnt Nukleinsäuren als Bindemolekül, ohne deren Eignung zur Wechselwirkung zu zeigen. Die US 2002/0128234 A1 verwendet derivatisiertes PEG zur Anbindung des Bindemoleküls.

Die bekannten Vorrichtungen zur Immobilisierung von Zellen sind dahingehend nachteilig, dass entweder nur denaturierte Zellen auf einem Trägersubstrat fixiert werden können, oder nur vorbestimmte Zellen spezifisch immobilisiert werden, beispielsweise durch Antikörper, die auf dem Trägersubstrat gebunden sind. Die bekannten Verfahren zur Analyse von Zellen verwenden jeweils die durchflusszytometrische Detektion spezifisch markierter Zellen, so dass notwendigerweise alle spezifischen Markierungsreagenzien gleichzeitig optisch aktiv und mit den Zellen in Kontakt sein müssen, woraus sich störende Wechselwirkungen der optisch detektierbaren Anteile ergeben.

Aufgabe der Erfindung

Gegenüber dem vorbekannten Stand der Technik ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vorrichtung und Verfahren zur Analyse von Zellen bereitzustellen, wobei die Zellen, insbesondere bakterielle und tierische Zellen, auf einfache Weise lebend auf einem Trägersubstrat immobilisiert werden können.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung löst die Aufgabe durch Bereitstellen eines Trägersubstrats zur unspezifischen Immobilisierung lebender bakterieller und/oder eukaryotischer Zellen, insbesondere tierischer Zellen, die als Einzelzellen, Zellagglomerate oder Gewebsschnitte vorliegen können. In einer ersten Ausführungsform ist die Oberfläche des Trägersubstrats zumindest abschnittsweise zwischen den Abstandshaltern mit einer Oligonukleinsäuren aufweisenden oder daraus bestehenden Schicht versehen, vorzugsweise mit kovalent an das Trägermaterial gekoppelten Ribonukleinsäuren, beispielsweise RNA, vorzugsweise ein- oder zweisträngige DNA. Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Begriff der Oligonukleinsäuren natürliche und synthetische Nukleinsäureketten, jeweils einsträngig oder zweisträngig, vorzugsweise mit einer Länge von mindestens 5 nt (Nukleotiden), bevorzugter 10 bis 10.000 nt, noch bevorzugter bis 5000 nt oder bis 1000 nt, besonders bevorzugt 10 bis 100 oder bis 50 nt. Bevorzugt besteht die zumindest abschnittsweise Beschichtung des Trägersubstrats aus chemisch gebundenen ein- und/oder zweisträngigen Oligonukleinsäuren, insbesondere DNA. Vorzugsweise ist das Trägersubstrat silikathaltig, beispielsweise silikathaltiges Glas, besonders bevorzugt Borosilikatglas.

Optional zusätzlich oder als Alternative zu der zumindest abschnittsweisen Beschichtung des Trägersubstrats mit kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren innerhalb des Kanals weist das Trägersubstrat einen Rahmen auf, der als zur Probe, beispielsweise einem Gewebsschnitt, formschlüssiger Vorsprung auf dem Trägersubstrat angeordnet ist. Durch einen solchen Rahmen auf dem Trägersubstrat können Zellen, die in einem Gewebsschnitt enthalten sind, formschlüssig positionsgenau auf dem Trägersubstrat immobilisiert sein, sodass lebende Zellen innerhalb des Gewebsschnitts wiederholt analysiert werden können, wobei jeweils positionsgenau einzelne Abschnitte des Gewebsschnitts wiederholt optisch analysiert werden können, auch wenn das Trägersubstrat zwischen einzelnen Detektionsschritten aus dem Gesichtsfeld des zur Analyse verwendeten Mikroskops entfernt wird. Denn sowohl die formschlüssige Halterung eines Gewebsschnitts auf dem Trägersubstrat, als auch die Immobilisierung von Zellen auf der mit Oligonukleinsäuren beschichteten Oberfläche des Trägersubstrats erfolgt unabhängig vom Zelltyp, daher nicht zellselektiv, und positionsgenau, sodass die Positionen immobilisierter Zellen in den Ausführungsformen der Erfindung in Relation zum Trägersubstrat positionsgenau und damit wiederholt analysierbar sind. Entsprechend ist das Analyseverfahren mit den als Trägersubstrat verwendeten, mit kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren beschichtete Silikatglas vorzugsweise zyklisch, wobei in jedem Zyklus, der zumindest die Schritte Kontaktieren mit Antikörperkonjugat, Detektieren von dessen Fluorochromanteil und Unwirksammachen des Fluorochromanteils enthält oder daraus besteht, ein Antikörperkonjugat mit anderer Antigenspezifität verwendet wird und die Zellen lebend immobilisiert oder denaturiert bzw. perforiert fixiert sind.

Anstelle eines Antikörperkonjugats können Nachweiskonjugate eine andere Bindegruppe als einen Antikörper aufweisen, die an ein Fluorochrom gekoppelt ist. Entsprechend umfasst der Begriff der Antikörperkonjugate für die Zwecke der Erfindung auch Fluorochrom-gekoppelte Bindemoleküle, die für einen Bestandteil einer Zelle spezifisch sind. Solche Bindemoleküle können ausgewählt sein aus synthetischen ein- oder mehrkettigen Antikörpern, Lektinen und rezeptorspezifischen Bindemolekülen.

Dabei hat die erfindungsgemäße Beschichtung von Silikatglas mit Oligonukleinsäuren den Vorteil, eine hohe Dichte und gleichmäßige Verteilung immobilisierter lebender Zellen bei Kontaktierung mit suspendierten Zellen zu erzeugen. Zusätzliche Reagenzien sind für die Immobilisierung prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen auf der mit kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren beschichteten Silikatglasoberfläche nicht erforderlich, so dass das Verfahren zur Immobilisierung aus der Kontaktierung der mit Oligonukleinsäuren beschichteten Silikatglasoberfläche mit Zellen oder Zellagglomeraten oder Gewebsstücken in Suspension bestehen kann, wobei die Suspension wässrig mit einem für die Zellen verträglichen Salzgehalt sein kann, wahlweise ohne organische Bestandteile.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Immobilisierung lebender eukaryotischer, insbesondere tierischer und menschlicher Zellen auf einem Trägersubstrat liegt gegenüber bekannten Immobilisierungsverfahren darin, dass bei der erfindungsgemäßen Oligonukleotidbeschichtung eine nicht zelltypspezifische Immobilisierung erfolgt, sondern vielmehr eine unspezifische Immobilisierung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, z. B. von Bakterien und insbesondere von tierischen einschließlich menschlicher Zellen. Die erfindungsgemäße Beschichtung erlaubt die Immobilisierung von tierischen Zellen über einen langen Zeitraum, beispielsweise mindestens 4 h, vorzugsweise mindestens 8 bis 10 h, wobei die Zellen in Zellkulturmedium innerhalb des Kanals lebensfähig sind, der vom Trägersubstrat, dem beabstandeten Deckel und zwei Abstandshaltern gebildet wird. Die Abstandshalter füllen den Abstand zwischen Trägersubstrat und Deckel aus, wobei der zwischen Trägersubstrat, Deckel und Abstandshaltern gebildete Kanal an einem, vorzugsweise an zwei beabstandeten Stellen, vorzugsweise einem ersten und einem gegenüberliegenden zweiten Ende, Öffnungen zum Ein- bzw. Auslass flüssiger Zusammensetzungen aufweist. Der Querschnitt des Kanals kann frei gewählt sein, vorzugsweise sind Trägersubstrat und beabstandet gegenüberliegender Deckel im Überdeckungsbereich parallel zueinander. Die Abstandshalter, die den Abstand zwischen Trägersubstrat und Deckel unter Bildung zumindest einer, vorzugsweise jeweils einer Einlass- und einer Auslassöffnung überdecken, können auf dem Trägersubstrat und/oder dem Deckel angebracht oder integral mit einem dieser geformt sein, so dass eine oder zwei Öffnungen, durch die das Innenvolumen des Kanals zugänglich ist, im Deckel und/oder im Trägersubstrat angeordnet sind. Das Trägersubstrat ist vorzugsweise optisch transparent und in Form einer Platte, alternativ in Partikelform. Besonders bevorzugt ist auch der Deckel optisch transparent.

Die Kontaktierung der immobilisierten Zellen innerhalb des Kanals ist durch eine Flüssigkeitsströmung entlang des Kanals möglich, beispielsweise durch Aufgeben einer wässrigen Zusammensetzungen mit einem spezifischen Farbstoff – gekoppelten Antikörper an einer ersten Öffnung des Kanals und Austretenlassen wässriger Zusammensetzungen aus der gegenüberliegenden zweiten Öffnung des Kanals, vorzugsweise unterstützt durch Entfernen austretender Flüssigkeit. Aufgrund des erfindungsgemäß geringen Innenvolumens des Kanals, beispielsweise im Bereich von 1 bis 200 μL, vorzugsweise 2 bis 20 μL, sind Volumina von 0,5 μL bis 200 μL, vorzugsweise 1 bis 10 μL der wässrigen Zusammensetzungen mit einem Gehalt an Farbstoff – gekoppeltem Antikörper ausreichend, um den immobilisierten Zellen den ersten und, nach dessen Detektion und Ausbleichen, einen weiteren Antikörper zuzuführen.

Eine erste Öffnung des Kanals wird an einem ersten Ende des Kanals gebildet, z. B. durch die Querschnittsfläche, die von dem Trägersubstrat und dem beabstandeten Deckel sowie zwei Abstandshaltern aufgespannt wird, während im gegenüberliegenden zweiten Ende des Kanals eine zweite Öffnung gebildet wird, z. B. durch die Querschnittsfläche des Kanals, die zwischen Trägersubstrat und Deckel sowie die zwischen diesen angeordneten Abstandshaltern aufgespannt wird. Vorzugsweise sind Abstandshalter, die den Querschnitt des Kanals begrenzen, mit dem Deckel verbunden, während das Trägersubstrat mit der Beschichtung mit Oligonukleinsäuren gegen die Abstandshalter angeordnet ist, wahlweise nur durch kraftschlüssige Anordnung oder durch formschlüssige Anordnung und/oder mit zwischen Abstandshaltern und Trägersubstrat angebrachtem Klebstoff. Vorzugsweise ist das Trägersubstrat beim Analyseverfahren horizontal und oberhalb des Deckels angeordnet, insbesondere während der Detektion, so dass die mit Oligonukleotiden beschichtete Oberfläche des Trägersubstrats die obere Begrenzung des Kanals bildet und z. B. am Trägersubstrat immobilisierte Zellen in den Kanal zwischen Trägersubstrat und Deckel hängen.

In Ausführungsformen, in denen ein zu einer Gewebsprobe formschlüssiger Rahmen auf dem Trägersubstrat angeordnet ist, hat der Rahmen vorzugsweise eine Höhe von 0,8 bis 5 mal der Schichtdicke der Gewebsprobe, vorzugsweise eine Höhe von 1 bis 1,5 mal der Schichtdicke der Gewebsprobe, wobei der Deckel in einem Abstand zu Gewebsprobe und Rahmen angeordnet ist. Die Oberflächen des Rahmens sind vorzugsweise senkrecht zu der mit Oligonukleinsäure beschichteten Oberfläche des Trägersubstrats angeordnet. Auf diese Weise ermöglicht der formschlüssig um die Gewebsprobe angeordnete Rahmen den Durchtritt wässriger Zusammensetzungen durch den Kanal, der zwischen Trägersubstrat und Deckel gebildet ist, sodass diese, beispielsweise Waschlösungen und Antikörperkonjugate, die an einer Einlassöffnung in den Kanal einströmen gelassen werden, die Gewebsprobe kontaktieren können, wobei vorzugsweise an einer der Einlassöffnung gegenüberliegenden Auslassöffnung wässrige Zusammensetzung ausströmen gelassen wird, vorzugsweise unterstützt durch Absaugen.

Alternativ zur Immobilisierung lebender Zellen und/oder von Gewebe kann das erfindungsgemäß mit einer Beschichtung von Oligonukleinsäuren und/oder mit einem zur Gewebsprobe formschlüssigen Rahmen versehene Trägersubstrat zur Immobilisierung denaturierter und/oder perforierter Zellen und Gewebsproben verwendet werden. Vorzugsweise werden beim erfindungsgemäßen Verfahren auf dem mit Oligonukleinsäuren und/oder mit einem Rahmen versehenen Trägersubstrat lebende Zellen oder Gewebsschnitte immobilisiert, die nach Analyse, beispielsweise nach einem Zeitraum von 1 bis 10 h analysiert wurden, die optional zusätzlich im immobilisierten Zustand denaturiert und/oder perforiert wurden, beispielsweise durch Zugabe von Formalin und/oder Aceton und/oder Puffer mit Saponin (erhältlich als FixPerm von BD Biosciences) und/oder Methanol.

Alternativ zu lebenden bzw. toten und nicht denaturierten Zellen können beim erfindungsgemäßen Verfahren fixierte und/oder denaturierte Zellen aus einer Suspension durch Kontaktieren der Suspension mit dem Trägersubstrat auf diesem immobilisiert werden.

Das Trägersubstrat mit einer Beschichtung, die aus Oligonukleinsäuren besteht, und/oder mit einem zu einer Gewebsprobe formschlüssigen Rahmen können daher auch in Analyseverfahren mit Denaturierung und Perforation der immobilisierten Zellen verwendet werden, so dass immobilisierte lebende Zellen im Anschluß an die Analyse auf dem Trägersubstrat im lebenden Zustand optional denaturiert und/oder perforiert werden, und in gleicher Position im Gesichtsfeld der optischen Detektionseinrichtung wie im lebenden Zustand dann im denaturierten Zustand analysiert werden.

Die erfindungsgemäße Beschichtung des silikathaltigen Trägersubstrats mit Oligonukleinsäuren ist vorzugsweise von kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren gebildet, die in dichter Anordnung auf der Oberfläche des Trägersubstrats angeordnet sind, vorzugsweise in einer im wesentlichen kontinuierlichen Anordnung, also unterbrechungsfrei, zumindest in einem Detektionsabschnitt des Trägersubstrats. Der Detektionsabschnitt des Trägersubstrats liegt innerhalb des Kanals und wird zur optischen Analyse vom Gesichtsfeld, d. h. dem optischen Erfassungsbereich der optischen Detektionseinrichtung erfasst. Besonders bevorzugt ist das Trägersubstrat, das mit kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren beschichtet ist, die im Detektionsabschnitt eine kontinuierliche Beschichtung bilden, durch Umsetzung des Trägersubstrats zumindest im Detektionsabschnitt durch Kontaktieren mit Alkoxysilangruppen-haltigen Oligonukleotiden in aprotischer Phase, z. B. in organischer Phase erhalten. Denn es hat sich herausgestellt, dass die Kontaktierung einer Silikatoberfläche in organischer Phase mit Alkoxysilangruppen-haltigen Oligonukleotiden die kovalente Bindung von Oligonukleotiden an die Silikatoberfläche ergibt. Vorzugsweise weist die Silikatoberfläche mit Alkoxysilan, insbesondere Methoxysilan, reaktionsfähige Hydroxylgruppen auf, die z. B. durch Anätzen zur Vorbehandlung erhältlich sind, beispielsweise durch Kontaktierung mit wässriger Fluorwasserstoffsäure (HF, Flusssäure).

Die erfindungsgemäß mit kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren beschichteten Silikatglasoberflächen haben den Vorteil, dass Zellen durch Kontaktieren ohne weitere reaktive Zusätze in reproduzierbar hoher Dichte im lebenden Zustand immobilisiert werden.

Diese reproduzierbare Dichte der Immobilisierung von Zellen tritt im wesentlichen unabhängig vom Bindungsverhalten des Silikatglases auf, das dieses ohne die Beschichtung mit Oligonukleinsäuren aufweist, so dass durch die erfindungsgemäße Beschichtung im wesentlichen unabhängig von den Bindungseigenschaften des unbeschichteten Silikatglases eine hohe und reproduzierbare Bindungswirkung für Zellen erzeugt wird.

Die mit einer Alkoxysilangruppe verbundenen Oligonukleinsäuren, insbesondere Methoxysilangruppen-haltige Oligonukleinsäuren umfassen Nukleinsäuremoleküle oder Desoxyribonukleinsäuremoleküle mit mindestens 5 bis mindestens 50, vorzugsweise mindestens 10 bis mindestens 10000 willkürlich angeordneten Nukleotiden, die z. B. synthetisiert sind oder aus biologischem Material isolierte DNA und/oder RNA sind. Die kovalent an die Oligonukleinsäure gebundene Alkoxysilangruppe ist vorzugsweise eine di- oder tri-Alkoxysilangruppe und kann durch herkömmliche Syntheseverfahren mit den Oligonukleinsäuren verbunden werden, z. B. mittels Kopplungsgruppen, die zwischen einer endständigen Phosphatgruppe der Oligonukleinsäure und einer Alkoxysilangruppe angeordnet sind.

Erfindungsgemäßes, mit kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren beschichtetes Silikatglas, z. B. Borosilikatglas, ist durch Kontaktieren eines silikathaltigen Trägersubstrats, das reaktive Hydroxylgruppen aufweist, unter aprotischen Bedingungen mit Oligonukleinsäure erhältlich, die mit Hydroxylgruppen reaktive Gruppen aufweist, z. B. in einem Verfahren, das die Schritte enthält:
Kontaktierung des silikathaltigen Trägermaterials mit Flusssäure, vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-% in Wasser,
Entfernen der Flusssäure vom Trägersubstrat,
Kontaktieren des Trägersubstrats mit aprotischem, insbesondere organischem Lösungsmittel und
Kontaktieren des Trägersubstrats mit Oligonukleinsäuren, die zumindest eine reaktive Silikatgruppe enthalten, beispielsweise Alkoxysilan-haltige Oligonukleinsäuren, insbesondere Methoxysilan-haltige Oligonukleinsäuren, beispielsweise Methoxysilan-konjugierte Oligonukleinsäuren, in aprotischem, insbesondere organischem Lösungsmittel.

Vorzugsweise wird das mit kovalent gebundenen Oligonukleinsäuren beschichtete silikathaltige Trägersubstrat, z. B. Silikatglas, während des Herstellungsverfahrens, während der Lagerung bis zur Verwendung zur Immobilisierung und während der Immobilisierung und des Analyseverfahrens zumindest in dem mit Oligonukleinsäuren beschichteten Abschnitt in Kontakt mit Flüssigkeit gehalten. Denn es hat sich gezeigt, dass das Trockenen des mit Oligonukleinsäuren beschichteten Abschnitts des Silikatglases zu einer Erhöhung der unspezifischen Bindung von Antikörperkonjugaten führt, die im Analyseverfahren verwendet werden.

Das Entfernen der Flusssäure vom Trägersubstrat und das anschließende Kontaktieren mit organischem Lösungsmittel, das vorzugsweise ein C1- bis C6-Alkohol ist, besonders bevorzugt Methanol, Ethanol und/oder Aceton, kann durch Verdrängen der Flusssäure, die vorzugsweise in wässriger Lösung vorliegt, durch das organische Lösungsmittel erfolgen.

Die erfindungsgemäße Beschichtung des silikathaltigen Trägersubstrats mit Oligonukleinsäuren bildet eine hochdichte, vorzugsweise monomolekulare Schicht von Oligonukleinsäuren auf dem Trägersubstrat, die eine hohe Kapazität zur Immobilisierung von Zellen, insbesondere tierischer Zellen unabhängig vom Zelltyp und/oder unabhängig von Oberflächenmarkern der Zellen aufweist. Daher ermöglicht die erfindungsgemäße Oligonukleinsäure – Beschichtung des Trägersubstrats die nicht zellspezifische Immobilisierung lebender Zellen, insbesondere bakterieller und tierischer Zellen, sodass bei Analyse einer biologischen Probe jede darin enthaltene Zellart entsprechend ihres Anteils an der Probe immobilisiert wird, und die Immobilisierung keine zellspezifische Selektion ergibt. Dies ist insbesondere für die Analyse von Oberflächenmarkern von Zellen vorteilhaft, da der spezifische Nachweis von Oberflächenmarkern auf Zellen unabhängig von der Immobilisierung der Zellen auf dem Trägersubstrat gewählt werden kann, nämlich allein durch Auswahl einer markerspezifischen Sonde, vorzugsweise Auswahl des Antikörperanteils eines Antikörperkonjugats mit Fluorochromanteil.

Gegenüber bekannten Verfahren zur Immobilisierung von Zellen, die jeweils auf die zelltypspezifische Immobilisierung ausgerichtet sind, hat die mit Oligonukleinsäuren und/oder einem zur Gewebsprobe formschlüssigen Rahmen versehene Oberfläche des Trägersubstrats eine wesentlich höhere Kapazität zur Bindung lebender Zellen; weiterhin ist die Immobilisierung stabil, beispielsweise über einen Zeitraum von bis zu 8 h für lebende Zellen, sodass eine mehrfache Kontaktierung der immobilisierten Zellen durch wiederholtes Durchströmenlassen von Antikörperkonjugaten in wässriger Zusammensetzung, die jeweils unterschiedliche Antigenspezifitäten haben, im Wesentlichen ohne Zellverlust möglich ist. Ein Vorteil des Oligonukleinsäure-beschichteten silikathaltigen Trägersubstrats liegt darin, dass die Immobilisierung ohne aufwendige Probenvorbereitung erfolgen kann, z. B. bei Blut nach Behandlung nur durch Erythrolyse, vorzugsweise nach Abtrennung lysierter Erythrozyten-Bestandteile von den intakten Zellen durch Zentrifugation, oder durch Isolierung eines gewünschten Zelltyps, z. B. durch Ficoll-Gradientenzentrifugation, Durchflußzytometrie-Verfahren oder Sortierverfahren mit zellspezifischen magnetischen Partikeln (MACS, Miltenyi Biotech). Andere medizinische Proben, die keine Verunreinigungen oder Erythrozyten enthalten, konnten ohne Aufbereitung der Probe unmittelbar immobilisiert werden, z. B. Liquor, Aszites, bronchio-alveoläre Spülung, Feinnadel-Punktat, Gewebe- oder Organbiopsien, optional nach Zellvereinzelung.

Vorzugsweise ist das Trägersubstrat zur Detektion an einer optischen Detektionseinrichtung so angeordnet, dass die mit Oligonukleotiden beschichtete Oberfläche des Trägersubstrats horizontal positioniert ist, vorzugsweise oberhalb des Deckels, sodass immobilisierte Zellen unterhalb des Trägersubstrats angeordnet sind. Zur Detektion ist es bevorzugt, dass sowohl Trägersubstrat als auch Deckel transparent sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von zellgebundenen Antigenen erfolgt durch

  • – Immobilisierung von Zellen, die Einzelzellen, Zellagglomerate und/oder Gewebsproben sein können, z. B. in Suspension, durch Kontaktierung mit dem mit Oligonukleotiden beschichteten Detektionsabschnitt des Trägersubstrats und/oder durch Anordnung innerhalb eines formschlüssigen Rahmens, der unmittelbar oder beabstandet auf dem Trägersubstrat angeordnet ist, vorzugsweise zur Verwendung mit Gewebsschnitten,
  • – Kontaktieren der Zellen mit einem ersten Antikörperkonjugat, das eine erste Antigenspezifität und einen Fluorochromanteil aufweist,
  • – Detektieren von Strahlung, die bei Einstrahlung von Licht mit einer Anregungswellenlänge vom Fluorochromanteil emittiert wird,
  • – Unwirksammachen bzw. Inaktivieren des Fluorochromanteils, beispielsweise durch Bestrahlung, z. B. mit UV-Licht oder der Anregungswellenlänge des Fluorochroms zum Ausbleichen,
  • – Kontaktieren der Zellen mit einem zweiten oder weiteren Antikörperkonjugat, das eine zweite bzw. weitere Antigenspezifität und den selben oder einen anderen Fluorochromanteil wie das erste Antikörperkonjugat aufweist, und
  • – Detektieren der bei Einstrahlung von Licht mit einer Anregungswellenlänge von dem Fluorochromanteil des zweiten Antikörperkonjugats emittierten Strahlung, optional mit Waschen der immobilisierten Zellen nach Kontaktierung mit einem der Antikörperkonjugate, beispielsweise durch Hindurchströmenlassen einer wässrigen Zusammensetzung, beispielsweise von Medium zur Zellkultur und/oder Puffer durch den Kanal, von dem ein Oberflächenabschnitt vom Trägersubstrat gebildet wird,
  • – Wiederholung der Schritte des Kontaktierens, Detektierens und Unwirksammachens des Fluorochromanteils mit jeweils einem weiteren Antikörperkonjugat.
  • – Vorzugsweise enthält das Verfahren den Schritt der automatischen Positionsbestimmung von detektierten Fluoreszenzsignalen in Relation zur Position des Trägersubstrats, und
  • – die virtuelle positionsgenaue Überlagerung von Abbildern detektierter Fluoreszenzsignale.

Alternativ zur zyklischen Abfolge des Kontaktierens immobilisierter Zellen mit einem Antikörper-Farbstoff-Konjugat, Entfernen ungebundenen Antikörperkonjugats, Detektion des Antikörperkonjugats und Unwirksammachen des Antikörperkonjugats, kann das Verfahren die Kontaktierung der immobilisierten Zellen mit mindestens 2 oder mehr Antikörperkonjugaten und deren gleichzeitige Detektion umfassen. Bei Verwendung von 2 oder mehr Antikörperkonjugaten haben diese vorzugsweise verschiedene Fluorochromanteile und die Detektion erfolgt bei zumindest zwei Wellenlängen, um verschiedene Fluorochromanteile getrennt voneinander zu detektieren.

Die Verfahrensschritte des Kontaktieren immobilisierter Zellen oder Gewebsstücke mit Antikörperkonjugat, Bestrahlen bei Anregungswellenlänge, Detektion emittierter Strahlung, Unwirksammachen des Fluorochromanteils des Antikörperkonjugats, z. B. durch Ausbleichen, können mehrfach nacheinander mit jeweils unterschiedlichen Antikörperkonjugaten erfolgen, die sich in ihrem Antikörperanteil bzw. ihrer Antigenspezifität unterscheiden, wobei optional der Fluorochromanteil des Antikörperkonjugats jeweils gleich ist. Da beim erfindungsgemäßen Verfahren die Zellen ortsspezifisch am Trägersubstrat immobilisiert sind, wird vorzugsweise das bei der Detektion emittierter Strahlung aufgenommene Abbild mit ortsspezifischer Zuordnung des Abbilds zum Trägersubstrat gespeichert. Die ortsspezifische Zuordnung des Abbilds kann dadurch erfolgen, dass das Trägersubstrat bei der Detektion immer die selbe Position zur optischen Detektionseinrichtung einnimmt, z. B. dieselbe Lage auf dem Objekttisch eines Mikroskops. Alternativ kann die Zuordnung und Speicherung der Position des Abbilds durch Identifikation der Position einer Markierung auf dem Trägersubstrat erfolgen in Relation zum Gesichtsfeld und/oder zum Strahlengang der Detektionseinrichtung erfolgen. Auf Grundlage der durch die Immobilisierung von Zellen auf dem Trägersubstrat festgelegte Position ist eine wiederholte Detektion der selben Zelle bzw. des selben Abschnitts des Trägersubstrats mit Antikörperkonjugaten jeweils unterschiedlicher Antigenspezifität möglich, wobei jedes Antikörperkonjugat separat detektiert wird, und daher störende Wechselwirkungen mit anderen Antikörperkonjugaten reduziert bzw. vermieden werden.

Alternativ oder zusätzlich zur spezifischen Detektion von Zellbestandteilen mittels eines Antikörperkonjugats kann das erfindungsgemäße Verfahren zumindest eine Gewebsfärbung vor oder nach der Kontaktierung mit Antikörperkonjugat umfassen, z. B. die Hämatoxylin-Eosin Färbung und/oder die May-Grünwald-Färbung.

Vorzugsweise wird die ortsspezifische Zuordnung des Abbilds bei der virtuellen Überlagerung von Abbildern, die bei Kontaktierung der Probe mit verschiedenen Antikörperkonjugaten detektiert wurden, die ortsspezifische Zuordnung von Zellen mit der virtuellen Mustererkennung eines für jedes Abbild aufgenommenen lichtmikrokopischen Abbilds und die virtuelle passende Ausrichtung des erkannten Musters von Zellen zur Verbesserung der Genauigkeit kombiniert.

Weiterhin erlaubt die Wiederholbarkeit der Analyse lebender Zellen mit Antikörperkonjugaten unterschiedlicher Antigenspezifität während einer Dauer von mindestens 5 bis 10 h die Auswahl von Antikörperkonjugaten auf Basis der Abbilder, die bei vorherigen Kontaktierungen der immobilisierten Zellen mit Antikörperkonjugaten anderer Antigenspezifität detektiert wurden. Dieses iterative Analyseverfahren ermöglicht die positionsabhängige Zuordnung der für jedes Antikörperkonjugat detektierten Abbilder und deren virtuelle Überlagerung. Daher ermöglicht das erfindungsgemäße Analyseverfahren durch die positionsabhängige Zuordnung der Abbilder zum einen die Analyse der selben Zellen bzw. des selben Gewebsstücks die spätere virtuelle Überlagerung der Abbilder und damit eine genaue Analyse einzelner Zellen oder Gewebsabschnitte, zum anderen die Auswahl von Antikörperkonjugaten mit einer besonderen Antigenspezifität auf Basis der Abbilder, die zuvor für einen Abschnitt des Trägersubstrats einer ausgewählten und festgelegten Position für Antikörperkonjugate detektiert wurden. Die Auswahl der Antikörperkonjugate kann ohne Abstimmung des Fluorochromanteils mit Fluorochromanteilen anderer Antikörperkonjugate erfolgen, da Wechselwirkungen der Fluorochromanteile vermieden werden, so dass die nacheinander verwendeten Antikörperkonjugate den gleichen Fluorochromanteil aufweisen können.

Besonders bevorzugt enthält das Verfahren den Schritt der Aufnahme eines lichtmikroskopischen Abbilds der Zellen, und deren automatischer Positionsbestimmung, optional gekoppelt mit dem Schritt der positionsgenauen Zuordnung der automatisch bestimmten Positionen zu detektierten Fluoreszenzsignalen. Die positionsabhängige Zuordnung der aus der Detektion von Fluoreszenzsignalen erzeugten Abbilder ist eine positionsgenau wiederholbare Detektion eines Abschnitts des Trägersubstrats bzw. der darauf immobilisieren Zellen, insbesondere bei Ausführungsformen, in denen das Trägersubstrat bei der Detektion unterschiedlicher Antikörperkonjugate die selbe Position im Gesichtsfeld der optischen Detektionseinrichtung einnimmt.

In Ausführungsformen des Analyseverfahrens, die den Schritt der virtuellen Überlagerung von positionsgenauen Abbildern eines Abschnitts des Trägersubstrats mit darauf immobilisierten lebenden prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen enthalten, wobei die Abbilder jeweils durch Wiederholung der Schritte des Kontaktierens der Zellen mit Antikörperkonjugat, der Detektion der mit den Zellen kontaktierten Antikörperkonjugate und des Unwirksammachens des Fluorochromanteils der Antikörperkonjugate mit Antikörperkonjugaten unterschiedlicher Antigenspezifität in jedem Schritt erzeugt sind, ist das Verfahren nicht auf die Immobilisierung auf mit Oligonukleinsäuren beschichtete Trägersubstrate beschränkt. Alternativ zur Beschichtung von Trägersubstrat mit Oligonukleinsäuren, die insbesondere zur Verwendung für die Immobilisierung lebender tierischer Zellen bevorzugt ist, kann das Trägersubstrat auch eine andere herkömmliche Beschichtung aufweisen, z. B. mit Polylysin, oder aus einem synthetischen Material bestehen, das die Anhaftung von Zellen fördert, z. B. Polystryol. Für das Verfahren zur Analyse von Zellen, die denaturiert sind, kann die Fixierung auf einem Trägersubstrat ohne besondere Beschichtung erfolgen.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird mm genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren beschrieben, in denen

1 unter A) als Vergleich eine gereinigte Glasoberfläche und unter B) eine mit Oligonukleinsäuren beschichtete Glasoberfläche in Einzelmoleküldetektion zeigt,

2 die Abbilder immobilisierter Zellen nach antigenspezifischer Markierung mit Fluoreszenzdetektion unter A) als Vergleich auf einer gereinigten Glasoberfläche und unter B) auf einer mit Oligonukleinsäuren beschichteten Glasoberfläche zeigt,

3 lichtmikroskopische Abbilder von Zellen unter A) als Vergleich auf einer gereinigten Glasoberfläche und unter B) auf einer mit Oligonukleinsäuren beschichteten Glasoberfläche zeigt,

4 die Ergebnisse einer Vitalitätsprüfung auf einer Trägeroberfläche immobilisierter lebender menschlicher Immunzellen mit und ohne unspezifische Stimulation zeigt,

5A) unter I) immobilisierte Leukozyten der Maus nach Inkubation mit anti-CD4-Antikörper-PE-Konjugat im mikroskopischen Bild unter Anregung der Fluoreszenz, unter II) die automatische Erkennung und Intensitätsmessung der vom Fluorochrom emittierten Strahlung, und unter III) eine grafische Darstellung der Fluoreszenzintensität (Y-Achse) über die Zellzahl (X-Achse) in Form eines Dotplots und Histogramms zeigt,

5B) von links nach rechts mikroskopische Aufnahmen unter Fluoreszenzanregung aufeinander folgender Inkubationen, jeweils mit Antikörperkonjugaten anderer Antigenspezifität im erfindungsgemäßen Verfahren zeigt,

6 Abbildungen der detektierten Emission von Fluorochromen nacheinander verwendeter Antikörperkonjugate mit verschiedenen Antigenspezifitäten (links neben Abbildungen angegeben) für nacheinander durchgeführte Kontaktierungen jeweils einer immobilisierten Probe (Zelle 1 bzw. Zelle 2) einschließlich Detektion intrazellulärer Antigene mit jeweils zwischenzeitlicher Inaktivierung des Fluorochromanteils zeigt,

7 für Aliquots derselben Probe mit denselben Antikörperkonjugaten unter A) das Ergebnis einer Analyse per Durchflußzytometrie zeigt, und unter B) die Ergebnisse eines erfindungsgemäßen Verfahrens (iSBC) mit menschlichen Zellen als immobilisierter biologischer Probe,

8 einen schematischen Aufbau einer Ausführungsform des mit Oligonukleinsäuren beschichteten Trägersubstrats zur Analyse einer Gewebsprobe zeigt und

9 das Ergebnis der Analyse eines Gewebsschnitts zeigt.

Beispiel 1: Herstellung eines Durchflusskanals mit Oligonukleotid – Beschichtung

Ein erfindungsgemäßer Kanal zur Verwendung im erfindungsgemäßen Analyseverfahren wurde durch abschnittsweises Herstellen einer kovalent gebundenen Oligonukleotid – Schicht auf einem silikatglashaltigen Trägersubstrat hergestellt. Als Trägersubstrat diente ein herkömmliches Deckglas, das auf zwei beabstandeten Abstandshaltern wurde. Die Abstandshalter waren auf einem Objektträger aus Glas fixiert, der als Deckel diente. In dem von Trägersubstrat, Abstandshaltern und Deckel aufgespannten Kanal wurde die kovalent gebundene Beschichtung aus Oligonukleotiden auf das Trägersubstrat durch oberflächliches Spülen oder Eintauchen in 1% Flusssäure in Wasser für 10 min bei Raumtemperatur, Entfernen der Flusssäure durch Spülen mit Aceton, Entfernen des Acetons und Kontaktieren mit einer methanolischen Lösung tri-Methoxysilangruppen-haltiger Oligonukleinsäuren (dT35) hergestellt. Überschüssiges Oligonukleotid konnte durch Waschen in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4) entfernt werden. Die tri-Methoxysilangruppe war in der folgenden Verbindung an die 35-dT-Oligonukleinsäure (Oligo) gekoppelt:

Entsprechend kann das Oligo anstelle des 35-dT-mers ein anderes Oligonukleotid synthetischer oder natürlicher Herkunft mit dieser oder einer anderen Kopplungsgruppe mit einer Alkoxysilangruppe verbunden sein. Als Test für die Verteilung und Bindung der Oligonukleinsäuremoleküle an die Glasoberfläche des Trägersubstrats wurde eine mit Flusssäure geätzte Glasoberfläche als Vergleich zur erfindungsgemäß mit der Oligo-dT-Nukleinsäure mit dem Fluoreszenzfarbstoff-markierten dA26-Cy3 in hoher Verdünnung kontaktiert. Das Ergebnis der fluoreszenzmikroskopischen Analyse (Axioplan 2e Mikroskop, 100× Plan-Achromat Objektiv zur Einzelmoleküldetektion) ist in 1 gezeigt, unter A) die gereinigte Glasoberfläche zum Vergleich, unter B) die mit kovalent gebundenem dT35 beschichtete Glasoberfläche. Diese Analyse zeigt, dass die Fluoreszenzmarkierung auf die kovalent gebundene Oligonukleinsäurebeschichtung zurückgeht und die Oligonukleinsäuremoleküle gleichmäßig über die Fläche verteilt sind.

Die Nukleinsäurebeschichtung war so vollständig bzw. kontinuierlich, dass die kontaktierte Oberfläche bei Kontaktierung mit einer Zellsuspension, z. B. mit Ficoll-Gradienten isolierte Leukozyten, die Zellen zu einer einschichtigen Zellschicht immobilisierte, wobei die Dichte immobilisierter Zellen abhängig von der Zellzahl war. Für die Einzelzellanalyse ist es bevorzugt, dass die Zellen beabstandet auf dem Trägersubstrat immobilisiert sind, um die Wiedererkennung der Einzelzellen anhand ihrer Position relativ zum Trägersubstrat zu erleichtern.

Die Immobilisierung von Zellen auf dem Oligonukleinsäure-beschichteten silikathaltigen Trägersubstrat erfolgt durch Kontaktieren des Oligonukleinsäure-beschichteten silikathaltigen Trägersubstrats mit den Zellen, die z. B. in Suspension vorliegen. Zur Kontaktierung ist das Aufgeben der Zellen in wässriger Zusammensetzung auf das Trägersubstrat bei 20 bis 36°C ausreichend, z. B. durch Pipettieren der Zellsuspension in die Einlassöffnung des die Beschichtung des Trägersubstrats umfassenden Kanals.

Zur optischen Analyse wurde der Objektträger auf dem Objekttisch eines Mikroskops platziert, so dass das mit Oligonukleinsäuren beschichtete Deckglas oberhalb des Objektträgers angeordnet war. Daher war das mit Oligonukleinsäuren beschichtete Trägersubstrat oberhalb des vom Objektträger gebildeten Deckels und oberhalb des Kanalvolumens angeordnet.

Die Verteilung der immobilisierten Zellen auf dem mit Oligonukleinsäure beschichteten Deckglas zeigt, dass die Oligonukleinsäure-Beschichtung generell eine gleichmäßige Immobilisierung von Zellen ergibt. Die Immobilisierungskapazität von ca. 2000 bis 2500 Zellen/0,15 μm2 (Gesichtsfeld) ist signifikant höher als die von Trägersubstraten mit immobilisiertem Fängerantikörper. Das geringe Kanalvolumen oberhalb des Detektionsabschnitts von ca. 2 μL erlaubt überdies die Verwendung für kleine Volumina an Probe und an Antikörperkonjugat. So reichen für ein Innenvolumen des Kanals, das an den mit Oligonukleinsäuren beschichteten Detektionsabschnitt angrenzt, ca. 10.000 bis 100.000 Zellen in einem Volumen von ca. 2 μL, um eine derzeit als optimal angesehene Dichte immobilisierter Zellen von ca. 400 bis 1800 Zellen/0,15 μm2 zu erhalten.

Weiterhin zeigt ein Vergleich der Analyse eines Aliquots von Zellen, das mit einer mit Oligonukleinsäuren beschichteten Glasoberfläche kontaktiert wurde, zu einem Aliquot, das mit einer durch Ätzen in Flusssäure gereinigten Glasoberfläche kontaktiert wurde, dass das die erfindungsgemäße Beschichtung mit Oligonukleinsäuren unspezifische Signale bei Fluoreszenzdetektion verringert, bzw. eine empfindlichere Detektion von fluoreszent markierten Analyten erlaubt. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen sind in 2A) für die gereinigte Glasoberfläche und in 2B) für die mit dT35 beschichtete Glasoberfläche nach Kontaktierung mit menschlichen PBMC (einkernige Zellen aus Blut) und Kontaktieren mit 10 μg/mL anti-CXCR5-PE-Antikörperkonjugat für 5 min gezeigt. Es wird deutlich, dass die Beschichtung mit Oligonukleinsäure eine signifikant bessere Detektion der spezifisch markierten Zellen ergibt, während unspezifische Hintergrundsignale durch die Beschichtung mit Oligonukleinsäure signifikant verringert sind.

Die lichtmikroskopische Analyse zeigt die besondere Eignung der Beschichtung mit Oligonukleinsäure zur Verwendung für die Fixierung permeabilisierter eukaryotischer Zellen. In 3A) sind PBMC auf der durch Ätzen mit Flusssäure gereinigten Glasoberfläche gezeigt, in 3B) die PBMC auf der mit dT35 beschichteten Glasoberfläche, wobei die Zellen jeweils nach Kontaktierung mit der Oberfläche durch Saponin-haltigen Puffer (FixPerm, BD Biosciences) fixiert und permeabilisiert wurden. Die Zellkonturen der auf mit Oligonukleinsäure beschichteten Glasoberfläche sind deutlich besser erhalten, als die Konturen der Zellen auf der gereinigten Glasoberfläche. Dies zeigt, dass die Beschichtung mit Oligonukleinsäure die Zellstrukturen bei Fixierung und Permeabilisierung besser erhält, als eine nicht beschichtete Oberfläche.

Beispiel 2: Immobilisierung und Analyse lebender eukaryotischer Zellen

Das erfindungsgemäße Analyseverfahren eignet sich sowohl für immobilisierte lebende Zellen, als auch für immobilisierte Zellen, die nach Kontaktierung mit der mit Oligonukleinsäuren beschichteten Silikatoberfläche in herkömmlicher Weise denaturiert und/oder perforiert sind, beispielsweise durch Inkubation mit Formalin, Aceton, Methanol und/oder Saponin.

Als Beispiel für eukaryotische Zellen wurden lebende menschliche Immunzellen verwendet, die nach Abtrennung von Erythrozyten in Suspension in PBS vorlagen. Zur Immobilisierung der Zellen auf dem mit Oligonukleotiden beschichteten Trägersubstrat wurden diese in einen Kanal einströmen gelassen, dessen eine Innenseite von dem mit Oligonukleinsäuren beschichteten Trägersubstrat gebildet wurde.

4 zeigt die funktionelle Analyse von lebenden menschlichen Immunzellen, die auf der Oberfläche eines nach Beispiel 1 mit Oligonukleinsäuren beschichteten Deckglases immobilisiert sind. Die Lebendfärbung mit 10 μL Trypanblau zeigt, dass zumindest über eine Immobilisierung für eine Dauer von 8 Stunden die Anzahl lebender Zellen nur geringfügig abnimmt. Das Abwerfen des CD62L von der Zelloberfläche (offene Kasten) ohne Zusatz eines Stimulanzes, d. h. spontan, zeigt zumindest über 8 h, vorzugsweise über 2 bis 4 h, eine nur geringfügige Beeinträchtigung der Zellen durch die Immobilisierung, im Unterschied zur Aktivierung durch Zusatz von PMA/Ionomycin, die zu einem Abwerfen von CD62L innerhalb der ersten zwei Stunden der Fixierung führte.

Entsprechend ist bevorzugt, das Verfahren zur Analyse zunächst an lebenden, immobilisierten biologischen Proben, insbesondere eukaryotischen Zellen durchzuführen, und diese Zellen im Anschluss zu denaturieren und/oder zu perforieren, um anschließend an den denaturierten bzw. fixierten Zellen das Analyseverfahren durchzuführen.

Beispiel 3: Detektion oberflächlicher Antigene in immobilisierten lebenden eurkaryotischen Zellen mit automatischer Positionsbestimmung der Zellen

Leukozyten aus peripherem Blut der Maus wurden nach Erythrolyse durch Zentrifugation von Erythrozyten-Resten abgetrennt und im Serum auf ein nach Beispiel 1 hergestelltes Trägersubstrat pipettiert, das von einem um 20 μm beabstandeten Objektträger als Deckel überdeckt war. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min in der Waagerechten wurde der Überstand durch Zugabe von PBS (pH 7,4) verdrängt.

Das Trägersubstrat wurde in den Strahlengang eines Mikroskops (Axioplan 2e Mikroskop, Zeiss, mit motorischer Objekttischverstellung und Fokussierung, Quecksilberlampe HBO 100 zur Anregung, Filter für PE oder FITC, Plan-Neofluar 16×/0,50 Immersionsobjektiv und CCD Kamera Axiocam MRm zur Aufzeichnung, in allen Beispielen verwendet) positioniert, nachdem oder bevor PE-konjugierte anti-CD4-Antikörper (10 μg/mL, 10 μL) in PBS zugegeben wurden. Entsprechend der bevorzugten Ausführungsform war das als Trägersubstrat verwendete Deckglas waagerecht und oberhalb des Objektträgers (Deckel) im Gesichtsfeld des Mikroskops angeordnet, so dass der mit Oligonukleinsäuren beschichtete Detektionsabschnitt die obere Wandung des Kanals zwischen Trägersubstrat und beabstandetem Deckel bildete. In dieser Position hängen die Zellen in das Innenvolumen des Kanals, und es wurde gefunden, dass so die Immobilisierung die Morphologie lebender Zellen nur geringfügig beeinflusst.

Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min wurde ungebundener Antikörper durch Waschen der immobilisierten Zellen mittels Aufgeben von 100 μL PBS an einem Ende des Deckglases und Absaugen austretender Flüssigkeit am gegenüberliegenden Ende entfernt. Die Detektion gebundenen Antikörpers erfolgte mikroskopisch durch Einstrahlung mit einer Wellenlänge von 488 nm. Das mikroskopische Bild mit Fluoreszenzanregung ist in 5A) I gezeigt, die bevorzugt durchzuführende automatische Bilderkennung in II gezeigt, und in III ist die durch die automatische Bilderkennung vorgenommene Zuordnung jeder Zelle zu einer bestimmten Position des Detektionsabschnitts, und in Verbindung damit zur automatisch bestimmten Position des Trägersubstrats gezeigt, was eine definierte Zuordnung jeder Zelle zu einer räumlichen Position relativ zum Trägersubstrat erlaubt, und daher ohne Verschiebung des Trägersubstrats und auch nach Entfernung und erneutem Anordnen des Trägersubstrats im Gesichtsfeld des Mikroskops eine eindeutige Identifikation und Zuordnung jeder Zelle auf Grundlage der automatisch bestimmten Position auf dem Trägersubstrat.

Die automatische Positionsbestimmung von Zellen im Gesichtsfeld des Mikroskops erfolgte mittels eines selbst entwickelten Programms, mit zusätzlicher automatischer Zuordnung der Position des rechnergesteuert verfahrbaren Objekttisches (Merzheuser, Deutschland) zu jeder bestimmten Position einer Zelle. Die Aufnahmen wurden durch Detektion für eine Dauer von 7 s mit Fluoreszenzdetektion (Durchlicht 100 ms) gemacht. Bei Entnahme des Trägersubstrats vom Objekttisch, z. B. zur weiteren Zugabe und/oder Entfernung von Lösungen zum Waschen und mit weiteren Antikörpern, wurde die Position der Zellen auf dem Trägersubstrat nicht verändert, so dass allein durch Korrelation der Positionierung des Trägersubstrats bzw. des diesen in der selben Position halternden Objekttisches jede Zelle positionsgenau erneut detektiert werden konnte, und mit verschiedenen Antikörpern nacheinander aufgenommene mikroskopische Fluoreszenzbilder für jede Zelle spezifisch überlagert werden konnten. Die in 5A) II eingefügten Kreise stehen für Positionen der nicht vom Antikörper markierten Zellen, die in einer vorherigen lichtmikroskopischen Aufnahme identifiziert wurden. Figur III zeigt die Verteilung der Intensität der für alle Zellen gemessenen Fluoreszenz über die Zellzahl.

Beispiel 4: Nacheinander folgende Detektion verschiedener oberflächlicher Antigene in immobilisierten lebenden eukaryotischen Zellen

Zellen aus einer broncho-alveolären Spülung einer Maus mit induziertem Asthma (entsprechend Polte et al., J. Allergy Clin. Immunol. 118, 942–8 (2006)) wurden gemäß Beispiel 2 immobilisiert. Die immobilisierten Zellen wurden nacheinander mit Antikörperkonjugaten, die jeweils das Fluorochrom PE enthielten, kontaktiert, jeweils mit Unwirksammachen des Fluorochroms vor Zugabe eines neuen Antikörperkonjugats, z. B. mittels Bestrahlung bei der für das Fluorochrom spezifischen Anregungswellenlänge (488 nm) für ca. 30 s, mit Waschen nach Zugabe eines neuen Antikörpers und Detektion unter Fluoreszenzanregung. Die Antikörperkonjugate unterschieden sich nur durch ihren Antikörperanteil, der eine Spezifität für CD11b, B7H1, CD11c bzw. CD3 hatte.

5B) zeigt von links nach rechts angeordnet mikroskopische Aufnahmen mit Detektion emittierter Fluoreszenz; die Spezifitäten der Antikörper, nämlich anti-CD11b, anti-B7H1, anti-CD11c und anti-CD3, sind unter den jeweiligen Aufnahmen angegeben. Die grafische Markierung einzelner Lokalisationen zeigt, dass die erfindungsgemäße Zuordnung jeweils für ein Antikörperkonjugat spezifisch detektierter Fluoreszenz zu einer Position des mikroskopischen Abbilds die Überlagerung der aufeinander folgend detektierten Fluoreszenzsignale erlaubt. In der Folge erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Detektion mehrerer zu analysierender Antigene in immobilisierten biologischen Proben nacheinander, jeweils mit Antikörperkonjugaten mit Spezifität für die zu analysierenden Antigene, mit demselben Fluorochromanteil oder unterschiedlichen Fluorochromanteilen. Diese Analyse zeigt, dass einzelne Positionen einer biologischen Probe, z. B. einzelne Zellen, nacheinander auf eine Mehrzahl von Antigenen analysiert werden können, ohne dass Beeinträchtigungen der Analyse durch Wechselwirkungen von Antikörperkonjugaten oder deren Fluorochromen auftreten, oder unspezifische Fluoreszenz entsteht, wobei die erfindungsgemäße Oligonukleinsäure-beschichtete Oberfläche des Trägersubstrats eine ausreichend lange Immobilisierung der Zellen im lebenden Zustand erlaubt. Auf Basis der Immobilisierung ist die automatische Positionsbestimmung der lichtmikroskopisch analysierten Position jeder Zelle und der detektierten Fluoreszenzsignale möglich, und die anschließende positionsgenaue Überlagerung bzw. Korrelation der lichtmikroskopischen Aufnahme und/oder von detektierten Fluoreszenzsignalen.

Die Überlagerung jeweils gleicher Positionen nachgewiesener Fluoreszenz, vorzugsweise in Verbindung mit der lichtmikroskopisch bestimmten Position von Zellen, erlaubt die in getrennten Schritten aufeinander folgende Detektion verschiedener Antigene und deren anschließende Zuordnung zu einer Zelle. Diese positionsgenaue Korrelation der detektierten Fluoreszenzsignale ist in 5B) durch die eingefügten Verbindungslinien zwischen eingekreisten Zellen dargestellt.

Beispiel 5: Nacheinander folgende Detektion intrazellulärer und oberflächlicher Antigene in fixierten und permeabilisierten eukaryotischen Zellen

Als Beispiel für eine biologische Probe wurden menschliche Leukozyten entsprechend Beispiel 2 immobilisiert, anschließend jedoch mit Formaldehyd fixiert und mit Saponinhaltigem Puffer (FixPerm, BD Biosciences) permeabilisiert.

Die auf dem mit Oligonukleinsäuren beschichteten Trägersubstrat fixierten Zellen wurden mit 10 μL (2 μg/mL–200 ng/mL) Antikörperkonjugat für 5 min bei Raumtemperatur kontaktiert und mit 200 μL PBS gewaschen. Generell wurde nach der Kontaktierung mit einem Antikörperkonjugat die unter Bestrahlung mit Licht der Anregungswellenlänge emittierte Strahlung detektiert, anschließend der Fluorochromanteil des Antikörperkonjugats durch Bestrahlung bei der für das Fluorochrom spezifischen Wellenlänge (488 nm) unwirksam gemacht, und anschließend wurde ein anderes Antikörperkonjugat mit der Probe kontaktiert.

Das als Trägersubstrat dienende, mit Oligonukleinsäuren beschichtete Deckglas war oberhalb eines Objektträgers angeordnet, der durch zwei stegförmige Abstandshalter von ca. 150 μm Dicke von dem Trägersubstrat beabstandet war, sodass die Stege den Raum zwischen Trägersubstrat und beabstandetem Objektträger zu einem Durchflusskanal begrenzten. Die Schritte der Kontaktierung der Probe mit Antikörper-Konjugat und die Waschschritte nach Zugabe eines anderen Antikörperkonjugats konnten jeweils durch Pipettieren der entsprechenden wässrigen Zusammensetzung an ein Ende des Durchflusskanals erfolgen, wahlweise in Verbindung mit Absaugen von Flüssigkeit am gegenüberliegenden Ende des Durchflusskanals.

Nach Inkubation der immobilisierten Zellen mit dem anti-IFNγ-Antikörperkonjugat für 5 min bei Raumtemperatur und einem anschließenden Waschschritt wurde die Fluoreszenz mikroskopisch detektiert. Die detektierte Fluoreszenz einschließlich des mikroskopischen Abbilds wurden unter Zuordnung zur Positionierung des Trägersubstrats, bzw. bei unveränderter Positionierung des Trägersubstrats durch Speichern in einem elektronischen Speicher aufgezeichnet. Anschließend wurde der Fluorochromanteil durch Bestrahlung bei 488 nm ausgeblichen.

Im Anschluss an dieses Unwirksammachen des Fluorochromanteils des ersten Antikörperkonjugats mit Spezifität für IFN-γ wurde ein Antikörperkonjugat mit der Probe kontaktiert, das identisch aufgebaut war, außer dass der Antikörperanteil nun ein anti-CD3-Antikörper war. Anschließend wurde wiederum Bestrahlung 488 nm der Fluorochromanteil des Antikörperkonjugats mit anti-CD3-Spezifität unwirksam gemacht.

In der selben Art und Weise wurde anschließend dieselbe Probe nacheinander mit Antikörperkonjugaten mit einem anti-CD4-Antikörperanteil, einem anti-CD8-Antikörperanteil bzw. einem anti-IL4-Antikörperanteil inkubiert, jeweils mit Unwirksammachen des Fluorochromanteils vor der Inkubation mit einem Antikörper mit anderer (zusätzlicher) Antigenspezifität, jeweils mit einem Waschschritt im Anschluss an die Zugabe eines Antikörperkonjugats zur Entfernung ungebundener Fluorochrome.

Mikroskopische Abbildungen sind in 6 für Zelle 1 und Zelle 2 gezeigt, wobei im Wesentlichen derselbe Bildausschnitt, der durch den manuell eingefügten Kreis gekennzeichnet ist, detektiert wurde. Es wird deutlich, dass das Unwirksammachen des Fluorochromanteils der jeweiligen Antikörperkonjugate zu einer Reduktion bzw. Eliminierung der Emissionen des zuvor verwendeten Antikörperkonjugats führte, jedenfalls auf ein Niveau unterhalb der Detektionsgrenze, wobei auch in folgenden Zyklen des Analyseverfahrens mit Antikörperkonjugaten anderer Antigenspezifität keine zusätzliche Hintergrundaktivität bzw. Hintergrund-Fluoreszenz auftrat. Weiterhin zeigt dieses Beispiel, dass sowohl die extrazellulären Antigene CD3, CD4, CD8, als auch die intrazellulären Antigene IFN-γ und der IL4 unabhängig voneinander in den fixierten Zellen nachgewiesen werden konnten.

Beispiel 6: Vergleich der Spezifität und der Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber Durchflußzytometrie

Das erfindungsgemäße Analyseverfahren wurde an menschlichen Leukozyten, die auf einem Trägersubstrat immobilisiert waren, und zum Vergleich durch herkömmliche Durchflußzytometrie-Analyse analysiert. Aliquots von Milzzellen der Maus (5 Tiere) wurden mit Antikörperkonjugaten verschiedener Antigenspezifität kontaktiert, um die Identifikation der jeweiligen Antigene auf den Zellen im Vergleich zu prüfen. Für die Vergleichsanalyse mittels Durchflußzytometrie (FACScan, Becton Dickinson) wurden Aliquots der Zellsuspensionen in 50 μL PBS mit 1% RSA und mit jeweils einem der folgenden Antikörperkonjugate (1 μL, 0,2 μg/mL) inkubiert: anti-CD3-PerCP, anti-CD4-PE, anti-CD8-FITC, anti-CD19-PerCP, anti-CD4-PE bzw. anti-CD3-FITC und für Antikörperkonjugate mit gleichem Fluorochromanteil separat analysiert.

Für das erfindungsgemäße Analyseverfahren wurden Leukozyten auf einem mit Oligonukleotiden beschichteten Trägersubstrat immobilisiert, der in einem Durchflusskanal angeordnet war und nacheinander mit den folgenden Antikörperkonjugaten kontaktiert, jeweils mit zwischenzeitlicher Inaktivierung des Fluorochromanteils durch UV-Bestrahlung: anti-CD3-PE, anti-CD4-PE, anti-CD8-PE, anti-CD19-PE, ebenfalls in 50 μL PBS mit 1% RSA und 1 μL, 0,2 μg/mL Antikörperkonjugat.

Die folgenden Anteile von Zellen wurden mit den Antikörperkonjugaten bestimmt:

AntigenDurchflußzytometrieerfindungsgemäß an immobilisierten ZellenCD19+60% +/– 160% +/– 0,7CD19+ CD4+0%0%CD3+39% +/– 2,540% +/– 3CD4+24,5% +/– 227% +/– 1,5CD8+15% +/– 214,5% +/– 1,5CD4+ CD3+17% +/– 319% +/– 2

Diese Ergebnisse zeigen, dass mit beiden Verfahren dieselben Antikörper-spezifischen Zellpopulationen in den Proben identifiziert wurden. Daher hat das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen dieselbe Spezifität wie die Analyse per Durchflusszytometrie (FACS).

Die Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde ebenfalls im Vergleich zu FACS geprüft, indem nach Beispiel 2 Milzzellen der Maus auf einem mit Oligonukleotiden beschichteten Deckglas immobilisiert wurden und nacheinander mit abnehmenden Verdünnungen, d. h. zunehmenden Konzentrationen von anti-CD4-PE Antikörperkonjugat kontaktiert wurden, mit Inaktivierung des Fluorochroms PE nach jeder Detektion. Für die Vergleichsanalyse per FACS wurden 7 Aliquots der Zellsuspension mit denselben Verdünnungen des anti-CD4-PE inkubiert und analysiert.

Die Ergebnisse sind zusammengefasst grafisch in 7A) für Durchflußzytometrie und 7B) für das erfindungsgemäße Analyseverfahren gezeigt, wobei Spitzenwerte mit Hinweisen auf die Konzentration des Antikörpers gekennzeichnet sind mit U = Negativkontrolle ohne Antikörperkonjugat und 1 bis 7 für zunehmende Konzentration. Die Ergebnisse zeigen, dass die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens etwa um den Faktor 10 höher als bei Durchflußzytometrie ist. So zeigt sich bei 1, der geringsten Antikörperkonzentration, im Durchflußzytometrie keine Auflösung vom Hintergrund (U), während das erfindungsgemäße Verfahren bereits für diese Antikörperkonzentration ein deutlich vom Hintergrund unterscheidbares Signal detektierbar macht.

Beispiel 7: Nachweis von Makrophagen in Lungengewebe

Als Beispiel für den Nachweis von zellspezifischen Oberflächen-Antigenen in einem Gewebsstück mit lebenden Zellen wurde ein Gewebsschnitt mittels vibrierendem Mikrotom (erhältlich von der Fa. Vibratom) aus Lungengewebe der Maus auf einem Trägersubstrat immobilisiert. Das Lungengewebe lebte und war dadurch immobilisiert, dass das Trägersubstrat einen formschlüssigen Rahmen aus elastischem Material aufwies, der durch Ausschneiden einer dem Gewebsschnitt entsprechenden Form aus Kunststofffolie und Anordnen dieses Rahmens auf einem Deckglas. Als Kunststofffolie konnte Polyethylen, Polypropylen und vorzugsweise Parafilm verwendet werden. Die Kunststofffolie hatte vorzugsweise eine Dicke von ca. 200 μm; der Gewebsschnitt hatte eine Schichtdicke von ca. 100 μm. Bevorzugt war das als Trägersubstrat verwendete Deckglas in dem vom Rahmen umgrenzten Abschnitt entsprechend Beispiel 1 zusätzlich mit Oligonukleinsäuren beschichtet. Als Deckel wurde ein Objektträger aus Glas gegenüber dem Deckglas angeordnet. Der zum Gewebsstück formschlüssige Rahmen bildete die Abstandshalter zwischen Deckglas und Objektträger, wobei der Rahmen zwei gegenüberliegende Öffnungen durch streifenförmige Ausnehmungen im Material des Rahmens aufwies, die gegenüberliegend in das vom Rahmen umgrenzte Volumen zwischen Trägersubstrat (Deckglas) und Deckel (Objektträger) münden. Die streifenförmigen Ausnehmungen im Material des Rahmens wurden in den Abstandshaltern gebildet und stellten die Einlassöffnung und gegenüberliegend die Auslassöffnung im vom Rahmen umgrenzten Volumen dar, und damit die Einlass- und Auslassöffnungen zum darin angeordneten Gewebsstück.

Eine schematische Ansicht des zum Gewebsstück formschlüssigen Rahmens ist in 8 gezeigt:
Das Gewebsstück 1, z. B. ein Gewebsschnitt, ist in einem formschlüssigen Rahmen 2 angeordnet. Der formschlüssige Rahmen 2 ist zwischen einem Trägersubstrat 3, das z. B. ein Deckglas sein kann, und einem Deckel 5 angeordnet, der z. B. ein Objektträger sein kann. Das Trägersubstrat ist vorzugsweise zumindest in dem Abschnitt, der vom Rahmen 2 umfasst wird, mit kovalent gebundenen Oligonukleotiden beschichtet. Der Rahmen 2 wird ist als Ausnehmung von Abstandshaltern 4 gebildet, die zwischen Trägersubstrat 3 und Deckel 5 angeordnet sind, wobei Trägersubstrat 3 und Deckel 5 das vom Rahmen 2 aufgespannte Volumen begrenzen. In Abstandshaltern 4 sind streifen- oder nutförmige Ausnehmungen 6a, 6b gebildet, die eine Einlassöffnung und eine etwa gegenüberliegende Auslassöffnung in dem vom Rahmen 2 aufgespannten Volumen zwischen Trägersubstrat 3 und Deckel 5 bilden.

Eine mikroskopisches Abbild des mit anti-Maus-CD11b-Antikörper-PE-Konjugat entsprechend Beispiel 2 analysierten Gewebsschnitts ist in 9 gezeigt. Die mit Pfeilen markierten Zellen zeigten die identifizierten CD11b+-Zellen im Gewebe und machen deutlich, dass der erfindungsgemäße, zu einem Gewebsstück formschlüssige Rahmen zwischen Trägersubstrat und Deckel zur Immobilisierung lebenden Gewebes und zur Analyse zellspezifischer Antigene im Gewebsstück geeignet ist.

Der Fluorochromanteil PE wurde durch Bestrahlung bei 488 nm ausgebleicht. Anschließend konnten in aufeinander folgenden Zyklen 30 weitere Antikörperkonjugate mit dem Gewebsstück kontaktiert werden. Die Antikörperkonjugate wiesen PE als Fluorochromanteil auf und einen jeweils unterschiedlichen Antikörperanteil. Das Trägersubstrat war für jede Detektion in der selben Position im Strahlengang des als Detektionseinrichtung verwendeten Mikroskops (Zeiss Axioplan 2e aus Beispiel 3) angeordnet. Jeder Zyklus umfasste das Kontaktieren des Gewebsstücks mit einem Antikörperkonjugat, Waschen zur Entfernung ungebundenen Antikörperkonjugats, Detektion des vom Fluorochromanteil unter Bestrahlung mit Licht bei Anregungswellenlänge (488 nm) emittierten Lichts, Speichern des detektierten Abbilds und das Unwirksammachen des Fluorochroms, z. B. durch Ausbleichen mittels Bestrahlung bei der Anregungswellenlänge. Zur Auswertung wurden die Abbilder aus dem Speicher abgerufen und virtuell positionsgenau übereinandergelegt, da die einzelnen Abbilder jedes Antikörperkonjugats bei identischer Positionierung des Trägersubstrats in der Detektionseinrichtung detektiert wurden. Diese Verfahrensschritte der Analyse von Zellen in einem Gewebsstück sind das generell bevorzugte Verfahren.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

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  • - DE 19709348 [0007]
  • - WO 2007/101706 A1 [0007]
  • - WO 2007/024701 [0008]
  • - US 2008/0138848 A1 [0009]
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  • - US 2002/0128234 A1 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • - Mahnke und Roederer, (Clin Lab Med. 2007, 27 (3) (2007)) [0002]
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  • - Polte et al., J. Allergy Clin. Immunol. 118, 942–8 (2006) [0069]