Title:
ChemBioNet Komponenten-Analyse unter Nutzung eines stabilen zellbasierten TetR-KRAB-Luciferase-Nachweis-systems (TIS 10-Zellen)
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Genkonstrukten unter der Regulation von Promotorkonstrukten, die in cis agierende Elemente enthalten, die Bindungsstellen für das Tetrazyklin-Repressor-Protein enthalten und stabil in eukaryontische Zellen integriert sind, und eines zweiten Konstrukts, das den Tet-Repressor mit dem TetKRAB Protein in der gleichen eukaryontischen Zelle integriert, um für aktive Substanzen zu screenen, die mit transkriptionellen Prozessen in eukaryontischen Zellen interferieren.




Inventors:
gleich Anmelder
Application Number:
DE102008050702
Publication Date:
04/15/2010
Filing Date:
10/07/2008
Assignee:
Thiesen, Hans-Juergen, Prof. (Rostock, 18055, DE)
International Classes:



Foreign References:
EP13438822004-06-23
Other References:
DEUSCHLE,U.et.al.: Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol.Cell.Biol.1995,15,4,S.1907-1914 S.1909 ,Fig.1A,Expressionskonstrukt für TetR-KRAB-Fusionsprotein,Fig.1B: tetO-Promotorkonstrukt mit Luciferase-Reportergen
Attorney, Agent or Firm:
Hammonds LLP Rechtsanwälte Patentanwälte (München, 80539)
Claims:
1. Verwendung von Genkonstrukten unter der Regulation von Promotorkonstrukten, die in cis agierende Elemente enthalten, die Bindungsstellen für das Tetrazyklin-Repressor-Protein enthalten und stabil in eukaryontische Zellen integriert sind, und eines zweiten Konstrukts, das den Tet-Repressor mit dem TetKRAB Protein in der gleichen eukaryontischen Zelle integriert, um für aktive Substanzen zu screenen, die mit transkriptionellen Prozessen in eukaryontischen Zellen interferieren.

Description:

Die Erfindung beruht auf eine Technologie zur Bestimmung von Leitstrukturen und Regulationswegen, die die Regulation von Transkriptionsprozessen bei menschlichen Krankheiten, wie Krebs modulieren.

Nachweissysteme, wie z. B. Luciferase-Genkonstrukte unter der Regulation von Promotor-Konstrukten, die cis-agierende Elemente enthalten, die wiederum als Bindungszellen für das Tetracyclin-Repressor-Protein dienen, müssen stabil in eukaryontische Zellen integriert werden. Ein zweites Konstrukt, welches den tet-Repressor im Verbund mit der TetKRAB-Domäne exprimiert, muss in dieselbe eukaryontische Zelle integriert werden. So eine Zelllinie wurde 1995 von Deuschle et al., Molecular and Cellular Biology, Vol. 15, April 1995, Seiten 1907–1914, publiziert. In Anwesenheit von Tetracyclin wird das Luciferasegen angeschaltet und in Abwesenheit von Tetracyclin abgeschaltet (Stand der Wissenschaft 1995).

Gemäß dieser Erfindung kann die Zelllinie benutzt werden, um Leitstrukturen zu ermitteln, die mit Transkriptionsprozessen in die eukaryontische Zelle interferieren.

Die Zelllinie TIS 10, publiziert 1995, kann benutzt werden, um Leitstrukturen in Komponentenbibliotheken zu identifizieren, die an der Modulation transkriptioneller Prozesse beteiligt sind.

Leitstrukturen, die ganz unterschiedliche Regulationswege adressieren, können identifiziert werden, falls diese Komponenten die Tet-KRAB vermittelte Repression an dem Luciferase-Zielkonstrukt aufheben.

Strukturell ganz unterschiedliche Komponenten können identifiziert werden.

KRAB-ZNF-Gene kodieren C2H2-Zinkfinger-Domänen zusammen mit der Krüppel-assoziierten Box (KRAB) initial identifiziert als siebener Wiederholung von Leucinen in KOX1/ZNS10 (1; zum Überblick der humanen- und Mausgene, s. Datenbank Sys-ZNF, 2). Die KRAB-Domäne stellt eine der wirkungsvollsten Repressor-Domänen dar, die im Säugetiergenom gefunden wurden (3). Im Jahr 1995: Die KRAB-Domäne fusioniert mit dem Tetracyclin-Repressor tetR beschrieb das erste Repressorsystem (tetR-KRAB), welches über ein kleines Molekül (Tetracyclin) reguliert werden konnte. Genetisch veränderte Hela-Zellen (TIS 10-Zellen) kodieren für ein stabil integriertes Luciferase-Reporter-Konstrukt zusammen mit tetR-Bindungsstellen sowie für ein TetR-KRAB-Expressionskonstrukt (4, 5). Mit dem Erscheinen der Tetrapoden erfolgte eine umfangreiche Expansion von ZNF-Genen, die sich hauptsächlich während der Evolution der Säugetiergenome ereignete. Jedoch viele Eigenschaften dieser KRAB-ZNF-Gene wareten darauf, noch entschlüsselt zu werden. TIS 10-Zellen stellen ein anwendungsfähiges System dar, um Substanzen (small molecules) zu identifizieren, die mit der KRAB-abhängigen Genexpression in Ab- oder Anwesenheit von Tetracyclin interferieren.

Mit der Unterstützung des Leibniz-Institutes für Pharmakologie konnte an 470 Komponenten der ChemBioNet Bibliothek im ersten Screen gezeigt werden, die Reporter-Gen-Expression zu beeinflussen, und sie wurden reanalysiert in Hela-Zellen, die transient mit unterschiedlichen Kontrollkonstrukten transfiziert waren. Die Komponenten mit höchsten spezifischen Aktivitäten wurden strukturell mit allen 18.079 Komponenten, die in der ursprünglichen ChemBioNet Bibliothek und mit den Molekülen, die in der Pub Chem Bibliothek (etwa 19 Mio.) und in der DTP Bibliothek (237.771 Einträge) vorhanden sind, verglichen.

Am interessantesten ist: strukturell ähnliche so wie Tetracyclin ähnliche Komponenten, die in der ChemBioNet Bibliothek vorkommen, zeigen keine vergleichbaren Luciferaseaktivitäten, darauf hinweisend, dass strukturell ähnliche Moleküle keine ähnlichen biologischen Funktionen ausüben. Schließlich, die effizientesten Komponenten, die mit der KRAB-vermittelten Repression interferieren, werden zur weitern Analyse ausgewählt, um zu bestimmen, ob die Interferenz mit der KRAB-vermittelten Gen-Repression benutzt werden kann, um mögliche KRAB-ZNF gesteuerte Ziel-Gene mittels Affymetrix-basierter Mikro-Array-Expressionsanalyse zu identifizieren.

KRAB Zinkfingergene(-proteine

  • • Große Familie mit mehr als 350 Genen im Menschen
  • • Zahlenmäßige Zunahme beginnend mit der Evolution der Tetrapoden
  • • Im allgemeinen ubiquitär mit relativ geringer Intensität exprimiert
  • • Gewöhnlich mehr als 5 Zinkfingerdomänen (oftmals mehr als 10) des C2H2-Typs
  • • Mutmaßlich DNA/RNA bindende Proteine
  • • KRAB transkriptionelle Repressionsdomänen (Box A, B, b, Bl, C)
  • • Funktionen größtenteils unbekannt

Eigenschaften der KRAB-vermittelten transkriptionellen Repression

  • • Bindung an die DNA in cis ist erforderlich
  • • Abschaltfunktion arbeitet effizient auch von weiter entfernten Positionen
  • • KRAB vermittelte Repression dominiert die VP16 Aktivierungsdomäne
  • • Abschaltfunktion wird über den Intermediärfaktor (TIF1beta) übertragen
  • • Mechanismen der Repression beinhalten Chromatin-modifizierende Aktivitäten

TIF1beta

  • • Mitglied der TRIM Familie
  • • RBCC Teil interagiert mit der KRAB Domäne
  • • Knock-outs sind embryonal letal in der Maus
  • • Interagiert mit Heterochromatin HP1 Proteine
  • • Komponenten der N-CoR1 und NuRD-Chromatin Remodelling Complexes
  • • Interagiert mit der H3 Histone-Methyltransferase SETDB1

Figurenbeschreibung:

1: Zeigt den experimentellen Ansatz des initialen Screenings, um chemische Verbindungen zu entdecken, welche das TetR-KRAB Repressionssystem in TIS-10 Zellen beeinflussen.

2: Zeigt die Luziferase-Aktivitäten von 14 Substanzen, ermittelt im 2. Screen unter unterschiedlichen Bedingungen verglichen mit der DMSO Kontrolle. Bemerke die unterschiedlichen Gruppen.

Gruppe I (Class I):

  • Induktion von Luziferase (Luc) (Abwesenheit von Tet) UND Additive/synergist. Effekte (Anwesenheit von Tet)

Gruppe II (Class II):

  • Minimale Luc-Induktion (Abwesenheit von Tet) UND Additive/synergist. Effekte (Abwesenheit von Tet)

Gruppe III (Class III):

  • Induktion von Luziferase (Luc) (Abwesenheit von Tet) ABER keine Additive/synergist. Effekte (Abwesenheit von Tet)

3: Zeigt den Arbeitsablaufplan des Projektes zur Entdeckung und Aufklärung von kleinen chemischen Verbindungen, welche mit KRAB-vermittelter transkriptioneller Repression interferieren. Geschlossener Rahmen = schon realisierte Schritte; geschilderte Rahmen = Schritte in Planung

4: Zeigt die auf der chemischen Struktur basierende hierarchische Gruppierung (Clustering) von 470 positiven Ergebnissen (hits) aus dem sekundären Screen stammend. Das Clustering basiert auf Strukturvergleiche, die mit Open Babel gemacht wurden, indem der Tanimoto Koeffizient benutzt wurde. Ausgewählte Zweige des Baumes heben chemische Substanzen hervor, die eine mehr als > 5, > 10 oder > 70 fache Aktivierung der Luziferase in TIS-10 Zellen verglichen mit DMSO Kontrollen zeigen (siehe Beispiele in 2A; Pfeil = Position einiger Substanzen aus 2).

5: Zeigt einen Auszug aus einem Baum mit den gleichen Daten wie in 4 mit der Ausnahme, dass die Struktur von Tetrazyklin (Tet, Pfeil) hinzugefügt wurde bevor das Clustering durchgeführt wurde. Nur die Hauptklade einschließlich Tetrazyklin ist dargestellt.

6: Zeigt ein Beispiel für zwei aktive Komponenten, die direkte Nachbarn aufgrund des hierarchischem Clusterings in einem Unterbaum sind und strukturell sehr ähnlich sind. Die beiden Substanzen interagieren möglicherweise mit der gleichen Zielstruktur.

7: Zeigt ein Beispiel für zwei aktive Komponenten, die direkte Nachbarn in einem Unterbaum aufgrund des hierarchischen Clusterings sind, aber strukturell sehr verschieden. Die beiden Komponenten interagieren möglicherweise mit unterschiedlichen Zielstrukturen.

8: Zeigt In-silico Vergleiche selektierter Substanzen mittels hierarchischem Clustering der Struktur (Open Babel) mit chemischen Substanzen in Datenbanken/Bibliotheken ChemBioNet, DTP und PubChem.

Beispiel für eine aktive Leitstruktur (markiert in rot, Pfeil). Bemerke, dass die nächsten Nachbarn (kurze Länge der Äste deuten auf nahe strukturelle Ähnlichkeiten hin) Kandidatenmoleküle für eine weiterführende experimentelle Austestung sind.

9: Konkordanz Englisch/Deutsch Figurenlegende:

  • KRAB Domäne: Siebener Wiederholung von Leuzinen.
  • Vergleich von Siebener Wiederholungen von Leuzinen in ZNF10/KOX1 mit Leuzin-Zipper-Strukturen in v-Fos, v-Jun, c-Myc, CEBP und GCN4 (Referenz 1)
  • Lokalisation des ZNF10/Kox1-Proteins nach ektopischer Expression in HeLa Zellen.
  • Model der KRAB Zinkfingerprotein gesteuerter, TIF1beta vermittelten transkriptionellen Repression (Silencing).

10: Zeigt das HeLa TIS-10 Zell System:
TIS10 Zellen enthalten zwei stabile Transgene: i. den Tet-Repressor fusioniert mit KOX1-KRAB (TetR-KRAB) als transkriptionelles Repressorprotein dessen Bindung über das Hinzufügen von Tetrazyklin (Tet) inhibiert werden kann und ii) ein Luziferase Reproter Konstrukt, der einen starken CMV-Promoter und 7 aufwärts sitzende Tet-Operator-Stellen für die Bindung des TetR Proteins enthält. In der Abwesenheit von Tet bindet TetR-KRAB an die TetO Sequenzen und die Transkription des Luziferase-Reporters wird inhibiert, während in Anwesenheit von Tetrazyklin (Tet) diese aufgehoben wird (ref. 4, 5).

Ergebnisse:

  • A. 470 Substanzen, die die KRAB vermittelte Repression modifizieren, wurden in zwei Screening-Runden selektioniert.
  • B. Drei Klassen funktioneller Aktivitäten wurden definiert.
    Gruppe I (Class I):
    Luziferase-Reporter-Induction UND additive/synergistische Effekte with Tetrazyklin
    Gruppe II (Class II):
    Luziferase-Reporter Induction nur in Anwesenheit von Tetrazyklin
    Gruppe III (Class III):
    Luziferase Reporter Induction aber keine additive/synergistic Effekte mit Tetrazyklin
  • C. Die Aktivitäten der Substanzen korrelieren nicht mit strukturellen Ähnlichkeiten
  • D. Aktive Substanzen werden in unterschiedlichen spezifischen Kladen gefunden, welches impliziert, dass zahlreiche Zielproteine und Regulationswege getroffen werden.
  • E. Die Aktivität ist nicht mit der strukturellen Ähnlichkeit zu Tetrazyklin korreliert.

Zusammenfassung:

Viele Substanzen wurden entdeckt, die direct oder indirect mit der Repression eines stabil integrierten CMV Promoter-Expressions-Konstrukts bedingt durch ein TetR.KRAB Repressorprotein-Konstrukt interferieren.

Referenzen:

  • 1 Thiesen HJ. Multiple genes encoding zinc finger domains are expressed in human T cells. New Biol. 1990; 2: 363–74.
  • 2 SysZNF: the C2H2 Zinc Finger Gene database, submitted. Web: epgd.biosino.org/SysZNF/
  • 3 Margolin JF, Friedman JR, Meyer WK, Vissing H, Thiesen HJ, Rauscher FJ 3rd. Krüppel-associated boxes are potent transcriptional repression domains. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91: 4509–13.
  • 4 Deuschle U, Meyer WK, Thiesen HJ. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 1995; 15: 1907–14.
  • 5 Lorenz P, Koczan D, Thiesen HJ. Transcriptional repression mediated by the KRAB domain of the human C2H2 zinc finger protein Kox1/ZNF10 does not require histone deacetylation. Biol Chem. 2001; 382: 637–44.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • - Deuschle et al., Molecular and Cellular Biology, Vol. 15, April 1995, Seiten 1907–1914 [0002]