Title:
PCR-supported method for differential detection of physiological condition of cells comprises achieving the differentiation through the selection of suitable PCR primers for amplification of a section of a specific target sequence
Kind Code:
A1


Abstract:
The PCR-supported method for differential detection of physiological condition of cells comprises achieving the differentiation through the selection of suitable PCR primers for amplification of a section of a specific target sequence, so that at least one of the oligonucleotide, used as PCR-primer, has an area beginning from the 3'-end extending over a large number of nucleotide bases with identical sequence or sequence homology distinct to a double stranded cDNA as to the genomic DNA containing the specific target sequence. The PCR-supported method for differential detection of physiological condition of cells comprises achieving the differentiation through the selection of suitable PCR primers for amplification of a section of a specific target sequence, so that at least one of the oligonucleotide, used as PCR-primer, has an area beginning from the 3'-end extending over a large number of nucleotide bases with identical sequence or sequence homology distinct to a double stranded cDNA, which is formed through the reverse transcription of a post-transcriptionally modified RNA of the specific target sequence, as to the genomic DNA containing the specific target sequence. The differential detection of physiological condition is the distinction between living and dead cells. The target sequence is a protein coding gene or ribosomal RNA coding gene. The post-transcriptional modification includes removing introns by splices.



Inventors:
Antrag auf Nichtnennung
Application Number:
DE102008029999
Publication Date:
12/31/2009
Filing Date:
06/24/2008
Assignee:
Leclerque, Andreas, Dr.rer.nat. MA (Darmstadt, 64285, DE)
International Classes:



Other References:
Flekna G, Stefanic P, Wagner M, Smulders FJ, Mozina SS, Hein I (2007). Insufficient differentiation of live and dead Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes cells by ethidium monoazide (EMA) compromises EMA/real-time PCR. Res Microbiol 158: 405-412
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Pisz JM, Lawrence JR, Schafer AN, Siciliano SD (2007). Differentiation of genes extracted from non-viable versus viable micro-organisms in environmental samples using ethidium monoazide bromide. J Microbiol Methods 71: 312-318
Raghavan R, Miller SR, Hicks LD, Minnick MF (2007) The Unusual 23S rRNA Gene of Coxiella burnetii: Two Self-Splicing Group I Introns Flank a 34-Base-Pair Exon, and One Element Lacks the Canonical G. J Bacteriol 189: 6572-6579
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Rueckert A, Ronimus RS, Morgan HW (2005) Rapid differentiation and enumeration of the total, viable vegetative cell and spore content of thermophilic bacilli in milk powders with reference to Anoxybacillus flavithermus. J Appl Microbiol 99: 1246-1255
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Soejima T, Iida K, Qin T, Taniai H, Seki M, Takade A, Yoshida S (2007). Photoactivated ethidium monoazide directly cleaves bacterial DNA and is applied to PCR for discrimination of live and dead bacteria. Microbiol Immunol 51: 763-775
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook. Springer, Heidelberg
Wang C, Li Z, Typas MA, Butt TM (2003) Nuclear large subunit rDNA group I intron distribution in a population of Beauveria bassiana strains: phylogenetic implications. Mycol Res 107: 1189-1200
Claims:
1. Ein PCR-gestütztes Verfahren zum differentiellen Nachweis physiologischer Zustände von Zellen dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung durch die Auswahl geeigneter PCR-Primer zur Amplifikation eines Abschnitts einer bestimmten Zielsequenz erzielt wird und zwar solchermaßen, dass mindestens eines der als PCR-Primer verwendeten Oligonukleotide vom 3'-Ende her beginnend einen sich über eine größere Zahl von Nukleotidbasen erstreckenden Bereich mit Sequenzidentität oder ausgeprägter Sequenzhomologie zu einer doppelsträngigen cDNA, die durch Reverse Transkription einer post-transkriptionell modifizierten RNA der fraglichen Zielsequenz gebildet werden könnte, aufweist als zu der die fragliche Zielsequenz enthaltenden genomischen DNA.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem differentiellen Nachweis physiologischer Zustände um die Unterscheidung zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen handelt.

3. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den genannten Zellen um Mikroorganismen handelt.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Mikroorganismen um niedere Eukaryonten handelt.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den niederen Eukaryonten um Pilze handelt.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den niederen Eukaryonten um Protozoen handelt.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Mikroorganismen um Prokaryonten handelt.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Prokaryonten um Bakterien handelt.

9. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den genannten Zellen um Zellkulturen höherer Eukaryonten handelt.

10. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zielsequenz um ein proteinkodierendes Gen handelt.

11. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zielsequenz um ein für ribosomale RNA kodierendes Gen handelt.

12. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der post-transkriptionellen Modifikation um das Entfernen eines Introns mittels Spleißen handelt.

13. Ein Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Intron um ein selbstspleißendes Gruppe I-Intron handelt.

Description:
Stand der Forschung und Technik

Nachweismethoden für das Vorliegen insbesondere pathogener, parasitischer oder auf andere Art schädlicher Mikroorganismen in Trägermaterialien sind z. B. in Medizin, Landwirtschaft und Lebensmittelproduktion von vielfältigem Interesse. Neben traditionell mikroskopischen sowie histo- oder zytologischen Methoden hat sich die molekulare Diagnostik auf der Basis der Polymerase-Kettenreaktion („polymerase chain reaction”, im folgenden kurz „PCR”) in vielfältigen Variationen zu einem Standardwerkzeug entsprechender Nachweise in einer Vielzahl von Anwendungskontexten entwickelt (Viljoen et al. 2005).

In zahlreichen Anwendungszusammenhängen ist nun nicht lediglich ein Nachweis über das bloße Vorliegen des z. B. infizierenden oder verunreinigenden Mikroorganismus notwendig, sondern darüber hinaus ist es wünschenswert, Informationen über den physiologischen Zustand des Organismus zu erhalten. Einen eminent wichtigen Sonderfall stellt hierbei die Unterscheidung der physiologischen Zustände „lebend” bzw. „lebensfähig” einerseits und „tot” bzw. „abgestorben” andererseits dar, welche beispielsweise im Zusammenhang mit Dauerformen, z. B. Sporen, bildenden Organismen und solchen Verfahren, welche die Abtötung des Mikroorganismus im Trägermaterial zum Ziel haben, also z. B. medizinische Behandlungs-, landwirtschaftliche Beiz- oder technische Sterilisationsverfahren, von besonderer Relevanz ist.

Eine Gruppe PCR-gestützter Nachweismethoden implementiert das Prinzip einer Unterscheidung zwischen genomischer DNA aus lebenden und toten Zellen des Mikroorganismus als Ausgangssubstanz („template”) der diagnostischen PCR-Reaktion. In der Regel wird hierbei DNA aus abgestorbenen Zellen abgebaut oder inaktiviert, so dass nur aus der Erbsubstanz lebender Zellen ein PCR-Produkt gebildet wird. Dessen z. B. gelelektrophoretischer Nachweis belegt diesem Funktionsprinzip zufolge das Vorliegen zumindest auch lebender Zellen des fraglichen Mikroorganismus. Diese Gruppe von Nachweismethoden wird paradigmatisch vertreten durch die sog. „EMA-PCR”, bei der durch eine Vorbehandlung der zu analysierenden Probe unter Zugabe der Chemikalie Ethidiummonoazid (EMA) DNA aus abgestorbenen Zellen des Mikroorganismus fragmentiert und abgebaut wird (Nogva et al. 2003, Rudi et al. 2005, Soejima et al. 2007). Die Diskriminierung zwischen DNA aus lebenden und toten Zellen beruht hierbei auf einer mit dem Verlust der Zellmembranintegrität verloren gehenden Abschirmung genomischer DNA gegen die DNA-bindende Wirkung des Ethidiummonoazid.

EMA-PCR und verwandte Methoden finden mittlerweile breite Verwendung in der Lebensmitteltechnologie (Rueckert et al. 2005) sowie zur Analyse von Umweltproben (Pisz et al. 2007). Die Exaktheit der mittels EMA-PCR erhaltenen Ergebnisse wird jedoch in vielen Fällen z. B. durch Verschiebung von Nachweisgrenzen vermindert durch die nachgewiesene Beeinträchtigung von Folgeanalysen durch in Proben verbleibendes EMA (Hein et al. 2006) sowie durch eine unzureichende Diskriminierung zwischen lebenden und toten Zellen (Flekna et al. 2007). Zudem ist EMA-PCR bislang nur zur Analyse von Bakterien eingeführt, während andere Mikroorganismen, z. B. Pilze oder Protozoa, von EMA-PCR nicht erfasst werden.

Die nachstehend unter der Bezeichnung „Splice-PCR” beschriebene, ebenfalls PCR-gestützte Methode macht sich zum Nachweisziel einer Unterscheidung lebender und toter Zellen eines Mikroorganismus ein anderes Prinzip zunutze.

In toten Zellen kommen sowohl die DNA-Transkription in RNA als auch die post-transkriptionelle Modifikation der RNA-Primärtranskripte zum Erliegen. Durch post-transkriptionelle Modifikation, insbesondere durch das „Spleißen” von Introns, entstehen genspezifische Sequenzunterschiede zwischen der die Transkriptionsvorlage bildenden genomischen DNA-(gDNA-)Sequenz und einer aus der modifizierten RNA durch Reverse Transkription erzeugten doppelsträngigen sog. komplementären DNA (cDNA). Diese Zusammenhänge sind wohlbekannt und Gegenstand des molekulargenetischen Lehrbuchwissens (siehe z. B. Lewin 1997). Zur Isolation genomischer DNA sowie der verschiedenen RNAs aus biologischen Proben wie auch zur in vitro-Synthese von cDNA aus isolierter RNA stehen molekularbiologische Standardmethoden zur Verfügung (siehe z. B. Sambrook & Russell 2001).

Beschreibung der Erfindung

Die vorstehend genannten molekulargenetischen Zusammenhänge lassen sich nun insofern zur Unterscheidung lebender von toten Zellen nutzbar machen, als die Parameter einer Polymerase-Kettenreaktion bei ausreichender genetischer Vorinformation über den Zielorganismus so gewählt werden können, dass ausgehend von genomischer DNA einerseits und post-transkriptionell modifizierter RNA bzw. aus dieser revers transkribierter cDNA andererseits unterschiedliche Produkte gebildet werden. Insbesondere kann durch geeignete Wahl der PCR-Primer (in Verbindung mit der Wahl geeigneter weiterer PCR-Parameter wie Annealing-Temperatur und Elongationszeit) erreicht werden, dass ausschließlich aus modifizierter RNA oder der zugehörigen cDNA, nicht aber aus der entsprechenden gDNA oder dem RNA-Primärtranskript ein DNA-Fragment amplifiziert wird. Hierzu muß mindestens einer der beiden Primer so entworfen werden, dass seine Sequenz zur Umgebung einer Spleißstelle der cDNA komplementär ist. Flankieren z. B. die zu 5'- und 3'-Ende der Primersequenz komplementären Abschnitte der gDNA dieselbe, im Zuge des RNA-Spleißens deletierte Struktur, z. B. ein Intron, so wird eine vollständige Primerbindestelle erst durch post-transkriptionelle Modifikation gebildet. Bei Verwendung einer ausreichend hohen Annealing-Temperatur fungiert der entsprechende Primer daher nur an gespleißter RNA oder aus solcher gebildeter cDNA, nicht aber an gDNA oder dem RNA-Primärtranskript als Startermolekül einer durch RNA- bzw. DNA-abhängige DNA-Polymerase vermittelten Elongationsreaktion. Da genomische DNA sowohl in lebenden als auch in toten, gespleißte RNA jedoch nur in lebenden Zellen vorliegt, kann mit Hilfe der beschriebenen Methode das Vorliegen lebender Zellen nachgewiesen werden. Für die beschriebene Methode wird daher die Bezeichnung „Splice-PCR” vorgeschlagen.

Ein Sonderfall der vorstehend beschriebenen Methode betrifft den Nachweis von Dauerformen, z. B. Sporen oder Dauermyzelien, in denen Stoffwechsel und Proteinbiosynthese nicht oder nur in sehr geringem Umfang stattfinden und in denen daher keine nachweisbaren Konzentrationen proteinkodierender „messenger-RNA” (mRNA) vorliegen. Lebens- z. B. keimfähige Dauerformen enthalten notwendig eine gewisse Menge an Ribosomen, von denen aus die vorübergehend eingestellte Proteinbiosynthese – auch diejenige ribosomaler Proteine – wieder aufgenommen werden kann, und können über die in den Ribosomen vorliegende reife ribosomale RNA (rRNA) nachgewiesen werden. Eine bevorzugte Zielstruktur im Sinne des oben geschilderten Ansatzes sind z. B. die in der rRNA niederer Eukaryonten häufigen sog. selbstspleißenden Gruppe I-Introns.

Eine mögliche Weiterentwicklung der vorstehend beschriebenen Methode betrifft die Präzisierung der Diagnoseleistung über die Unterscheidung lebender von toten hinaus.

Über die Durchführung eines Splice-PCR-Ansatzes an solchen Genen, die für ein Genprodukt bekannter Funktion kodieren, kann eine feinere Unterscheidung zwischen zwei möglichen physiologischen Zuständen A und B eines in einer Probe vorliegenden Organismus erreicht werden. Ist z. B. in einem gegebenen Anwendungskontext von Interesse, ob ein Organismus nicht lediglich im physiologischen Zustand A, sondern auch im physiologischen Zustand B vorliegt und ist weiterhin bekannt, dass Zustand B mit dem Vorliegen eines bestimmten Proteins notwendig verbunden oder durch dessen Vorliegen charakterisiert ist, und unterliegt zudem die für dieses Protein kodierende mRNA bekanntermaßen einer bestimmten post-transkriptionellen Modifikation, so kann das Vorliegen des physiologischen Zustandes B in der betreffenden Probe über eine Splice-PCR in Analogie zum oben Ausgeführten nachgewiesen werden.

In Bezug auf den Stand der Technik ist die hier beschriebene Methode in ihrer Leistungsfähigkeit insbesondere zur EMA-PCR komplementär. Umfangreiche post-transkriptionelle Modifikation, insbesondere das Spleißen von Introns, ist für Eukaryonten charakteristisch, so dass die Splice-PCR bevorzugt ein von der EMA-PCR nicht erfasstes Spektrum möglicher Anwendungen abdeckt. Das wachsende Verständnis post-transkriptioneller Modifikationen auch bei Prokaryonten sowie das Vorliegen von Gruppe I-Introns in rRNA-Genen zahlreicher Bakterien machen Splice-PCR auch über den Bereich der Eukaryonten hinaus anwendbar. Mögliche gewerbliche Anwendungen der Erfindung bestehen u. a. zur Qualitätssicherung in der Lebensmittelproduktion sowie zur medizinischen oder phytosanitären Diagnostik.

Ausführungsbeispiel 1:

Das 28S rRNA kodierende Gen des Biokontrollstammes VIZR13 des entomopathogenen Pilzes Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin enthält – wie auch zahlreiche andere Stämme der Art (Wang et al. 2003) – zwei funktionale, durch 662bp kodierender Sequenz voneinander getrennte Gruppe I-Introns. Die kodierende Sequenz in der Umgebung beider Insertionsstellen wurde wie folgt festgestellt, wobei „*” den Insertionsort des Introns markiert:

Auf der Basis dieser Sequenzkenntnisse wurden in folgender Orientierung Splice-PCR Primer gegen die unterstrichenen Sequenzbereiche verwendet:

Da die Primersequenzen nahe dem 3'-Ende durch die Insertionsstelle des Introns unterbrochen werden, ist mit einer Amplifikation der interintronischen Sequenz nur bei Vorliegen einer Ausgangssubstanz („template”) zu rechnen, aus der beide Introns deletiert wurden, wodurch erst eine zu den Primern komplementäre kontinuierliche Sequenz im template entsteht. Entsprechend gespleißte RNA sollte nur in lebenden Zellen vorliegen.

Auf der Basis frischen Myzels des Pilzes sowie zweierlei Sporentypen, auf Festmedium erzeugten Konidiosporen und in Submerskultur gebildeten Blastosporen, wurde sowohl vor als auch nach abtötender Behandlung (Autoklavieren) ein Standard-Isolationsprotokoll für Gesamt-RNA durchgeführt. Ebenfalls nach Standardverfahren wurden dann mit Primer spliceR1 eine cDNA-Erststrangsynthese (Reverse Transkription) und unter Verwendung beider Primer die cDNA-Amplifikation durchgeführt. Hierbei wurden für die cDNA-Amplifikation folgende Parameter gewählt: anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, dann 35 Zyklen bestehend aus 30 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 30 Sekunden Annealing bei 56°C und 60 Sekunden Elongation bei 72°C, sowie abschließende 5 Minuten Elongation bei 72°C. Aus allen drei Entwicklungsstufen wurde vor abtötender Behandlung das erwartete, ca. 700 bp lange PCR-Produkt amplifiziert, wohingegen aus den abgetöteten Proben kein Produkt erhalten wurde.

Ausführungsbeispiel 2:

Das 28S rRNA kodierende Gen des humanpathogenen Gammaproteobakteriums Coxiella burnetii enthält zwei durch nur 34 bp kodierender Sequenz getrennte selbstspleißende Gruppe I-Introns (Raghavan et al. 2008), deren Insertionsstellen (*) im folgenden Sequenzkontext liegen:

Ausgehend von diesem Sequenzabschnitt lassen sich zwei verschiedene Splice-PCR-Ansätze durchführen. Erstens unter Verwendung des antiparallel orientierten splice-Primers (komplementär zur unterstrichenen Sequenz) in Kombination mit einem stromaufwärts liegenden Gegenprimer, zweitens unter Verwendung des parallel orientierten splice-Primers (identisch der kursiv gedruckten Sequenz) in Kombination mit einem stromabwärts liegenden Gegenprimer.

Der methodologische Unterschied zwischen beiden Ansätzen besteht darin, dass im ersten Fall Primer spliceR2 zur cDNA-Erststrangsynthese, d. h. in Verbindung mit RNA.-abhängiger DNA-Polymerase eingesetzt wird, während im zweiten Fall die Erststrangsynthese mit einem gewöhnlichen Primer vorgenommen wird und Primer spliceF2 zur Zweitstrangsynthese und cDNA-Amplifikation dient. Der genannte Unterschied ist zum qualitativen Nachweis lebend-tot unerheblich – in beiden Fällen entsteht aus abgestorbenen Zellen kein Produkt –, kann aber für quantifizierende Weiterentwicklungen methodologisch nutzbar gemacht werden.

Angeführte Literaturstellen

  • Flekna G, Stefanic P, Wagner M, Smulders FJ, Mozina SS, Hein I (2007). Insufficient differentiation of live and dead Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes cells by ethidium monoazide (EMA) compromises EMA/real-time PCR. Res Microbiol 158: 405–412.
  • Hein I, Flekna G, Wagner M (2006) Possible Errors in the Interpretation of Ethidium Bromide and PicoGreen DNA Staining Results from Ethidium Monoazide-Treated DNA. Appl Environm Microbiol 72: 6860–6862.
  • Lewin B (1997) Genes VI. Oxford University Press, Oxford
  • Nogva HK, Drømtorp SM, Nissen H, Rudi K (2003). Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques 34: 804–813.
  • Pisz JM, Lawrence JR, Schafer AN, Siciliano SD (2007). Differentiation of genes extracted from non-viable versus viable micro-organisms in environmental samples using ethidium monoazide bromide. J Microbiol Methods 71: 312–318.
  • Raghavan R, Miller SR, Hicks LD, Minnick MF (2007) The Unusual 23S rRNA Gene of Coxiella burnetii: Two Self-Splicing Group I Introns Flank a 34-Base-Pair Exon, and One Element Lacks the Canonical G. J Bacteriol 189: 6572–6579.
  • Rudi K, Moen B, Drømtorp SM, Holck AL (2005) Use of Ethidium Monoazide and PCR in Combination for Quantification of Viable and Dead Cells in Complex Samples. Appl Environm Microbiol 71: 1018–1024.
  • Rueckert A, Ronimus RS, Morgan HW (2005) Rapid differentiation and enumeration of the total, viable vegetative cell and spore content of thermophilic bacilli in milk powders with reference to Anoxybacillus flavithermus. J Appl Microbiol 99: 1246–1255.
  • Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
  • Soejima T, Iida K, Qin T, Taniai H, Seki M, Takade A, Yoshida S (2007). Photoactivated ethidium monoazide directly cleaves bacterial DNA and is applied to PCR for discrimination of live and dead bacteria. Microbiol Immunol 51: 763–775.
  • Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook. Springer, Heidelberg.
  • Wang C, Li Z, Typas MA, Butt TM (2003) Nuclear large subunit rDNA group I intron distribution in a population of Beauveria bassiana strains: phylogenetic implications. Mycol Res 107: 1189–1200.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • - Viljoen et al. 2005 [0001]
  • - Nogva et al. 2003 [0003]
  • - Rudi et al. 2005 [0003]
  • - Soejima et al. 2007 [0003]
  • - Rueckert et al. 2005 [0004]
  • - Pisz et al. 2007 [0004]
  • - Hein et al. 2006 [0004]
  • - Flekna et al. 2007 [0004]
  • - Lewin 1997 [0006]
  • - Sambrook & Russell 2001 [0006]
  • - Wang et al. 2003 [0012]
  • - Raghavan et al. 2008 [0016]