Title:
Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von HI-Viren mittels Multiplex-PCR in multiplen Genombereichen
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur Detektion von HIV-1 und HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend
a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
e) Herstellen eines PCR-Mastermixes,
umfassend
für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region und gag-Region der HIV-1-Genotypen abgeleitet werden,
wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22,
und
für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet werden,
wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist,
und weiter umfassend
eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist,
wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist,
und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet,
f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung,
wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, und
g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.




Inventors:
Seifried, Erhard, Prof. Dr. med. (61462, Königstein, DE)
Schmidt, Michael, Dr. med. (63075, Offenbach, DE)
Hourfar, Michael Kai, Dr. (64354, Reinheim, DE)
Application Number:
DE102008025328A
Publication Date:
10/17/2013
Filing Date:
05/27/2008
Assignee:
DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH, 60528 (DE)
International Classes:



Other References:
Dreier J. u.a.: Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays. In: J. of Clinical Microbiology (2005) 43 (9) 4551-4557
Drosten C. u.a.: TaqMan 5'-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. In: J. of Clinical Microbiology (2001) 39 (12) 4302- 4308
Drosten C. u.a.: Ultrasensitive monitoring of HIV-1 viral load by a low-cost real-time reverse transcription-PCR assay with internal control for the 5' long terminal repeat domain. In: Clin . Chem. (2006) 52 (7) 1258-66
MacNeil A. u.a.: Genomic sites of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) integration: similarities to HIV-1 in vitro and possible differences in vivo. In: J. of Virology (2006) 80 (15) 7316-7321
O' Connell K. P. u.a.: Real-time fluorogenic reverse transcription-PCR assays for detection of bacteriophage MS2. In: Applied and Environmental Microbiology (2006) 72 (1) 478-483
Vet J.A.M. u.a. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (1999) 96 (11) 6394-9
Attorney, Agent or Firm:
BOEHMERT & BOEHMERT, 28209, Bremen, DE
Claims:
1. Verfahren zur Detektion von HIV-1 und HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend
a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
e) Herstellen eines PCR-Mastermixes,
umfassend
für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region und gag-Region der HIV-1-Genotypen abgeleitet werden,
wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22,
und
für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet werden,
wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist,
und weiter umfassend
eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist,
wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist,
und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet,
f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung,
wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, und
g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive oder eine kompetitive Nukleinsäure ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleinsäure ist und die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 16 hat.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleinsäure ist und eine Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der PCR-Mastermix weiterhin umfasst:
für den Nachweis einer Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für MS2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer und einen Antisense-Primer umfasst,
wobei der Sense-Primer ausgewählt ist aus Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10, 12 und 14 und der Antisense-Primer ausgewählt ist aus Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 11, 13 und 15.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 und 11,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 12 und 13,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 14 und 15.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben, insbesondere Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben handelt.

8. Verfahren einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die in Schritt a) zur Verfügung gestellten aus Blut abgeleiteten Proben zu mindestens einem Probenpool zusammengeführt werden.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Konzentrieren der Proben in Schritt b) Zentrifugieren umfasst.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz der vierten Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, von der Sequenz der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleinsäure ist und die vierte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 24 ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleinsäure ist, insbesondere die Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 hat, und die vierte Sonde ausgewählt ist aus Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 25, 26 oder 27.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine oder mehrere der Sonden Hydrolyse-Sonden oder Molecular Beacons sind.

14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 12, wobei die Sonden mit jeweils zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, und die zwei Fluoreszenzfarbstoffe bevorzugt ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher, sind.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Fluoreszenzdonor oder -reporter ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
6-Carboxyfluorescein (6-FAM),
5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX),
3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow),
Boron-dipyrromethen (BDP),
Tetramethylrhodamin (TMR),
5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und
Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red).

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA),
Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB),
4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1),
4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2),
4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und
5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ).

17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert sind, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem die vierte Sonde markiert ist, unterscheidet.

18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ausgewählt ist aus
Multiplex-PCR,
Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA), Ligase-Kettenreaktion (LCR),
Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) und Strang-Ablöse-Amplifikation (strand displacement amplification, SDA).

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Multiplex-PCR eine Multiplex-Realtime-PCR ist.

20. Zusammensetzung zum Nachweis von HIV-1 und HIV-2,
umfassend Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 1 bis 9 sowie Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23,
wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird:
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7;
und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird:
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22,
und wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, weiterhin umfassend ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 24.

22. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 und 21, weiterhin umfassend
– mindestens zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 bis 15; und
– mindestens ein Oligonukleotid ausgewählt aus den Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NO. 25 bis 27.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 bis 15, ausgewählt sind aus den Paaren
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 10 und 11,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 12 und 13,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 14 und 15.

24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 19 bis 27 mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei die zwei Fluoreszenzfarbstoffe ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher, sind.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der Fluoreszenzdonor oder -reporter ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
6-Carboxyfluorescein (6-FAM),
5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX),
3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow),
Boron-dipyrromethen (BDP),
Tetramethylrhodamin (TMR),
5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und
Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red).

27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA),
Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB),
4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1),
4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2),
4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und
5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ).

28. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 19 bis 23 mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert sind, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 24 bis 27 markiert sind, unterscheidet.

29. Testkit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von HI-Viren in aus Blut abgeleiteten Proben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, umfassend
– mindestens eine der Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 20 bis 28,
– Reagenzien und Hilfsstoffe für die Extraktion viraler Nukleinsäuren aus aus Blut abgeleiteten Proben und für die Nukleinsäure-Amplifizierung.

Description:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Zusammensetzungen und Testkits für die Amplifikation und Detektion von humanem Immundefizienzvirus (HIV). Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Multiplex-PCR-Verfahren, welches durch die Anwendung von multiplen Primersets/Sondensets alle bisher bekannten Subtypen von HIV-1, einschließlich der Gruppe M- und der Gruppe O-Isolate, sowie alle Subtypen von HIV-2 amplifizieren kann. Dabei erfolgt die Amplifikation der HIV-1 Subtypen bevorzugt in zwei konservierten Genomregionen, um das Risiko einer falsch negativen Reaktion durch spontane Mutationen des HIV signifikant gegenüber bisher beschriebenen HIV-Nachweisverfahren zu reduzieren.

Hintergrund der Erfindung

Das erworbene Immundefizienzsyndrom (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) wird durch das humane Immundefizienzvirus (HIV) verursacht. Das HI-Virus kann in zwei Gruppen differenziert werden: HIV-1 und HIV-2. Beide Gruppen zeigen eine genetische Verwandtschaft, jedoch eine Variabilität in der Erbinformation. Gegenwärtig werden in der Literatur 10 Subtypen von HIV-1 (Gruppe M umfassen die Subtypen A-I und Gruppe O umfasst den Subtyp O1 und O2) identifiziert. Diese große genetische Variabilität unter den HIV-Isolaten macht es extrem schwierig, Verfahren, umfassend die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), sowie Primer und Sonden zu entwerfen, welche alle Subtypen von HIV-1 und alle HIV-2-Subtypen effizient detektieren. Ferner muss damit gerechnet werden, dass aufgrund der fehlenden „Proof-Reading” Funktion der reversen Transkriptase weitere Mutationen bei HI-Viren auftreten werden und somit die Anzahl der Subtypen zunehmen wird.

Gegenwärtig beschriebene Methoden basierend auf Multiplex-PCR beschreiben die Amplifikation in jeweils einer Genomregion pro Virus (EP 0 727 497 B1, EP 0 630 973 A2 oder DE 698 33 160 T2). Kommt es in der beschriebenen Amplifikationsregion zu Mutationen im Bereich der Primerbindungsstellen oder der Sondenbindungsstellen, so ist mit einer verminderten Amplifikationseffizienz bzw. einem falsch negativen Ergebnis zu rechnen. Handelt es sich dabei um ein Blutprodukt, so besteht die Gefahr einer Übertragung von HIV auf einen Empfänger. Trotz gesetzlicher Einführung der Realtime PCR in das Spenderscreening kam es im Frühjahr 2007 zu einer transfusionsbedingten Übertragung von HIV-1 auf einen Empfänger. Mitverantwortlich für die Übertragung waren Mutationen in der Sondenbindungsregion und im Bereich des Antisense-Primers des verwendeten PCR-Screening Verfahrens.

Vet et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(11): 6394–6399) beschreiben ein Multiplex-Verfahren zur gleichzeitigen Detektion von 4 Retroviren, HIV-1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II. Dabei werden zugleich jeweils ein Virus-spezifisches Primerpaar und ein Molecular Beacon als eine Sonde verwendet, wobei für HIV-1 und HIV-2 ein Primerpaar aus der gag-Region von HIV-1 und ein Primerpaar aus der env-Region von HIV-2 eingesetzt werden. Es können die HIV-1 Subtypen A-G und die HIV-2 Subtypen A, D und SD detektiert werden.

Drosten et al. (Clin Chem. 2006; 52(7): 1258–1266) beschreiben ein RT-PCR-Nachweisverfahren für HIV-1. Es werden ein aus der LTR-Domäne von HIV-1 abgeleitetes Primerpaar, zwei Sonden, eine interne Kontroll-Nukleinsäure und eine dafür spezifische Sonde eingesetzt.

Drosten et al. (J Clin Microbiol. 2001; 39(12): 4302–4308) offenbaren einen HT-RT-PCR-Assay zum Nachweis von HIV-1, der ein Primerpaar aus der gag-Region von HIV-1 und eine interne Kontrollsonde, die in einen MS2-Coliphagen verpackt ist („armored RNA”), verwendet.

MacNeil et al. (J Virol. 2006; 80(15): 7316–7321) offenbaren das Mapping von 202 HIV-2 Integrationsstellen in das humane Genom. O'Connell (Appl Environ Microbiol. 2006; 72(1): 478–83) offenbaren real-time fluorogene RT-PCR-Assays zur Detektion des Bacteriophagen MS2. Dreier et al. (J Clin Microbiol. 2005; 43(9): 4551–4557) offenbaren die Verwendung des Bacteriophagen MS2 als interne Kontrolle in viralen RT-PCR-Assays.

Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Methoden für die Detektion aller bekannten HIV-1 Subtypen und HIV-2 Subtypen zur Verfügung zu stellen, um insbesondere im Blutspendewesen das Risiko für falsch negative Ergebnisse, wie verursacht durch Spontanmutationen in einer Genomregion von HIV, zu reduzieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung überwindet die oben aufgeführten Probleme und stellt Mittel zur Amplifikation und Detektion von hoch divergenten HIV-1 und HIV-2 Isolaten zur Verfügung.

Die oben aufgeführte Aufgabe wird durch die Erfindung, wie in den Patentansprüchen beansprucht, gelöst.

Die oben aufgeführte Aufgabe wird gelöst durch das zur Verfügung stellen von Verfahren für die Detektion aller bekannten HIV-1 Subtypen und/oder HIV-2 Subtypen in aus Blut abgeleiteten Proben, umfassend eine parallele Amplifikation in zwei konservierten Genombereichen des HIV. Somit wird das Risiko für falsch negative Ergebnisse durch Spontanmutationen in einer Genomregion von HIV reduziert. Die Erfindung stellt weiterhin Zusammensetzungen und Testkits zur Verfügung, die insbesondere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.

Verschiedene andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Amplifikation von HIV-Nukleinsäuren. Die Verfahren umfassen das in Kontaktbringen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie HIV-Nukleinsäuren enthält, mit vier verschiedenen NTPs, einer reversen Transkriptase sowie ggf. RNase-Inhibitoren, einer thermostabilen DNA-Polymerase in der Gegenwart von Oligonukleotiden für die Amplifikation von HIV-1 Nukleinsäuren, von Oligonukleotiden für die Amplifikation von HIV-2 Nukleinsäuren sowie in Gegenwart von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden als Sonden für die Amplifikation von HIV-1 Zielnukleinsäuren, Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden als Sonden für die Amplifikation von HIV-2 Zielnukleinsäuren sowie in Gegenwart von Oligonukleotiden für die Amplifikation/Detektion einer internen Kontrolle sowohl in der Ausführungsform einer kompetitiven internen Kontrolle (z. B. HIV-1 interne Kontrolle) sowie in der Ausführungsform einer nicht kompetitiven internen Kontrolle (z. B. Bacteriophage MS2).

Detaillierte Beschreibung der ErfindungErfindungsgemäße Detektions- und Screeningverfahren

Wie oben ausgeführt, wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Detektion von HIV-1 und HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
In einem ersten Schritt (a) werden aus Blut abgeleitete Proben zur Verfügung gestellt.

Im nächsten Schritt (b) werden die aus Blut abgeleiteten Proben konzentriert.

Im nächsten Schritt (c) erfolgt die Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine erste interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution.

Im nächsten Schritt (d) werden die viralen Nukleinsäure-Extrakte aus dem vorhergehenden Schritt (c) erhalten.

Im nächsten Schritt (e) wird ein PCR-Mastermix hergestellt.

Der PCR-Mastermix umfasst für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst. Dabei werden die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von zwei verschiedenen konservierten Regionen, der HIV-1-Genotypen (5'-LTR-Region und gag-Region) abgeleitet.

Wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22.

Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst.

Dabei werden die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet.

Wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist.

Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist. Die Sonden sind mit jeweils mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die erste, zweite und dritte Sonde ist dabei jeweils mit mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert und die vierte Sonde ist mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet.

Im nächsten Schritt (f) werden die viralen Nukleinsäure-Extrakte (aus Schritt d) zum PCR-Mastermix zugegeben und die Nukleinsäuren amplifiziert, wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt.

Im nachfolgenden Schritt (g) erfolgt die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren, d. h. der viralen Nukleinsäuren (wenn vorhanden) und der internen Kontroll-Nukleinsäure.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

  • a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
  • b) Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
  • c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
  • d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
  • e) Herstellen eines PCR-Mastermixes,
umfassend
für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region und gag-Region der HIV-1-Genotypen abgeleitet werden,
wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird: Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7; und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20, Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22,
und
für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst,
wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von der konservierten 5'-LTR-Region der HIV-2-Genotypen abgeleitet werden,
wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist,
und weiter umfassend
eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist,
wobei die erste, zweite und dritte Sonde mit jeweils mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert sind,
und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet,
  • f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung,
    wobei vor der Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix eine reverse Transkription der viralen RNA und der internen Kontroll-Nukleinsäure erfolgt, und
  • g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben. Die zelluläre Blutbestandteile enthaltenden Proben sind dabei ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Erythrozyten, Thrombozyten oder Plasmaprodukten.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zum Screening von Einzelproben als auch zum Screening von gepoolten Proben. In einer Ausführungsform werden die aus Blut abgeleiteten Proben zu mindestens einem Probenpool zusammengeführt. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe bzw. Probenpool werden bevorzugt mindestens 3000 μl (3 ml) Probe bzw. Probenpool benötigt. Untersucht werden bevorzugt Plasmaproben mit einem Mindestvolumen von 100 μl. Hierbei können Minipools bevorzugt von einer Poolgröße zwischen 3 und 96 Proben hergestellt und untersucht werden.

Der Begriff „Oligonukleotide” bezieht sich insbesondere auf ein Molekül, welches eines oder mehrere Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfasst, wie z. B. Primer, Sonden und Nukleinsäurefragmente, die detektiert werden sollen.

Der Begriff „Primer” bezieht sich insbesondere auf ein Oligonukleotid, welches entweder natürlich vorkommt oder synthetisch hergestellt wird und welches in der Lage ist, als ein Ausgangspunkt der Synthese zu agieren, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, unter welchen die Synthese eines Primer-Extensionsprodukts komplementär zu einem Nukleinsäurestrang induziert wird. Dabei werden geeignete Reaktionsbedingungen (Temperatur, pH-Werte) für eine Amplifizierungs-Reaktion gewählt.

Um HIV-Zielnukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren, werden bevorzugt Primersets aus folgenden Oligonukleotiden ausgewählt:

Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure mindestens eine Region, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann. Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure außerdem Regionen, an denen sich Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, spezifisch anlagern können, so dass die interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert werden kann.

Erfindungsgemäß ist die mindestens eine Region der internen Kontroll-Nukleinsäure, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann, unterschiedlich zu Sequenzen des Zieltargets, der Nukleinsäuren der HI-Viren, HIV-1 und HIV-2, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt eine Sonde, die spezifisch für die viralen Nukleinsäuren ist, wird nicht an die interne Kontroll-Nukleinsäure hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere (vierte) Sonde verwendet, deren Sequenz von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wurde.

Es wird bevorzugt, dass die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz ist bzw. eine Nukleinsäure ist, die eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz umfasst.

Erfindungsgemäß zeichnet sich eine kompetitive Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure dadurch aus, dass sich die Regionen, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, nicht unterscheiden von den respektiven Regionen der Nukleinsäuren der HI-Viren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt dieselben Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, führen zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren und zur Amplifikation der internen kompetitiven Kontroll-Nukleinsäure.

Dahingegen sind die Regionen einer nicht kompetitiven Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, verschieden zu den respektiven Regionen der viralen Nukleinsäuren. Das heißt die Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, die zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren führen, amplifizieren nicht zugleich die interne nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure.

Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz, deren Zuckerbestandteil Desoxyribose oder Ribose ist. Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz aus DNA, RNA oder modifizierten Nukleotiden, aber auch um DNA- oder RNA-Konstrukte, insbesondere synthetisierte DNA- oder RNA-Konstrukte.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz. Für den Nachweis von HIV, insbesondere von HIV-1, hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 16 oder ein Komplementär davon.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz. Für den Nachweis von HIV, insbesondere von HIV-2, hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz und ist ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2.

Für den Nachweis einer solchen Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 umfasst der PCR-Mastermix in den erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für MS2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer und einen Antisense-Primer umfasst.

Bevorzugt ist dabei der Sense-Primer ausgewählt ist aus SEQ ID NOs. 10, 12 und 14 und der Antisense-Primer ist bevorzugt ausgewählt aus SEQ ID NOs. 11, 13 und 15, wobei bevorzugt aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird SEQ ID NOs. 10 und 11, SEQ ID NOs. 12 und 13, SEQ ID NOs. 14 und 15. Für die entsprechenden Sonden, siehe unten.

Unter einer Multiplex-PCR versteht man die Amplifikation von mindestens zwei Nukleinsäuresequenzen in einem Amplifikationsschritt. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleinsäuren von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und/oder HIV-2, durch eine geeignete Wahl der Primer- und Sonden-Sequenzen amplifiziert, sofern sie (die Viren) in der Untersuchungsprobe vorhanden sind. Ferner wird die zugegebene interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert und überwacht damit die Amplifikation, vor allem in negativen Untersuchungsproben, in denen keine Amplifikation viraler Nukleinsäuren stattfindet.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet einen PCR-Mastermix.

Für jede Zielnukleinsäure wird im allgemeinen ein Set von mindestens 2 Primern verwendet. Eine Vielzahl von Sets an Primern kann simultan verwandt werden, um eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren zu amplifizieren.

Für den gleichzeitigen Nachweis von HIV-1 und HIV-2 umfasst der PCR-Mastermix

  • – für den Nachweis von HIV-1: einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst,
    wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von verschiedenen konservierten Regionen der bekannten HIV-1-Genotypen abgeleitet werden,
  • – für den Nachweis von HIV-2: einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, und weiterhin
  • – eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist.

Methoden für die Präparation und Verwendung von Sonden und Primern werden zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Vol. 1–3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et al., PCR-Protokolle. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. PCR-Primer-Paare können von einer bekannten Sequenz zum Beispiel unter der Verwendung von Computerprogrammen, welche für diesen Zweck entwickelt wurden, wie zum Beispiel PRIMER3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) abgeleitet werden.

Die Anmelder begannen die Entwicklung ihres PCR-Amplifikationssystems für HI-Viren durch die Identifikation von hoch konservierten Sequenzregionen von HIV-1 sowie HIV-2. Primer wurden für konservierte Regionen unter Zuhilfenahme der aktuellen Literatur (C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258–1266), (C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302–4308), (Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316–7321), (Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478–483) und (J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551–4557) untersucht. Primer der publizierten Arbeiten wurden anhand der Los Alamos Gendatenbank bezüglich des Auftretens von Mutationen überprüft sowie geringfügige Modifikationen durchgeführt.

Die erfindungsgemäßen Sätze Oligonukleotide aus je mindestens einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und mindestens einer Sonde sind spezifisch für die Nukleinsäuren von HIV-1 bzw. HIV-2. Die Sequenzen des Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonden werden bevorzugt abgeleitet von in den Gendatenbanken veröffentlichen Nukleotidsequenzen von HIV-1 und HIV-2.

Eine wesentliche Innovation der vorliegenden Erfindung besteht in der simultanen Amplifikation der HIV-1 Zielnukleinsäure in den konservierten Regionen 5' LTR sowie gag. In der vorliegenden Erfindung wurden somit Primersets für HIV-1 und HIV-2 entwickelt, welche miteinander kompatibel sind und daher kombiniert werden können. Die Primer und Fluoreszenz markierten Oligonukleotide (Sonden) wurden dabei so gewählt, dass alle bisher bekannten Isolate von HIV-1 und HIV-2 detektiert werden können. Aufgrund der fehlenden Proof-Reading Funktion der reversen Transkriptase besteht bei Retroviren eine höhere Gefahr für das Auftreten von neuen Mutationen sowie neuen Genotypen bzw. Subtypen. Die Anmelder haben dieses Hindernis dahingehend überwunden, dass der Nachweis der HIV Zielnukleinsäure in mehreren Regionen erfolgt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleotidsequenzen der Oligonukleotide, die spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren sind, von konservierten Regionen der (bekannten) HIV-1-Genotypen/Isolate, nämlich der 5'-LTR-Region und der gag-Region, abgeleitet.

Dabei ist:

  • – der Sense-Primer ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 1, 3, 5 und 6 oder Komplementären davon,
  • – der Antisense-Primer ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 2, 4 und 7 oder Komplementären davon,
  • – die erste Sonde ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 19 und 21 oder Komplementären davon und
  • – die zweite Sonde ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 20 und 22 Komplementären davon,
wobei SEQ ID NOs. 1–4, 19 und 20 von der HIV-1 gag Region abgeleitet wurden
wobei SEQ ID NOs. 5–7, 21 und 22 von der HIV-1 5'-LTR-Region abgeleitet wurden
Hier wird das Verfahren zum Nachweis von HIV-1 verwendet.

Dabei wird dabei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt SEQ ID NOs. 1 und 2, SEQ ID NOs. 3 und 4, SEQ ID NOs. 5 und 7, SEQ ID NOs. 6 und 7;
und wird aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt SEQ ID NOs. 19 und 20, SEQ ID NOs. 21 und 22.

Weiter bevorzugt werden folgende Kombinationen der Paare verwendet:

RegionSense und Antisense
Primer
erste und zweite Sonde
gagSEQ ID NOs. 1 und 2SEQ ID NOs. 19 und 20gagSEQ ID NOs. 3 und 4SEQ ID NOs. 19 und 205'-LTRSEQ ID NOs. 5 und 7SEQ ID NOs. 21 und 225'-LTRSEQ ID NOs. 6 und 7SEQ ID NOs. 21 und 22

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleotidsequenzen der Oligonukleotide, die spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren sind, von konservierten Regionen der (bekannten) HIV-2-Genotypen/Isolate, nämlich der 5'-LTR-Region, abgeleitet.

Dabei hat der Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8 oder ein Komplementär davon, der Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9 oder ein Komplementär davon und die dritte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 23 oder ein Komplementär davon. Hier wird das Verfahren zum Nachweis von HIV-2 verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Nukleotidsequenz der vierten Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, von der Sequenz der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet.

Aufgrund der genetischen Diversität und dem Vorhandensein von multiplen Genotypen und Subtypen, stellt die Entwicklung eines Co-Amplifikationssystems für die simultane Detektion von HIV-1 und HIV-2 eine extreme erfinderische Herausforderung dar. Zentrale Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Primerinteraktionen zwischen mindestens 11 Primer (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 1–9) sowie 7 fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 19–23) zu minimieren, sowie Nebenproduktbildungen, welche sowohl die Assay-Sensitivität als auch möglicherweise die Spezifität reduzieren können, zu vermeiden. Ferner war es notwendig, eine interne Kontrolle („Interna”) zu den Amplifikationsprimern zuzufügen. Dabei gibt es zwei bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Zum einen besteht die Möglichkeit, eine kompetitive interne Kontrolle zu verwenden (wie SEQ ID NO. 16), die für die Amplifikation die Primer von HIV-1 verwendet und für die Detektion ein spezielles Fluoreszenz-markiertes Oligonukleotid (Sonde, wie SEQ ID NO. 24) verwendet. Zum anderen besteht eine Ausführungsform in der Verwendung einer nicht kompetitiven internen Kontrolle (z. B. Bacteriophage MS2) unter Verwendung von Oligonukleotidprimern (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 10–15) und eines Fluoreszenz-markierten Oligonukleotides (Sonde, ausgewählt aus SEQ ID NOs. 25–27).

Ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz und hat die Sequenz SEQ ID NO. 16, dann hat die vierte Sonde bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 24.

Ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz und hat insbesondere eine Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 hat, dann hat die vierte Sonde bevorzugt eine Nukleotidsequenz ausgewählt von SEQ ID NOs. 25, 26 oder 27.

Hier werden folgende Kombinationen der Primer-Paare mit der vierten Sonde bevorzugt:

Sense und Antisense
Primer
vierte Sonde
SEQ ID NOs. 10 und 11SEQ ID NOs. 25SEQ ID NOs. 12 und 13SEQ ID NOs. 26SEQ ID NOs. 14 und 15SEQ ID NOs. 27

Bei einer „Sonde” handelt es sich um ein Oligonukleotid, welches an den Enden mit bestimmten Fluorochromen markiert/gelabelt wurde. Nach dem physikalischen Prozess des Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET-Prinzip), welches 1946 von Theodor Förster beschrieben wurde, wird die einströmende Energie vom Reporter Molekül auf ein Quenchermolekül übertragen. Nach dem spezifischen Anlagern der Oligonukleotide an die Nukleinsäure-Zielsequenz, wird durch die Exonukleasefunktion der Polymerase die Distanz zwischen dem Reporter und dem Quencher vergrößert, so dass der so genannte Förster Radius (r) zunimmt und anschließend der Energietransfer vom Reporter auf den Quencher nicht mehr erfolgen kann. In diesem Fall wird eine zunehmende Emission der Fluoreszenzwellenlänge des Reportermoleküls detektiert. Unter der Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik können die Sonden mit einem spezifischen Bindungsliganden (z. B. Biotin), einem Enzym (z. B. Glukoseoxidase, Peroxidasen, Originase oder alkalischer Phosphatase), Radioisotopen, elektronendichten Reagenzien, Chromogenen, Fluorogenen, phosphoreszierenden Resten oder Pheritin markiert werden. Bevorzugt dabei ist die Markierung mittels spezifischer Fluochrome.

Die Sonden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind bevorzugt mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, insbesondere solche, die für Realtime-PCR geeignet sind. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen Fluoreszenzdonor oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher sind. Eine Sonde ist bevorzugterweise mit einem Paar aus jeweils einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher (einem FRET-Paar bzw. Fluoreszenzfarbstoffpaar) markiert.

Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX), 3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow), Boron-dipyrromethen (BDP), Tetramethylrhodamin (TMR), 5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red) oder vergleichbaren Fluoreszenzdonoren/-reportern.

Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB), 4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-di-isopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1), 4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2), 4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyano-ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ), oder vergleichbaren Fluoreszenzakzeptoren/-quenchern.

Weitere geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind Cyan 500, VIC, NED, LightCycler® Red 610 (LC610), Cyanin-Farbstoff Cy5 und LightCycler® Red 670 (LC670); weitere geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind Deep Dark Quencher (DDQ) und Cyanin-Farbstoff Cy5.

Es wird bevorzugt, dass die erste und die zweite und die dritte Sonde jeweils mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert ist.

Für die erste, zweite und dritte Sonde: wird eine einheitliche Fluoreszenzmarkierung am 5'-Ende der Sonden bevorzugt und am 3'-Ende wird ein Blackhole-Quencher bevorzugt.

Es wird weiterhin bevorzugt, dass sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten, zweiten und dritten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde unterscheidet.

Die Fluoreszenzmarkierung kann sich am 5'-Ende unterscheiden, wie 6-FAM für die erste, zweite und dritte Sonde (HIV-Nukleinsäureamplifikation) und Cy5 für die vierte Sonde (interne Kontrolle).

Wenn HIV-1 und HIV-2 gleichzeitig nachgewiesen werden, kann sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten und zweiten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der dritten Sonde unterscheiden, welche sich wiederum von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde unterscheiden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten, zweiten und dritten Sonde 6-FAM und TAMRA. Das Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde kann VIC und TAMRA sein. Alternativ werden Kombinationen von 6-FAM und Black Hole Quenchern sowie VIC und Black Hole Quenchern bevorzugt.

Der Vorteil einer geeigneten Wahl der Paare der Fluoreszenzfarbstoffe ist es, dass aufgrund der unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen gleichzeitig zwei Fluoreszenz-Emissionen (z. B. von FAM und VIC) oder auch mehrere (z. B. 3) Fluoreszenz-Emissionen beobachtet werden können und damit jeweils auf die An- bzw. Abwesenheit von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und/oder HIV-2, und interner Kontroll-Nukleinsäure rückgeschlossen werden kann. Dabei ist zu beachten, daß sich die Anregungs- und Emissionswellenlängen jeweils nicht überlappen bzw. interagieren.

Es liegt im Können des Fachmanns, jeweils geeignete Fluoreszenzfarbstoffpaare auszuwählen. Dabei sollen die unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt werden, dass eine gegenseitige Überstrahlung bzw. Überlagerung der Fluoreszenzemissionen (bzw. sogenanntes „bleed through”) vermieden wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Sonden Hydrolyse-Sonden oder Molecular Beacons.

Bevorzugterweise umfasst das Konzentrieren der Proben in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens Zentrifugieren. Dabei werden bevorzugterweise, die in der Probe enthaltenen Bestandteile, wie Zellen und Viren, angereichert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mit Barcode etikettierte Gefäße, die die Proben enthalten, zunächst 15 Minuten bei mind. 5000 × g und anschließend 1 Stunde bei mindestens 48.000 × g zentrifugiert. Anschließend wird jeweils der Überstand verworfen.

Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ist bevorzugt ausgewählt aus Multiplex-PCR, insbesondere Multiplex-Realtime-PCR, Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA, Transcription mediated amplification), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) und Strang-Ablöse-Amplifikation (strand displacement amplification, SDA).

Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ist bevorzugt eine Multiplex-PCR, weiter bevorzugt eine Multiplex-Realtime-PCR. Dabei erfolgt zunächst eine reverse Transkription, bei der die vorhandene virale RNA und die interne Kontroll-RNA in eine cDNA umgeschrieben wird. Im weiteren erfolgt dann die Amplifikation der cDNA durch eine DNA-Polymerase.

Die Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren erfolgt bevorzugt mittels des Realtime-Prinzips. Bindet/hybridisiert dabei eine Sonde an ihrer Zielsequenz, wird der Reporter der Sonde durch die Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase, wie Taq-Polymerase, im Verlauf der Amplifikation abgespalten. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) vom Reporter zum Quencher kann somit aufgrund der räumlichen Distanz nicht mehr erfolgen. Die emittierte Energie des Reporters wird als positives Signal aufgezeichnet. Da der Reporter der für die viralen Nukleinsäuren spezifischen Sonde (z. B. FAM-markierte Sonde) Fluoreszenz in einem anderen Wellenbereich emittiert als der Reporter der weiteren Sonde, die für die interne Kontroll-Nukleinsäure spezifisch ist (z. B. VIC-markierte Sonde), können beide Amplifikationen voneinander unterschieden werden.

Die generellen Prinzipien und Bedingungen für die Amplifikation und die Detektion von Nukleinsäuren unter der Verwendung von der Polymerase Kettenreaktion (PCR) sind sehr gut bekannt, wobei die Details davon in zahlreichen Referenzen zur Verfügung gestellt werden, einschließlich US Patent Nr. US 4,683,195 A (Mullis et al.), US 4,683,202 A (Mullis) und US 4,965,188 A (Mullis et al.), welche alle hiermit durch Referenz eingefügt werden. Daher sollte ein Fachmann angesichts der zur Verfügung gestellten Lehren auf dem Gebiet keine Schwierigkeiten beim Gebrauch der vorliegenden Erfindung haben, um alle bekannten Subtypen von HIV-1 und HIV-2 zu detektieren.

Erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Testkits

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Zusammensetzungen, die zum Nachweis von HI-Viren, HIV-1 und–HIV-2, geeignet sind, gelöst. Diese erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden bevorzugt in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 1 bis 9 sowie Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23.

Wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird:
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 1 und 2,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 3 und 4,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 5 und 7,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 6 und 7;
und aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde ausgewählt wird:
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 19 und 20,
Nukleinsäuren mit der Sequenz von SEQ ID NOs. 21 und 22,
und wobei die Zusammensetzung für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, wobei ein Sense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 8, ein Antisense-Primer eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 9 und eine dritte Sonde eine Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID NO. 23 ist.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt eine vierte Sonde, die spezifisch für eine interne Kontroll-Nukleinsäure ist.

Bei einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann es sich um einen PCR-Mastermix handeln, wie er in Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt und für die Amplifizierung der viralen Nukleinsäuren und der internen Kontroll-Nukleinsäure verwendet wird.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfassen.

Die Auswahl der Nukleotidsequenzen für Primer, Sondern und interne Kontroll-Nukleinsäuren etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 24 oder ein Komplementär davon.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt

  • – mindestens zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 10 bis 15, bevorzugt ausgewählt aus den Paaren SEQ ID NOs. 10 und 11, SEQ ID NOs. 12 und 13, SEQ ID NOs. 14 und 15; oder deren Komplementäre und
  • – mindestens ein Oligonukleotid ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 25 bis 27 oder deren Komplementäre.

Die Sonden einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind bevorzugt jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe sind bevorzugt ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher. Der Fluoreszenzdonor oder -reporter ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 5'-Hexachlor-Fluorescein (HEX), 3-(5,6,4',7'-Tetrachlor-5'-Methyl-3',6'-Dipivaloylfluorescein-2-yl)-Propanamidohexyl-1-O-(2-Cyanoethyl)-(N,N-Diisopropyl)-Phosphoramidit (Yakima Yellow), Boron-dipyrromethen (BDP), Tetramethylrhodamin (TMR), 5'-Tetrachlor-Fluorescein (TET), und Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid (Texas Red). Der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), Dihydrocyclopyrroloindol-Tripeptid Minor Groove Binder (MGB), 4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-di-isopropyl)-phosphoramidit (BHQ-1), 4'-(4-Nitro-phenyldiazo)-2'-methoxy-5'-methoxy-azobenzene-4''-(N-ethyl)-N-ethyl-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (BHQ-2), 4,4-Difluor-5-Styryl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionsäure-Succinimidyl-Ester (BodiPy 564/570), und 5'-Dimethoxytrityloxy-5-[6-(9-[4-nitro-2',5'-dimethoxyazobenz-4'-yl diazo]-julolidin-8-oxy)-hexylamidoethyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyano-ethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (BBQ). Die Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung der erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt.

Weitere geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind Cyan 500, VIC, NED, LightCycler® Red 610 (LC610), Cyanin-Farbstoff Cy5 und LightCycler® Red 670 (LC670); weitere geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind Deep Dark Quencher (DDQ) und Cyanin-Farbstoff Cy5.

In einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 27 oder deren Komplementäre mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert.

Bevorzugt sind Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23 mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 24 bis 27 markiert sind, unterscheidet.

Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Testkits zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von HI-Viren in aus Blut abgeleiteten Proben.

Ein erfindungsgemäßer Testkit umfasst

  • – mindestens eine der erfindungsgemäßen hierin beschriebenen Zusammensetzungen,
  • – Reagenzien und Hilfsstoffe für die Extraktion viraler Nukleinsäuren aus aus Blut abgeleiteten Proben und für die Nukleinsäure-Amplifizierung.

Ein PCR-Reagenz bezieht sich auf irgendeines der Reagenzien, die als essentiell für die PCR angesehen werden, nämlich ein Set an Primern für eine Zielnukleinsäure, eine DNA Polymerase, eine reverse Transkriptase, PCR-Puffer und ein oder mehrere Desoxyribonukleosid-5-Triphosphate (dNTPs).

Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym, welches Desoxynukleosid-Monophosphat-Moleküle an das 3'-Hydroxylende des Primers in einem Komplex von Primer und Matrize addiert.

Bevorzugt sind thermostabile DNA-Polymerasen, von denen eine Zahl im Stand der Technik einschließlich derjenigen, die im Detail in US Patent Nr. US 4,965,188 A (Mullis et al.) und US 4,889,818 A (Gelfand et al.) berichtet wurden, welche beide hier durch Referenz eingefügt werden. Einige nützliche thermostabile Polymerasen sind kommerziell erhältlich wie z. B. Amplitaq, Tth, UITMA, Pfu von Stratagene und VENT von New England Biolabs. Ein DNA-Polymerase Co-Faktor bezieht sich auf eine Nicht-Proteinverbindung, von welcher das Enzym in Bezug auf seine Aktivität abhängig ist. Daher ist das Enzym ohne die Anwesenheit des Co-Faktors katalytisch inaktiv. Eine Reihe von Materialien sind bekannte Co-Faktoren, einschließlich aber nicht limitiert auf Mangan- und Magnesiumsalze, sowie z. B. Chloride, Sulfate, Acetate und Salze von Fettsäuren. Magnesiumchloride und -sulfate werden bevorzugt. Für die PCR werden außerdem zwei oder mehrere Desoxyribonukleid-5-Triphosphate benötigt wie z. B. zwei oder mehrere dATP, dCTP, dGTP, dTTP und/oder dUTP.

Die PCR-Reagenzien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden in der PCR in geeigneten Konzentrationen zur Verfügung gestellt und verwendet, um die Amplifikation der Zielnukleinsäure(n) zu ermöglichen. Die minimale Menge der DNA-Polymerase ist im Allgemeinen mindestens ungefähr 0,5 Einheiten pro 100 Mikroliter Lösung, wobei ungefähr 2–25 Einheiten pro 100 Mikroliter Lösung bevorzugt werden und von ungefähr 7–20 Einheiten pro 100 Mikroliter Lösung weiter bevorzugt werden. Die minimale Menge jedes Primers, der bei der Amplifikation verwendet wird, ist mindestens ungefähr 0,075 Mikromolar, wobei ungefähr 0,1–2 Mikromolar bevorzugt werden, aber andere Mengen sind im Stand der Technik bekannt. Die PCR-Reagenzien können individuell oder in zahlreichen Kombinationen oder alle in einer gepufferten Lösung, die einen pH-Wert im Bereich von ungefähr pH 7–pH 9 aufweist, unter der Verwendung irgendeines geeigneten Puffers, wovon viele im Stand der Technik bekannt sind, bereitgestellt werden. Die amplifizierten Nukleinsäuren können auf einer Reihe von bekannten Wegen detektiert werden, wie z. B. denjenigen, die im US Patent Nummer US 4,965,188 A (Mullis et al.) beschrieben werden. Zum Beispiel können die amplifizierten Nukleinsäuren unter der Verwendung von Southern Blotting, Dot-Blot-Techniken oder nicht-isotopischer Oligonukleotide mit einer markierten Sonde detektiert werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird die amplifizierte Zielnukleinsäure unter der Verwendung einer Oligonukleotidsonde detektiert, welche für die Detektion markiert ist und direkt oder indirekt mit dem amplifizierten Ziel hybridisiert werden kann.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen illustriert.

In der vorliegenden Erfindung, wie z. B. in den beschriebenen Beispielen, kann gezeigt werden, dass die Verwendung von unterschiedlichen Primersets und Sondensets die gleichzeitige Amplifikation von HIV-1 Nukleinsäuren sowie HIV-2 Nukleinsäuren ermöglicht. Somit existiert ein neues Verfahren sowohl für das Screening von Blutspenden in Pools von bis zu 96 Einzelproben als auch für das Screening von Einzelproben. Der Vorteil der gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien, Enzymen, Primern sowie in einer Reduzierung der Amplifikationsgeräte (Thermocycler). Ferner reduziert sich durch die vorliegende Erfindung das Risiko von falsch negativen Ergebnissen durch spontane Mutationen im Primer-/Sondenbereich des HIV-1 Virus. Bezugnehmend auf die Prävalenz von HIV-1 für Deutschland stellt gerade dieses Virus eine besondere Situation dar, die in den 90ziger Jahren zum AIDS Skandal führte und seitdem der besonderen Aufmerksamkeit verdient.

BeispieleMaterialien und Methoden

In der bevorzugten Ausführungsform ist als PCR-Puffer QuantiTect Multiplex PCR Mastermix (QTMP, Qiagen, Hilden, Deutschland) zu verwenden. Der optimierte PCR Puffer enthält eine Magnesiumchlorid-Konzentration von 11 Millimolar sowie eine HotStarTaq DNA-Polymerase (rekombinierte 94 kDa DNA-Polymerase, isoliert aus Thermus aquaticus und kloniert in E. Coli), dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP/dUTP) Ultrapur Rox (passive Referenz Fluoreszenzfarbstoff) sowie RNase freies Wasser.

An weiteren Enzymen werden in der bevorzugten Ausführungsform die SuperScript III der Firma Invitrogen (MMLV RT mit RNase H-Aktivität; 200 IU/μl) verwandt. Als weiteres Enzym zur Vermeidung von einer Kontamination mit RNasen wird RNasin der Firma Promega (Ribonuklease Inhibitor; 40 IU/μl) verwandt.

Als Primer werden die Oligonukleotide mit den SEQ ID NO. 1–11 sowie als Sonden die Oligonukleotide mit den SEQ ID NO. 19–23 sowie die Sonde (SEQ ID NO 24) für eine kompetitive interne Kontrolle sowie bevorzugt die Sonde (SEQ ID NO 25, 26 oder 27) für eine nicht-kompetitive interne Kontrolle verwendet.

Die Amplifikation erfolgt mittels Realtime-PCR mit speziellen Oligonukleotiden, die am 5'-Ende mit verschiedenen Fluorochromen (Reporter-Fluochrom) gelabelt sind und am 3'-Ende einen Quencher (Quencher-Fluochrom) aufweisen. Es sind folgende Fluorochrome geeignet: Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, TET, NET, Texas Red, LC610, Cy5, LC670. Für die Amplifikation von HIV-Zielnukleotidsequenzen (HIV-1 Nukleinsäuren und HIV-2 Nukleinsäuren) wird für die Oligonukleotide (Sonden) mit den SEQ ID NOs. 19–23 eine einheitliche Fluoreszenz-Markierung am 5'-Ende empfohlen. Am 3' Ende wird ein Blackhole-Quencher empfohlen.

Die Fluoreszenzfarbstoff-gelabelten Oligonukleotide (Sonden) für die interne Kontrolle weisen am 5'-Ende einen Fluoreszenzfarbstoff auf, der sich von den Fluoreszenzfarbstoff-gelabelten Oligonukleotide (Sonden) für die Detektion der HIV-Nukleinsäuren unterscheidet (z. B. 6-FAM für HIV-Nukleinsäureamplifikation und Cy5 für interne Kontrollen). Erfindungsgemäß können folgende Sonden als interne Kontrollen verwandt werden: SEQ ID NO 24 für die kompetitive interne Kontrolle und SEQ ID NO. 25, 26 oder 27 für die nicht kompetitive interne Kontrolle.

Als interne positive Kontrolle wurde eine kompetitive Kontrollsequenz zur HIV-1 Zielnukleinsäurensequenz mit Hilfe einer in vitro Transkription hergestellt sowie eine nicht-kompetitive interne Kontrollsequenz aus dem Bacteriophagen MS2 verwandt.

Für die Herstellung der kompetitiven internen Kontrolle wurde folgendes DNA Oligonukleotid synthetisiert.

Es erfolgt eine Amplifikation mit folgenden Primern:

Nach erfolgter Amplifikation sowie der Darstellung des Amplifikats im Agarose-Gel erfolgte eine Gelextraktion mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskits sowie eine anschließende in vitro Transkription mit Hilfe des in-Vitro-Transkriptions Kit der Firma Ambion. Nach erfolgter Aufreinigung mit Mega Clear (Firma Ambion) sowie dem Poly(A)Purist mRNA wird die interne Kontrolle in Konzentrationen zu 3000 Kopien/μl aliquotiert.

Für die nicht-kompetitive interne Kontrolle wurde der Bacteriophage MS2 von der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig bezogen. Die Analyse erfolgte an Realtime Cycler der Firma ABI (ABI PRISM 7000, ABI PRISM 7300, ABI PRISM 7500).

Für die Amplifikation zum Nachweis der Zielnukleinsäure wurde folgendes Cyclerprogramm verwendet.

  • 1. 55°C 1–60 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 20 Minuten einmal
  • 2. 95°C 1–30 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 15 Minuten einmal
  • 3. 95°C 1–30 Sekunden gefolgt von 62°C 10 Sekunden – 5 Minuten mit bevorzugten Zeiten von 10 Sekunden, 95°C und 30 Sekunden bei 62°C. Insgesamt 2–20 Wiederholungen
  • 4. 95°C 2 Sekunden – 2 Minuten gefolgt von 56°C 10 Sekunden – 2 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 93°C 10 Sekunden und 56°C 40 Sekunden mit 50 Wiederholungen

Experimente

Die Anmelder begannen die Entwicklung ihres PCR-Amplifikationssystems für HI-Viren durch die Identifikation von hoch konservierten Sequenzregionen von HIV-1 sowie HIV-2. Primer wurden für konservierte Regionen unter Zuhilfenahme der aktuellen Literatur (C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258–1266), (C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302–4308), (Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316–7321), (Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478–483) und (J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551–4557) untersucht. Primer der publizierten Arbeiten wurden anhand der Los Alamos Gendatenbank bezüglich des Auftretens von Mutationen überprüft sowie geringfügige Modifikationen durchgeführt.

Des Weiteren wurden die einzelnen Primersysteme bezüglich ihrer gegenseitigen Verträglichkeit in einem geeigneten Puffersystem überprüft.

– Analytische Sensitivität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz

Anschließend wurde die formulierte Entwicklung bezüglich der analytischen Sensitivität bezogen auf HIV-1 sowie HIV-2 mit Hilfe einer Probitanalyse untersucht. Die Probitanalyse wurde mit dem Programm SPSS 12.0 (nicht log-converted) durchgeführt.

Diesbezüglich wurden jeweils im Multiplex-Mix je Verdünnungsstufe 24 Replikate in 8 unterschiedlichen Verdünnungsstufen in Minipools (96 Proben pro Pool) untersucht.

Für HIV-1: wurden am WHO Standard NIBSC 97/650 HIV-1 folgende Konzentrationen untersucht: 2000 IU/ml, 1000 IU/ml, 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 3,13 IU/ml und 0,31 IU/ml.

Für HIV-2: wurden anhand einer quantifizierten Plasmakonserve HIV-2 folgende Konzentrationen untersucht: 2000 IU/ml, 1000 IU/ml, 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 3,13 IU/ml und 0,31 IU/ml.

Die Extraktion erfolgte mittels QIAamp ViralRNA Kit, die Analyse mittels ABI PRISM® 7000 SDS).

Es zeigte sich eine analytische Sensitivität bezogen auf 1 ml Einzelspende von 434,7 IU/ml für HIV-1 und von 795 IU/ml für HIV-2. Die maximale analytische Sensitivität pro prozessiertes Volumen beträgt 4,5 IU/ml für HIV-1 und 8,3 Kopien/ml für HIV-2.

– Analytische Spezifität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz

Bezüglich der analytischen Spezifität wurden Untersuchungen mit potentiell kreuzreaktiven Erregern (Poliovirus Typ 1, Typ 2, Typ 3, Echovirus Typ 6, Typ 7, Typ 9, Typ 11, Typ 30, Coxsackievirus A9, B1, B2, B3, B4, B5, CMV, Humanes Herpes Virus A1, Humanes Herpes Virus A2, Adenovirus, Staphylococcus aureus, Escherichia Coli, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Bacillus cereus, Hepatitis B Genotyp A, B, C, D, E, F; Hepatitis C Genotyp 1A, 1B, 2A, 2B, 2C, 2I, 3, 4, 5) durchgeführt. Dabei zeigte sich keine Kreuzreaktivität mit potentiell kreuzreaktiven Erregern, sondern eine HIV-1 spezifische Amplifkation (Tabelle 1) bzw. eine HIV-2 spezifische Amplifkation (Tabelle 2). Bezüglich HIV-1 wurde eine Untersuchung an Genotypen Panels mit den Subtypen der Gruppe M, A, B, C, D, E, F, G und H sowie der Gruppe O durchgeführt. Es zeigte sich eine Amplifikation aller bekannter Subtypen. Tabelle 1 Spezifitätstestung des DRK HIV-1 PCR Kits mit potentiell kreuzreaktiven Erregern

ErregerHIV-1 (6-FAM)Interne Kontrolle (VIC, nicht beansprucht)Poliovirus Typ 1+Poliovirus Typ 2+Poliovirus Typ 3+Echovirus Typ 6+Echovirus Typ 7+Echovirus Typ 9+Echovirus Typ 11+Echovirus Typ 30+Coxsackievirus-A9+Coxsackievirus-B1+Coxsackievirus-B2+Coxsackievirus-B3+Coxsackievirus-B4+Coxsackievirus-B5+CMV+Humanes Herpesvirus 1 (Herpes-simplex-Virus 1)+Humanes Herpesvirus 2 (Herpes-simplex-Virus 2)+Adenovirus+Staphylococcus aureus+Escherichia coli+Staphylococcus epidermidis+Pseudomonas aeruginosa+Klebsielle oxytoca+Bacillus cereus+Hepatitis B Genotyp A+Hepatitis B Genotyp B+Hepatitis B Genotyp C+Hepatitis B Genotyp D+Hepatitis B Genotyp E+Hepatitis B Genotyp F+HCV-Genotyp 1a+HCV-Genotyp 1b+HCV-Genotyp 2a+HCV-Genotyp 2b+HCV-Genotyp 2c+HCV-Genotyp 2i+HCV-Genotyp 3+HCV-Genotyp 4+HCV-Genotyp 5+HIV-1 Subtyp A++HIV-1B++HIV-1C++HIV-1 D1++HIV-1 D2++HIV-1 D3++HIV-1 E1++HIV-1 E2++HIV-1 F1++HIV-1 F2++HIV-1 G++HIV-1 H++HIV-1 O1++HIV-1 O2++
Tabelle 2 Spezifitätstestung des DRK HIV-2 PCR Kits mit potentiell kreuzreaktiven ErregernErregerHIV-2 (6-FAM)Interne Kontrolle (VIC, nicht beansprucht)Poliovirus Typ 1+Poliovirus Typ 2+Poliovirus Typ 3+Echovirus Typ 6+Echovirus Typ 7+Echovirus Typ 9+Echovirus Typ 11+Echovirus Typ 30+Coxsackievirus-A9+Coxsackievirus-B1+Coxsackievirus-B2+Coxsackievirus-B3+Coxsackievirus-B4+Coxsackievirus-B5+CMV+Humanes Herpesvirus 1 (Herpes-simplex-Virus 1)+Humanes Herpesvirus 2 (Herpes-simplex-Virus 2)+Adenovirus+Staphylococcus aureus+Escherichia coli+Staphylococcus epidermidis+Pseudomonas aeruginosa+Klebsielle oxytoca+Bacillus cereus+Hepatitis B-Genotyp A+Hepatitis B-Genotyp B+Hepatitis B-Genotyp C+Hepatitis B-Genotyp D+Hepatitis B-Genotyp E+Hepatitis B-Genotyp F+HCV-Genotyp 1a+HCV-Genotyp 1b+HCV-Genotyp 2a+HCV-Genotyp 2b+HCV-Genotyp 2c+HCV-Genotyp 2i+HCV-Genotyp 3+HCV-Genotyp 4+HCV-Genotyp 5+HIV-2++

– Diagnostische Sensitivität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz

Zur Analyse der diagnostischen Sensitivität wurden jeweils 100 Positivkontrollen mit einer Konzentration des Dreifachen der 95% Nachweisgrenze (1800 IU/ml HIV-1; 2400 Kopien/ml HIV-2) analysiert. Dabei zeigte sich eine diagnostische Sensitivität größer 99,9%.

für HIV-1:

Getestete PositivkontrollePositivNegativDiagnostische Sensitivität1001000> 99,0%
für HIV-2: Getestete PositivkontrollePositivNegativDiagnostische Sensitivität1001000> 99,0%

– Diagnostische Spezifität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz

Zur Untersuchung der diagnostischen Spezifität wurden jeweils 500 negative Poolproben analysiert. Untersucht wurden jeweils 500 Pool-Proben im Zeitraum von Januar bis März 2008. Es zeigte sich eine diagnostische Spezifität größer 99,8%.

für HIV-1:

Getestete Pools Negative Pools Positive Pools Falsch positive PoolsDiagnostische Spezifität500500100%
für HIV-2: Getestete Pools Negative Pools Positive Pools Falsch positive PoolsDiagnostische Spezifität500500100%

– Robustheit von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz

Die Robustheit wurde alternierend an 8 Reihen von HIV-1 positiven Proben (106 IU/ml) und negativen Proben analysiert, ein identisches Verfahren wurde anschließend für HIV-2 Proben durchgeführt. Es zeigte sich ein robustes Verfahren. Eine Kontamination konnte ausgeschlossen werden.

SEQUENCE LISTING

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.