Title:
Verfahren zur Differenzierung von verschiedenen Spezies der Gattung Methylobacterium
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur Identifizierung von verschiedenen Spezies der Gattung Methylobacterium, umfassend die folgenden Reaktionsschritte:
• Herstellung eines Rohextraktes (RE) aus einer Suspension von Methylobakterien (Rs1 bis Rs8);
• Amplifikation des 16S rRNA Gens mittels PCR unter Verwendung von Rohextrakt (RE) als DNA Matrize und den Oligonucleotiden pA und pH als Primer (Rs9, Rs10);
• Durchführung von mindestens zwei Restriktionsverdauen des PCR Produktes (PCR-RE) in parallelen Reaktionsansätzen (Rs12 bis RS16a/b) mit jeweils einem 6-Basen-Cutter Restriktionsenzym oder MboII oder EcoO109I;
• Auftrennung und Analyse der Restriktionsfragmente der mindestens zwei Restriktionsverdaue mittels Gelelektrophorese (Rs17);
• Detektion der mindestens zwei Restriktionsmuster der parallel angesetzten Restriktionsverdaue; und
• Vergleich der Restriktionsmuster und der DNA Fragmentlängen mit den bekannten Restriktionsmustern von Referenzstämmen von Methylobacterium zur Identifizierung des Methylobakterienstammes im Rohextrakt (RE).




Inventors:
Krolczyk, Sabine (34270, Schauenburg, DE)
Application Number:
DE102008002978
Publication Date:
12/10/2009
Filing Date:
07/31/2008
Assignee:
Universität Kassel, 34125 (DE)
International Classes:



Other References:
14 W (pat) 48/04
DUBEY, S.K., u.a.: Tracking of methanotrophs and their diversity in paddy soil: A molecular approach. Current Science (2003) 85 (1) 92-95
EDWARDS,U., u.a.: Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. (1989) 17, 7843-7853
STAKENBORG,T., u.a.: Evaluation of amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) for the identification of Mycoplasma species. BMC Infect. Dis. (2005) 5: 46, S.1-10
Attorney, Agent or Firm:
Reichert & Kollegen, 93047, Regensburg, DE
Claims:
1. Verfahren zur Identifizierung von verschiedenen Spezies der Gattung Methylobacterium, umfassend die folgenden Reaktionsschritte:
• Herstellung eines Rohextraktes (RE) aus einer Suspension von Methylobakterien (Rs1 bis Rs8);
• Amplifikation des 16S rRNA Gens mittels PCR unter Verwendung von Rohextrakt (RE) als DNA Matrize und den Oligonucleotiden pA und pH als Primer (Rs9, Rs10);
• Durchführung von mindestens zwei Restriktionsverdauen des PCR Produktes (PCR-RE) in parallelen Reaktionsansätzen (Rs12 bis RS16a/b) mit jeweils einem 6-Basen-Cutter Restriktionsenzym oder MboII oder EcoO109I;
• Auftrennung und Analyse der Restriktionsfragmente der mindestens zwei Restriktionsverdaue mittels Gelelektrophorese (Rs17);
• Detektion der mindestens zwei Restriktionsmuster der parallel angesetzten Restriktionsverdaue; und
• Vergleich der Restriktionsmuster und der DNA Fragmentlängen mit den bekannten Restriktionsmustern von Referenzstämmen von Methylobacterium zur Identifizierung des Methylobakterienstammes im Rohextrakt (RE).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung des Rohextraktes (RE) folgende Schritte umfasst:
• thermische Lyse einer Zellsuspension aus Methylobakterien (Rs3);
• Proteinase K Behandlung der abgekühlten lysierten Zellsuspension (Rs5, Rs6); und
• Hitzeinaktivierung der Proteinase K (Rs7).

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension aus Methylobakterien zur Herstellung des Rohextraktes (RE) hergestellt wird, indem eine Kolonie von Methylobakterien von einer Nährstoffplatte in 200 μl bidestilliertem Wasser resuspendiert wird (Rs1, Rs2).

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die thermische Lyse durchgeführt wird, indem die Suspension aus Methylobakterien mindestens 90s bei 95°C erhitzt wird (Rs3).

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe nach der thermischen Lyse abgekühlt wird (Rs4).

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zu der abgekühlten Probe 2 μl 20 mg/ml Proteinase K gegeben werden (Rs5).

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion eine Stunde bei 55°C inkubiert wird (Rs6).

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinase K behandelte Rohlysat bis zur weiteren Verwendung gekühlt aufbewahrt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das 16S rRNA Gen des Methylobacterien-Stammes mittels PCR amplifiziert wird, wobei Rohextrakt (RE) als DNA Matrize und Primer pA und pH als Primer als den Oligonukleotide verwendet werden (Rs9, Rs10).

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Restriktionsverdaue mit jeweils einem Restriktionsenzym (E) ausgewählt aus der Gruppe von ApaI, BamHI, BclI, BglII, HindIII, MluI, NheI, PvuII, ScaI, XhoI und/oder einem Iso- oder Neoschizomer der genannten Enzyme bei der entsprechenden Temperatur durchgeführt werden (Rs12 bis Rs16a/b).

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zwölf Restriktionsverdaue mit jeweils einem der Restriktionsenzyme (E) ausgewählt aus der Gruppe von ApaI, BamHI, BclI, BglII, EcoO109I, HindIII, MboII, MluI, NheI, PvuII, ScaI, XhoI oder einem Iso- oder Neoschizomer der genannten Enzyme bei der entsprechenden Temperatur durchgeführt werden (Rs12 bis Rs16a/b).

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils 5 μl des aus dem Rohextrakt (RE) amplifizierten 16S rRNA Gens (PCR-RE) mit Restriktionsenzym (E) verdaut werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Restriktionsfragmente auf dem Agarose- oder Acrylamidgel mittels Ethidiumbromid unter UV sichtbar gemacht werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Restriktionsfragmente auf dem Agarose- oder Acrylamidgel mittels Methylenblau angefärbt und sichtbar gemacht werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass bei Übereinstimmung der aus dem Verfahren gewonnenen Restriktionsmuster mit den bekannten Restriktionsmustern ein spezieller Stamm der Gattung Methylobacterium gemäß einer Binäraussage identifiziert ist.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur einfachen und schnellen Differenzierung zwischen verschiedenen Spezies der Gattung Methylobacterium.

Bakterien stellen einen allgegenwärtigen Bestandteil der menschlichen Umwelt und des menschlichen Körpers dar. Spezielle Bakterien sind beispielsweise in der menschlichen Darmflora zu finden. Andererseits verursachen viele Mikroorganismen als Lebensmittelverderber oder Krankheitserreger so häufig Probleme, dass einer effektiven, schnellen und zuverlässigen Diagnostik sehr große Bedeutung zukommt.

Ein wesentlicher Schritt im Kampf gegen humanpathogene Bakterien besteht in der Identifizierung des für eine Krankheit oder ein pathologisches Symptom ursächlichen Keims. Häufig können erst nach der Identifizierung geeignete medizinische Maßnahmen ergriffen werden.

D. h. um einen infizierten Menschen richtig behandeln zu können, muss zuerst analysiert werden, um welchen Erreger es sich handelt. Viele der Erreger kommen in verschiedenen Spezies vor, die teilweise unterschiedlich behandelt werden müssen. Für die spezielle Behandlung kann es also notwendig sein, dass zwischen den verschiedenen bekannten Spezies einer Art unterschieden wird.

Ein klassischer Nachweis von Bakterien besteht in der mikrobiologischen Identifizierung, die in der Regel eine Vereinzelung auf Agar-Agar-haltigen selektiven Medien umfasst.

Dieses Verfahren hat jedoch zwei wesentliche Nachteile: erstens ist der Nachweis häufig nicht zuverlässig oder spezifisch. Zweitens benötigen viele Bakterien eine Wachstumszeit von mindestens 18 Stunden zur Vereinzelung in Kolonien. In vielen Fällen ist zudem eine Sekundärvereinzelung oder ein Sekundärnachweis erforderlich. Dies führt zu Diagnosezeiten von bis zu einer Woche, bis endlich eine Aussage getroffen werden kann. Darüber hinaus gibt es jedoch auch eine Menge pathogener Keime, die sich nicht oder nur schwer kultivieren lassen.

EDWARDS, U. u. a. ”Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA.” Nucleic Acids Res. (1989) 17 (19) 7843–7853, offenbart die in-vitro Verstärkung von Gensequenzen. Es ist eine fast komplette Nucleotid-Bestimmung für die 16S ribosomale RNA nachgeschaltet.

STAKENBORG, T. u. a. ”Evaluation of amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) for the identification of Mycoplasma species.” BMC Infect. Dis. (2005) 5: 46 Seiten 1–10, offenbart eine Berechnung und einen theoretischen Vergleich der ARDRA-Profile auf der Basis von zur Verfügung stehenden 165 rDNA Sequenzen.

DUBEY, S. K. u. a. ”Tracking of methanotrophs and their diversity in paddy soil: A molecular approach.” Current Science (2003) 85 (1) 92–95, offenbart eine Überwachung von Methanotrophen, die in beregneten Böden für den Reisanbau vorkommen. Hierzu werden molekulare Werkzeuge eingesetzt.

In der Patentliteratur sind verschiedene Methoden zur Identifizierung und/oder Differenzierung unterschiedlicher Bakterienstämme bekannt.

Beispielsweise beschreibt KR 1020040000872 A eine Methode zur Identifizierung von Bifidobacterium Stämmen mittels einer RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) Analyse. Hierbei wird zuerst die komplementäre cDNA der 16S rRNA hergestellt. Diese komplementäre cDNA wird mit einem Restriktionsenzym verdaut. Für den Restriktionsverdau wird EcoRI, HindIII oder CfoI verwendet. Die entstandenen Fragmente werden mittels Gelelektrophorese analysiert.

JP 2003265199 A beschreibt eine Methode, um mikrobielle Organismen zu analysieren. Hierbei wird eine PCR mit der bakteriellen chromosomalen DNA durchgeführt, wobei markierte Primer verwendet werden, die eine Region aus dem 16S rRNA Gen von E. coli amplifiziert. Anschließend wird eine T-RFLP Analyse basierend auf den Restriktionsenzymen BfaI, RsaI, TagI, HhaI oder BslL oder einem entsprechenden Restriktionsenzym durchgeführt. Das so erhaltene Fragment wird in einen entsprechenden Vektor kloniert und sequenziert. Hierbei handelt es sich um eine Methode mit einem hohen apparativen Aufwand, da zusätzlich zu einem PCR Cycler und Gel-Elektorphoreseapparaturen eine Sequenzierungsapparatur benötigt wird, oder aber die Sequenzierung außer Haus gegeben werden muss.

JP 2006094803 A verwendet ebenfalls eine T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) Methode zur Analyse von Mikroorganismen. Hierbei wird von einer entnommenen Probe das 16S rRNA Gen mittels zweier spezifischer fluoreszent markierter Primer amplifiziert. Der 5' Primer ist dabei mit einer anderen Farbe markiert als der 3' Primer. Weiterhin ist ein Restriktionsschritt notwendig und die Länge der gespaltenen Sequenz wird mit einem fluoreszenten Sequenzierer ermittelt, woraufhin die mikrobielle Spezies identifiziert werden kann.

Das US-Patent 6 054 278 A verwendet ebenfalls den Polymorphismus des 16S rRNA Gens zur Identifizierung von mikrobiellen Arten, Unterarten und Stämmen. Hierbei wird eine zusammengesetzte Polynukleotidsequenz des 16S rRNA Gens des untersuchten Mikroorganismus hergestellt. Diese zusammengesetzte 16S rRNA Sequenz wird mit einer Liste bekannter 16S rRNA Sequenzen verglichen, wodurch die Art, Unterart oder Stamm des untersuchten Mikroorganismus ermittelt werden kann. Dies erfolgt vorzugsweise mit Computer basierenden Methoden.

Das US-Patent 6 261 769 B1 beschäftigt sich mit der Detektion und der Identifizierung von Chlamydiaceae in Labor- und klinischen Proben. Hierbei wurde eine zwischen dem 16S rRNA Gen und dem 23S rRNA Gen liegende Spacer Region als geeignete Zielsequenz für die Entwicklung spezifischer Sonden und Primer identifiziert.

Die internationale Patentanmeldung WO 96/19585 A1 verwendet Oligonukleotide zur Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von Mikroorganismen. Die Methode ist auch geeignet, um zwischen spezifischen Isolaten und allelischen Subtypen zu unterscheiden. Die Methode verwendet ebenfalls die zwischen dem 16S und dem 23S rRNA liegende Spacer Region. Diese Region weist eine hoch konservierte Sequenz am 3' Ende und eine weitere am 5' Ende auf.

Die beschriebenen Verfahren sind häufig aufgrund der spezifischen Primer nur für bestimmte Gattungen anwendbar. Zur Auswertung ist meist das Auswerten von parallel behandelten Referenzstämmen nötig oder die Methoden sind mit einem erheblichen apparativen Aufwand verbunden, da verschiedene teure Laborgeräte und entsprechende Software benötig werden. Beispielsweise muss die Größe der mittels RFLP erhaltenen Banden berechnet werden. Da ein Teil der dabei entstehenden DNA Fragmente aufgrund ihrer geringen Grolle nur verhältnismäßig wenig Ethidiumbromid binden kann, sind sie unter UV teilweise für das menschliche Auge nicht sichtbar. In diesen Fallen muss ein sehr teures Dokumentationssystem mit entsprechender Software verwendet werden. Dies ist aber insbesondere für Klinkien und Krankenhäuser häufig zu teuer. Weiterhin ist für viele dieser Methoden die Entwicklung spezieller Primer notwendig, deren Preis insbesondere durch fluoreszente Markierungen sehr erhöht wird.

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Differenzierung von Spezies der Gattung Methylobacterium. Da zumindest einige Vertreter der Spezies Methylobacterium als potentiell humanpathogen gelten und bereits mehrfach (Sekundär) Infektionen von Menschen durch Methylobacterien beschrieben wurden, ist es häufig notwendig, die fragliche Spezies genau zu identifizieren, um entsprechend behandeln zu können (vgl. auch Furuhata et. al., 2007, Int J Syst Evol Microbiol, 57, S. 566–571; Gallego et. al., 2005, Microbiol. Immunol. 50 (1), S. 11–17; Hornei et. al., 1999, J Clin Microbiol 37 (1), S. 248–250; Sanders et. al., 2000, Clinical Infectious Diseases 30, S. 936–938).

Bekannte Methoden umfassen unter anderem die Sequenzierung des 16S rRNA Gens. Dieses ist in etwa 1500 Nukleotide lang, so dass in der Regel mindestens zwei Sequenzierungsreaktionen notwendig sind, um das gesamte Gen zu erfassen.

Der Preis für eine Sequenzierungsreaktion ist abhängig vom genutzten System (beispielsweise LI-COR Biosciences, ABI DNA Analyzer etc.). Dazuzurechnen sind die Kosten für die Wartung der Geräte, die Kosten für die Polyacrylamid Gele oder die Kapillarelektrophorese, das Primer Labelling, die Kosten für die Aufreinigung um störende Bestandteile der Sequenzierungsreaktion zu entfernen usw. Alternativ können auch Sequenzierungsanbieter verwendet werden, wobei sich der Preis allgemein nach der Länge des zu sequenzierenden Fragments richtet und zwischen 10 bis 13 Euro zzgl. Mehrwertsteuer liegt. In diesem Fall muss die zu sequenzierenden DNA vorher aufgereinigt und zusammen mit dem entsprechenden Primer verschickt werden.

Die ermittelten Sequenzen können anschließend mit den bereits bekannten Sequenzen in den einschlägigen Datenbanken verglichen werden. Dieser Weg ist aufgrund der mindestens zwei notwendigen Sequenzierungsreaktionen, deren Ergebnisse anschließend editiert und analysiert werden müssen, relativ zeit- und kostenintensiv. Eine Identifizierung ist im besten Fall innerhalb von zwei Tagen möglich, in der Regel kann es jedoch deutlich länger dauern.

Problematisch ist weiterhin, dass einige Spezies dieser Gattung Sequenzhomologien von > 97% aufweisen und somit aufgrund ihrer 16S rDNA Sequenz allein nicht voneinander differenzierbar sind. Beispielsweise weisen die Spezies Mtb. fujisawaense und Mtb. oryzae eine Sequenzhomologie von 100% auf (Madhaiyan et. al., 2007, Int J Sys Evol Microbiol, 57, S. 326–331).

Weiterhin werden zur Differenzierung von Methylobacterium Spezies häufig physiologische und biochemische Test herangezogen. Diese werden beispielsweise in Green, 2006 beschrieben (Green, 2006, The Prokaryotes, 3rd edition, S. 257–265, Springer Verlag). Beispielsweise werden bei so genannten Assimilationstests verschiedene Verbindungen als einzige Kohlenstoff- bzw. Energiequelle angeboten und deren Verwertung durch die Mikroorganismen anhand von derem Wachstum getestet. Im Rahmen von biochemischen Tests wird beispielsweise die Synthese von charakteristischen Enzymen durch deren Aktivität nachgewiesen. Anhand dieser Informationen können die Stämme zugeordnet werden.

Problematisch ist hierbei die mangelnde Reproduzierbarkeit. Werden dieselben Assimilationstests von verschiedenen Laboratorien durchgeführt, kann es zu ganz verschiedenen Ergebnissen kommen, was eine Klassifizierung der Stämme sehr erschwert. Ein Grund hierfür könnte das verwendete Minimalmedium sein, da dieses nicht standartisiert ist.

Ein weiteres Problem besteht darin, dass die Methylobakterien in einem mehr oder weniger starken Ausmaß zur Bildung von Biofilm und Speicherstoffen, beispielsweise in Form von Polybetahydroxybuttersäure Granula, neigen. Die Stärke der Ausprägung ist unter anderem von der zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle abhängig. Die Fähigkeit zur Anlage von Speichergranula erschwert die optische Auswertung von Assimilationstests, da eine Unterscheidung zwischen einem schwachen Wachstum aufgrund schlechter Verwertung der zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle oder der Verwertung noch vorhandener Speicherstoffe selbst anhand einer Negativkontrollen häufig schwer zu ermitteln ist.

Eine spektralphotometrische Messung, d. h. die Bestimmung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge zwischen 546 nm und 600 nm, ist aufgrund der Biofilmbildung nicht möglich, da sich die Zellen aufgrund von Adhäsion an den Wänden des Kulturgefäßes befinden oder aneinander kleben und sedimentieren. Somit ist es schwierig, die Zellen für die Messung in die Testküvette zu überführen, zudem sie an dieser wiederum adhärieren.

Aufgrund der relativ langen Generationszeit der Methylobakterien, die selbst bei optimalen Wachstumsbedingungen mehrere Stunden beträgt, liegt die empfohlenen Inkubationszeit für Assimilationstests bei ca. 14 Tage. Aufgrund dieser langen Dauer werden Assimilationstests nicht bevorzugt durchgeführt, so dass auch nur wenige Daten zu den assimilatorischen Fähigkeiten verschiedener Stämme zur Verfügung stehen.

Aufgrund dessen wird bisher die bereits oben beschriebene Sequenzierung des 16 S rRNA Gens unter Umständen in Verbindung mit der Sequenzierung weiterer Gene zur Identifizierung des fraglichen Methylobakterien Stammes bevorzugt.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur schnellen, einfachen und vor allem kostengünsten Differenzierung von Spezies der Gattung Methylobacterium, insbesondere für die Routinediagnostik, zu schaffen.

Die obige Aufgabe wird mit dem Gegenstand des unabhängigen Anspruchs 1 gelöst. Merkmale vorteilhafter Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifizierung von verschiedenen Spezies der Gattung Methylobacterium umfasst die folgenden Reaktionsschritte: Zuerst wird ein Rohextrakt aus einer Suspension von Methylobakterien hergestellt. Dieser Rohextrakt enthält unter anderem die bakterielle DNA. Diese bakterielle DNA dient als Matrize für die Amplifizierung des Spezies spezifischen 16S rRNA Gens mittels PCR. Hierbei wird der Rohextrakt ohne weitere Reinigungsschritte direkt in die PCR eingesetzt. Als Primer dienen so genannte universelle Oligonukleotide pA und pH (vgl. Edwards et. al. 1989, Nucl. Acid Research 17 (19), S. 7843–7853; vgl. Ranjard et. al. 1998, Eur. J. Soil Biol. 34 (2); S. 89–97).

Durch die PCR Reaktion wird das ca. 1500 bp große 16S rRNA Gen vervielfältigt und anschließend mindestens zwei parallel angesetzten Restriktionsanalysen unterworfen. D. h. es werden mindestens zwei parallele Reaktionsansätze mit jeweils beispielsweise 5 μl des PCR-Produktes aus der o. g. PCR-Reaktion (Rs12 bis RS16a/b) mit jeweils einem 6-Basen-Cutter Restriktionsenzym oder MboII oder EcoO109I angesetzt. Unter zwei parallelen Restriktionsverdauen versteht man die gleichzeitige Durchführung von zwei unterschiedlichen Restriktionsanlysen des PCR-Produktes in unterschiedlichen Reaktionsgefäßen, wobei in einem ersten Reaktionsgefäß der Verdau des PCR-Produktes mit einem ersten Restriktionsenzym erfolgt und in einem Reaktionsgefäß 2 der Verdau des PCR-Produktes mit einem zweiten Restriktionsenzym durchgeführt wird.

Die mindestens zwei Reaktionsansätze werden mit dem jeweiligen entsprechenden Puffer versetzt und gegebenenfalls mit vorzugsweise sterilem bidestillierten Wasser aufgefüllt. Anschließend versetzt man die so präparierten Restriktionsansätze mit jeweils einer entsprechenden Menge eines Restriktionsenzyms und inkubiert bei der entsprechenden Restriktionstemperatur.

Das PCR Produkt muss für diese Restriktionsanalyse nicht erst mittels Gelelektrophorese und Extraktion aus dem Gel o. ä. gereinigt werden, stattdessen kann direkt ein Aliquot des PCR-Ansatzes, beispielsweise 5 μl, direkt für die jeweiligen parallel durchgeführten Restriktionsanalysen verwendet werden.

Das Ergebnis des Restriktionsverdaus wird analysiert, indem die bei den parallel durchgeführten Restriktionsanalysen entstandenen Restriktionsfragmente mittels Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Parallel dazu lässt man einen DNA Längenstandard oder andere DNAs bekannter Länge in einer weiteren Tasche des Gels mitlaufen, um anschließend die Größen der Restriktionsfragmente besser abschätzen bzw. berechnen zu können.

Die Restriktionsfragmente werden detektiert, ihre Größe abgeschätzt bzw. berechnet und mit den bekannten Restriktionsmustern von Referenzstämmen von Methylobacterium verglichen, um den fraglichen Methylobacterien-Stamm identifizieren zu können.

Zur Herstellung des Rohextraktes wird eine Zellsuspension aus Methylobakterien thermisch lysiert. Anschließend wird die thermobehandelte Zellsuspension beispielsweise auf Eis, im Kühlschrank etc. abgekühlt und mit Proteinase K behandelt, um die zellulären Proteine, insbesondere zelluläre DNAsen, zu inaktivieren. Die Proteinase K wird in einem weiteren Hitzeschritt ebenfalls inaktiviert. Der dabei entstandene Rohextrakt kann im Kalten, d. h. beispielsweise bei 4°C bis 8°C im Kühlschrank oder im Gefrierfach aufbewahrt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Methylobakterien Kolonie mittels einer Impföse o. ä. von einer Nähstoffplatte oder einem anderen Nährmedium aufgenommen und in einem entsprechenden Reaktionsgefäß in 200 μl bidestilliertem Wasser resuspendiert. Dies geschieht beispielsweise durch Schütteln oder Vortexen des Reaktionsgefäßes. Die thermische Lyse wird durchgeführt, indem die Suspension ca. 90s bei 95°C erhitzt wird. Andere Lysezeiten und/oder Temperaturen sind ebenfalls möglich und sollen ebenfalls umfasst sein. Beispielsweise ist denkbar, die Lyse bei einer geringeren Temperatur, wie zum Beispiel 80°C, für einen längeren Zeitraum durchzuführen.

Die lysierten Zellen werden anschließend auf Eis o. ä. für mindestens zwei bis drei Minuten abgekühlt. Anschließend werden 2 μl einer Proteinase K Lösung der Konzentration 20 mg/ml zugegeben und der Reaktionsansatz wird ca. eine Stunde oder auch länger bei ca. 55°C inkubiert und danach bis zur weiteren Verwendung gekühlt aufbewahrt. Die Verwendung einer anders konzentrierten Proteinase K-Lösung oder aber einer anderen geeigneten Proteinase sowie abweichende Reaktionszeiten und -temperaturen, die demselben Zweck – d. h. dem Abbau zellulärer DNAsen und anderer störender Proteine dienen – sollen ebenfalls umfasst werden.

Das aus dem Rohextrakt mittels PCR amplifizierte 16S rRNA Gen wird anschließend durch mindestens zwei parallele Restriktionsverdaue analysiert. Das PCR Produkt wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform direkt, d. h. ohne vorherige zeit- und kostenintensive Reinigung, in den Verdau eingesetzt. Beispielsweise werden jeweils 5 μl der PCR Reaktion pro Restriktionsansatz verdaut.

Hierfür wird jeweils ein Restriktionsenzym aus der Gruppe bestehend aus ApaI, BamHI, BclI, BglII, EcoO109I, HindIII, MboII, MluI, NheI, PvuII, ScaI, XhoI und/oder einem Iso- oder Neoschizomer der genannten Enzyme eingesetzt. Der Restriktionsverdau wird bei der jeweils für das Enzym optimalen Temperatur von beispielsweise 37°C für BamHI, HindIII etc., oder 55°C für BclI im Wasserbad, im Heizblock, im Thermocycler o. ä. inkubiert. Für die Reaktionsanalyse kann ohne weiteres auf den bereits für die PCR verwendeten Thermocycler zurückgegriffen werden, es sind also keine weiteren Geräte notwendig.

Da verschiedene Hersteller für ihre Enzymisolate teilweise unterschiedliche bevorzugte Inkubationstemperaturen angeben, soll die Verwendung abweichender Inkubationstemperaturen ebenfalls umfasst sein.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das PCR Produkt in zwölf parallelen Reaktionsansätzen mit allen zwölf oben genannten Restriktionsenzymen verdaut und die dabei entstandenen DNA Fragmente beispielsweise über Gelelektrophorese aufgetrennt und analysiert. Für die parallelen Reaktionsansätze werden beispielsweise jeweils 5 μl des PCR Produktes aus dem Rohextrakt zum Verdau eingesetzt.

Die elektrophoretisch aufgetrennten DNA Banden können herkömmlich mit Ethidiumbromid unter UV sichtbar gemacht werden. Hierbei besteht zum einen die Möglichkeit, dass Ethidiumbromid bereits vor dem Auftragen auf das Agarosegel dem verwendeten Ladepuffer zugesetzt werden kann. Alternativ kann das Gel auch nachträglich mit Ethidiumbromid versetzt und die DNA-Banden sichtbar gemacht werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann auf die Verwendung von Ethidiumbromid verzichtet werden. Stattdessen wird das Gel mit einer Methylenblau-Lösung gefärbt. Der Farbstoff lagert sich ebenfalls bevorzugt an die DNA-Fragmente an, so dass nach einem Entfärbungsschritt die DNA-Fragmente ebenfalls sichtbar und dokumentierbar sind.

Das beschriebene Verfahren erlaubt eine Binäraussage. Entweder die DNA wird mit einem bestimmten Restriktionsenzym mindestens einmal geschnitten, oder nicht. Wird die DNA nicht geschnitten, so ist immer ein DNA-Fragment von ca. 1500 bp sichtbar. Wird die DNA dahingegen mindestens einmal geschnitten, so findet man mindestens zwei DNA Fragmente definierter Größe, wobei die Fragmentgröße davon abhängt, von welchem Methylobakterien Stamm der Rohextrakt gewonnen wurde und mit welchem Enzym geschnitten wurde. Aufgrund der Übereinstimmung der aus dem Verfahren gewonnenen Restriktionsmuster mit einem bekannten Restriktionsmuster kann der Stamm der Gattung Methylobacterium eindeutig identifiziert werden.

Weitere Merkmale, Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nun folgenden detaillierten Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hervor, die als nicht einschränkendes Beispiel dient und auf die beigefügten Zeichnungen Bezug nimmt.

1 zeigt eine schematische Übersicht über die Herstellung des Rohextraktes;

2 zeigt schematisch die Amplifizierung des 16S rRNA Gens mittels PCR;

3 zeigt eine schematische Übersicht über die ARDRA Restriktionsanalyse;

4 zeigt eine Übersicht der verwendeten Restriktionsenzyme;

5 zeigt eine Übersicht der beim Restriktionsverdau entstehenden Fragmente in Abhängigkeit vom analysierten Methylobacterien Stamm und

6 vergleicht die ARDRA Methode mit herkömmlich verwendeten Methoden.

Für gleiche oder gleich wirkende Elemente der Erfindung werden identische Bezugszeichen verwendet. Ferner werden der Übersicht halber nur Bezugszeichen in den einzelnen Figuren dargestellt, die für die Beschreibung der jeweiligen Figur erforderlich sind. Die dargestellte Ausführungsform stellt lediglich ein Beispiel dar, wie das erfindungsgemäße Verfahren ausgestaltet sein könnte und stellt keine abschließende Beschränkung der Erfindung dar.

Eine schematische Übersicht über die Herstellung des Rohextraktes RE ist in 1 dargestellt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt keine aufwändige Reinigung der mikrobiellen DNA. Für die Herstellung des Rohextraktes RE wird eine relativ dünne Suspension aus Methylobakterien verwendet. Beispielsweise werden ein bis zwei Methylobacterium – Kolonien 10 mit einem Durchmesser von ca. 1 mm mittels einer sterilen Impföse 20, einem sterilen Zahnstocher oder einem anderen geeigneten Werkzeug von einer Platte 12 bestehend aus einem geeigneten Nährmedium o. ä. aufgenommen und in ca. 200 μl vorzugsweise sterilem bidestillierten Wasser in einem geeigneten Reaktionsgefäß 22 durch schütteln, vortexen o. ä. resuspendiert (Reaktionsschritte Rs1 und Rs2). Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden wenige μl einer Flüssigkultur aus Methylobakterien in 200 μl bidestillierten Wasser resuspendiert. Als geeignetes Reaktionsgefäß 22 findet beispielsweise ein Eppendorfcup mit 1 ml; 1,5 ml oder 2 ml Inhalt Verwendung, es kann aber genauso gut ein PCR-Cup mit 0,5 ml Inhalt o. ä. eingesetzt werden. Die Größe des Reaktionsgefäßes 22 ist insbesondere davon abhängig, in welcher Apparatur die im Nachfolgenden beschriebenen Temperaturschritte durchgeführt werden sollen.

Die Suspension wird bei 95°C für 90s aufgekocht, um die Zellen mittels thermischer Lyse aufzuschließen und einen Großteil der zellulären Proteine zu inaktivieren (Reaktionsschritt Rs3). Anschließend wird die Probe für 2 bis 3 Minuten auf Eis abgekühlt (Reaktionsschritt Rs4) und mit Proteinase K behandelt, um restliche DNA schädliche Enzyme zu entfernen. In Reaktionsschritt Rs5 werden 2 μl eine Proteinase K Lösung der Konzentration 20 mg/ml zugegeben und der Reaktionsansatz wird ca. 1 Stunde bei 55°C im Heizblock, im Wasserbad, im Thermocycler o. ä. inkubiert (Reaktionsschritt Rs6).

In einem weiteren Hitzeschritt Rs7 von ca. 5 min bei 95°C wird die Proteinase K inaktiviert. Der so entstandene Rohextrakt RE wird anschießend auf Eis abgekühlt (Reaktionsschritt Rs8) und kann über Jahre konserviert und für Experimente verwendet werden, ohne dass die bakterielle DNA durch zelluläre DNAsen abgebaut wird.

Der Rohextrakt RE kann ohne weiteres, d. h. insbesondere ohne zeit- und kostenintensive DNA Extraktion, direkt als Template für die PCR (Polymerasekettenreaktion) zur Herstellung der Substrat DNA für die anschließende Restriktionsanalyse verwendet werden.

2 zeigt schematisch die Amplifizierung des 16S rRNA Gens aus dem Rohextrakt RE. Zur Überprüfung, dass die Amplifikationsreaktion der PCR (Polymerasekettenreaktion) funktioniert, werden parallel zur Amplifikation des Rohextraktes noch eine Positivkontrolle pC und eine Negativkontrolle nC durchgeführt.

Für die Positivkontrolle wird DNA aus E. coli eingesetzt, während in die Negativkontrolle anstelle von DNA Reinstwasser eingesetzt wird. Zur Herstellung des Amplifikationsproduktes des 16S rRNA Gens PCR RE werden als Template, d. h. als DNA Matrize, ca. 1 bis 2 μl des Rohextraktes RE, dessen Herstellung in 1 beschrieben wurde, verwendet.

Hierbei wird mittels PCR die Sequenz des 16S rRNA Gens amplifiziert. Das 16S rRNA Gens der Methylobakterien weist eine Länge von ca. 1500 Basenpaaren auf. Die verwendeten Primer sind universell bekannt und einfach käuflich zu erwerben. D. h. es müssen somit nicht extra für dieses Verfahren neue Primer entwickelt und geprüft werden, was ebenfalls zu einer Kostenreduktion führt.

Zu dem Rohextrakt RE, der E. coli DNA pC und dem Reinstwasser nC wird jeweils PCR Mastermix MM hinzugegeben (Reaktionsschritt Rs9) und eine PCR (Reaktionsschritt Rs10) durchgeführt. Der PCR Mastermix enthält neben einer amplifizierenden Polymerase in dem entsprechenden Puffer noch Nukleotide und die Primer pA und pH. Diese beiden Primer können universell für die Amplifizierung des 16S rRNA Gens verschiedener Organismen eingesetzt werden.

Der Primer pA weist folgende Sequenz auf:
5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'.

Der Primer pH weist folgende Sequenz auf:
5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'

Beide Primer wurden in Edwards et. al. 1989, Nucl. Acid Research 17 (19), S. 7843–7853 erstmals beschrieben. Die Verwendung beider Primer in Verbindung mit Bakterien einer anderen Gattung wurde in Ranjard et. al. 1998, Eur. J. Soil Biol. 34 (2); S. 89–97 beschrieben.

Die PCR (Reaktionsschritt Rs10) wird nach folgendem Protokoll durchgeführt:

Zur Kontrolle des Erfolges der PCR Reaktion, d. h. zur Kontrolle, ob das 16S rRNA Gen amplifiziert wurde, wird ein Teil der PCR Ansätze PCR RE, PCR pC und PCR nC mittels Gelelektrophorese analysiert, um die Länge der entstandenen PCR Produkte zu überprüfen. Hierfür wird vorzugsweise ein Agarosegel verwendet, es ist aber auch ohne weiteres die Verwendung eines Polyacrylamidgels möglich. Weiterhin ist die Verwendung anderer Methoden, die die Längenbestimmung von DNA ermöglichen, ohne weiteres denkbar.

Zur Größenabschätzung wird beispielsweise ein geeigneter DNA Längenstandard MW ebenfalls mit auf das Gel aufgetragen und analysiert.

Anschließend wird das PCR-Produkt PCR RE, d. h. das amplifizierte 16S rRNA Gen, enzymatisch geschnitten. Daher ergibt sich auch die Bezeichnung des Verfahrens als ARDRA-Methode. ARDRA bedeutet Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis und ist in 3 als schematische Übersicht dargestellt.

Vor dem Restriktionsverdau muss das PCR Produkt PCR RE nicht extra aufgereinigt werden, stattdessen werden jeweils 5 μl des PCR RE Ansatzes unverändert für die Restriktionsanalyse verwendet. Es werden parallel zwölf Ansätze mit jeweils einem unterschiedlichen Restriktionsenzym behandelt und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt und analysiert. Die Inkubation der Verdaureaktion bei der entsprechenden Temperatur kann im vorhandenen PCR-Cycler stattfinden, so dass kein weiteres Gerät notwendig ist. Dies stellt einen weiteren wichtigen Faktor in Bezug auf die Reduzierung von Kosten dar.

Es werden also zwölf parallele Reaktionsansätze hergestellt, wobei zu jedem Reaktionsansatz 5 μl PCR RE pipettiert werden (Reaktionsschritt Rs12). Anschließend werden die Ansätze mit einer entsprechenden Menge an bidestilliertem Wasser, Puffer P und Restriktionsendonuclease E versetzt (Reaktionsschritt Rs13, Rs14 und Rs15) und bei der entsprechenden Temperatur von 37°C oder 55°C, abhängig vom Restriktionsenzym E, für eine Stunde inkubiert (Reaktionsschritt Rs16a und Rs16b). Die Restriktionsverdaue werden anschließend quantitativ auf ein Gel aufgetragen, aufgetrennt und analysiert (Reaktionsschritt 17). In 3 ist exemplarisch das Restriktionsmuster von sieben der zwölf parallel durchgeführten Restriktionsverdauansätzen dargestellt. Hierbei ist zu beachten, dass die im Schema sichtbaren „Muster” nur der Veranschaulichung der Methode dienen. Die Verhältnisse müssen nicht denen entsprechen, die sich bei der Durchführung der ARDRA-Methode ergeben.

Mittels des spezifisch entstehenden Restriktionsmusters wird das amplifizierte 16S rRNA Gen auf das Vorkommen der spezifischen sechs bis acht Basenpaare umfassenden Erkennungssequenzen hin untersucht. Ist eine entsprechende Restriktionsschnittstelle im Gen vorhanden, so wird die DNA an dieser Stelle geschnitten und es können mindestens zwei DNA Fragmente nachgewiesen werden.

Die verwendeten Restriktionsenzyme sind in 4 aufgelistet und werden aus einer Gruppe bestehend aus zwölf Restriktionsenzymen ausgewählt, wobei zehn Restriktionsenzyme TypII Endonukleasen mit einer definierten Erkennungssequenz darstellen und zwei TypIIb Endonukleasen sind, die degenerierte Erkennungssequenzen erkennen und schneiden.

Von den Enzymen, die mit einem * gekennzeichnet sind, sind Isoschizomere, die spezifisch die gleiche Nukleotidsequenz erkennen und diese in gleicher Weise spalten, bekannt. Von den mit drei *** gekennzeichneten Enzymen sind Neoschizomere bekannt, die spezifisch die gleiche Nukleotidsequenz erkennen, diese aber in unterschiedlicher Weise spalten. Von den mit zwei ** gekennzeichneten Enzymen sind sowohl Iso- als auch Neoschizomere bekannt. Für die Restriktionsanalysen können auch bisher noch nicht identifizierte Iso- oder Neoschizomere der oben genannten Enzyme verwendet werden.

Das Ergebnis der Restriktionsanalysen ist von binärem Charakter, d. h. entweder weist das Gen mindestens eine Restriktionsschnittstelle auf oder eben nicht. Diese Restriktionsmuster sind Spezies spezifisch. D. h. anhand des charakteristischen Restriktionsmusters sind die verschiedenen Spezies der Gattung des Methylobacterium einfach zu unterscheiden.

Der Nachweis der geschnittenen oder ungeschnittenen DNA und die Auswertung des Ergebnisses erfolgt mittels Gelelektrophorese über ein Agarosegel. Für den Nachweis von kurzen Fragmenten müssen im Allgemeinen hochwertige Agarosen verwendet werden. Allerdings ist auch die Verwendung günstigerer Agarosen und dünnerer, beispielsweise 1%iger Agarosegele möglich, da kurze Fragmente (< 100 bp) auch indirekt durch eine entsprechend geringere Größe der längeren Fragmente nachgewiesen werden können.

Zum Vergleich kann ungeschnittene und geschnittene DNA eines bekannten Typenstammes parallel auf das Gel aufgetragen werden, so dass gegebenenfalls sogar auf die Verwendung eines DNA-Längenstandards MW zur Bestimmung der Fragmentgrößen verzichtet werden kann.

Mit dieser so genannten ARDRA Methode (Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis) können innerhalb von fünf bis acht Stunden aussagekräftige Ergebnisse erzielt werden.

Eine Übersicht über die mittels ARDRA erhaltenen unterschiedlichen Fragmentgrößen, der verschiedenen Methylobakterien Stämme ist in 5 dargestellt. Anhand dieser Übersicht und des Ergebnisses des Restriktionsverdaus kann der fragliche Stamm einfach identifiziert werden. Hierbei ist zu beachten, dass der Stamm Mtb. rhodesianum auch unter dem Synonym Mtb. lusitanum und der Stamm Mtb. extorquens auch unter den Synonymen Mtb. dichloromethanicum und Mtb. chloromethanicum bekannt ist, während der Stamm Mtb. goesingense noch nicht valide publiziert ist.

6 stellt tabellarisch die wesentlichen Unterschiede zwischen den bekannten Differenzierungsmethoden und der ARDRA-Methode dar.

Die Kosten für biochemische und/oder physiologische Tests sind relativ gering, da die einzelnen Bestandteile, beispielsweise Nährmedien etc. günstig erhältlich sind. Die Sequenzierung ist dagegen wie bereits beschrieben sehr kostenintensiv, unabhängig davon, ob sie im Haus durchgeführt werden kann oder nach außen abgegeben werden muss. In jedem Fall muss die zu sequenzierende DNA erst aufgereinigt werden. Dieser Schritt kann bei der ARDRA-Methode komplett entfallen.

Die Kosten zur Analyse eines Methylobakterien Stammes mittels der beschriebenen ARDRA-Methode setzen sich aus den Kosten für den Proteinase K Verdau, den Kosten für die Restriktionsanalysen, d. h. insbesondere für die Kosten der einzelnen Restriktionsenzyme und den Kosten für das Agarosegel zusammen. Die Kosten für die einzelnen Enzymkomponenten belaufen sich auf 0,4 bis 17 Cent pro Reaktion. Die Kosten für ein Agarosegel liegen beim Einsatz von hoch auflösender Agarose bei ca. 3,5 Euro pro Gel. Somit kann eine vollständige Differenzierung und Identifizierung des fraglichen Stammes bereits für ca. 4 Euro erfolgen.

Wie bereits im Stand der Technik erwähnt, sind die Ergebnisse der biochemischen und/oder physiologischen Tests schlecht oder gar nicht reproduzierbar. In dieser Hinsicht ist die ARDRA-Methode mit der Sequenzierung vergleichbar, da beide Methoden gut reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Ein großer Unterschied ergibt sich jedoch beim Zeitaufwand der benötigt wird, bis ein aussagekräftiges Ergebnis vorliegt. Dies dauert bei biochemischen und/oder physiologischen Tests i. d. R. vierzehn Tage, während die Ergebnisse der Sequenzierung durch einen Fremdanbieter bereits nach zwei Tagen vorliegen können, wobei auch längere Laufzeiten keine Seltenheit sind. Im Gegensatz dazu bietet die ARDRA-Methode einen klaren Vorteil, da hierbei ein aussagekräftiges Ergebnis bereits nach 5 bis 8 Stunden, d. h. innerhalb eines Arbeitstages, vorliegt.

Ein besonderer Vorteil der ARDRA-Methode besteht weiterhin darin, dass kein hoher apparativer Aufwand nötig ist. Die Analyse kann mittels eines PCR Cyclers und einer Gelelektrophorese Apparatur durchgeführt werden. Die verschiedenen Temperaturschritte, die für die Herstellung des Rohextraktes RE und für die Restriktionsanalyse des 16S rRNA Gens nötig sind, können beispielsweise direkt im PCR Cycler durchgeführt werden. Ein zusätzlicher Heizblock ist somit nicht zwingend nötig.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Gele nicht zwingend mit Ethidiumbromid gefärbt und mit UV analysiert werden müssen. Es ist ebenso möglich, die Gele nach der elektrophoretischen Auftrennung mit Methylenblau zu färben und die DNA Banden somit für das menschliche Auge sichtbar und photographisch dokumentierbar zu machen.

Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch für einen Fachmann vorstellbar, dass Abwandlungen oder Änderungen der Erfindung gemacht werden können, ohne den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Insbesondere ist es denkbar, dass eine PCR eines anderen gattungsspezifischen Gens der Gattung Methylobacterium durchgeführt wird und/oder dass andere Primer verwendet werden und/oder dass andere Restriktionsenzyme eingesetzt werden.

Bezugszeichenliste

10
Methylobakterien-Kolonie
12
Nährmedium
20
Impföse
22
Reaktionsgefäß
E
Restriktionsendonuklease/Restriktionsenzym
MM
Mastermix
MW
DNA Längenstandard
nC
Negativkontrolle
pC
Positivkontrolle
P
Puffer
PCR nC
PCR der Negativkontrolle
PCR pC
PCR der Positivkontrolle
PCR RE
PCR des Rohextraktes
RE
Rohextrakt