Title:
Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden
Document Type and Number:
Kind Code:
B3

Abstract:

Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet, wobei das Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,001 nM bis ≤ 80 nM an aktiviertes Protein C bindet, und wobei das Aptamer eine Länge im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 160 Nukleotide aufweist, und wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) worin:
N1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin, Uracil, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid, oder eine Deletion;
und/oder 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).





Inventors:
Mayer, Günter, Dr. (53123, Bonn, DE)
Müller, Jens, Dr. (53119, Bonn, DE)
Pötzsch, Bernd (Bonn, DE)
Application Number:
DE102007063902A
Publication Date:
11/23/2017
Filing Date:
08/31/2007
Assignee:
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, 53113 (DE)
International Classes:
A61K31/7088; A61K31/7115; A61P7/04; C07H21/00; C12Q1/68; G01N33/68
Foreign References:
20060110739
5650275
WO1992014843A1
Other References:
BLANK M u.a. Aptamers as tools for target validation, 2005, Curr. Opin. Chem. Biol., vo. 9, Bd. 4, S. 336-342.
GAL SW u.a. Selection of a RNA aptamer that binds to human activated protein C and inhibits its protease function, 1998, Eur. J. Biochem., Vol. 252, Bd. 3, S. 553-562
HOWARD EL u.a. Factor IXa inhibitors as novel anticoagulants, 2007, Arterioscler. Thromb. Vas. Biol., Vol 27, Bd. 4, s. 722-727
RUSCONI CO u.a. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa, 2002, Nature, Vol. 419, Bd. 6902, S. 9094
Attorney, Agent or Firm:
Michalski Hüttermann & Partner Patentanwälte mbB, 40221, Düsseldorf, DE
Claims:
1. Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet, wobei das Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,001 nM bis ≤ 80 nM an aktiviertes Protein C bindet, und wobei das Aptamer eine Länge im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 160 Nukleotide aufweist, und wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) worin:
N1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin, Uracil, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid, oder eine Deletion;
und/oder 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).

2. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,002 nM bis ≤ 8 nM, vorzugsweise im Bereich von ≥ 0,005 nM bis ≤ 5 nM, bevorzugt im Bereich von ≥ 0,01 nM bis ≤ 2 nM, besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,05 nM bis ≤ 1,5 nM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 1,3 nM, an aktiviertes Protein C bindet.

3. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Anzahl an Nukleotiden im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 120 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 40 Nukleotide bis ≤ 88 Nukleotide, aufweist.

4. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer wenigstens eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife aufweist.

5. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife aufweist, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist.

6. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz SEQ ID NO: 1 die zweite Haarnadel-Struktur umfasst.

7. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin aufweist, die eine Ausbuchtung ausbildet.

8. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 4 Basenpaare bis ≤ 15 Basenpaare, vorzugsweise im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare aufweist.

9. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schleife der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 5 Nukleotide bis ≤ 30 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 6 Nukleotide bis ≤ 18 Nukleotide, aufweist.

10. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend: wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.

11. Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer nach einem der vorherigen Ansprüche mit der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, inkubiert wird und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und aktiviertem Protein C nachgewiesen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Flüssigkeit eine Körperflüssigkeit ist, vorzugsweise Blut oder Blutprodukte, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Blutplasma, Serum und/oder Vollblut.

13. Kit umfassend wenigstens ein an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer nach einem der vorherigen Ansprüche.

14. Verwendung eines an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers nach einem der vorherigen Ansprüche, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.

15. Verwendung eines an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers nach einem der vorherigen Ansprüche, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden.

16. Arzneimittel umfassend an aktiviertes Protein C bindende Aptamere nach einem der vorherigen Ansprüche.

Description:

Die Erfindung betrifft Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet.

Aktiviertes Protein C (APC) ist eine Serinprotease und die aktive Form des im Blut zirkulierenden Zymogens Protein C. Als sogenannter ”endogener Inhibitor” inaktiviert aktiviertes Protein C die aktivierten Gerinnungsfaktoren Va und VIIIa und kontrolliert dadurch die plasmatische Gerinnungsaktivierung. Eine verminderte Bildung von aktiviertem Protein C oder eine Störung der Aktivität des aktivierten Protein C ist mit einem erhöhten Risiko zur Entwicklung von venösen Thrombosen verbunden und spielt in der Pathogenese von Mikrozirkulationsstörungen, wie sie zum Beispiel im Rahmen der schweren Sepsis auftreten, eine entscheidende Rolle. Ein rekombinant hergestelltes Konzentrat von aktiviertem Protein C wird beispielsweise in der Behandlung der schweren Sepsis eingesetzt.

Trotz der zentralen Rolle, die aktiviertes Protein C in der Pathogenese, Pathophysiologie und Therapie von verschiedenen vaskulären und inflammatorischen Erkrankungen spielt, ist kein routinetaugliches diagnostisches Testverfahren verfügbar, mit dem die Konzentration von aktiviertem Protein C in Plasma oder Vollblut gemessen werden kann.

Der Nachweis von aktiviertem Protein C wird durch seine geringen Plasmakonzentrationen und einem gleichzeitig vorliegendem 10.000-fachen Überschuss von Protein C erschwert.

Hinzu kommt, dass die Aminosäuresequenz von aktiviertem Protein C bis auf ein zwölf Aminosäuren langes Propeptid identisch mit der von Protein C ist.

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von aktiviertem Protein C, zum Beispiel durch Bestimmung der Protein C-Propeptidkonzentration, sind zwar bekannt, jedoch aufgrund vielfacher technischer Probleme in der Diagnose nicht einsetzbar.

Die Schrift WO 92/14843 A1 beschreibt Aptamere, die spezifisch an Biomoleküle binden und Verfahren zur Herstellung dieser Aptamere. Weiterhin beschreiben Gal S. W. et al. in „Selection of a RNA aptamer that binds to human activated protein C and inhibits ist protease function”, 1998, Eur. J. Biochem., Vol. 252, Bd 3, S. 553–562, RNA Aptamere gegen humanes aktiviertes Protein C.

Weiterhin ist aus der Schrift US 6989241 ein monoklonaler Antikörper gegen aktiviertes Protein C zur Differenzierung zwischen aktiviertem Protein C und Protein C bekannt. Jedoch ist die Affinität dieses Antikörpers zu Protein C nur um eine Zehnerpotenz geringer. Dementsprechend ist ein auf der Basis dieses Antikörpers entwickeltes Testverfahren zwar grundsätzlich zur Bestimmung von aktiviertem Protein C geeignet, erfordert jedoch aufgrund der geringen Affinitätsunterschiede Inkubationszeiten von mehr als 19 Stunden und zeigt eine eingeschränkte Spezifität. Darüber hinaus ist eine komplizierte präanalytische Probenbearbeitung erforderlich.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das wenigstens einen der vorgenannten Nachteile des Standes der Technik überwindet. Insbesondere bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das einen Nachweis von aktiviertem Protein C ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet, wobei das Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,001 nM bis ≤ 80 nM an aktiviertes Protein C bindet, und wobei das Aptamer eine Länge im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 160 Nukleotide aufweist, und wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) worin:
N1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin, Uracil, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid, oder eine Deletion;
und/oder 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).

Ein weiterer Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, wobei wenigstens ein an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer mit der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, inkubiert wird und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und aktiviertem Protein C nachgewiesen wird.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Unter dem Begriff ”Aptamer” sind im Sinne dieser Erfindung Oligonukleotide zu verstehen, die spezifisch und mit hoher Affinität an ein Zielmolekül, insbesondere an ein an der Hämostase beteiligtes Zielprotein wie aktiviertes Protein C binden.

Die Erfinder konnten überraschender Weise Aptamere selektieren, die aktiviertes Protein C mit hoher Affinität binden können. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere wird dadurch zur Verfügung gestellt, dass diese aktiviertes Protein C mit hoher Affinität und hoher Selektivität binden können. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Aptamere spezifisch an aktiviertes Protein C gegenüber dem inaktiven Zymogen Protein C binden.

Insbesondere zeichnen sich die erfindungsgemäßen Aptamere durch eine hohe Affinität im nanomolaren und sub-nanomolaren Bereich und eine ausgeprägte Spezifität für aktiviertes Protein C gegenüber dem inaktiven Zymogen Protein C aus. Diese Eigenschaften ermöglichen eine zuverlässige Bestimmung von aktiviertem Protein C auch bei Anwesenheit eines großen Überschusses an inaktivem Zymogen Protein C, und eine reproduzierbare Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben. Die Affinität und Spezifität der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind vorzugsweise besser oder zumindest vergleichbar der von Antikörpern. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten Aptamere im Gegensatz zu Antikörpern kostengünstig synthetisch herstellbar sind.

Die Selektion der erfindungsgemäßen Aptamere erfolgte entsprechend dem bekannten SELEX®(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)-Verfahren, beispielsweise beschrieben in US 5,475,096, US 5,270,163 und EP 0 533 838, auf die hiermit Bezug genommen wird, insbesondere dem so genannten Counter-SELEX®-Verfahren. Hierzu erfolgte zunächst die Synthese eines randomisierten DNA-Pools. Aptamere wurden schematisch durch folgende Schritte generiert. Aptamere aus dem DNA-Pool wurden angereichert, indem der Pool mit aktiviertem Protein C zur Bindung gebracht wurde und der Bindungskomplex von ungebundener ssDNA abgetrennt wurde. Um eine Anreicherung von Matrixbindern zu unterdrücken erfolgte vor ausgewählten Selektionsschritt eine Prä-Selektion gegen Streptavidin Beads. Nach der Inkubation mit aktiviertem Protein C wurde die gebundene ssDNA eluiert, amplifiziert und die erhaltene dsDNA in ssDNA überführt, bevor mit diesen ssDNAs das Verfahren wiederholt wurde. Dieses wurde 11-fach wiederholt. Nach erfolgter Klonierung des selektierten Aptamer-Pools wurde die Sequenz individueller Aptamere durch Sequenzierung und Sequenzanalysen ermittelt und die Bindungseigenschaften durch Bindungsstudien charakterisiert. Selektierte Aptamere mit bekannter Struktur sind mit herkömmlichen Methoden der Nukleinsäuresynthese und/oder Vervielfältigung herstellbar.

Die Bindungsfähigkeit der selektierten Aptamere wird durch die Affinität der Bindung üblicherweise ausgedrückt über die Dissoziationskonstante beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bindet das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,002 nM bis ≤ 8 nM, vorzugsweise im Bereich von ≥ 0,005 nM bis ≤ 5 nM, bevorzugt im Bereich von ≥ 0,01 nM bis ≤ 2 nM, besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,05 nM bis ≤ 1,5 nM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 1,3 nM, an aktiviertes Protein C.

Die Dissoziationskonstanten KD wurden durch nichtlineare Regression mittels einer 4-Parameter-Logistik-Funktion bestimmt. Die Bestimmung erfolgte durch nichtlineare Regression der erhaltenen Datenpunkte von an aktiviertes Proteins C gebundenen radioaktiv-markierter Aptamere gegenüber der Konzentration des verwendeten aktivierten Proteins C, wie in Beispiel 3 beschrieben. Zur Berechnung wurde die Funktion ”Logistische Dosisantwort in Pharmakologie/Chemie” der Software Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA) verwendet.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Anzahl an Nukleotiden im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 120 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 40 Nukleotide bis ≤ 88 Nukleotide, auf. Besonders bevorzugt weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Anzahl an Nukleotiden im Bereich von ≥ 44 Nukleotide bis ≤ 120 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 44 Nukleotide bis ≤ 88 Nukleotide bevorzugt im Bereich von ≥ 44 bis ≤ 52 Nukleotide auf.

Wenn im Folgenden nicht anderes angegeben umfasst der Begriff ”Nukleotid” die Begriffe ”Ribonukleotid” und ”Desoxyribonukleotid”. Entsprechend umfasst der Begriff ”2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid” 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide.

Erfindungsgemäße Aptamere können eine DNA- oder eine RNA-Sequenz aufweisen. Es versteht sich, dass für den Fall, dass erfindungsgemäße Aptamere eine RNA-Sequenz aufweisen, in den angegebenen Sequenzmotiven und Sequenzen Thymidin durch Uridin ersetzt ist.

Die erfindungsgemäß geeigneten RNA-Sequenzen entsprechen den erfindungsgemäßen DNA Sequenzen, wobei T durch U ersetzt ist.

Vorzugsweise weisen Aptamere eine DNA-Sequenz auf. Aptamere auf DNA-Basis besitzen in vorteilhafter Weise eine erhöhte Stabilität.

Weiterhin geeignet sind Aptamere, die eine Sequenz umfassend 2'-modifizierte Nukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide, aufweisen. Auch geeignet sind Aptamere, die 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide, aufweisen. Weiterhin können Aptamere Desoxyribonukleotide und 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluor-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide aufweisen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten an aktiviertes Protein C bindende Aptamere selektiert werden, die zwei Hauptgruppen zugeordnet werden konnten, wobei die Sequenzen der Aptamere innerhalb einer Hauptgruppe ein gemeinsames Sequenzmotiv aufweisen. Dieses gemeinsame Sequenzmotiv variiert innerhalb einer Hauptgruppe nur in einzelnen Basenpositionen.

”C” steht vorliegend entsprechend dem üblichen hier verwendeten Ein-Buchstaben-Code der Basen für Cytosin, entsprechend stehen ”A” für Adenin, ”G” für Guanin und ”T” für Thymin, ”U” für Uracil.

Insbesondere die Position N1 des Sequenzmotivs SEQ ID NO: 1 ist hochvariabel. So kann die Position N1 verschiedene Basen oder Nukleotide oder eine Deletion umfassen. Beispielsweise kann an der Position N1 ein Ribonukleotid in einem DNA-Aptamer umfasst sein. Weiterhin können insbesondere an der Position N1 modifizierte Nukleotide, insbesondere modifizierte Ribonukleotide umfasst sein.

In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 3 des an aktiviertes Protein C bindende Aptamers keine modifizierten Nukleotide auf.

Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 1 und 3 eine essentielle Bedeutung bei der Bindung der erfindungsgemäßen Aptamere an aktiviertes Protein C aufweisen.

Unter den an aktiviertes Protein C bindenden Aptameren, die ein Sequenzmotiv 5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) aufweisen, wurden vier Untergruppen identifiziert, die eine jeweils gemeinsame Base N1 ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin und/oder Thymin aufweisen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Hierbei können die Sequenzmotive SEQ ID NOs: 4 bis 7 modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen.

Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 4 bis 7 eine besonders gute Bindung der erfindungsgemäßen Aptamere an aktiviertes Protein C vermitteln können.

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 8 bis 19 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 4) auf, die die Base Thymin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 aufweist.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.

Teile der vorgenannten Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 4).

Varianten der erfindungsgemäßen Sequenzen können durch Modifikationen, wie Alkylierung, insbesondere Methylierung, Arylierung oder Acetylierung von zumindest einem Nukleotid, Einbau von Enantiomeren und/oder durch Fusion der Aptamere mit einem oder mehreren Nukleotiden oder einer Nukleinsäuresequenz entstehen. Mutanten können beispielsweise durch Substitution, Deletion, Insertion, Translokation, Inversion und/oder Addition von zumindest einem Nukleotid erhalten werden.

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 20 bis 31 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGGATGGG-3' (SEQ ID NO: 5) auf, die die Base Guanin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGGATGGG-3' (SEQ ID NO: 5).

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGAATGGG-3' (SEQ ID NO: 6).

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 32 bis 34 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGAATGGG-3' (SEQ ID NO: 6) auf, die die Base Adenin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 aufweist.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGCATGGG-3' (SEQ ID NO: 7).

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 35 und 36 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGCATGGG-3' (SEQ ID NO: 7) auf, die die Base Cytosin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 aufweist.

In weiter bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 97 bis 115 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1), insbesondere die Sequenzmotive 5'-TATCCCGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-TATCCCGGATGGG-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-TATCCCGAATGGG-3' (SEQ ID NO: 6) oder 5'-TATCCCGCATGGG-3' (SEQ ID NO: 7).

In auch bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 116 und 117 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCACGGATGGGC-3' (SEQ ID NO: 118), das sich von dem Sequenzmotive SEQ ID NO: 1 dadurch unterscheidet, dass Adenin an der Position 5 enthalten ist.

In noch bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 119 und 120 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCAAATGGGG-3' (SEQ ID NO: 121), das sich von dem Sequenzmotive SEQ ID NO: 1 dadurch unterscheidet, dass Adenin an der Position 7 enthalten ist, oder das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 122), das sich von dem Sequenzmotive SEQ ID NO: 1 dadurch unterscheidet, dass Adenin an der Position 11 enthalten ist.

In auch bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer das Sequenzmotiv 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen jeweils das Sequenzmotiv 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 46, 123 und 124 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-ATCGCTTCAGGG-3' (SEQ ID NO: 125).

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz
5'-ACGTGAATGTCTGGCTGGTGTAGGTCTGGGCTGGACGTGGGGCTAGTGA-3' (SEQ ID NO: 47) auf.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz
5'-ACGTGAATGTCTGGCTGGTGTAGGTCTGGGCTGGACGTGGGGCTAGTGA-3' (SEQ ID NO: 126) auf.

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.

Hierbei umfassen die Sequenzen SEQ ID NOs: 48 bis 85 die vorgenannten SEQ ID NOs: 8 bis 36 und 39 bis 47, wobei diese jeweils von zwei Sequenzen 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (SEQ ID NO: 86) und 5'-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3' (SEQ ID NO: 87) flankiert werden. Diese Sequenzen SEQ ID NO: 86 und SEQ ID NO: 87 entsprechen den Primerbindungssequenzen, die bei der Selektion der erfindungsgemäßen Aptamere verwendet wurden.

Überraschend konnte festgestellt werden, dass insbesondere die erfindungsgemäßen Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 49, 58, 70 und 83 eine sehr gute Affinität der Bindung an aktiviertes Protein C aufwiesen. Insbesondere in Filterbindungsexperimenten konnte festgestellt werden, dass die bestimmte Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 0,4 nM lag.

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.

Hierbei umfassen die Sequenzen SEQ ID NOs: 127 bis 152 die vorgenannten SEQ ID NOs: 97 bis 117, 119, 120, 123, 124 und 126, wobei diese jeweils von zwei Sequenzen 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (SEQ ID NO: 86) und 5'-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3' (SEQ ID NO: 87) flankiert werden. Diese Sequenzen SEQ ID NO: 86 und SEQ ID NO: 87 entsprechen den Primerbindungssequenzen, die bei der Selektion der erfindungsgemäßen Aptamere verwendet wurden.

Aptamere können sich unter definierten Bedingungen in eine spezifische dreidimensionale Struktur beispielsweise so genannte Haarnadelstrukturen falten. Vorzugsweise weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer wenigstens eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife auf.

Unter dem Begriff ”Haarnadelstruktur” oder ”Hairpin” ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine spezielle Form der Sekundärstruktur bei Nukleinsäuresequenzen insbesondere Aptameren zu verstehen, die sich aus zwei zueinander komplementären Sequenz-Abschnitten im so genannten Stamm (stem) und einem weiteren Sequenzabschnitt in der so genannten Schleife (loop) zusammensetzen, zu verstehen. Hierbei können im Stamm eine oder mehrere Basen einzelsträngige Bereiche so genannte Ausbuchtungen (Bulge) ausbilden.

Es ist bevorzugt, dass der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 4 Basenpaare bis ≤ 15 Basenpaare, vorzugsweise im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare aufweist. Es ist weiter bevorzugt, dass die Schleife der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 5 Nukleotide bis ≤ 30 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 6 Nukleotide bis ≤ 18 Nukleotide, aufweist.

In vorteilhafter Weise kann eine Anzahl gepaarter Nukleotide im Bereich von ≥ 4 Basenpaare bis ≤ 15 Basenpaare, insbesondere im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare, im Stamm der ersten Haarnadel-Struktur dazu beitragen, dass eine hochaffine Bindung des Aptamers zu aktiviertem Protein C ausbildbar ist.

Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein wird angenommen, dass eine Anzahl gepaarter Nukleotide insbesondere im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare dazu beitragen kann, dass eine stabile Ausbildung des Stammes der ersten Haarnadel-Struktur ermöglicht wird.

In bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife auf. Vorzugsweise ist die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet.

In weiter bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife auf, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer das Sequenzmotiv SEQ ID NO: 1 auf, wobei das Sequenzmotiv SEQ ID NO: 1 die zweite Haarnadel-Struktur umfasst. In weiter bevorzugten Ausführungsformen weist der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin (CT) auf, die einen einzelsträngigen Bereich, eine Ausbuchtung, ausbildet.

Es konnte festgestellt werden, dass insbesondere eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin (CT) im Stamm der erste Haarnadelstruktur, die einen einzelsträngigen Bereich, einen so genannten Bulge ausbildet, zu einer Verbesserung der Bindung des Aptamers an aktiviertes Protein C beitragen kann.

In bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 auf. In besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92, wobei diese eine Sekundärstruktur aufweisen, die eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife und eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife ausbildet, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist.

In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamer aufweisend Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 eine Sekundärstruktur auf, die eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife und eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife umfasst, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist, und wobei das Sequenzmotiv SEQ ID NO: 1 die zweite Haarnadel-Struktur umfasst.

In weiter ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 einen Stamm der ersten Haarnadel-Struktur auf mit im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare und/oder eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin (CT) im Stamm der erste Haarnadelstruktur, die einen einzelsträngigen Bereich, einen so genannten Bulge ausbildet. In ebenfalls ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere aufweisend Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 eine Schleife der ersten Haarnadel-Struktur mit einer Anzahl Nukleotide im Bereich von ≥ 6 Nukleotide bis ≤ 18 Nukleotide auf.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend: wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.

In anderen Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Überraschend konnte festgestellt werden, dass insbesondere die erfindungsgemäßen Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 eine sehr gute Affinität der Bindung an aktiviertes Protein C aufwiesen, wobei die durch Filterbindungsexperimente bestimmte Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 1,3 nM lag.

Locked-Nukleinsäuren (LNA, Locked Nucleic Acid) entsprechen einem konformationsfixierten Analogon von DNA. Die Oligonukleotide der Locked-Nukleinsäuren enthalten ein oder mehrere bizyklische Ribonukleoside, bei denen die 2'OH-Gruppe mit dem C4-Kohlenstoffatom über eine Methylengruppe verbunden ist. Vorteilhafter Weise zeigen Locked-Nukleinsäuren im Vergleich zu nicht modifizierter DNA eine höhere Stabilität gegenüber Nukleasen sowie bessere Hybridisierungseigenschaften, wodurch eine Verbesserung der Affinität und/oder Spezifität der Bindung des Aptamers erzielt werden kann.

Eine weitere bevorzugte chemische Modifikation ist beispielsweise die Anfügung einer so genannten ”3'-CAP”- oder ”5'-CAP”-Struktur, eines modifizierten Guanosin-Nukleotids (7-Methyl-guanosin) an das 3'-Ende oder 5'-Ende. Die Modifikation des 3'-Endes oder 5'-Endes kann das Aptamer in vorteilhafter Weise vor einem schnellen Abbau durch Nukleasen, insbesondere in einem Organismus oder einer biologischen Probe schützen.

In anderen Ausführungsformen kann insbesondere das 5'-Ende des Aptamers pegyliert sein. Eine 5'-PEG-Modifikationen kann beispielsweise wenigstens eine Polyethylenglykol-Einheit umfassen, bevorzugt im Bereich von 1 bis 900 Polyethylenglykol-Einheiten, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 450 Polyethylenglykol-Einheiten. Bevorzugt verwendbar sind lineare Polyethylenglykol(PEG)-Einheiten HO-(CH2CH2O)n-H, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 900, bevorzugt im Bereich von 1 bis 450 ist.

Von Vorteil bei einer chemischen Modifikation, einer Änderung des Phosphorzuckerrückgrates oder einer Verwendung von enzymatisch nicht erkennbaren veränderten Nukleotidbausteinen ist, dass die verwendeten Nukleinsäuren gegen einen enzymatischen Abbau insbesondere in einem Organismus oder einer biologischen Probe stabilisiert sind.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Aptamere als Phosphorothioat-DNA oder peptide nucleic acid (PNA) vorliegen. Durch diese Modifikationen können die Aptamere gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabilisiert werden. Die Stabilisierung berührt die Affinität der modifizierten DNA-Aptamere nicht, kann jedoch die Zersetzung der Aptamere in einem Organismus oder einer biologischen Probe durch abbauende Enzyme wie Nukleasen oder DNasen verzögern, vermindern oder sogar verhindern.

Vorzugsweise weisen die Nukleotide der Sequenzmotive (SEQ ID NO: 1) und/oder (SEQ ID NO: 3) keine Modifikationen auf. Bevorzugt sind Nukleotide in Stamm und/oder Schleife der Aptamere modifiziert.

Ein weiterer Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, wobei wenigstens ein erfindungsgemäßes an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer mit der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, inkubiert wird und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und aktiviertem Protein C nachgewiesen wird.

In bevorzugten Ausführungsformen ist das Verfahren ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben ein diagnostisches Testverfahren. Die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind insbesondere in der klinischen Analytik vorteilhaft verwendbar.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere wird dadurch zur Verfügung gestellt, dass diese aktiviertes Protein C mit hoher Affinität und hoher Selektivität binden können. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Aptamere spezifisch an aktiviertes Protein C gegenüber dem inaktiven Zymogen Protein C binden. Dies ermöglicht, die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, insbesondere in Blut und anderen Körperflüssigkeiten zu verwenden. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere in einem routinetauglichen Testverfahren verwendbar.

Eine ”biologische Probe” im Sinne der Erfindung ist ein bereitgestelltes oder durch Probenentnahme erhaltenes biologisches Material. Biologische Proben sind insbesondere biologische Materialien, die von humanen Individuen insbesondere Patienten isoliert werden, beispielsweise biologische Gewebe und Flüssigkeiten. Bevorzugte biologische Proben sind biologische Flüssigkeiten insbesondere Körperflüssigkeiten, vorzugsweise Blut oder Blutprodukte, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Blutplasma, Serum und/oder Vollblut. Die Proben können vorbehandelt sein, beispielsweise durch Mischen, Zugabe von Enzymen oder Markern, oder aufgereinigt sein.

Die Probe wird mit wenigstens einem erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamer inkubiert. Unter einer Inkubation im Sinne der Erfindung ist eine Kontaktierung der Probe, insbesondere der darin enthaltenen Verbindungen, Stoffe und Proteine, mit einem Aptamer zu verstehen.

Beispielsweise kann wenigstens ein erfindungsgemäßes an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, zugesetzt werden. Weiterhin kann die Probe mit zuvor immobilisiertem Aptamer inkubiert werden, beispielsweise durch Zugabe der Probe in eine mit Aptameren beschichtete Vertiefung einer ELISA-Platte.

Gelangt ein Aptamer zu seinem Zielprotein aktiviertes Protein C, bindet es an dieses. Das Bindungsereignis zwischen Aptamer und aktiviertem Protein C wird erfindungsgemäß nachgewiesen. Das Bindungsereignis kann elektrochemisch, optisch, mikrogravimetrisch, kalorimetrisch oder piezoelektrisch nachgewiesen werden.

Das Bindungsereignis kann auch markierungsfrei nachgewiesen werden, wobei das Aptamer beispielsweise auf einer Oberfläche fixiert und die Änderung der Schichtdicke nach Anlagerung aktiviertem Protein C bestimmt wird, beispielsweise optisch über eine Änderung des Evaneszenz-Feldes.

Vorzugsweise wird eine Bindungsbildung zwischen Aptamer und aktiviertem Protein C in einer Indikatorreaktion nach einer direkten oder indirekten Kopplung eines Bindungspartners mit einer gut nachweisbaren Markierungssubstanz nachgewiesen. Bevorzugt ist hierfür das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer mit einer Markierung versehen.

Die Markierung kann durch Lumineszenz, Farbreaktionen, enzymatisch, elektrochemisch oder radioaktiv nachgewiesen werden. Bevorzugt sind Markierungen durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz nachweisbar. Bevorzugt ist ein Nachweis mittels Fluoreszenz. Bevorzugte Fluoreszenzfarbstoffe sind Bisbenzimidazole, die kovalent an Aptamere gekoppelt werden können. Bevorzugte Fluoreszenzfarbstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fluoreszein, Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC), Carbocyanin-Farbstoffe, insbesondere Indocarbocyanin-Farbstoffe und Indodicarbocyanin-Farbstoffe, beispielsweise erhältlich unter der Handelsbezeichnung Cy3 und Cy5 bei der Firma Amersham Biosciences Europe GmbH. Verwendbar sind weiterhin n-Hydroxy-Succinimidester der Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise erhältlich unter der Bezeichnung Alexa Fluor®-Farbstoffe bei der Firma Invitrogen. Verwendbare Farbstoffe zur Färbung von DNA sind beispielsweise das zu den Phenantrinen gehörende Ethidiumbromid, oder die zu den Cyaninen gehörenden SYBR-Farbstoffe (SybrGreen®) der Fa. Molecular Probes. Zur Markierung von doppelsträngiger DNA oder RNA geeignet sind weiterhin interkalierende Farbstoffe, wie Phenantrine beispielsweise Propidiumjodid.

Ein Nachweis von Aptamer-gebundenem aktiviertem Protein C kann ebenfalls über die amidolytische Aktivität des aktivierten Protein C erfasst werden. Hierzu können chromogene oder fluorogene Peptidsubstrate eingesetzt werden, welche von aktiviertem Protein C gespalten werden.

Des weiteren kann der Nachweis von Aptamer-gebundenem aktiviertem Protein C durch Antikörper oder markierte Antikörper erfolgen, welche in der Lage sind an aktiviertes Protein C zu binden. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann der Nachweis von aktiviertem Protein C durch die Zugabe der Probe zu immobiliserten Aptameren und anschließender Detektion des gebundenen aktivierten Protein C durch dessen amidolytsiche Aktivität oder über entsprechende Antikörper erfolgen.

Die Auswertung kann mittels entsprechenden Messgeräten, beispielsweise im Fluoreszenzmikroskop, oder durch Durchflußzytometrie, beispielsweise im Cytofluorimeter erfolgen. Eine bevorzugte chemische Markierung zur Chemilumineszenz ist Luminol. Eine bevorzugte Biolumineszenz umfasst die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer durch Enzyme katalysierten Redoxreaktion. Weiterhin kann der Nachweis mit Enzymen als Markierungssubstanzen geführt werden, die Substrate zu farbigen Produkten umsetzen, vorzugsweise Peroxidase, Luciferase, beta-Galactosidase oder alkalische Phosphatase.

Weiterhin kann der Nachweis radioaktiv über Markierung mittels radioaktiver Isotope erfolgen. Ein Nachweis kann weiterhin mittels eines so genannten ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) erfolgen. Die vorgenannten Verfahren schließen vorzugsweise intensive Waschschritte ein, um ungebundene und/oder unspezifisch gebundene Aptamere und/oder Nachweisreagenzien abzutrennen.

In anderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer an einer festen Phase immobilisiert werden, vorzugsweise über ein Spacer-Molekül. Dieses kann beispielsweise eine Linkernukleinsäure sein. Eine Immobilisierung kann mittels kovalenter Kopplung oder nicht-kovalenter Kopplung mittels geeigneter Affinitätspaare beispielsweise Biotin/Streptavidin erfolgen. Feste Phasen können ausgewählt sein aus Platten, Streifen, Membranen, Filmen, Gelen und/oder Perlen. Geeignete Trägermaterialien sind anorganische und organische Polymere, insbesondere biodegradierbare Polymere oder Biopolymere, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cellulose, Dextran, Agar, Agarose und/oder Sephadex, oder so genannte Magnetic Beads.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere zur Aufreinigung von aktiviertem Protein C. Die an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind beispielsweise zur Affinitätsreinigung und/oder Affinitätschromatographie geeignet.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit umfassend wenigstens ein erfindungsgemäßes an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Kits kann dieser signalgebende Substanzen oder Vorrichtungen enthalten, vorzugsweise Fluororeszenzfarbstoffe, Chemilumineszenz-Cofaktoren, Enzymsubstrate oder markierte Antikörper.

Eine Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere ermöglicht in vorteilhafter Weise insbesondere Diagnoseverfahren zur Bestimmung der Konzentration an aktiviertem Protein C in der Hämostase-Diagnostik und der erweiterten Sepsisdiagnostik. Weiterhin ermöglicht eine Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere in der Diagnostik eine Bestimmung einer gestörten Konzentration an aktiviertem Protein C und somit eine Diagnostik von Erkrankungen, die mit einer Störung des Systems Protein C/aktiviertes Protein C einhergehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.

Die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind geeignet mit hoher Affinität an aktiviertes Protein C zu binden und dessen Aktivität zu modulieren, insbesondere zu inhibieren. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92, geeignet, die antikoagulatorische Enzymaktivität von aktiviertem Protein C zu blockieren.

Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass insbesondere die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 geeignet sind, eine allosterische Konformationsänderung im Molekül des aktivierten Proteins C zu induzieren. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass diese allosterische Konformationsänderung die Inaktivierung von aktiviertem Protein C durch den physiologischen Inhibitor Protein C-Inhibitor verstärken kann. Weiterhin wird ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein angenommen, dass die durch die erfindungsgemäßen Aptamere induzierte allosterische Konformationsänderung von aktiviertem Protein C zu einer Bildung von Komplexen des aktivierten Protein C mit Protein C-Inhibitor führt.

Eine Verabreichung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten ermöglicht in vorteilhafter Weise eine therapeutische Beeinflussung der Aktivität von aktiviertem Protein C.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden.

Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden, sind insbesondere Blutungen, die als Folge einer Überdosierung mit aktiviertem Protein C auftreten oder Blutungen, die in Folge einer gesteigerten Bildung von aktiviertem Protein C als Folge einer sekundären Thrombinämie auftreten.

Rekombinat hergestelltes aktiviertes Protein C wird beispielsweise in der Behandlung der schweren Sepsis verwendet. Insbesondere sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere geeignet, als Antidot für rekombinates aktiviertes Protein C im Falle einer absoluten oder relativen Überdosierung und dadurch ausgelösten Blutungen, zu wirken. Weiterhin sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere insbesondere geeignet, als Surrogattherapeutikum in der Substitution mit Faktor VIII-Konzentrat bei Patienten mit Hamophilie A. Insbesondere kann durch die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindende Aptamere die Halbwertszeit und/oder Wirksamkeit des Faktor VIII-Konzentrats verbessert werden. Weiterhin sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere insbesondere zur Behandlung erworbener hämorrhagischer Diathesen, die durch eine überschießende Bildung von aktiviertem Protein C als Folge einer generalisierten Thrombinbildung entstehen können, geeignet. Eine derartige Konstellation kann beispielsweise bei Patienten nach kardiochirurgischen Eingriffen vorliegen.

Insbesondere sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von Patienten geeignet, die mit Konzentraten von aktiviertem Protein C behandelt werden, oder die durch das Überwiegen des gerinnungshemmend wirkenden aktivierten Proteins C eine Blutungsneigung aufweisen. Weiterhin sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere geeignet, zur Behandlung von Patienten mit einem angeborenen Mangel des Blutgerinnungsfaktors VIII, wobei durch Verabreichen der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindende Aptamere die Halbwertzeit und Effektivität von verabreichtem Faktor VIII-Konzentrat verbessert werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel umfassend erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere. Das Arzneimittel umfasst erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere vorzugsweise als pharmakologisch akzeptables Salz, bevorzugt als Salze anorganischer Säuren, beispielsweise Phosphorsäure, oder als Salze organischer Säuren beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure. Arzneimittel können weiterhin pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffen und/oder Träger umfassen.

In vorteilhafter Weise ist das Arzneimittel zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden, geeignet.

Das Arzneimittel ist oral, transmucosal, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral verabreichbar. Bevorzugt ist eine Verabreichung durch Injektion.

Wenn nicht anders ausgeführt, weisen die verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung auf, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.

Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und weiteren hier angegebenen Literaturangaben sind voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen.

Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.

In den Figuren zeigt:

1 Sequenzen von DNA-Aptameren, die an aktiviertes Protein C binden. Die Sequenz der 1a entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 58, die Sequenz der 1b entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 88. Die Sequenzen weisen jeweils eine Konsensussequenz SEQ ID NO. 1 auf.

2 Sequenzen von DNA-Aptameren, die an aktiviertes Protein C binden. Die Sequenz der 2a entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 89, die Sequenz der 2b entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 90, die Sequenz der 2c entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 91, und die Sequenz der 2d entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 92. Die Sequenzen weisen jeweils eine Konsensussequenz SEQ ID NO. 1 auf.

Die Berechnung der Sekundärstrukturen basierte auf dem im Internet verfügbaren Faltungsprogramm mfold, M. Zuker, Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucleic Acid Res. 31 (13), 3406–15 (2003).

Beispiel 1In-vitro Selektion (SELEX®/Counter-SELEX®)

Zur Selektion von DNA-Aptameren gegen aktiviertes Protein C (APC) wurde als APC-Quelle das als Medikament bei schwerer Sepsis eingesetzte Drotrecogin Alpha (Xigris®) verwendet. Zur für die Selektion notwendigen Immobilisierung der Ziel-Proteine wurden 100 μg des APC biotinyliert und an Streptavidin-beschichtete, magnetische Beads gekoppelt (Dynabeads M-280 Streptavidin [Dynal, Invitrogen]). Zur Biotinylierung wurde bezüglich der eingesetzten APC-Moleküle ein 3fach molarer Überschuss an NHS-Biotin verwendet (Pierce, Rockford, USA). Die Inkubation erfolgte in PBS-Puffer (1 × PBS, pH 7,4) in einem Gesamtvolumen von 100 μl für 30 min auf Eis und anschließend für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Nicht-gebundenes NHS-Biotin wurde anschließend mittels Säulchen-Chromatographie entfernt (Micro Bio-Spin 6 Chromatography columns, Biorad, München, Deutschland). Das auf diese Weise gewonnene biotinylierte APC wurde mit 5 mg der magnetischen Beads in einem Gesamtvolumen von 600 μl PBS (0,1% BSA) für 30 min bei RT unter ständiger Bewegung inkubiert. Anschließend wurden die Beads 1× mit 500 μl PBS (0,1% BSA) gewaschen und letztlich in 1 ml PBS (0,1% BSA) aufgenommen. Als DNA-Aptamer-Startbibliothek wurde der sogenannte D1-Pool mit einer 49-Basen-langen, von zwei Primerbindungsstellen flankierten, variablen Sequenzregion eingesetzt (5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-N49-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3' SEQ ID NO: 95). Dieser wurde von der Firma Metabion (Martinsried, Deutschland) synthetisiert und HPLC-gereinigt erhalten.

Initial wurden 500 pmol des D1-Pools mit 80 μl (8 μg) immobilisiertem APC in einem Gesamtvolumen von final 160 μl in Selektionspuffer (1 × PBS, pH 7,4, 0,1% BSA, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Beads 1× mit 150 μl Selektionspuffer gewaschen und gebundene DNA bei 80°C in 55 μl Aqua eluiert. Der so selektierte Pool wurde anschließend mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in 5 getrennten 100 μl Reaktionen (jeweils 90 μl Mastermix + 10 μl Probe) unter Verwendung der Primer (HPLC-pure, Metabion) 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (forward, SEQ ID NO: 86) und 5'-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3' (Reverse, SEQ ID NO: 96), mit 5'-Biotin-Modifikation) amplifiziert und anschließend eine Einzelstrangtrennung durchgeführt. Hierzu wurden die PCR-Produkte über die an das 5'-Ende der Reverse-Primer gekoppelten Biotin-Moleküle an die bereits beschriebenen magnetischen Beads gebunden. Hierbei wurden die Beads (500 μl [5 mg] je Einzelstrangtrennung) zuerst 3× mit jeweils 1000 μl BW-Puffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1,0 M NaCl) gewaschen und anschließend in 500 μl 2 × BW-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 2,0 M NaCl) aufgenommen. Nach Zugabe der PCR-Produkte (5 × 100 μl) wurde diese Ansätze für 45 Minuten bei RT unter ständiger Bewegung inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Beads jeweils 2× mit BW-Puffer und 1× mit 2 × BW-Puffer gewaschen (jeweils 1000 μl) um nicht gebundene Bestandteile der PCR-Reaktionsmixe zu entfernen. Anschließend wurden die Beads in 50 μl 0,1 M NaOH aufgenommen und für 3 Minuten bei RT inkubiert. Nach der Immobilisierung der Beads wurden die in der NaOH-Lösung befindlichen Aptamere in ein neues Reaktionsgefäß überführt und der Vorgang mit weiteren 50 μl NaOH wiederholt. Zur Neutralisation des pH-Wertes wurde eine im Vorfeld optimierte Menge einer 0,1 molaren HCl-Lösung zu der Aptamer-Lösung pipettiert. Nach Durchführung der vorstehend beschriebenen Einzelstrangtrennung wurden 50 pmol der so gewonnenen Aptamere in den nächsten Selektionszyklus eingesetzt. Zur Erhöhung der Spezifität wurde ab der dritten Runde ein Counter-Selex gegen die verwendeten Streptavidin-Beads durchgeführt und die Anzahl der Waschschritte nach Bindung der Aptamere an das immobilisierte APC schrittweise erhöht. Aufgrund der durch die Selektion bedingten Anreicherung APC-bindender Aptamer-Sequenzen wurde die Anzahl der zur Amplifikation durchgeführten PCR-Zyklen nach jedem Selektionszyklus neu angepasst. Insgesamt wurden 12 Selektionszyklen durchgeführt. Eine Übersicht der während der Selektion variierten Parameter findet sich in Tabelle 1. Tabelle 1. Übersicht zu den gewählten Selektionsparametern

RundeEinsatz ssDNACounter-SELEXWaschschrittePCR-Zyklen[#][pmol][ja/nein][Anzahl][Anzahl]1500nein118250nein218350ja418450ja818550ja812650ja89750ja812850ja812950ja8111050ja8101150ja891250ja810

Beispiel 2Klonierung and Sequenzierung

Zur Analyse der Sequenzen der selektierten Aptamere wurde der nach 10 Selektionsrunden gewonnene Aptamer-Pool (Einzelstrang-DNA) re-amplifiziert (5 Zyklen mit Primern 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (forward, SEQ ID NO: 86) und 5'-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3' (Reverse, SEQ ID NO: 96), in 100 μl Reaktionsgesamtvolumen bei Einsatz von 0,75 pmol Einzelstrang-DNA) und die so hergestellten PCR-Produkte mittels TA-Cloning in pCR II-Vektoren (TA Cloning® Kit, Invitrogen) ligiert. Anschließend wurden chemisch kompetente E.coli-Zellen (XL-10 Gold, Stratagene) mit den Vektoren transformiert und auf LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Von den über Nacht bei Inkubation bei 37°C entstandenen colony forming units (CFU) wurde eine Auswahl in 5 ml Suspensionskulturen (LB mit 100 μg/ml Ampicillin) unter ständiger Bewegung über Nacht bei 37°C weiter vermehrt und die Vektoren nach Zentrifugation der Zellen bei 5.000 rpm/min für 15 min mittels des QIAprep Spin Mini Kit (Qiagen) aufgereinigt. Die Sequenzierung der Vektor-Inserts (Aptamer-Sequenzen) erfolgte unter Verwendung von M13-Sequenzierprimern mittels eines ABI 3130xl Genetic Analyzer.

Beispiel 3Bestimmung der Dissoziationskonstante KD einzelner an aktiviertes Protein C bindender Aptamere (Filterbindungstests)

Zur Überprüfung der APC-Bindungseigenschaften wurden die zu untersuchenden Aptamere mittels einer Polynukleotid-Kinase (PNK) am 5'-Ende mit 32p-ATP markiert. Hierzu wurden 5 pmol der Aptamere mit 10 μCi 32p-ATP in Anwesenheit von 10 U PNK in einem Gesamtvolumen von 10 μl für 45 min bei 37°C inkubiert. Zur Entfernung von ungebundenem 32p-ATP wurden die Ansätze anschließend mit 40 μl Aqua versetzt und über G25-Säulen (Microspin G-25 Colums, Amersham) aufgereinigt. Die so radioaktiv-markierten Aptamere wurden in einer Konzentration von final 0,4 nM in Selektionspuffer mit verschiedenen Konzentrationen an APC, ausgehend vont 100 nM und nachfolgende, halb-logarithmische Verdünnungsstufen, in einem Gesamtvolumen von 25 μl für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden jeweils 20 μl der Ansätze mittels eines Vakuumsystems über eine Nitrozellulose-Membran (Schleicher und Schuell, 0,45 μM) filtriert. Anschließend erfolgten mehrere Waschschritte (4 × 200 μl) mit Waschpuffer (1 × PBS, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) um überschüssige, nicht-proteingebundene Radioaktivität von der Membran zu entfernen. Die Aufnahme der jeweiligen Strahlungsintensitäten erfolgte mittels eines Phosphor-Screens. Zur Auswertung der Daten wurde ein FUJIFILM FLA-3000 mit entsprechender AIDA Imagequant Software verwendet. Durch nicht-lineare Regression der erhaltenen Datenpunkte, der gebundenen Radioaktivität über APC-Konzentration, konnten die einzelnen KDs ermittelt werden. Zur Berechnung wurde die Funktion ”Logistische Dosisantwort in Pharmakologie/Chemie” der Software Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA) verwendet.

Hinsichtlich der Bindung einzelner Aptamere an das zur Selektion verwendete Xigris® konnten mit der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise folgende KDs ermittelt werden: Versuchsserie 1: Testung einzelner Aptamer aus dem nach 10 Selektionsrunden erhaltenen Aptamer-Pool

Aptamer SEQ ID NO:HS02(SEQ ID NO: 58): 0,12 ± 0,02 nMHS03(SEQ ID NO: 70): 0,19 ± 0,03 nMHS04(SEQ ID NO: 49): 0,21 ± 0,02 nMHS08(SEQ ID NO: 83): 0,30 ± 0,09 nM
Versuchsserie 2: Testung von auf (SEQ ID NO: 58) basierenden Aptamer-VariantenAptamerSEQ ID NO:HS02-88(SEQ ID NO: 58): 0,43 ± 0,08 nMHS02-62(SEQ ID NO: 88): 0,56 ± 0,13 nMHS02-52(SEQ ID NO: 89): 0,35 ± 0,09 nMHS02-52G(SEQ ID NO: 90): 0,47 ± 0,11 nMHS02-48G(SEQ ID NO: 91): 0,40 ± 0,13 nMHS02-44G(SEQ ID NO: 92): 0,17 ± 0,06 nM

Es zeigte sich, dass die an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sehr gute Dissoziationskonstanten für die Bindung an aktiviertes Protein C aufwiesen.

Beispiel 4Bestimmung der Spezifität einzelner an aktiviertes Protein C bindender Aptamere

Die Ermittlung der APC-Spezifität der Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 erfolgte durch die Inkubation unterschiedlicher Konzentrationen von nativem APC (aus Plasma gereinigtes PC [Ceprotin®, Baxter], welches mit humanem alpha-Thrombin [Cellsystems, St. Katharinen, Deutschland] aktiviert wurde), PC (Ceprotin®), alpha-Thrombin (Cellsystems), Faktor VIIa (NovoSeven®, Novo Nordisk), Faktor Xa (Cellsystems) und FIXa (Cellsystems) mit radioaktiv-markierten Aptameren der Sequenzen SEQ ID NO: 58, 88 bis 92 und anschließendem Filterbindungsexperiment wie unter Beispiel 3 beschrieben. Hierbei wurde das native APC in einer halblogarithmischen Verdünnungsreihe startend von 100 nM und das Zymogen PC ebenfalls in einer halblogarithmischen Verdünnungsreihe allerdings startend von 1000 nM eingesetzt. Alpha-Thrombin, Faktor VIIa, Faktor Xa und FIXa wurden jeweils in Konzentrationen von 320 nM, 32 nM und 3,2 nM getestet.

Bis zu einer Konzentration von 320 nM konnte bezüglich Alpha-Thrombin, Faktor VIIa, Faktor Xa und FIXa keinerlei Bindung der Aptamere beobachtet werden. Zwar wurde eine Bindung aller Aptamere an PC beobachtet, die KDs waren jedoch nicht quantitativ bestimmbar, lagen aber in allen Fällen bei > 320 nM. Untersuchungen mit einem fluorogenen Peptidsubstrat lassen darauf schließen, dass ein zumindest ein Teil der beobachteten Bindung der Aptamere auf eine Verunreinigung des verwendeten PC (Ceprotin®) mit APC zurückzuführen ist.

Neben der Bindung an Xigris® konnte für die mit hoher Affinität bindenden HS02-Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 auch eine effektive Bindung an natives APC (aktiviertes Ceprotin®) bestätigt werden. Die ermittelten KDs lagen hierbei bei:

AptamerSEQ ID NO:HS02-88(SEQ ID NO: 58): 0,47 ± 0,06 nMHS02-62(SEQ ID NO: 88): 1,06 ± 0,23 nMHS02-52(SEQ ID NO: 89): 0,97 ± 0,18 nMHS02-52G(SEQ ID NO: 90): 0,74 ± 0,26 nMHS02-48G(SEQ ID NO: 91): 0,85 ± 0,06 nMHS02-44G:(SEQ ID NO: 92): 0,76 ± 0,10 nM

Es zeigte sich, dass die an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sehr gute Dissoziationskonstanten für die Bindung an natives aktiviertes Protein C aufwiesen.

Beispiel 5Versuche zur Inhibierung der APC-vermittelten Faktor Va-Inaktivierung

Zur Überprüfung der Inhibition der antikoagulatorischen APC-Aktivität durch die verschiedenen HS02-Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 wurden diese jeweils in aufsteigenden Konzentrationen in ein gereinigtes System zur Bestimmung der APC-vermittelten Inhibierung der FVa-Kofaktoraktivität eingesetzt. Hierbei wurde 625 pM FVa (Cellsystems) mit 18,3 pM APC (Xigris®) in Assay-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% BSA, 137 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 10 μg/ml Phospholipide) in Anwesenheit unterschiedlicher Aptamer-Konzentrationen (halblogarithmische Verdünnungsreihe startend von 180 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für 20 min bei RT inkubiert. Die Bestimmung der verbleibenden FVa-Kofaktor-Aktivität wurde unter Zuhilfenahme eines Plattenfluorometers (Ascent Fluoroscan, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Hierbei wurden jeweils 75 μl einer Lösung mit 42 pM humanem FXa (Cellsystems) and 667 μM eines fluorogenen Peptidsubstarts (Z-Gly-Gly-Arg-AMC, Bachem, Weil am Rhein, Deutschland) in die Vertiefungen von weißen C8 Fluoronunc-Modulen (Nunc, Thermo Fisher Scientific) vorgelegt und 25 μl des oben beschriebenen Testansatzes zugegeben. Unmittelbar vor Beginn der kinetischen Messung des Substratumsatzes (eine Messung pro Minute für 20 Minuten) erfolgte die Zugabe von 50 μl einer 25 nM Prothrombinlösung in Assay-Puffer (Cellsystems).

Durch nicht-lineare Regression der erhaltenen Datenpunkte (Cofaktor-Restaktivität über Aptamerkonzentration) wurden die nachfolgend dargestellten IC50-Werte erhalten:

AptamerSEQ ID NO:HS02-88(SEQ ID NO: 58): 0,58 ± 0,04 nMHS02-62(SEQ ID NO: 88): 1,20 ± 0,09 nMHS02-52(SEQ ID NO: 89): 0,70 ± 0,17 nMHS02-52G(SEQ ID NO: 90): 0,42 ± 0,16 nMHS02-48G(SEQ ID NO: 91): 0,36 ± 0,17 nMHS02-44G(SEQ ID NO: 92): 0,28 ± 0,11 nM

In den vorstehend beschriebenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Aptamere die funktionelle Aktivität von APC bezüglich der Inaktivierung von FVa mit niedrigen IC50-Werten zu inhibieren vermögen.

Beispiel 6Versuche zur Inhibierung der APC-vermittelten Faktor VIIIa-Inaktivierung

Zur weiteren Überprüfung der Inhibition der antikoagulatorischen APC-Aktivität durch die verschiedenen HS02-Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 wurden diese ebenfalls jeweils in aufsteigenden Konzentrationen in ein gereinigtes System zur Bestimmung der APC-vermittelten Inhibierung der FVIIIa-Kofaktoraktivität eingesetzt. Hierzu wurde 1 U rekombinanter FVIII (Recombinate®, Baxter) durch Inkubation mit 0,025 NIH-units humanem alpha-Thrombin (Cellsystems) für 2 min in PBS-Puffer (0,1% BSA) in einem Gesamtvolumen von 100 μl aktiviert. Zum Stoppen der Aktivierungsreaktion wurden dem Ansatz 5 μl einer 1,4 nM Hirudinlösung (Refludan®, Bayer Healthcare) zugegeben. Anschließend wurde der so aktivierte FVIII (FVIIIa) in einer finalen Konzentration von 0,16 U/ml mit 1,8 nM APC (Xigris®) in Assay-Puffer in Anwesenheit unterschiedlicher Aptamer-Konzentrationen (halblogarithmische Verdünnungsreihe startend von 180 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für 20 min bei RT inkubiert. Die Bestimmung der verbleibenden FVIIIa-Kofaktor-Aktivität wurde ebenfalls unter Zuhilfenahme eines Plattenfluorometers (FLx-800, Bio-Tek) durchgeführt. Hierbei wurden jeweils 75 μl einer Lösung von 3 nM humanem FIXa (Cellsystems) und 333 μM eines fluorogenen Peptidsubstarts (Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC, Bachem) in die Vertiefungen von schwarzen F16 Fluoronunc-Modulen (Nunc, Thermo Fisher Scientific) vorgelegt und 25 μl des oben beschriebenen Testansatzes zugegeben. Unmittelbar vor Beginn der kinetischen Messung des Substratumsatzes (eine Messung pro Minute für 20 Minuten) erfolgte die Zugabe von 50 μl einer 25 nM FXa-Lösung in Assay-Puffer (Cellsystems).

Durch nicht-lineare Regression der erhaltenen Datenpunkte (Cofaktor-Restaktivität über Aptamerkonzentration) wurden die nachfolgend dargestellten IC50-Werte erhalten:

AptamerSEQ ID NO:HS02-88(SEQ ID NO: 58): 1,27 ± 0,41 nMHS02-62(SEQ ID NO: 88): 0,88 ± 0,46 nMHS02-52(SEQ ID NO: 89): 2,46 ± 0,08 nMHS02-52G(SEQ ID NO: 90): 0,22 ± 0,15 nMHS02-48G(SEQ ID NO: 91): 1,06 ± 0,43 nMHS02-44G(SEQ ID NO: 92): 0,88 ± 0,11 nM

In den vorstehend beschriebenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Aptamere die funktionelle Aktivität von APC bezüglich der Inaktivierung von FVIIIa mit niedrigen IC50-Werten zu inhibieren vermögen.

Beispiel 7Versuche zur Bestimmung des Einflusses der APC-Aptamere auf die Inhibierung von APC durch den Protein-C-Inhibitor (PCI)

Zur Untersuchung des Einflusses der APC-Aptamere auf die Kinetik der Inhibierung von APC durch PCI wurde ein Testsystem im Mikrotiterplatten-Format eingesetzt. Hierbei wurden die Vertiefungen von weißen C8 Fluoronunc-Modulen (Nunc, Thermo Fisher Scientific) mit einem polyklonalen rabbit-anti human PC-Antikörper (Dako) in Beschichtungspuffer (30 mM Na2CO2, 200 mM NaHCO3, pH 9.0) bei 4°C über Nacht beschichtet (100 μl/Vertiefung). Anschließend wurden die Vertiefungen 3× mit Waschpuffer (1 × PBS, pH 7.4, 0.05% Tween 20) gewaschen (dies ist die in diesem Testverfahren standardmäßig eingesetzte Waschsequenz, durchgeführt mit einem automatischen Mikrotiterplatten-Washer [SLT, Tecan, Germany]) und freie Bindungsstellen mit Blockpuffer (1 × PBS, pH 7.4, 2% BSA, 0.05% Tween 20) für 2 h bei RT blockiert. Nach Waschen der Vertiefungen erfolgte die Zugabe von 100 μl/Vertiefung einer 360 pM APC (Xigris®)-Lösung in Verdünnungspuffer (1 × PBS, pH 7.4, 0,1% BSA, 0.05% Tween 20), welche für 1 h bei RT inkubiert und anschließend durch Waschen entfernt wurde. Zu dem nun in den Vertiefungen der Module immobilisierten APC erfolgte dann die Zugabe von 100 μl/Vertiefung Citrat-Poolplasma, welchem im Vorfeld jeweils die zu testenden Aptamere in einer Konzentration von final 100 nM zugegeben wurden. Es wurde ebenfalls ein Leerwert ohne Aptamere mitgeführt. Um die Bindung des im Poolplasma enthaltenen PCI an das in den Vertiefungen immobilisierte APC zu definierten Zeitpunkten zu stoppen, wurden die entsprechenden Vertiefungen nach verschiedenen Inkubationszeiten (5, 10, 20 und 30 min) standardmäßig gewaschen und mit 100 μl/Vertiefung Verdünnungspuffer befüllt. Nach Abschluss der Versuchsserie wurden alle Vertiefungen erneut gewaschen. Zur Bestimmung der in den Vertiefungen verbliebenden amidolytischen APC-Aktivität wurde anschließend ein fluorogenes Peptidsubstrat für APC (Pefa 3342, Pentapharm) in einer Konzentration von 200 μM in Verdünnungspuffer zugegeben (100 μl/Vertiefung) und die Kinetik der Substarthydrolyse mittels eines Plattenfluorometers (Ascent Fluoroscan, Thermo Fisher Scientific) erfasst. Die scheinbaren Inhibitionskonstanten (kapp) als Maß für die Geschwindigeit der Inhibierung des immoblisierten APC wurden aus den sich ergebenden Datensätzen mittels exponentieller Interpolation berechnet. Um die PCI-Spezifität des gefundenen Effekts nachzuweisen, wurden die Vertiefungen nach Aufnahme der Inhibitionskinetiken erneut gewaschen und anschließend 100 ul/Vertiefung eines POD-markierten polyklonalen anti-PCI-Antikörpers (Affinity Biologicals) in einer 1:2000 Verdünnung in Verdünnungspuffer zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurden die Vertiefung erneut gewaschen und 100 μl/Vertiefung eines Chemilumineszenz-Substrats (Roche) zugegeben. Die Intensität der freigesetzten Chemilumineszenz wurde nach einer Inkubationszeit von 3 min mit dem Ascent Fluoroscan bestimmt.

Nachfolgend sind die über den vorstehend dargestellen Immunoassay ermittelten, scheinbaren Inhibitionskonstanten (kapp) von immobilisiertem APC bei Anwesenheit der verschiedenen Aptamere der Sequenzen SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 (100 nM) in der Plasmamatrix dargestellt:

AptamerSEQ ID NO:HS02-88(SEQ ID NO: 58): 0,143 ± 0,012HS02-62(SEQ ID NO: 88): 0,095 ± 0,002HS02-52(SEQ ID NO: 89): 0,085 ± 0,006HS02-52G(SEQ ID NO: 90): 0,080 ± 0,002HS02-48G(SEQ ID NO: 91): 0,053 ± 0,000HS02-44G(SEQ ID NO: 92): 0,047 ± 0,000ohne Aptamer: 0,031 ± 0,000

In den Versuchsansätzen konnte die Bildung von APC/PCI-Komplexen als Ursache für die Inhibierung des APC nachgewiesen werden. Hierbei war die ermittelte Anzahl der gebildeten Komplexe proportional zu den gefundenen Inhibitionskonstanten.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.