Title:
Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden
Kind Code:
B4


Abstract:

Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer ist, umfassend wenigstens zwei an Thrombin bindende Aptamere und wenigstens einen Linker, wobei der wenigstens eine Linker die wenigstens zwei an Thrombin bindenden Aptamere verbindet, wobei das Thrombin-bindende Fusions-Aptamer eine Sequenz aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:




Inventors:
Mayer, Günter, Dr. (53123, Bonn, DE)
Müller, Jens, Dr. (53119, Bonn, DE)
Pötzsch, Bernd (Bonn, DE)
Application Number:
DE102007041476A
Publication Date:
03/30/2017
Filing Date:
08/31/2007
Assignee:
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, 53113 (DE)
International Classes:



Foreign References:
20060110739
5650275
WO1992014843A1
Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
Michalski Hüttermann & Partner Patentanwälte mbB, 40221, Düsseldorf, DE
Claims:
1. Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer ist, umfassend wenigstens zwei an Thrombin bindende Aptamere und wenigstens einen Linker, wobei der wenigstens eine Linker die wenigstens zwei an Thrombin bindenden Aptamere verbindet, wobei das Thrombin-bindende Fusions-Aptamer eine Sequenz aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

2. Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die an Thrombin bindenden Aptamere Modifikationen aufweisen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder die Aptamere modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen.

3. Verwendung von Thrombin-bindenden Fusions-Aptameren nach Anspruch 1 oder 2, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.

4. Verwendung von Thrombin-bindenden Fusions-Aptameren nach Anspruch 1 oder 2, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus arterielle oder venöse Thrombosen, insbesondere akuter Myokard- und Hirninfarkts oder Lungenembolien und/oder thromboembolischen Komplikationen, insbesondere als Blutgerinnungshemmer.

5. Arzneimittel umfassend wenigstens ein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer nach Anspruch 1 oder 2.

Description:

Die Erfindung betrifft Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden, wobei das Aptamer ein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer ist.

Die Schrift US 2006/0110739 A1 beschreibt Biosensoren zum Nachweis von Makromolekülen und anderen Analyten. Generell werden molekulare Biosensoren beschrieben. Insbesondere werden molekulare Biosensoren beschrieben, die ein oder mehrere Aptamere aufweisen. Die molekularen Biosensoren sind in verschiedenen Verfahren verwendbar, einschließlich der Identifizierung und Quantifizierung von Zielmolekülen.

Eine Aufgabe der Erfindung war es, Thrombin-inhibierende Aptamere zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamerein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer ist, umfassend wenigstens zwei an Thrombin bindende Aptamere und wenigstens einen Linker, wobei der wenigstens eine Linker die wenigstens zwei an Thrombin bindenden Aptamere verbindet, wobei das Thrombin-bindende Fusions-Aptamer eine Sequenz aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Unter dem Begriff ”Aptamer” sind im Sinne dieser Erfindung Oligonukleotide zu verstehen, die spezifisch und mit hoher Affinität an ein Zielmolekül, insbesondere an ein an der Hämostase beteiligtes Zielprotein wie aktiviertes Protein C oder Thrombin, binden.

Unter dem Begriff ”Fusions-Aptamer” sind im Sinne dieser Erfindung Aptamerkonstrukte zu verstehen, die wenigstens zwei gleiche oder unterschiedliche Aptamersequenzen und wenigstens einen die Aptamersequenzen verbindenden Linker oder Spacerregion aufweisen.

Überraschender Weise konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere eine unerwartet starke Inhibtion von Thrombin zeigen können. Insbesondere konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere eine unerwartet hohe inhibierende Wirkung auf die durch Thrombin vermittelte Blutgerinnung aufweisen.

Beispielsweise konnte zur Thrombin-inhibierenden Wirkung der erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere festgestellt werden, dass eine Blutgerinnung bei einer Verwendung erfindungsgemäßer Thrombin-bindender Fusions-Aptamere bereits bei einer 30-fach geringeren Konzentrationen gegenüber einzelnen Aptameren gehemmt werden konnte.

Erfindungsgemäße Thrombin-bindende Fusions-Aptamere können eine DNA- oder eine RNA-Sequenz aufweisen. Vorzugsweise weisen Thrombin-bindende Fusions-Aptamere eine DNA-Sequenz auf. Aptamere auf DNA-Basis besitzen in vorteilhafter Weise eine erhöhte Stabilität.

Weiterhin geeignet sind Aptamere, die eine Sequenz umfassend 2'-modifizierte Nukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide, aufweisen. Auch geeignet sind Aptamere, die 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide, aufweisen. Weiterhin können Aptamere Desoxyribonukleotide und 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluor-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide aufweisen.

In bevorzugten Ausführungsformen des Thrombin-bindendes Fusions-Aptamers umfasst das Fusions-Aptamer:

  • – zwei an Thrombin bindende Aptamere; und
  • – ein Linker, wobei der Linker jeweils zwei an Thrombin bindende Aptamere verbindet.

Vorzugsweise weisen die an Thrombin bindenden Aptamere eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend: und/oder Hierbei können die an Thrombin bindenden Aptamere Modifikationen aufweisen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer kann modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide, aufweisen.

Bevorzugt verwendbare an Thrombin bindende Aptamere binden an die Exosites 1 und 2 von Thrombin.

Besonders bevorzugte Linker sind so genannte Poly A-Linker.

Es konnte überraschend festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere eine besonders gute Affinität zu Thrombin aufweisen können, deren Linker überwiegend das Nukleotid Adenosin enthalten oder aus dem Nukleotid Adenosin ausgebildet sind.

Die an Thrombin bindenden Aptamere können Modifikationen aufweisen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder die Aptamere modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen können.

Eine weitere bevorzugte chemische Modifikation ist beispielsweise die Anfügung einer so genannten ”3'-CAP”- oder ”5'-CAP”-Struktur, eines modifizierten Guanosin-Nukleotids (7-Methyl-guanosin) an das 3'-Ende oder 5'-Ende. Die Modifikation des 3'-Endes oder 5'-Endes kann das Fusions-Aptamer in vorteilhafter Weise vor einem schnellen Abbau durch Nukleasen, insbesondere in einem Organismus oder einer biologischen Probe schützen.

In anderen Ausführungsformen kann insbesondere das 5'-Ende des Fusions-Aptamers pegyliert sein. Eine 5'-PEG-Modifikationen kann beispielsweise wenigstens eine Polyethylenglykol-Einheit umfassen, bevorzugt im Bereich von 1 bis 900 Polyethylenglykol-Einheiten, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 450 Polyethylenglykol-Einheiten auf. Bevorzugt verwendbar sind lineare Polyethylenglykol(PEG)-Einheiten HO-(CH2CH2O)n-H, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 900, bevorzugt im Bereich von 1 bis 450 ist.

Eine Verabreichung der erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten ermöglicht in vorteilhafter Weise eine therapeutische Beeinflussung der Aktivität von Thrombin.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert.

Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere verwendbar als Blutgerinnungshemmer oder Antikoagulantien.

Überraschend konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere sehr wirksame Blutgerinnungshemmer sind. Insbesondere konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamer SEQ ID NO: 98 eine deutlich höhere Wirkung auf die durch Thrombin vermittelte Blutgerinnung aufweisen, als eine Kombination der Einzelaptamere SEQ ID NO: 95 und SEQ ID NO: 97.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Thrombin-bindendes Fusions-Aptamers, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von erfindungsgemäßen Thrombin-bindendes Fusions-Aptameren, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert, insbesondere als Blutgerinnungshemmer.

Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend arterielle oder venöse Thrombosen, insbesondere akuter Myokard- und Hirninfarkt oder Lungenembolien, und/oder thromboembolischen Komplikationen.

Erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere sind insbesondere geeignet zur Therapie von arteriellen Thrombosen, insbesondere des akuten Myokard- und Hirninfarkts und Sekundärprophylaxe von thromboembolischen Komplikationen nach gefäßrekonstruktiven Eingriffen. Erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere sind weiterhin geeignet zur systemischen Antikoagulation zur Verwendung bei extrakorporalen Therapieverfahren, insbesondere Herz-Lungen-Maschine, Hämodialyse und Hämofiltrationsverfahren. Erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere sind auch geeignet zur Verwendung in der Akuttherapie von venösen Thrombosen, insbesondere akuten Lungenembolien.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel umfassend wenigstens ein erfindungsgemäßes Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer. Das Arzneimittel umfasst erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere vorzugsweise als pharmakologisch akzeptables Salz, bevorzugt als Salze anorganischer Säuren, beispielsweise Phosphorsäure, oder als Salze organischer Säuren beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure. Das Arzneimittel kann weiterhin pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffen und/oder Träger umfassen.

In vorteilhafter Weise ist das Arzneimittel zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert, insbesondere als Blutgerinnungshemmer, geeignet.

Das Arzneimittel ist oral, transmucosal, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral verabreichbar. Bevorzugt ist eine Verabreichung durch Injektion.

Wenn nicht anders ausgeführt, weisen die verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung auf, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.

Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und weiteren hier angegebenen Literaturangaben sind voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen.

Beispiele, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.

Beispiel 1Versuche zur Blutgerinnungshemmung durch das Thrombin-bindende Fusions-Aptamer der Sequenz SEQ ID NO: 98

Die Thrombin-inhibierende Wirkung des Thrombin-bindenden Fusions-Aptamers der Sequenz 5'-GGTTGGTGTGGTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3' (SEQ ID NO: 98) wurde in einem einschrittigen Thrombin-basierten Gerinnungstest unter Verwendung eines Amelung-Coagulometer AMAX CS 190 (Amelung, Lemgo) bestimmt.

Hierzu wurde humanes α-Thrombin (CellSystems, St. Katharinen) in PBS (pH 7,4; 3 mM MgCl2, 0,1% BSA) auf eine Konzentration von 2,5 NIH Einheiten/ml (NIH = National Institute of Health, USA; definiert biologische Einheiten) verdünnt und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Thrombin-bindenden Fusions-Aptamers der Sequenz SEQ ID NO: 98 sowie den Aptameren der Sequenzen SEQ ID NO: 95 und SEQ ID NO: 97 versetzt, wobei eine halblogarithmische Verdünnungsserie startend von 1500 nM verwendet wurde.

Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten bei at 37°C wurden 25 μl der Reaktionsmischung zu 50 μl humanem Citrat-Poolplasma (eigene Herstellung) gegeben und die Zeit bis zur Gerinnung der Testansätze bestimmt.

Es konnte festgestellt werden, dass die Gerinnung bei Zugabe des Thrombin-bindenden Fusions-Aptamers der Sequenz SEQ ID NO: 98 bereits bei einer 30-fach geringeren Konzentrationen gegenüber dem Aptamer der Sequenz SEQ ID NO: 95 gehemmt wurde.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.