Title:
Proteinnachweis und -quantifizierung mit Hilfe von Hydroxychinolon-Farbstoffen
Kind Code:
A1


Abstract:

Eine Hydroxychinolonverbindung, die als ein fluoreszierender Farbstoff zum/zur Proteinnachweis, -test, -quantifizierung etc. formuliert ist. Die Hydroxychinolonverbindung kann modifiziert sein, zum Beispiel durch Hinzufügen oder Entfernen von Sulfatgruppen, durch Abändern der Kohlenwasserstoffkettenlängen etc., was zu wünschenswerteren Eigenschaften führt, wie der verbesserten Bindung an basischen Proteinen, verbesserter Löslichkeit etc. Der Farbstoff weist eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber im Handel verfügbaren Proteinanfärbungen auf und kann verwendet werden, um Proteine in Lösung, auf Gelen aufgetrennte Proteine, auf feste Träger übertragene Proteine etc. anzufärben. Verfahren zur Verwendung der Farbstoffe werden ebenfalls beschrieben.




Inventors:
Desai, Surbhi (Rockford, Ill., US)
Wolf, Brian (Machesney Park, Ill., US)
Lehmann, Frank (Jena, 07749, DE)
Wenzel, Matthias (Jena, 07749, DE)
Schweder, Bernd (Jena, 07743, DE)
Czerney, Peter (Weimar, 99425, DE)
Application Number:
DE102007025546
Publication Date:
08/14/2008
Filing Date:
05/31/2007
Assignee:
Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill., US)
International Classes:



Attorney, Agent or Firm:
Patentanwälte von Kreisler, Selting, Werner et col. (Köln, 50667)
Claims:
1. Zusammensetzung, umfassend mindestens einen Exzipienten und eine Verbindung, gewählt aus der Gruppe, die aus den Verbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4, und Nr. 5 und Modifikationen und Kombinationen davon besteht, in einer Konzentration im Bereich von etwa 25 nMol/L bis etwa 200 nMol/L, wobei die Verbindung Nr. 1 die Verbindung Nr. 2 die Verbindung Nr. 3 die Verbindung Nr. 4 und die Verbindung Nr. 5

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung modifiziert ist, um mindestens eine einer nicht-sulfonierten Verbindung, einer mono-sulfonierten Verbindung, einer disulfonierten Verbindung oder einer trisulfonierten Verbindung zu erhalten.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung modifiziert ist, um einen N-substituierten Hydroxychinolonring zu erhalten, wobei die N-Substitution aus mindestens einem von Alkylsulfonat, H oder einem C1-C10-Kohlenwasserstoff gewählt ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung modifiziert ist, um mindestens eines aus Alkylsulfonat-substituiertem N im Indolring oder Sulfonat-substituiertem C im Benzolring zu erhalten.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung modifiziert ist, um einen 7-N-monoalkylierten C4-C10-Kohlenwasserstoff oder ein 7-N,N-dialkyliertes C4-C10-Kohlenwasserstoffamin, gebunden an den Benzolring des Hydroxychinolons, zu erhalten.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung modifiziert ist, um ein 7-N,N-Di-hexylamin, gebunden an den Hydroxychinolonring, zu erhalten.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Exzipient aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Buffer, einer Solubilisierungsverbindung, einer Stabilisatorverbindung, Benzaldehyd, Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylalkohol (PVA) oder Kombinationen davon besteht.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Exzipient mindestens eine OH-Gruppe enthält.

9. Verfahren zum Anfärben mindestens eines Proteins, wobei das Verfahren das Anwenden einer Zusammensetzung, die mindestens eine der Verbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4, Nr. 5 und Modifikationen davon in einer wirksamen Konzentration und mindestens einen Exzipienten umfasst, auf ein Protein unter Bedingungen, die zur Bindung der Verbindung an das Protein ausreichend sind, und
das Nachweisen der Protein-gebundenen Verbindung, wobei die Verbindung Nr. 1 die Verbindung Nr. 2 die Verbindung Nr. 3 die Verbindung Nr. 4 und die Verbindung Nr. 5

10. Verfahren vom Anspruch 9, wobei das Protein ein Polypeptid einschließt.

11. Verfahren vom Anspruch 9, wobei das Protein auf einem festen Träger, in einem Gel und/oder in Lösung ist.

12. Verfahren vom Anspruch 9, wobei das Protein durch Fluoreszenz nachgewiesen wird.

13. Verfahren vom Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung auf das Protein etwa 5 Minuten bis etwa 18 Stunden angewendet wird.

14. Verfahren vom Anspruch 9, wobei die Konzentration der Verbindung im Bereich von etwa 25 nMol/L bis etwa 200 nMol/L beträgt.

15. Verfahren vom Anspruch 9, wobei die Konzentration der Verbindung entweder etwa 1,65 μM beträgt, was zu einer 10×-Lösung führt und die 10×-Lösung zu einer 1×-Lösung vor der Anwendung auf das Protein verdünnt wird, oder die Konzentration der Verbindung etwa 165 nM beträgt, was zu einer 1×-Lösung führt, die auf das Protein angewandt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Modifikation aus der Gruppe gewählt wird, die aus Folgendem besteht:
(a) mindestens einer aus einer nicht-sulfonierten Verbindung, einer mono-sulfonierten Verbindung, einer disulfonierten Verbindung oder einer trisulfonierten Verbindung
(b) einem N-substituierten Hydroxychinolonring, wobei die N-Substitution aus mindestens einem von Alkylsulfonat, H oder einem C1-C10-Kohlenwasserstoff gewählt ist;
(c) mindestens eines aus Alkylsulfonat-substituiertem N im Indolring oder Sulfonat-substituiertem C im Benzolring;
(d) mindestens einem C4-C10-Kohlenwasserstoff am N, gebunden in einer 7-Position des Benzolringes des Hydroxychinolons;
(e) 7-N,N-Di-hexylamin, gebunden an dem Hydroxyl-Hydroxychinolonring;
und Kombinationen davon.

17. Verfahren vom Anspruch 9, wobei der Exzipient aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Buffer, einer Solubilisierungsverbindung, einer Stabilisatorverbindung, Benzaldehyd, Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylalkohol (PVA) oder Kombinationen davon besteht.

Description:
GEBIET DER ERFINDUNG

Verwendungen von Hydroxychinolonverbindungen als fluoreszierende Farbstoffe für den/die Proteinnachweis und -quantifizierung.

HINTERGRUND

Proteine, die durch Elektrophorese in einem Gel aufgetrennt wurden, oder nach einer Übertragung auf eine Membran, sind herkömmlicherweise unter Verwendung von sichtbaren organischen Farbstoffen nachgewiesen worden. Die Nachweisgrenze unter Verwendung chromogener Farbstoffe, wie Coomassie G250 oder Coomassie R250 liegt allgemein im Bereich von 1 ng bis 10 ng. Fluoreszenzverfahren zum Proteinnachweis liefern gute Empfindlichkeiten und Vervielfachungs- bzw. Multiplexing-Möglichkeiten. Zum Beispiel ermöglichen sie den Nachweis eines post-translational modifizierten Proteins, wie eines Glycoproteins mit einem spezifischen Färbemittel, in Kombination mit einem Gesamtproteinfärbemittel. Solche fluoreszierenden Farbstoffe und ihre Verfahren der Verwendung bei dem/der Proteinnachweis und -quantifizierung sind erwünscht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die 1 zeigt die Struktur einer mit Nr. 1 bezeichneten Hydroxychinolonverbindung (V08-05106).

Die 2 zeigt die Struktur einer anderen mit Nr. 2 bezeichneten Hydroxychinolonverbindung (V07-05155).

Die 3 zeigt die Struktur einer anderen mit Nr. 3 bezeichneten Hydroxychinolonverbindung (V07-05158).

Die 4 zeigt die Struktur einer anderen mit Nr. 3 bezeichneten Hydroxychinolonverbindung (V07-05165).

Die 5 zeigt die Struktur einer weiteren mit Nr. 5 bezeichneten Hydroxychinolonverbindung (V10-01018).

Die 6 zeigt die Verwendung von Hydroxychinolonverbindungen als Farbstoffe zum Anfärben von Aminosäuren und Proteinen, die auf Membranen aufgetupft wurden.

Die 7 zeigt die Verwendung von Hydroxychinolonverbindungen als Farbstoffe zum Anfärben von Proteinen, die auf Gelen aufgetrennt wurden.

Die 8 zeigt die Absorptions- und Emissionsspektren einer Hydroxychinolonverbindung.

Die 9 zeigt die Verwendung von einer Hydroxychinolonverbindung als ein Farbstoff zum Nachweisen eines weiten Bereichs an im Handel verfügbaren Proteinstandards, die auf Polyacrylamidgelen aufgetrennt wurden.

Die 10 zeigt die Verwendung von einer Hydroxychinolonverbindung als ein Farbstoff zum Nachweisen von Proteinen von Zelllysaten unter Verwendung von HeLa-Zellen (10A) und Rattenherzgewebe (10B).

Die 11 zeigt die Verwendung von einer Hydroxychinolonverbindung als ein Farbstoff und von im Handel verfügbaren Proteinfarbstoffen zum Nachweisen von Proteinen, die auf Gelen durch zweidimensionale Elektrophorese aufgetrennt wurden.

Die 12 ist eine grafische Darstellung des Fluoreszenz-Outputs unter Verwendung von einer Hydroxychinolonverbindung als ein Farbstoff gegen die Proteinkonzentration unter Verwendung von hochmolekulargewichtigen Proteinen (12A), von Phosphoproteinen (12B), von Glycoproteinen (12C) und von niedermolekulargewichtigen Proteinen (12D).

Die 13 zeigt matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisierungs-Massenspektren (MALDI-MS) von Proteinen, die durch Hydroxychinolon-Farbstoffe (13A, 13C) und durch ein im Handel verfügbares Färbemittel (13B, 13D) angefärbt wurden.

Die 14 zeigt die Inkubationszeiten zum Anfärben von Proteinen unter Verwendung einer Hydroxychinolonverbindung als Farbstoff und von anderen im Handel verfügbaren fluoreszierenden Proteinfärbemitteln.

Die 15 zeigt die Anwendung von Hydroxychinolon-Farbstoffen zum Nachweisen eines weiten Bereichs von Proteinen mit mehrfachen Polyacrylamidgel-Formaten (15A, 15B, 15C, 15D).

Die 16 zeigt Gele, auf welchen Protein und Nukleinsäure aufgetrennt wurden und durch Ethidiumbromid (16A) und Hydroxychinolon-Farbstoffe (16B) angefärbt wurden.

Die 17 zeigt Gele, auf welchen Proteine aufgetrennt wurden, durch Hydroxychinolon-Farbstoffe angefärbt wurden und durch zwei Bildgebungsmodalitäten dargestellt wurden (17A, 17B).

Die 18 zeigt Gele, auf welchen Proteine getrennt wurden und durch einen Hydroxychinolon-Farbstoff und kommerzielle Farbstoffe angefärbt wurden.

Die 19 zeigt ein Gel (19A) und eine Grafik (19B) von relativen Fluoreszenzintensitäten für mit einem Hydroxychinolon-Farbstoff und kommerziellen Farbstoffen angefärbte Proteine.

Die 20 zeigt die Empfindlichkeit von einem Hydroxychinolon-Farbstoff zum Nachweisen von durch Elektrophorese aufgetrennten Proteinen.

Die 21 zeigt einen Proteine anfärbenden Hydroxychinolon-Farbstoff, die durch Elektrophorese auf zwei verschiedenen Gelen aufgetrennt wurden (21A, 21B).

Die 22 zeigt einen weiteren Proteine anfärbenden Hydroxychinolon-Farbstoff, die durch Elektrophorese auf zwei verschiedenen Gelen aufgetrennt wurden (22A, 22B).

Die 23 zeigt einen Proteine anfärbenden Hydroxychinolon-Farbstoff, die durch Elektrophorese unter unterschiedlichen Bedingungen aufgetrennt wurden.

Die 24 zeigt die Verwendung einer Hydroxychinolonverbindung zum Nachweisen von Proteinen in Lösung in einem Multimuldenformat.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Diese Anmeldung enthält mindestens eine in Farbe angefertigte Zeichnung. Ein Gesuch gemäß 37 C.F.R. §1.84, in dem die Annahme der Farbzeichnungen beantragt wird, wird separat am selben Datum hiermit eingereicht. Kopien dieses Patents oder der Veröffentlichung der Patentanmeldung mit Farbzeichnung(en) werden vom Amt auf Antrag und nach Bezahlung der erforderlichen Gebühr zu Verfügung gestellt.

Ein Verfahren wird offenbart unter Verwendung einer Familie von substituierten Hydroxychinolonverbindungen, die als die Verbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 5 bezeichnet sind bzw. in den 1, 2, 3, 4 und 5 gezeigt sind, und von Modifikationen dieser Verbindungen, wie im Anschluss beschrieben, die als fluoreszierende Farbstoffe (auch als Anfärbungen bezeichnet) für den Nachweis, die Quantifizierung, die Anfärbung, das Assay etc. von Proteinen formuliert und verwendet werden. Diese als Farbstoffe formulierten Hydroxychinolonverbindungen, auch als Hydroxychinolon-Farbstoffe bezeichnet, weisen Proteine und/oder Aminosäuren mit einer Empfindlichkeit von weniger als 1 ng nach. Die Fluoreszenz von Hydroxychinolon-Farbstoffen nimmt zu, wenn der Farbstoff an Protein gebunden ist. Solche Farbstoffe führen zu einer erhöhten Empfindlichkeit, leichten Anwendung, einem verringerten Hintergrund und genaueren Resultaten gegenüber anderen Proteinnachweis und -assayreagenzien, wie Komplexen auf Schwermetallbasis.

Das offenbarte Verfahren umfasst jede qualitative und/oder quantitative Bestimmung des Vorhandenseins, der Charakterisierung, der Funktion etc. von einem oder mehreren Peptiden und/oder Proteinen. Ein oder mehrere Hydroxychinolon-Farbstoffe binden an Proteinen in Lösung oder Proteinen, die von einer Mischung getrennt wurden. Proteine können durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt werden, gefolgt von einer Wasch-/Fixier-Prozedur, und in dem Gel nachgewiesen und/oder untersucht werden. Alternativ können aufgetrennte Proteine auf eine Membran übertragen werden und in der Membran nachgewiesen und/oder aufgetrennt werden. Weiterhin können diese Farbstoffe zur Quantifizierung von Proteinen in Lösung verwendet werden.

Eine Lösung des/der Hydroxychinolon-Farbstoff(e) wird auf aufgetrennte Proteine angewendet oder einer Proteinlösung hinzugefügt und für eine ausreichende Zeit zum Anfärben der Proteine inkubiert. In einer Ausführungsform kann die Inkubation etwa eine Stunde dauern. Nach der Inkubation werden der/die an Proteine gebundene(n) Hydroxychinolon-Farbstoff(e) direkt oder indirekt und durch jedes beliebige Verfahren (z. B. visuell, durch qualitatives und/oder quantitatives Abtasten mit Hilfe eines Fluoreszenz-Bildgebungssystems etc.) nachgewiesen. In Ausführungsformen, in denen Proteine aufgetrennt werden, wird das Gel oder die Membran mit Wasser oder einer verdünnten Alkohol/Säure-Mischung vor der Farbstoffinkubation gewaschen.

Modifikationen der Verbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 5 sind von dem Verfahren umfasst, wie von einem Fachmann auf dem Gebiet anerkannt wird. Modifikationen schließen Substitutionen, Derivate, Additionen, Deletionen etc. von einem oder mehreren Verbindungsbestandteilen und/oder Salz ein und können in der Hydroxychinolonstruktur, dem Indolring, dem Benzolring, den Kohlenwasserstoffketten, den Sulfonatgruppen etc. vorhanden sein. In einer Ausführungsform sind die offenbarten Hydroxychinolonverbindungen zum Nachweis in der sichtbaren und/oder Infrarot-(IR-)Region des elektromagnetischen Spektrums modifiziert. Zum Beispiel führt eine Erhöhung der Länge des Alken-Linkers zwischen Ringstrukturen zu einer Verbindung, die, wenn sie als ein Farbstoff formuliert ist, in der IR-Region nachweisbar ist. In einer weiteren Ausführungsform können die Hydroxychinolonverbindungen nicht-, mono-, di- oder trisulfoniert sein. In einer weiteren Ausführungsform kann Stickstoff in dem Hydroxychinolonring mit H, Methyl, Ethyl oder anderen Kohlenwasserstoffketten oder einer Sulfonatgruppe substituiert sein. In einer weiteren Ausführungsform kann Stickstoff in dem Indolring und/oder Kohlenstoff in dem Benzolring mit Alkylsulfonat- oder Sulfonatgruppen substituiert sein, was zu einem Farbstoff mit einer erhöhten Polarität führt. In einer weiteren Ausführungsform erhöht das Hinzufügen langer Kohlenwasserstoffketten auf dem Stickstoff, gebunden an den Benzolring des Hydroxychinolons, dessen Polarität und erhöht damit die Empfindlichkeit des Farbstoffs. In einer weiteren Ausführungsform erhöht die Hinzufügung einer N,N-Di-hexylamino-Funktion an der 7-Position zu dem Hydroxychinolonring die Bindung des Farbstoffs und führt zu einem verstärkten Anfärben von hydrophoben Aminosäuren.

Ausgewählte physikalische Charakteristika der in den 1-5 gezeigten Hydroxychinolon-Farbstoffe sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

MGMolare Extinktion ε (in MeOH)Extinktion Max. λabs (in MeOH)Emission Max. λem (in MeOH)Verbindung Nr. 1 (V08-05106)611,67 g/Mol110 000 Mol–1cm–1508 nm560 nmVerbindung Nr. 2 (V07-05155)882,04 g/Mol65 000 Mol–1cm–1516 nm598 nmVerbindung Nr. 3 (V07-05158)754,03 g/Mol107 000 Mol–1cm–1513 nm580 nmVerbindung Nr. 4 (V07-05165)751,94 g/Mol105 000 Mol–1cm–1513 nm580 nmVerbindung Nr. 5 (V10-01018)639,73 g/Mol80 000 Mol–1cm–1513 nm580 nm

Die 6 zeigt das Anfärben von Aminosäuren und Proteinen auf Membranen unter Verwendung von Hydroxychinolon-Farbstoffen, welchen hydrophobe Alkyl- und Alkylsulfonatgruppen hinzugefügt wurden. Die 6A zeigt das Anfärben von Polymeren von einzelnen Aminosäuren (z. B. Polyalanin, Polyhistidin, Polylysin etc.) und Proteinen. Ausgewählte Proteine von einzelnen Aminosäuren (200 ng/Tupffleck) und Proteinen (500 ng/Tupffleck, 50 ng/Tupffleck, 5 ng/Tupffleck und 0,5 ng/Tupffleck) wurden auf Nitrocellulose-Membranen aufgetupft (für Aminosäuren: ALA-Alanin; ARG-Alanin; ARG-Arginin; ASN-Asparagin; ASP-Asparaginsäure; HIS-Histidin; LYS-Lysin; TYR-Tyrosin; TRP-Tryptophan; für Proteine BSA-Rinderserumalbumin; HRP-Meerrettichperoxidase; Lys-Lysozym). Die Membranen wurden mit den Hydroxychinolon-Farbstoffen, gelöst in Wasser mit 100 ng/ml, angefärbt. Die 6B ist eine Grafik, welche die Hintergrundanfärbung von Farbstoffen zeigt, welche die Verbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 bzw. Nr. 4 enthalten. Die 6C ist eine Kurve bzw. Graphik, welche die relativen Intensitäten für diese Farbstoffe zeigt.

Jeder der Hydroxychinolon-Farbstoffe (Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4, Nr. 5) färbte basische Aminosäuren an (Lysin, Histidin und Arginin). Mit der Hinzufügung der 7-N,N-Dihexylamino-Funktion zu dem Hydroxychinolonring oder anderen hydrophoben Alkylketten (Verbindungen Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4) banden die Farbstoffe auch schwach an hydrophobe Aminosäureseitenketten (6A). Farbstoffe, die hydrophobe Alkylketten enthielten (7-N,N-Dihexylamino-substituierte Verbindungen Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4) hatten eine geringere variable Protein-zu-Protein-Anfärbung, weil die Farbstoffe an ein breiteres Spektrum von Aminosäureseitengruppen banden. Das Hinzufügen von hydrophoben Alkylgruppen und Alkylsulfonaten (wie bei der Verbindung Nr. 2) zu der Hydroxychinolon-Grundstruktur (Verbindung Nr. 1) verstärkte die Proteinbindung und verringerte das Hintergrundsignal (Farbstoffbindung an einem Polyacrylamidgel oder Nitrocellulose-Membran). Die Verbindungen Nr. 3 und Nr. 4 haben eine hydrophobe 7-N,N-Dihexylamino-Funktion an der 7-Position, die zu einem erhöhten Binden an hydrophoben Aminosäuren führte (rote Kästchen in 6A) und die Fähigkeit zum Nachweis von Tupfflecken, die 0,5 ng Lysozym enthielten. Jedoch war der Hintergrund höher mit den Verbindungen Nr. 3 und Nr. 4 (6B) im Vergleich mit den Verbindungen Nr. 1 und Nr. 2.

Die Hinzufügung von N-Alkylsulfonatgruppen, zum Beispiel in der Verbindung Nr. 2, verringerte die Hintergrundanfärbung. Der Verbindung Nr. 1 mangelt es an einer hydrophoben 7-N,N-Dihexylamino-Funktion. Ohne durch eine spezifische Theorie gebunden zu sein, kann die Hinzufügung von Sulfonaten bewirken, dass die Verbindung insgesamt hydrophiler ist, was zu einem geringeren Hintergrund und einer reduzierten Nachweisempfindlichkeit führt (etwa 50 ng). Die Verbindung Nr. 2 bietet ein Gleichgewicht zwischen den hydrophoben Alkylketten und Sulfonaten durch Hinzufügen eines dritten Sulfonats durch eine auf dem Hydroxychinolonring-Stickstoff substituierte Sulfoalkylgruppe. Die Verbindung Nr. 2 zeigte einen verminderten Hintergrund (6B) im Vergleich mit den Verbindungen Nr. 3 und Nr. 4 und einen erhöhten Nachweis gegenüber der Verbindung Nr. 1 (6A, 6C). Zum Nachweis von Proteinen auf einer Membran zeigte die Verbindung Nr. 2 den geringsten Hintergrund mit der höchsten Fluoreszenzintensität unter allen bewerteten Verbindungen (6C).

Der Nachweis von Proteinen auf einem Gel im Anschluss an die Elektrophorese wurde bewertet. Ein Protein-Standard, welcher Myosin, Phosphorylase B, Rinderserum Albumin; Meerrettichperoxidase, Carboanhydrase, Myokinase, Sojabohnentrypsininhibitor und Lysozym enthielt, wurde reihenverdünnt. Die Proteine in dem Standard wurden durch Elektrophorese in 4–20% Precise Tris-HEPES(Pierce)-Gelen aufgetrennt und mit den Hydroxychinolonverbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4, verdünnt in Wasser zu 100 ng/ml, angefärbt (7). Die Verbindung Nr. 2 zeigte unter den bewerteten Verbindungen den höchsten Nachweis von Proteinen auf Membranen. Die Verbindung Nr. 2 hatte einen zweifach verringerten Nachweisgrad, etwa 2 ng, im Vergleich mit der Verbindung Nr. 4, welche die empfindlichste (0,5 ng) unter den auf Gelen bewerteten Verbindungen war. Die Verbindung Nr. 4 zeigte einen leichten Anstieg beim Hintergrundsignal, doch beeinträchtigte dies nicht das Nachweisen und Sichtbarmachen von Proteinbanden.

Die Verbindung Nr. 1 war in der Lage, Proteine mit einer Empfindlichkeit von 3,9 ng nachzuweisen, während sie einen relativ geringen Hintergrund zeigte (20). Die Verbindung Nr. 2 in einer Konzentration von 100 ng/ml in 50 mM Natriumpropionat, pH-Wert 4, war in der Lage, Proteine mit einer Empfindlichkeit von mindestens 0,25 ng nachzuweisen, wenn Proteine durch Elektrophorese auf einem 4–20% Tris-Glycin-Gel (Invitrogen) aufgetrennt wurden, gefolgt von einer zweistündigen Entfärbung in Wasser (21A). Unter Verwendung der gleichen Konzentration war die Verbindung Nr. 2 in der Lage, Proteine mit einer Empfindlichkeit von mindestens 0,5 ng nachzuweisen, wenn Proteine durch Elektrophorese auf einem 4–20% Precise Tris-HEPES-Gel (Pierce) aufgetrennt wurden (21B). Die Verbindung Nr. 3 in einer Konzentration von 100 ng/ml in 50 mM Natriumpropionat, pH-Wert 4, war in der Lage, Proteine mit einer Empfindlichkeit von mindestens 0,25 ng nachzuweisen, wenn Proteine durch Elektrophorese auf einem 4–20% Tris-Glycin-Gel (Invitrogen) aufgetrennt wurden, gefolgt von einer zweistündigen Entfärbung in Wasser (22A). Unter Verwendung der gleichen Konzentration war die Verbindung Nr. 3 in der Lage, Proteine mit einer Empfindlichkeit von mindestens 0,25 ng nachzuweisen, wenn Proteine durch Elektrophorese auf einem 4–20% Precise-Tris-HEPES-Gel (Pierce) aufgetrennt wurden (22B). Die Verbindung Nr. 4 in einer Konzentration von 100 ng/ml in 50 mM 3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure (CAPS), pH-Wert 10, war in der Lage, Proteine mit einer Empfindlichkeit von mindestens 0,1 ng nachzuweisen, wenn Proteine durch Elektrophorese auf eifern 4–20% Tris-Glycin-Gel (Novex) aufgetrennt wurden, gefolgt von einer dreißigminütigen Entfärbung in Wasser (23A). Unter Verwendung der gleichen Konzentration war die Verbindung Nr. 4 in der Lage, Proteine mit einer Empfindlichkeit von mindestens 0,25 ng nachzuweisen, wenn Proteine durch Elektrophorese auf einem 4–20% Precise-Tris-HEPES-Gel aufgetrennt wurden, gefolgt von einer dreißigminütigen Entfärbung in Wasser (23B).

Die Verbindung Nr. 4, die als ein Hydroxychinolon-Farbstoff formuliert war, von welcher Ausführungsformen zuvor beschrieben wurden, wies Proteine mit einer Empfindlichkeit von etwa 0,25 ng/Proteinbande oder weniger nach, hatte ein geringes Hintergrundsignal und lieferte lineare quantitative Proteinbanden über drei Größenordnungen auf einer logarmithmischen Skala. Die Verbindung Nr. 4, wenn sie in Methanol gelöst war, wies ein Absorptionsmaximum s bei 513 nm und ein Emissionsmaximum bei 580 nm (orange-rotes Spektrum) auf (8 und Tabelle 1), was sie mit Scannern auf Basis von 532-nm-Lasern und anderen Geräten mit Filtereinstellungen für die Cy3-Wellenlängen kompatibel macht. Der geringe Extinktionspeak in der UV-(von 280 nm bis 320 nm-)Region ermöglichte es, dass der Farbstoff der Verbindung Nr. 4 mit UV-Lichtkästen und Transilluminatoren sichtbar gemacht werden konnte.

Die Arbeitsformulierung des fluoreszierenden Proteinanfärbungsreagens kann eine oder eine Kombination von mehr als eine der in den 1-5 offenbarten und/oder wie beschrieben modifizierten Hydroxychinolonverbindungen in Konzentrationen im Bereich von etwa 25 nMol/L bis etwa 200 nMol/L enthalten.

In einer Ausführungsform wurden durch Elektrophorese in einer Polyacrylamidmatrix aufgetrennte Proteine mit der/den Hydroxychinolonverbindung(en) in einer Konzentration im Bereich von etwa 100 nMol/L bis etwa 180 nMol/L angefärbt. In einer weiteren Ausführungsform wurden Proteine mit einer der Verbindungen allein in einem Farbstoff angefärbt. In einer weiteren Ausführungsform wurden Proteine mit einer Mischung von Verbindungen in dem Farbstoff, zum Beispiel der Verbindungen Nr. 2 und Nr. 4, der Verbindungen Nr. 4 und Nr. 3, der Verbindungen Nr. 4 und Nr. 5, der Verbindungen Nr. 5 und Nr. 3, der Verbindungen Nr. 1, Nr. 4 und Nr. 2, der Verbindungen Nr. 2, Nr. 3 und Nr. 4, der Verbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 5 etc. angefärbt.

Die zuvor beschriebenen Hydroxychinolonverbindungen, einschließlich modifizierter Hydroxychinolonverbindungen, wurden mit Exzipienten als Proteinfarbstoffe formuliert. Zum Beispiel waren die Verbindungen mit einem breiten Spektrum an Puffern über einen pH-Bereich von etwa pH 3 bis etwa pH 11 kompatibel. Die folgenden Puffer können zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit (Grad des Proteinnachweises) verwendet werden und schließen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, kurzkettige organische Säuren (R-CO2), worin R = H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH3 etc. ist, anorganische Puffer, wie Phosphat- und Boratsalze, und/oder organische Puffer, wie TRIS (Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid), CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure), CHES (2-[Cyclohexylamino)ethansulfonsäure), MES (2-N-Morpholino]ethansulfonsäure), HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) und MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure). Die Pufferkonzentration lag im Bereich von etwa 10 mM bis etwa 1 M. In einer Ausführungsform lag der pH im Bereich von etwa pH 3 bis etwa pH 5. In einer weiteren Ausführungsform lag der pH-Wert im Bereich von etwa pH 8 bis etwa pH 10. In einer Ausführungsform wurde der Puffer-pH-Wert unter Verwendung von entweder Natrium- oder Kaliumhydroxid eingestellt.

Andere Komponenten können als Exzipienten eingeschlossen werden. Zum Beispiel können Additive, welche die Solubilisierung und Stabilisierung der Hydroxychinolonverbindung(en) in Lösung unterstützen, eingeschlossen werden. Beispiele für solche Additive, welche die Solubilisierung, Stabilisierung und Lichtbeständigkeit unterstützen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, einen Alkohol (R-OH) mit etwa 0,1% v/v bis etwa 10% v/v, wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol; und/oder ein Diol mit etwa 1% v/v bis etwa 10% v/v, wie 1,2-Propandiol, Propan-1,3-diol, Butan-1,2-diol, Butan-1,3-diol, Butan-1,4-diol, Butan-2,3-diol, Pentan-1,2-diol, Pentan-1,3-diol, Pentan-1,4-diol, Pentan-1,5-diol, Pentan-2,3-diol, Pentan-2,4-diol, Hexan-2,3-diol und/oder Hexan-2,5-diol.

In einer Ausführungsform kann die Farbstoffformulierung auch Benzaldehyd enthalten. Zum Beispiel erhöhte Benzaldehyd in einer Konzentration von mindestens 50 mM die Extinktion und Fluoreszenzintensität, die Farbstoffbeständigkeit, die Farbstoff-Lichtbeständigkeit und die Nachweisempfindlichkeit von Hydroxychinolon-Farbstoffen. Die Fluoreszenz wurde über ausgedehnte Waschungen hinweg beibehalten.

Die Formulierung kann auch Polyethylenglycol (PEG) und/oder Polyvinylalkohol (PVA) mit etwa 0,1% v/v bis etwa 5% v/v enthalten. Ausführungsformen, die Hydroxychinolonverbindung(en) und PEG und/oder PVA enthalten, weisen einen reduzierten Hintergrund auf und liefern somit eine erhöhte Empfindlichkeit durch Erhöhen des Signal-zu-Geräusch-Verhältnisses.

Die zuvor beschriebenen Ausführungsformen dienten für eine 1×-Farbstoffarbeitsformulierung, die zum Anfärben von Proteinen in einem Polyacrylamidgel oder einem festen Träger, wie Nitrocellulose oder PVDF, im Anschluss an die Übertragung verwendet wurde. Die Farbstoffformulierung kann auch als eine 10×-Lösung hergestellt und gelagert werden. Die 10×-Lösung kann bei etwa 4°C bis etwa 25°C für einen längeren Zeitraum, z. B. mindestens ein Jahr, aufbewahrt werden. In einer Ausführungsform schließt die 10×-Lösung 550 mM Natriumacetat, pH-Wert 4, 3% w/v Polyethylenglycol, 50% v/v 1,2-Propandiol, 4,9% v/v Ethylalkohol, 500 mM Benzaldehyd und 1,65 μM Hydroxychinolonverbindung (z. B. Verbindung Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und/oder Nr. 5, und einschließlich der Modifikationen von einer oder mehreren Verbindung(en) wie zuvor beschrieben) ein. Vor dem Anfärben von Proteinen verdünnt der Anwender die 10×-Lösung 1 zu 10 in Wasser, um eine 1×-Arbeitslösung herzustellen, welche danach zum Anfärben von Proteinen in Lösung, auf Gelen, Membranen etc. verwendet wird.

Die oben beschriebenen Farbstoffe können zum Anfärben von durch Elektrophorese aufgetrennten Proteinen in einem Gel in etwa 5 Minuten bis etwa 160 Minuten verwendet werden. Im Anschluss an die Elektrophorese wurden die Gele in einem Alkohol (R-OH) von etwa 30% v/v bis etwa 50% v/v und Säure (R-CO2) mit etwa 5% v/v bis etwa 15% v/v Fixierlösung gewaschen. Beispiele für Alkohole in der Fixierlösung schließen Methanol, Ethanol und Isopropanol ein, und Beispiele für Säuren in der Fixierlösung schließen Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure ein. In einer Ausführungsform ist die Fixierlösung etwa 40% v/v Ethanol und etwa 10% v/v Essigsäure. Der Fixierschritt kann etwa fünf Minuten bis etwa über Nacht dauern. In einer Ausführungsform beinhaltet die Fixierung zwei aufeinander folgende dreißigminütige Waschungen in der Fixierlösung. Im Anschluss an die Fixierung wurde das Gel in Wasser etwa fünf Minuten bis etwa fünfzehn Minuten lang gewaschen, um etwaigen überschüssigen Alkohol und/oder Säure zu entfernen. Die 10×-Anfärbeformulierung (zum Beispiel: 550 mM Natriumacetat, pH-Wert 4, 3% w/v PEG, 4,9% v/v Ethanol, 500 mM Benzaldehyd, 50% v/v 1,2-Propandiol und 1,65 μM Hydroxychinolonverbindung(en) wurde zu einer 1×-Arbeitslösung durch Kombinieren von einem Volumen des 10×-Anfärbungsreagens mit neun Volumina Wasser verdünnt. Ein ausreichendes Volumen der 1×-Arbeitsanfärblösung wurde zur vollständigen Bedeckung des Gels verwendet. Typischerweise sind 20 ml bis 35 ml fluoreszierende Proteinanfärbungsreagenslösung für ein 8 cm × 10 cm großes Gel ausreichend. Das Gel kann mindestens etwa fünf Minuten lang angefärbt werden und kann bis über Nacht angefärbt werden. Längere Inkubationszeiten bei der Anfärbung sorgen für eine größere Fluoreszenzintensität und erhöhen den Proteinnachweisgrad. In einer Ausführungsform wird das Gel mit dem fluoreszierenden Proteinanfärbungsreagens etwa eine Stunde bis etwa zwei Stunden lang inkubiert. Nach dem Anfärben wird das Gel mit Essigsäure von etwa 5% v/v gewaschen. Das Gel wird dann in Wasser mindestens etwa drei Minuten lang gewaschen oder entfärbt. Ein längeres Waschen kann angewandt werden, doch nach etwa zwölf Stunden gab es eine Abnahme des Nachweisgrades. In einer Ausführungsform bestand die Entfärbungsprozedur aus zwei aufeinander folgenden fünfzehnminütigen Waschungen in Wasser. In einer weiteren Ausführungsform schloss die Entfärbungswaschlösung auch Tween-20 in einer Konzentration von weniger als etwa 1% v/v ein. In einer weiteren Ausführungsform wurde das Gel mit Natriumcarbonatlösung in einer Konzentration von etwa 100 mM bis 200 mM und mit einem pH-Wert von 9 bis etwa pH 11 entfärbt.

Die Hydroxychinolon-Farbstoffe können auch zur Quantifizierung von Proteinen in Lösung verwendet werden. Formulierungen, die verschiedene Konzentrationen der Hydroxychinolonverbindungen enthielten (z. B. Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und/oder Nr. 5, einschließlich der zuvor beschriebenen Modifikationen) können Proteinlösungen zugegeben werden. In einer Ausführungsform wird ein Volumen der Proteinlösung mit 10 Volumina der Farbstoffformulierung kombiniert. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Volumen der Proteinlösung mit einem Volumen der Farbstoffformulierung kombiniert. Die resultierende Proteinprobe und Farbstoffformulierung kann sofort oder nach einer Inkubationsperiode abgelesen werden. In einer Ausführungsform wird die Proteinprobe und Farbstoffformulierung etwa dreißig Minuten lang inkubiert. Der Assay kann in mehreren Formaten, einschließlich Mikrotiterplatten mit vielen Mulden, Röhrchen etc., durchgeführt werden und in geeigneten Fluorometern abgelesen werden.

Das Verfahren wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter gewürdigt.

BEISPIEL 1

Repräsentative Gele wurden mit den Farbstoffen, die die Verbindungen Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 und/oder Nr. 5 enthielten, gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren angefärbt. Die 9A, 9B und 9C zeigen die Resultate mit einer beispielhaften Verbindung (Verbindung Nr. 4). Die folgenden kommerziellen Protein-Standards wurden angewandt: Breitspektrum-Protein-Standards (Bio-Rad) (9A), Glycoprotein-Standardmix (Molecular Probes) (9B) und Phosphoprotein-Mix (Molecular Probes) (9C). Der Breitspektrum-Protein-Standard wurde reihenverdünnt und auf 4–20% Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgele (Invitrogen) in Mengen von 1000 ng/Spur; 500 ng/Spur; 250 ng/Spur; 125 ng/Spur; 62,5 ng/Spur; 31,3 ng/Spur; 15,6 ng/Spur; 7,8 ng/Spur; 3,9 ng/Spur; 1,95 ng/Spur; 0,98 ng/Spur, 0,49 ng/Spur, 0,24 ng/Spur, 0,12 ng/Spur und 0,06 ng/Spur geladen. Der Glycoprotein-Standard wurde seriell verdünnt und auf 4–20% Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgele (Invitrogen) in Mengen von 500 ng/Spur; 250 ng/Spur; 125 ng/Spur; 62,5 ng/Spur; 31,3 ng/Spur; 15,6 ng/Spur; 7,8 ng/Spur; 3,9 ng/Spur; 1,95 ng/Spur; 0,98 ng/Spur, 0,49 ng/Spur und 0,24 ng/Spur geladen. Der Phosphoprotein-Standard wurde seriell verdünnt und auf 4–20% Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgele (Invitrogen) in Mengen von 400 ng/Spur; 200 ng/Spur; 100 ng/Spur; 50 ng/Spur; 25 ng/Spur; 12,5 ng/Spur; 6,25 ng/Spur; 3,1 ng/Spur; 1,56 ng/Spur; 0,78 ng/Spur und 0,39 ng/Spur geladen. Proteine auf allen Gelen wurden durch Elektrophorese aufgetrennt.

Im Anschluss an die Elektrophorese wurden Gele, die aufgetrennte Proteine enthielten, in eine saubere Schale gegeben und zweimal dreißig Minuten lang jeweils mit 35 ml 40% v/v Ethanol, 10% v/v Essigsäure gewaschen. Die Gele wurden danach fünf Minuten lang in Wasser gewaschen. Nach der Wasserwaschung wurden 35 ml des 1×-Anfärbungsreagens (55 mM Natriumacetat; pH-Wert 4; 0,3% w/v PEG, 5% v/v 1,2-Propandiol, 0,49% v/v Ethanol, 50 mM Benzaldehyd und 165 nM Verbindung Nr. 4) in die Schale, welche das gewaschene Gel enthielt, gegeben und eine Stunde lang unter vorsichtigem Mischen inkubiert. Nach dem Anfärben wurde das Gel mit 35 ml 5% v/v Essigsäure fünf Minuten lang gewaschen, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden fünfzehnminütigen Wasserwaschungen. Das Gel wurde auf einem Typhoon 9410-Imager (Bildgeber) mit variablem Modus (GE Healthcare) bei Anregung mit 532 nm und auf einem 580 Bandpass-(BP)-30-Emissionsfilter und einer PMT-Einstellung von 600 V einer Bildgebung unterzogen.

Die Anfärbung wies eine diverse Auswahl von Proteinen nach, darin eingeschlossen Phosphoproteine (Ovalbumin, β-Kasein) und Glycoproteine (α2-Makroglobulin, Glucoseoxidase, α1-Säure-Glycoprotein, Avidin). Die Nachweisempfindlichkeit betrug mindestens 1 ng Protein pro Bande, doch ausgewählte Proteine wurden mit einer Empfindlichkeit von 0,1 ng Protein pro Bande nachgewiesen. Das Anfärbungsreagens wies die meisten Proteine nach, wenn 0,12 ng Protein auf die Gele geladen wurden. Die Ergebnisse bei dieser Konzentration sind als mit Kästchen versehene Spur in 9A dargestellt. Proteine in dem Glyoprotein-Mix wurden mit einer Empfindlichkeit von 1 ng für alle Proteine nachgewiesen, und mit einer Empfindlichkeit von 0,5 ng oder weniger für Proteine mit höherem Molekulargewicht, wie α-Säure-Glycoprotein (9B). Proteine in dem Phosphoprotein-Mix wurden mit einer Empfindlichkeit von 1,6 ng oder weniger nachgewiesen (9C). Die Variabilität der Nachweisempfindlichkeit kann eine Folge leichter Unterschiede in den Proteinkonzentrationen der Standards sein (z. B. eine 1%ige Varianz in einer 1000-ng-Proteinlösung ist 10 ng) oder infolge von Problemen mit sterischer Hinderung, die durch posttranslationale Modifikationen, wie Glycosylierung oder Phosphorylierung, verursacht werden. Diese Modifikationen können das Binden des Farbstoffs an die Aminosäuren in dem Protein reduzieren.

BEISPIEL 2

Im Handel verfügbare HeLa-Zellen und Rattenherzgewebe wurden lysiert (mit Hilfe von M-PER, Pierce), und der Proteingehalt der Lysate wurde durch ein BCA-Protein-Assay (Pierce) ermittelt. Lysate wurden in einem Probenpuffer, der SDS und 10 mM DTT enthielt, zu 125 ng Gesamtprotein/μl (HeLa-Zell-Lysate) und 62,5 ng Gesamtprotein/μl (Rattenherzgewebe) verdünnt. Die Lysate wurden reihenverdünnt, und 10 μl jeder Probe wurden auf ein 4–20% Tris-Glycin-SDS-Gel geladen, und es wurden Proteine durch Elektrophorese aufgetrennt. Im Anschluss an die Elektrophorese wurden Gele, die aufgetrennte Proteine enthielten, durch zwei dreißigminütige Waschungen in 40% Ethanol, 10% Essigsäure, fixiert. Die Gele wurden danach fünf Minuten lang mit Wasser gewaschen. Anfärbungsarbeitsreagens (1×) wurde durch Verdünnen des 10×-Anfärbungsreagens (550 mM Natriumacetat, pH-Wert 4; 3% w/v PEG, 50% v/v 1,2-Propandiol, 4,9% v/v Ethanol, 500 mM Benzaldehyd und 1,65 μM Verbindung Nr. 4) 1 zu 10 in Wasser hergestellt. Die Gele wurden in dem 1×-Arbeitsreagens sechzig Minuten lang inkubiert, in 5%iger Essigsäure fünf Minuten gewaschen, gefolgt von zwei fünfzehnminütigen Waschungen in Wasser, und danach auf einem Typhoon 9410-Imager mit variablem Modus(GE Healthcare) mit einem 532-nm-Laser, 580 BP-30-Emissionsfilter, 600 V PMT, einer Bildgebung unterzogen.

Die Ergebnisse sind in der 10 gezeigt, wobei aus den HeLa-Zell-Lysaten abgetrennte Proteine in der 10A gezeigt sind, und Proteine, die aus Rattenherzgewebe-Lysaten abgetrennt wurden, in der 10B gezeigt sind. Das Proteinprofil der Lysate wurde als ein verschmierter Fleck festgestellt, wobei stark vorkommende Proteine als scharte Banden erscheinen. Die scharfen Proteinbanden wurden bei einer Empfindlichkeit von 39 ng Gesamtprotein/Mulde oder weniger mit dem HeLa-Zell-Lysat (10A) nachgewiesen, und 20 ng Gesamtprotein/Mulde oder weniger mit dem cytosolischen Rattenherzgewebe-Extrakt (10B).

Beispiel 3

HeLa-Zell-Lysate wurden so hergestellt, wie es vorstehend beschrieben wurde, und in 8 M Harnstoff, 4% CHAPS unter Verwendung einer 2-D-Proben-Präg. für lösliche Proteine (Pierce, Nr. 89865) äquilibriert. Lysatprotein (28 μg), bestimmt durch ein BCA-Assay (Pierce, Nr. 23225), wurde unter Verwendung von pH 5–8 IPG-Streifen (Bio-Rad) für eine isoelektrische Fokussierung für die erste Dimension und von SDS-PAGE auf 4–20% Tris-HCl-Gelen (Bio-Rad) für die zweite Dimension getrennt. Die Gele wurden gemäß den empfohlenen Protokollen des Herstellers angefärbt, und die angefärbten Gele wurden unter Verwendung des Typhoon 94 10-Imager mit variablem Modus (GE Healthcare) bei den Anregungs/Emissions-Einstellungen, die die beste Empfindlichkeit für jedes Färbemittel lieferten, einer Bildgebung unterzogen. Die positive Elektrode war links, und die negative war auf der rechten Seite.

Die Ergebnisse sind in der 11 gezeigt, wobei die Verbindung Nr. 4 als fluoreszierendes Proteinanfärbreagenz verwendet wurde. Verglichen mit den im Handel verfügbaren Färbemitteln Flamingo (Bio-Rad), SYPRO-Ruby (Invitrogen) und Deep Purple (GE Healthcare) lieferte die Verbindung Nr. 4 ein äquivalentes oder überlegenes Leistungsvermögen für Proteine, die durch zweidimensionale Elektrophorese getrennt wurden. Die Verbindung Nr. 4 führte zu einem schärferen, intensiveren Nachweis der Proteine, weniger Protein-zu-Protein-Variabilität und einem breiteren dynamischen Bereich des Nachweises.

Beispiel 4

Um das Ausmaß der Linearität von Protein-Standardkurven unter Verwendung einer repräsentativen Verbindung in dem fluoreszierenden Proteinanfärbreagenz zu bestimmen, wurden ausgewählte Proteine, die als kommerzielle Proteinstandards verfügbar waren, in Reihe verdünnt. Jeder Proteinansatz wurde mittels Elektrophorese auf entweder Novex 4–20% Tris-Glycin-SDS-Gelen (Invitrogen) oder Criterion 4–20% Tris-HCl-SDS-Gelen (Bio-Rad) aufgetrennt, durch ein Konzentrationsgradient von Proteinbanden erzeugt wurde. Gele, die aufgetrennte Proteine enthielten, wurden mit dem fluoreszierenden Proteinanfärbreagenz, welches die Verbindung Nr. 4 enthielt, angefärbt, und auf einem Typhoon 94 10-Imager mit variablem Modus (GE Healthcare) mit einem 532 nm-Laser, 530 BP 30-Emissionsfilter, 600 V PMT einer Bildgebung unterzogen.

Die relative Fluoreszenzintensität der aufgetrennten Proteinbanden wurde unter Verwendung der ImageQuant-Software bestimmt. Der Logarithmus (log) der relativen Intensität wurde gegen den Logarithmus der Proteinbandenkonzentration aufgetragen. Die Linie mit bester Anpassung wurde durch lineare Regression bestimmt, und der R2-Wert ist für jede Linie angegeben, wie in der 12 gezeigt, und zwar unter Verwendung von Myosin und Rinderserumalbumin als Beispiele für Proteine mit hohem Molekulargewicht (12A), Ovalbumin und β-Casein als Beispiele für Phosphoproteine (12B), α-Säure-Glycoprotein und Glucoseoxidase als Beispiele für Glycoproteine (12C) und Lysocym und Trypsininhibitor als Beispiele für Proteine mit niedrigem Molekulargewicht (12D).

Der lineare Quantifizierungsbereich von allen Proteinen, die mit dem fluoreszierenden Proteinanfärbreagenz angefärbt wurden, erstreckte sich über mindestens drei Größenordnungen. Spezifische Proteine, wie Myosin und Rinderserumalbumin (12A), Lysozym und Trypsininhibitor (12D) wurden über vier Größenordnungen quantifiziert.

Beispiel 5

Das fluoreszierende Proteinanfärbungsreagenz war mit der MALDI-MS-Analyse reversibel und kompatibel.

Rinderserumalbumin (200 ng) (13A, 13B) oder Pferdeherz-Myoglobin (200 ng) (13C und 13D) wurden auf 4–20% Tris-Glycin-Gele geladen und mittels Elektrophorese getrennt. Gele, welche die aufgetrennten Proteine enthielten, wurden unter Verwendung einer repräsentativen Verbindung als fluoreszierendes Proteinanfärbungsreagenz angefärbt (75 mM Natriumpropionat, pH 4, 4,9% Ethanol, 5% 1,2-Propandiol, 0,3% w/v Polyethylenglykol, 50 mM Benzaldehyd, 75 ng/ml Verbindung Nr. 4). Die im Handel verfügbare Anfärbung SYPRO Ruby (Invitrogen) wurde zum Vergleich verwendet.

Banden, welche aufgetrennte Proteine enthielten, wurden aus Gelen als Gelkerne ausgeschnitten, das Protein wurde mit Trypsin verdaut, und die Peptidfragmentverdauungen wurden unter Verwendung von Verfahren extrahiert, die dem Durchschnittsfachmann im Fachbereich bekannt sind. Die resultierenden Peptidfragmente wurden weiter mittels Zip Tips (Milli Pore) gereinigt und zur MALDI-MS-Analyse in Matrixform aufgetragen (2 mg/ml α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, 50% Acetonitril, und 0,1% Trifluoressigsäure).

Die Ergebnisse sind in der 13 gezeigt. Charakteristische Peaks wurden für Verdauungen vom Rinderserumalbumin (13A) und Myoglobin (13B), die mit dem fluoreszierenden Proteinanfärbungsreagenz angefärbt wurden, festgestellt. Verdauungen vom Rinderserumalbumin (13C) und Myoglobin (13D) waren mit im Handel verfügbarem SYPRO Ruby angefärbt. identische Massenpeakprofile wurden für Proteine festgestellt, die mit dem fluoreszierenden Proteinfärbemittel (Verbindung Nr. 4) und SYPRO Ruby angefärbt worden waren. Die Massenpeaks entsprachen den tryptischen Peptidfragmenten und zeigten keine Massenzunahme, welche für die Farbstoffmasse repräsentativ wäre.

Beispiel 6

Die fluoreszierenden Hydroxyquinolon-Proteinanfärbreagenzien lieferten eine äquivalente oder überlegene Proteinanfärbung und -detektion in weniger Zeit im Vergleich zu bestehenden fluoreszenten Färbemitteln.

Die 14 zeigt die Zeit, welche erforderlich ist, um Proteine unter Verwendung einer Anzahl von im Handel verfügbaren Proteinfärbemitteln anzufärben, und zwar im Vergleich zu einer repräsentativen Verbindung (Verbindung Nr. 4), die als ein fluoreszierendes Proteinanfärbreagenz formuliert ist. In einer Ausführungsform erforderte das Anfärben mit dem Hydroxychinolon-Proteinanfärbreagenz 160 Minuten.

In einer Ausführungsform wurden alle Gele, die aufgetrennte Proteine enthielten, in 40% v/v Ethanol, 10% v/v Essigsäure für zwei dreißig Minuten lange Waschungen fixiert, gefolgt von einer fünf Minuten dauernden Wasserwaschung. Gele wurden dann eine Stunde lang in dem 1×-Arbeitsanfärbreagenz angefärbt. Angefärbte Gele wurden in 5% Essigsäure fünf Minuten lang gewaschen und zwei fünfzehn Minuten dauernden Wasserwaschungen unterzogen, um Hintergrundanfärbung zu entfernen. In einer anderen Ausführungsform wurden alle Gele, die aufgetrennte Proteine enthielten, in 40% v/v Ethanol, 10% v/v Essigsäure für zwei fünf Minuten dauernde Waschungen fixiert, gefolgt von einer einminütigen Wasserwaschung. Gele wurden dann fünfzehn Minuten lang in dem 1×-Arbeitsanfärbreagenz angefärbt. Angefärbte Gele wurden drei Minuten lang in Wasser gewaschen, um eine Hintergrundanfärbung zu entfernen. Diese Ausführungsform erforderte eine Gesamtanfärbzeit von etwa dreißig Minuten. Der Proteinnachweis befand sich bei einer Empfindlichkeit von etwa 10 ng Protein. Wie in der 14 gezeigt, betrug die Gelverarbeitungs- und -Handhabungszeit, die für den Proteinnachweis mit der Verbindung Nr. 4 erforderlich war, weniger als die, welche mit anderen fluoreszierenden Färbemitteln erforderlich war.

Beispiel 7

Das fluoreszierende Proteinanfärbungsreagenz detektierte einen breiten Bereich von Proteinen unter Anwendung von multiplen Polyacrylamidgeleformaten. Reihenverdünnungen von im Handel verfügbaren Proteinstandards, die bereits vorstehend beschrieben wurden, wurden mittels Elektrophorese auf den folgenden Gelen aufgetrennt, wobei die Ergebnisse in der 15 gezeigt sind: Criterion 4–20% Tris-HCl (Bio-Rad) (15a); Precise 4–20%, Tris-HEPES (Pierce) (15B); im Labor hergestelltes 12%-Bis-Acrylamid (Bis-Acrylamid, Tris-Puffer, TEMED und Ammoniumpersulfat von Bio-Rad) (15C); und 12% NuPage-Gel, MES-Puffer (Invitrogen) (15D). Gele, welche aufgetrennte Proteine enthielten, wurden mit dem fluoreszierenden Proteinanfärbreagenz, das die Verbindung Nr. 4 enthielt, angefärbt und auf einem Typhoon 94 10-Imager mit variablem Modus (GE Healthcare) unter Anwendung eines 532 nm-Lasers, 580 BP 30-Emissionsfilters und einer PMT-Einstellung von 600 V einer Bildgebung unterzogen. Die Ergebnisse zeigen Kompatibilität der Färbemittelverbindung Nr. 4 mit verschiedenen Geltypen und -formaten.

Beispiel 8

Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz war eher für Proteine als für Nukleinsäuren selektiv. Zwei 6% Polyacrylamid-DNA-Retardationsgele wurden mit einer 100 bp-DNA-Leiter und einem Breitband-Proteinstandard beladen. Es wurde eine Elektrophorese in 0,5 × TBE-Laufpuffer bei einem pH-Wert von 8,3 durchgeführt.

Ein Gel, welches aufgetrennte Proteine und Nukleinsäuren enthielt, wurden mit Ethidiumbromid angefärbt und auf einer UV-Lichtbox begutachtet, und zwar mit den in der 16A gezeigten Ergebnissen. Dieses Gel diente als positive Kontrolle, welche die Anwesenheit von DNA in dem Gel anzeigte.

Das andere Gel, welches aufgetrennte Proteine und Nukleinsäuren enthielt, wurde mit einem 1 × Hydroxychinolon-Anfärbreagenz, welches die Verbindung Nr. 4 enthielt, angefärbt und auf einem Typhoon 94 10-Imager mit variablem Modus (GE Healthcare) unter Verwendung eines 532 nm-Lasers, 580 BP 30-Emissionsfilter und einer PMT-Einstellung von 600 V mit den in 16B gezeigten Ergebnissen einer Bildgebung unterzogen.

Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz wies den Proteinstandard nach, wies jedoch nicht die DNA-Leiter nach. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Hydroxychinolonanfärbung spezifisch für Aminosäuren und Proteine war.

Beispiel 9

Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz war mit multiplen Bildgebungsplattformen kompatibel, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, einen CCD-Imager, einen auf Laser basierenden Scanner und einen UV-Transilluminator, und zwar mit den in der 17 gezeigten Ergebnissen.

Proteinstandards wurden mittels Elektrophorese in einem 4–20% Tris-Glycin-Gel aufgetrennt und mit dem fluoreszenten Proteinanfärbreagenz 75 mM Natriumpropionat, pH 4, 4,9% Ethanol, 5% 1,2-Propandiol, 0,3% w/v Polyethylenglykol, 50 mM Benzaldehyd, 75 ng/ml Verbindung Nr. 4) angefärbt. Das Gel, welches aufgetrennte Proteine enthielt, wurde auf einem Kodak 200 mm-Imager unter Verwendung eines 535 nm-Anregungsfilters, eines 600 nm-Emissionsfilters mit einer fünfminütigen Belichtung (17A) und einem Typhoon 94 10-Imager mit variablem Modus (GE Healthcare) unter Verwendung eines 532 nm-Lasers, 580 BP 30-Emissionsfilters und einer PMT-Einstellung von 600 V (17B) einer Bildgebung unterzogen. Proteinbanden wurden bei einer Empfindlichkeit von 1,95 ng oder weniger nachgewiesen, wenn mit der fluoreszenten Proteinanfärbungsverbindung Nr. 4 angefärbt wurde und entweder mit einer CCD- oder auf Laser basierenden Bildgebungsplattform einer Bildgebung unterzogen wurde.

Beispiel 10

Ein Proteinstandard wurde unter Verwendung von Myosin, Rinderserumalbumin, Meerrettichperoxidase, Carboanhydrase, Sojabohnentrypsininhibitor und Lysozym hergestellt. Dieser Proteinstandard wurde reihenverdünnt und auf vier Novex 4–20% Tris-Glycin-Gelen (Invitrogen) in Mengen von 1000 ng/Spur; 500 ng/Spur; 250 ng/Spur; 100 ng/Spur; 50 ng/Spur; 25 ng/Spur; 10 ng/Spur; 5 ng/Spur; 2 ng/Spur; 1 ng/Spur; 0,5 ng/Spur und 0,25 ng/Spur aufgetragen. Proteine wurden mittels Elektrophorese aufgetrennt. Gele, welche aufgetrennte Proteine enthielten, wurden mit einer repräsentativen Verbindung (Verbindung Nr. 4), die als ein Fluoreszenzproteinanfärbreagenz formuliert war (18A), oder mit einem der folgenden im Handel verfügbaren Färbemittel angefärbt: Deep Purple (GE Healthcare) (18B) SYPRO Ruby (Invitrogen) (18C) oder Flamingo (Bio Rad) (18D), gemäß dem empfohlenen Protokoll der Hersteller.

Gele wurden unter Verwendung vom Typhoon 94 10-Imager mit variablem Modus (GE Healthcare) bei den Anregungs/Emissions-Einstellungen, welche die beste Empfindlichkeit für jedes Färbemittel bereitstellten, einer Bildgebung unterzogen. Die Fluoreszenzintensitäten für Banden, welche Meerrettichperoxidase und Sojabohnentrypsininhibitor enthielten, wurden unter Verwendung der ImageQuant-Analyse-Software bestimmt. Die Fluoreszenzintensität wurde gegen die Proteinkonzentration für jedes Färbemittel aufgetragen, wobei die Ergebnisse in der 18E für Meerrettichperoxidase und in der 18F für den Trypsininhibitor gezeigt sind.

Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz war mit den im Handel verfügbaren Färbemitteln in Bezug auf das Nachweisniveau vergleichbar. Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz detektierte Proteine mit Empfindlichkeiten im Sub-Nanogramm-Bereich, wobei das Fluoreszenzsignal von stärker konzentrierten Proteinbanden nicht gesättigt wurde.

Beispiel 11

Reihenverdünnungen eines SDS-PAGE-Proteinstandards für das SYPRO-Orange-Breitspektrum-Färbemittel (Bio-Rad) wurden auf Criterion 4–20% Tris-HCl-Gele (Bio-Rad) in Mengen im Bereich von 1000 ng/Spur bis 0,12 ng/Spur geladen. Proteine wurden mittels Elektrophorese aufgetrennt und gemäß dem empfohlenen Protokoll der Hersteller angefärbt oder unter Verwendung des fluoreszenten Proteinanfärbreagenzes, welches die Verbindung Nr. 4 enthielt, angefärbt, und zwar wie oben beschrieben. Gele wurden unter Verwendung eines Typhoon 94 10-Imagers mit variablem Modus (GE Healthcare) bei den Anregungs/Emissions-Einstellungen, welche zu der besten Empfindlichkeit für jedes Färbemittel führten, einer Bildgebung unterzogen.

Die 19A zeigt die Spur, welche mit 15,6 ng Protein beladen worden war und unter Verwendung von Verbindung Nr. 4, die als ein fluoreszierendes Proteinanfärbreagenz formuliert worden war, Deep Purple (GE Healthcare), SYPRO Ruby (Invitrogen) oder Flamingo (Bio-Rad) angefärbt worden war. Die Fluoreszentintensität wurde unter Verwendung der ImageQuant-Analyse-Software bestimmt. Die 19B zeigt eine Kurve der Intensität für jede angefärbte Proteinbande in jeder der 125 ng-Spur, der 15 ng-Spur und der 1 ng-Spur; die Ergebnisse wurden gemittelt, und die Standardabweichungen wurden berechnet und aufgetragen.

Flamingo-Färbemittel besaß das höchste Signal, jedoch einen niedrigeren linearen Bereich. Das Deep Purple-Färbemittel hatte die größte Standardabweichung oder Variabilität unter den Proteinen. Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz (Verbindung Nr. 4) besaß sowohl hohe Signalintensität als auch einen breiten quantitativen Bereich.

Beispiel 12

Die Verbindung Nr. 1 wurde in Dimethylformamid (DMF) zu 1 mg/ml gelöst und zu 10 μg/ml, 5 μg/ml und 2,5 μg/ml in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,0, verdünnt. Einhundert und fünfzig μl jeder Verbindung wurde zu vier separaten Mulden einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Mulden hinzugefügt. Zu einer Mulde, enthaltend jede dieser Verdünnungen des Assayreagenzes, wurden 25 μl Rinderserumalbumin (hergestellt in 150 mM NaCl/0,02% Natriumazidlösung) zu 2 mg/ml, 1 mg/ml bzw. 0,5 mg/ml hinzugesetzt. Die Platte wurde sofort unter Anwendung des Tecan Saffire-Instruments bei einer Anregung von 485 nm und einer Emission von 520 nm mit einer Zunahme von 116 (24A) und bei einer Anregung von 555 nm und einer Emission von 570 nm mit einer Zunahme von 112 (24B) abgelesen. Die Verbindung Nr. 1 zeigte ein zunehmendes Signal-zu-Hintergrund (S/N)-Verhältnis mit zunehmender Proteinkonzentration. Der 5 μg/ml-Farbstoff (Verbindung Nr. 1) besaß die beste differenzielle Antwort im Hinblick auf eine zunehmende Proteinkonzentration.

Die oben genannten Beispiele und Beschreibungen zeigen, das der fluoreszierende Proteinfarbstoff in der Lage war, einen diversen Satz an Proteinen, wie Phosphoproteine, Glycoproteine und Proteine, die von Zelllysaten stammen, anzufärben. Er war mit Proteinen kompatibel, die mittels der Elektrophorese sowohl bei 1-dimensionalen als auch 2-dimensionalen Gelen aufgetrennt wurden, als auch bei Proteinen in Lösung. Er erlaubte eine Proteinquantifizierung über vier Größenordnungen, und eine lineare Quantifizierung für mindestens drei, und für einige Proteine, für mindestens vier Größenordnungen. Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz zeigte eine Empfindlichkeit, die gleich oder größer war als für im Handel verfügbare Färbemittel, bezogen auf einen breiten Bereich an Proteinen in 1-dimensionalen Gelen, und es ermöglichte üblicherweise den Nachweis von weniger als 0,25 ng Protein. Das fluoreszierende Proteinanfärbreagenz färbte selektiv Proteine gegenüber Nukleinsäuren, und es war mit der MALDI-MS-Analyse und multiplen Geltypen und Bildgebungsplattformen kompatibel.

Andere Variationen oder Ausführungsformen der Erfindung sind dem Durchschnittsfachmann im Fachbereich aus den oben dargelegten Figuren, der Beschreibung und Beispielen ebenfalls ersichtlich. Somit sollten die vorstehenden Ausführungsformen nicht als den Umfang dieser Erfindung beschränkend angesehen werden.