Title:
Organismusspezifisches hybridisierbares Nucleinsäuremolekül
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nukleinsäuremoleküls, ein nach diesem Verfahren hergestelltes Nukleinsäuremolekül, ein Kit, das zumindest eines der Nukleinsäuremoleküle aufweist, die Verwendung einer Nukleotidsequenz, die zwischen zwei Elementen auf der genomischen Information eines Organismus liegt, zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nukleinsäuremoleküls, sowie ein Verfahren zum Nachweis eines Organismus in einer biologischen Probe.




Inventors:
gleich Anmelder
Application Number:
DE102007010311
Publication Date:
08/28/2008
Filing Date:
02/23/2007
Assignee:
Thines, Marco, Dr. (Ostfildern, 73760, DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE69827934T2N/A2006-03-23
DE60014350T2N/A2005-10-13
DE19835109A1N/A1999-04-15



Foreign References:
WO1995033075A11995-12-07
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Attorney, Agent or Firm:
Witte, Weller & Partner (Stuttgart, 70178)
Claims:
1. Verfahren zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls, das folgende Schritte aufweist:
1. Bereitstellung eines Organismus;
2. Isolierung der genomischen Information aus dem Organismus;
3. Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks von der genomischen Information zum Erhalt eines Musters von Amplifikaten der genomischen Information;
4. Isolierung von zumindest einem Amplifikat aus dem Muster;
5. Sequenzierung des isolierten Amplifikats zum Erhalt einer Nucleotidsequenz;
6. Auswahl eines solchen Abschnitts der Nucleotidsequenz, der zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls geeignet ist, und
7. Herstellung eines Nucleinsäuremoleküls, das den in Schritt (6) ausgewählten Abschnitt aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische Information des Organismus doppelsträngige DNA ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erstellung des genetischen Fingerabdrucks in Schritt 3 folgendes Verfahren durchgeführt wird:

4. 3.1 Amplifizierung von Fragmenten der genomischen Information des Organismus zum Erhalt einer Mischung von Amplifikaten,

5. 3.2 Vereinzelung der in der Mischung enthaltenen Amplifikate zum Erhalt eines Musters von Amplifikaten von Genomfragmenten.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifizierung in Schritt 3.1 mittels Polymerase-Kettenraktion (PCR) erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der PCR als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine Nucleotidsequenz einer Satelliten-DNA auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine Nucleotidsequenz einer Satelliten-DNA auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Satelliten-DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Mikrosatelliten-DNA, simple sequence repeats (SSRs) und intersimple sequence repeats (ISSRs).

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der PCR als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine randomisierte Nucleotidsequenz mit einer Länge von 3 bis 30, vorzugsweise von 4 bis 20, höchst bevorzugt von 6 bis 10 Nucleotiden, auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine Nucleotidsequenz mit einer Länge von 3 bis 30, vorzugsweise von 4 bis 20, höchst bevorzugt von 6 bis 10 Nucleotiden, auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der PCR als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine auf ein Virusgenom zurückführbare Nucleotidsequenz auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine auf ein Virusgenom zurückführbare Nucleotidsequenz auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der PCR als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine Nucleotidsequenz eines transposablen Elements auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine Nucleotidsequenz eines transposablen Elements auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der PCR als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine repetitive Nucleotidsequenz eines Telomers oder Centromers auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an eine repetitive Nucleotidsequenz eines Telomers oder Centromers auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (2) und vor Schritt (3.1) weitere folgende Schritte durchgeführt werden:
2.1 Inkubation der genetischen Information des Organismus mit zumindest einer Restriktionsendonuclease zum Erhalt einer Mischung von Restriktionsfagmenten, und
2.2 Ligation von Oligonucleotiden einer definierten Nucleotidsequenz (Adaptorsequenz) an die freien Enden der Restriktionsfragmente zum Erhalt von Fragmenten der genomischen Information,
wobei die Amplifizierung in Schritt 3.1 mittels Polymerase-Kettenraktion (PCR) erfolgt und als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an die Adaptorsequenz auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-PCR-Primer ein solcher gewählt wird, der an die Adaptorsequenz auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erstellung des genetischen Fingerabdrucks in Schritt 3 folgendes Verfahren durchgeführt wird:
3.1.1 Inkubation der genetischen Information mit zumindest einer Restriktionsendonuclease zum Erhalt einer Mischung von Fragmenten der genomischen Information,
3.1.2 Ligation der Fragmente der genomischen Information in Vektoren,
3.1.3 Einbringung der Vektoren in Wirtsorganismen,
3.1.4 Amplifizierung der Vektoren in den Wirtsorganismen,
3.1.5 Isolierung der amplifizierten Vektoren zum Erhalt einer Mischung von Amplifikaten von Fragmenten der genomischen Information, und
3.2 Vereinzelung der in der Mischung enthaltenen Amplifikaten zum Erhalt eines Musters von Amplifikaten von Fragmenten der genomischen Information.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt 3.1.3 und vor Schritt 3.1.4 folgender Schritt erfolgt:
3.1.3' Ausplattierung der Wirtsorganismen auf Kultivierungsplatten.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Vereinzelung in Schritt 3.2 mittels einer chromatographischen und/oder elektrophoretischen Methode erfolgt.

17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 4 zumindest ein solches Amplifikat isoliert wird, das in Relation zu den übrigen Amplifikaten in Schritt 3.1 überdurchschnittlich stark amplifiziert wurde.

18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt 4 und vor Schritt 5 folgende weitere Schritte erfolgen:
4.1 Einfügung des isolierten Amplifikats in einen Vektor,
4.2 Einbringen des Vektors in einen geeigneten Organismus, und
4.3 Isolieren des Vektors aus dem Organismus zum Erhalt von zumindest einem isolierten Amplifikat.

19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der in Schritt 6 ausgewählte Abschnitt eine Länge von 3 bis 1000 Nucleotiden, von vorzugsweise 10 bis 64, weiter vorzugsweise 12 bis 48, weiter vorzugsweise 14 bis 36, weiter vorzugsweise 16 bis 27 Nucleotiden aufweist.

20. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (7) hergestellte Nucleinsäuremolekül als PCR-Primer ausgestaltet wird.

21. Nucleinsäuremolekül, das eine der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 5 bis 15 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine hierzu komplementäre Nucleotidsequenz aufweist.

22. Nucleinsäuremolekül, das zumindest 20%, bevorzugt zumindest 30%, weiter bevorzugt 40%, vorzugsweise 50%, weiter vorzugsweise 60%, weiter vorzugsweise 70%, weiter vorzugsweise 80%, weiter vorzugsweise 90%, weiter vorzugsweise 95%, weiter vorzugsweise 99% Sequenzhomologie mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 19 aufweist.

23. Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 19 oder 20 hybridisiert.

24. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls mit einer Nucleotidsequenz, die zwischen zwei Elementen auf der genetischen Information eines Organismus liegt, zur Herstellung eines organismenspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls, dadurch gekennzeichnet, dass die zwei Elemente jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Satelliten-DNA-Nucleotidsequenz, auf Virusgenom zurückführbare Nucleotidsequenz, Nucleotidsequenz eines transposablen Elementes, repetitive Nucleotidsequenz eines Telomers/Centromers.

25. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das organismusspezifische hybridisierbare Nucleinsäuremolekül ein PCR-Primer ist.

26. Nucleinsäuremolekül, das eine der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 4 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine hierzu komplementäre Nucleotidsequenz aufweist.

27. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nucleotidsequenz von 3 bis 812, vorzugsweise von 10 bis 64, weiter vorzugsweise 12 bis 48, weiter vorzugsweise 14 bis 36, weiter vorzugsweise 16 bis 27 aufeinanderfolgenden Nucleotiden aus einer der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 4 oder einer hierzu komplementäre Nucleotidsequenz aufweist.

28. Nucleinsäuremolekül, das zumindest 20%, bevorzugt zumindest 30%, weiter bevorzugt 40%, vorzugsweise 50%, weiter vorzugsweise 60%, weiter vorzugsweise 70%, weiter vorzugsweise 80%, weiter vorzugsweise 90%, weiter vorzugsweise 95%, weiter vorzugsweise 99% Sequenzhomologie mit dem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 24 oder 25 aufweist.

29. Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an das Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26 hybridisiert.

30. Kit, das zumindest eines der Nucleinsäuremoleküle gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21 und/oder 24 und 25, eine Beschreibung zur Verwendung des zumindest einen Nucleinsäuremoleküls sowie ggf. Puffer und Chemikalien aufweist.

31. Verfahren zum Nachweis eines Organismus in einer biologischen Probe, das folgende Schritte aufweist:
1. Bereitstellung einer Nucleinsäure enthaltenden biologischen Probe,
2. Isolierung der Nucleinsäure aus der Probe,
3. Unterziehung der isolierten Nucleinsäure einer Polymerase-Kettenraktion (PCR),
4. Feststellung, ob in Schritt 3 eine Amplifikation der isolierten Nucleinsäure erfolgt ist, und
5. Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt 4 mit dem Vorhandensein des Organismus in der Probe, und Korrelation einer negativen Feststellung in Schritt 4 mit der Abwesenheit des Organismus in der Probe,
dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 3 als PCR-Primer zumindest ein Nucleinsäuremolekül verwendet wird, das nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 hergestellt wurde.

32. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, das als PCR-Primer zumindest ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 24 bis 26 verwendet wird.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls, ein nach diesem Verfahren hergestelltes Nucleinsäuremolekül, ein Kit, das zumindest eines der Nucleinsäuremoleküle aufweist, die Verwendung einer Nucleotidsequenz, die zwischen zwei Elementen auf der genomischen Information eines Organismus liegt, zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls, sowie ein Verfahren zum Nachweis eines Organismus in einer biologischen Probe.

Unter Hybridisierung wird die Zusammenlagerung zweier Nucleinsäure-Einzelstränge, die komplementäre Rasensequenzen besitzen, zu Doppelsträngen verstanden. Hybridisierung kann zwischen zwei DNA-Strängen, einem DNA- und einem RNA-Strang sowie zwischen zwei RNA-Strängen erfolgen.

Hybridisierbare Nucleinsäuremoleküle sind bspw. Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Primer) oder für andere Amplifikationsverfahren, die auf der Aktivität einer Nucleinsäurepolymerase basieren, sowie Hybridisierungssonden. Bei den Primern, bspw. für die PCR, oder Hybridisierungssonden kann es sich um DNA-, RNA- oder synthetische Oligonucleotidmoleküle handeln, die zum Nachweis, zur Charakterisierung oder Lokalisierung von solchen Zielnucleinsäuremolekülen verwendet werden können, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, welche zu jener der PCR-Primer oder Hybridisierungssonden komplementär ist. Verfahren zur Herstellung von PCR-Primern oder Hybridisierungssonden sind im Stand der Technik allgemein bekannt; vgl. Sambrook und Russel (2001), Molecular Cloning – A laboratory Handbook, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Der Nachweis der Zielnucleinsäuremoleküle ermöglicht einen indirekten Nachweis des Organismus, der das Zielnucleinsäuremolekül trägt. Auf diese Art lassen sich bspw. pathogene Organismen nachweisen, die das Zielnucleinsäuremolekül als Bestandteil ihrer genomischen Information enthalten. Die Identifizierung von pathogenen Organismen wiederum ist die Voraussetzung für eine zielgerichtete Therapie einer durch den Organismus ausgelösten Krankheit.

Die moderne Phytopathologie befasst sich mit der Erkrankung von Pflanzen durch abiotische Ursachen oder biotische Krankheitserreger. Zu diesen Krankheitserregern zählen Pflanzenviren, Bakterien, Pilze oder parasitische Blütenpflanzen. Gegenstand der phytopathologischen Forschung ist bspw. die Entwicklung von Nachweisverfahren, mit denen Krankheitserreger im Saat- und Pflanzengut, in Bodenproben, Flüssigsubstraten und beliebigen anderen Medien detektiert werden können. Herkömmliche Testverfahren der Phytopathologie beschränken sich im Wesentlichen auf das Auspflanzen von möglicherweise erkrankten Pflanzen und der visuellen Charakterisierung des Phänotyps hinsichtlich charakteristischer Krankheitsmerkmale (Bonitur). Diese auf visueller Bonitur basierenden Nachweisverfahren für Pflanzenerkrankungen sind jedoch sehr zeit- und arbeitsaufwändig.

Alternativ kommen serologische Verfahren zum Nachweis von Phytopathogenen zum Einsatz, bei denen gegen die Pathogene gerichtete Antikörper verwendet werden, bspw. im Rahmen eines sogenannten „enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA). Serologische Verfahren sind jedoch sehr kostenintensiv, da die Herstellung von spezifischen monoklonalen Antikörpern mit hohem technischem Arbeitsaufwand verbunden ist. Auch ist es wegen der großen Homologien der antigenen Strukturen von eukaryotische Pathogenen häufig sehr schwierig, hochspezifische Antikörper gegen Eukaryoten zu entwickeln, die keine Kreuzreaktion mit nahe verwandten Spezies oder mit formae specialis, d. h. hochspezialisierten Unterarten einer Spezies, aufweisen.

Bei Nachweisverfahren, die sich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bedienen, werden unter Verwendung von entsprechenden PCR-Primern üblicherweise moderat variable Genomabschnitte des Pathogens amplifiziert, wie der sogenannte „internal transcribed spacer" (ITS). Diese moderat variablen Genomabschnitte der Pathogene weisen über die Artgrenzen hinweg sehr große Sequenzhomologien auf. Daraus resultiert, dass sich mit dieser Methode sehr nahe verwandte Arten von Pathogenen kaum unterscheiden lassen. Ferner ist mittels dieser herkömmlichen PCR-gestützten Verfahren eine Differenzierung von solchen Schaderregern innerhalb derselben Art, die verschiedene Wirte befallen oder besiedeln bzw. von formae specialis, nicht möglich.

Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die Herstellung von hochselektiven organismenspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremolekülen gelingt, die im Rahmen eines Verfahrens zum Nachweis von biotischen Krankheitserregern eingesetzt werden können, und mit denen die zuvor genannten Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden. Insbesondere sollen hochselektive, organismenspezifische Nucleinsäuremoleküle hergestellt werden, die eine reduzierte Kreuzreaktivität mit verwandten pathogenen Spezies oder formae specialis aufweisen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls gelöst, das folgende Schritte aufweist:
(1) Bereitstellung eines Organismus; (2) Isolierung der genomischen Information aus dem Organismus; (3) Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks von der genomischen Information zum Erhalt eines Musters von Amplifikaten der genomischen Information; (4) Isolierung von zumindest einem Amplifikat aus dem Muster; (5) Sequenzierung des isolierten Amplifikats zum Erhalt einer Nucleotidsequenz; (6) Auswahl eines solchen Abschnitts der Nucleotidsequenz, der zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls geeignet ist, und (7) Herstellung eines Nucleinsäuremoleküls, das den in Schritt (6) ausgewählten Abschnitt aufweist.

Erfindungsgemäß wird unter einem „Organismus" ein jegliches Lebewesen verstanden, das einen pflanzlichen, tierischen oder humanen Wirt besiedeln bzw. befallen kann. Ggf. können dadurch bei dem Wirt Krankheiten ausgelöst werden. In diesem Zusammenhang wird insbesondere an Pflanzenkrankheiten gedacht, die durch Pflanzenviren, Bakterien, Pilze, Oomyceten, parasitische Pflanzen und Tiere etc. ausgelöst werden.

Erfindungsgemäß wird unter „genomischer Information" Nucleinsäure verstanden, die spezifisch für den Organismus ist. Hierbei wird insbesondere an das Genom in Form der DNA gedacht, auch jedoch an die RNA des Organismus, die aus einer Abschrift eines Genomteils entsteht. Erfindungsgemäß umfasst die genomische Information nicht nur informationstragende sondern auch inter- und/oder exogenische Abschnitte des Genoms.

Verfahren zur Isolierung der genomischen Information aus einem Organismus sind im Stand der Technik allgemein bekannt; vgl. Sambrook und Russell (a. a. O.); der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Unter einem „genetischen Fingerabdruck" werden charakteristische genetische Merkmale eines Organismus verstanden, welche dessen Identifizierung erlauben. Diese Identifizierungsmöglichkeit basiert auf dem Vorkommen bestimmter Nucleotidabfolgen in der genomischen Information des Organismus. Hierunter fallen beispielsweise repetitive tandemartig angeordnete DNA-Sequenzen. Ein prominentes Beispiel für diese repetitiven DNA-Sequenzen ist die sogenannte Satelliten-DNA. Sateliten-DNA besteht aus einer Vielzahl von Kopien von Nucleotidabfolgen, die direkt hintereinander vorkommen. Beispiele von kurzen solchen Wiederholungsfolgen sind A, AC, AAT oder AAC, wobei auch andere Abfolgen beobachtet werden. Satelliten-DNA mit AC-Dinucleotid-Folgen kommt durchschnittlich einmal pro 30 kb-Genomabschnitt vor. Tri- oder Tetranucleotid-Folgen sind seltener, einmal unter einigen hunderttausend Basenpaaren. In der genomischen Information des Organismus werden ferner längere sich wiederholende Abschnitte von 5 bis 2000 Nucleotiden Länge gefunden. Diese repetitiven DNA-Sequenzen sind im Genom weitgehend statistisch verteilt, wobei sie an den Centromeren und Telomeren der Chromosomen gehäuft auftreten.

Die Zahl der Di-, Tri- oder Tetranucleotide etc. in einer Satelliten-DNA ist hochpolymorph. D. h. zwei Allele unterscheiden sich mit hoher Wahrscheinlichkeit in der Zahl der Di-, Tri- oder Tetranucleotide einer gegebenen Sateliten-DNA. Die Ursache für diesen Polymorphismus sind Verrutschungen in DNA-Sequenzwiederholungen im Bereich der Replikationsgabeln. Die Satelliten-DNA wird nach dem Mendelschen Regeln vererbt.

Verfahren zur Generierung von genetischen Fingerabdrücken, die im erfindungsgemäßen Schritt 3 zur Anwendung kommen, sind im Stand der Technik umfassend beschrieben und werden als „DNA-Fingerprinting", „DNA-Profiling" oder „DNA-Typing" bezeichnet; diese sind bspw. beschrieben in Weising et al. (1995), „Fingerprinting in Plants and Fungi", CRS Press, Boca Raton, Florida, USA; der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

So ist eine große Zahl der repetitiven Abschnitte, wie bspw. Satelliten-DNA, mittlerweile sequenziert und Methoden zum Identifizieren weiterer Satelliten-DNA sind im Stand der Technik umfassend beschrieben; vgl. bspw. Kolpakov et al. (2003), "mreps: efficient and flexible detection of tandem repeats in DNA. Nucleic Acids Research 31 (13), Seiten 3672–3678. Der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahe Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Das Computerprogramm „mreps", mit dem die Identifizierung von Satelliten-DNA gelingt, ist bspw. auf der Website „Bioinfo" der Bioinformatikgruppe an der „Universite des Sciences et Technologies de Lille", Frankreich unter http://bioinfo.lifl.fr/mreps/ oder auf der Website der „Bioinformation Systems e. V., Verein zur Förderung der Datenverwertung in der molekularen Biologie" unter http://www.bioinfo.de/isb/gcb01/poster/wu.html erhältlich. Der Inhalt dieser Websites ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Die Nucleotidsequenzen zahlreicher Satelliten-DNA sind öffentlich zugänglichen Datenbanken zu entnehmen. Satelliten-DNA aus Pflanzen, Tieren und Pilzen sind bspw. auf der Website des „International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (ICRISAT)" unter http://intranet.icrisat.org/gtl/ssr/AnnotatedSSRs.asp?dname =Sorghum veröffentlicht. Satelliten-DNA aus Pflanzen sind ferner auf der Website „PlantSat" des Labors für molekulare Cytogenetik, Institut für molekulare Pflanzenbiologie, Ceske Budejovice, Tschechische Republik, unter http://w3lamc.umbr.cas.cz/ PlantSat/ veröffentlicht. Der Inhalt dieser Datenbanken bzw. Websites ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Basierend auf diesen Sequenzinformationen lassen sich PCR-Primer herstellen, die an die Satelliten-DNA hybridisieren. Es versteht sich, dass der Vorwärts- und Rückwärtsprimer jeweils an die gleiche Satelliten-DNA oder aber auch an unterschiedliche Satelliten-DNA, d. h. unterschiedliche Nucleotidsequenzen hybridisieren kann. Wichtig ist lediglich, dass die zwischen zwei solchen repetitiven Abschnitten der genomischen Information liegenden Abschnitte amplifiziert werden, die im folgenden „Amplifikate" genannt werden. Dies erfolgt in dem gegebenen Beispiel mittels der PCR-Reaktion. Es versteht sich, dass weitere Methoden der Nucleinsäureabschnittsvervielfältigung in Frage kommen, wie bspw. Amplifikation mittels phi-DNA-Polymerasen oder der thermophilic Helicase-Dependent Amplification (tHDA).

Die jeweiligen Amplifikate können dann erfindungsgemäß mittels chromatographischer oder elektrophoretischer Verfahren bspw. ihrer Größe nach aufgetrennt und über spezifische an DNA bindende oder assoziierende Farbstoffe sichtbar gemacht werden. Dadurch wird ein Muster von Amplifikaten erhalten, das aufgrund des angesprochenen Polymorphismus charakteristisch für den jeweils analysierten Organismus ist. Dieses Muster wird als genetischer Fingerabdruck bezeichnet. In einem Extremfall, wenn der oder die für das DNA-Fingerprinting genutzten Primer nur ein einzelnes Fragment der genomischen Information amplifizieren, kann erfindungsgemäß das Muster aus nur einem Amplifikat bestehen. Es versteht sich, dass mit „einem" Amplifikat erfindungsgemäß gemeint ist, dass mehrere Nucleinsäuremoleküle mit identischer Nucleotidsequenz vorliegen, die sich folglich voneinander nicht unterscheiden.

In dem nächsten erfindungsgemäßen Schritt 4 wird aus dem erhaltenen genetischen Fingerabdruck bzw. dem Muster von Amplifikaten „ein" Amplifikat isoliert. Dies kann bspw. dadurch erfolgen, dass eine Bande, die die Nucleinsäure „eines" Amplifikates enthält, aus einem Elektrophoresegel mit einem Messer herausgeschnitten wird, und die darin enthaltende Nucleinsäure nach allgemein bekannten Methoden aus dem Gel eluiert wird.

Die im nächsten erfindungsgemäßen Schritt 5 erfolgende Sequenzierung des isolierten Amplifikates wird ebenfalls gemäß im Stand der Technik allgemein bekannter Verfahren durchgeführt, bspw. mittels dem Maxam-Gilbert- oder dem Sanger-Verfahren; vgl. Sambrook und Russell (a. a. O.).

Nachdem die Nucleotidsequenz des isolierten Amplifikates erhalten wurde, wird im Schritt 6 ein solcher Abschnitt ausgewählt, der zur Herstellung eines hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls geeignet ist. Die hierbei verwendeten Auswahlkriterien sind dem Fachmann allgemein bekannt. Ist bspw. die Herstellung eines PCR-Primers bezweckt, so werden vorzugsweise Abschnitte ausgewählt, die eine Länge von 3 oder 10 bis 36 Nucleotiden aufweisen, allerdings auch kürzer oder länger sein können. Die vom Fachmann angelegten Kriterien zur Herstellung eines PCR-Primers sind bspw. zu finden in Sambrook und Russel (a. a. O.), Chapter 8, Table 8.3, der Inhalt dieser Tabelle ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Die eigentliche Herstellung des speziespezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls erfolgt unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardmethoden der Nucleinsäuresynthese; vgl. ebenfalls Sambrook und Russell (a. a. O.).

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.

Der Erfinder hat erkannt, dass Amplifikate, die bei der Erstellung eines genetischen Fingerabdruckes des Organismus erhalten werden, geeignete Matrizen für die Herstellung von hochselektiven organismusspezifischen und hybridisierbaren Nucleinsäuremolekülen, wie bspw. Sonden und PCR-Primer, sind. So hat der Erfinder festgestellt, dass im Rahmen des DNA-Fingerprintings Fragmente der genomischen Information des interessierenden Organismus amplifiziert werden können, die in der Regel zwischen den Genen des Organismus, d. h. intergenisch, angeordnet sind, d. h. keine proteincodierende Information tragen. Diese Fragmente weisen aufgrund des geringen oder gar fehlenden Selektionsdrucks eine sehr hohe Variabilität zwischen einzelnen Organismen und somit eine hohe Spezifität für den jeweiligen Organismus auf. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich solche Nucleinsäuremoleküle gewinnen, die hoch-selektiv an derartige Fragmente binden können. Beispiele solcher Nucleinsäuremoleküle sind Sonden und PCR-Primer bzw. DNA-Oligomere. Unter Anwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren kann ein Fachmann, wie ein Molekularbiologe oder Pflanzenpathologe, feststellen, ob ein solches erfindungsgemäß hergestelltes Nucleinsäuremolekül an genomische Information in einer beliebigen biologischen Probe hybridisieren kann. Im Falle einer Hybridisierung kann darauf rückgeschlossen werden, dass der gesuchte Organismus in der Probe enthalten ist.

Besonders vorteilhaft ist, dass mit den PCR-Primern bzw. Hybridisierungssonden, die über das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden, nicht nur zwischen verschiedenen Spezies sondern sogar hochselektiv zwischen Individuen unterschieden werden kann. Dadurch wird auch der Nachweis von formae specialis bzw. von pathogenen Subspezies innerhalb einer Art ermöglicht und die Voraussetzungen für eine zielgerichtete Behandlung einer befallenen Pflanze geschaffen.

Bei dem Verfahren ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die genomische Information des Organismus doppelsträngige DNA ist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass sich die genomische, doppelsträngige DNA des Organismus zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks besonders eignet. So sind im Stand der Technik eine Vielzahl von Methoden beschrieben, die die Erstellung des genetischen Fingerabdrucks aus der Basis von doppelsträngiger DNA ermöglichen; vgl. Weising et al. (a. a. O.). Diese beinhalten die eingangs näher dargestellte PCR-basierende Methode des DNA-Fingerprintings.

Zur Erstellung des genetischen Fingerabdrucks wird in Schritt 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise folgendes Verfahren durchgeführt: 3.1 Amplifizierung von Fragmenten der genomischen Information des Organismus zum Erhalt einer Mischung von Amplifikaten, und 3.2 Vereinzelung der in der Mischung enthaltenen Amplifikate zum Erhalt eines Musters von Amplifikaten von Genomfragmenten.

Mit diesen Maßnahmen lässt sich auf besonders geeignete Weise ein Muster von Amplifikaten von Fragmenten der genomischen Information erhalten.

Die Amplifizierung in Schritt (3.1) erfolgt vorzugsweise mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wobei als Primer-Ansatzstellen besonders Abschnitte von Satelliten-DNA, insbesondere von Mikrosatelliten-DNA und simple sequence repeats (SSRs) geeignet sind.

Unter Satelliten-DNA werden hauptsächlich im Genom von Eukaryoten vorkommende, vielfach wiederholte d. h. repetitive DNA-Sequenzen verstanden, die je nach Organismus bis zu 90% des Gesamtgenoms ausmachen können. Satelliten-DNAs werden anhand ihrer repetitiven Nucleotidsequenzlänge und der Anzahl dieser tandemartig angeordneten Kopien verschieden bezeichnet. Kleinere Satelliten-DNA wird oft als „Mikrosatelliten-DNA" bezeichnet. Darunter versteht man Di-, Tri- oder Tetranucleotide, die zu 10 bis 30 Kopien innerhalb einer „geclusterten" Repetitionseinheit auftreten. Mikrosatelliten-DNA umfasst auch repetitive Sequenzen von 20 bis 40 Nucleotiden und erstreckt sich über einen Bereich von einigen Kilobasen. Man nennt sie auch „variable number of tandem repeats" (VNTR). „Single sequence repeats" (SSRs), die auch als „simple sequence repeats" bezeichnet werden, sind kurze, repetitive 1 bis 4 Nucleotide umfassende Sequenzen.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Nucleotidsequenzen einer Vielzahl von Satelliten-DNAs im Stand der Technik beschrieben sind. Es ist somit für den Fachmann ein Leichtes geeignete PCR-Primer zu generieren, die an die Satelliten-DNA hybridisieren. Nucleotidsequenzen von Satelliten-DNAs finden sich bspw. auf der Website des „International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (ICRISAT)" (a. a. O.). Der Inhalt dieser Website ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Satelliten-DNA lässt sich allgemein mit (Nx)n darstellen, wobei N für ein beliebiges Nucleotid steht, und x eine ganze Zahl von 2–6 für SSRs, x eine ganze Zahl von 7–30 für Mikrosatelliten-DNA und x eine ganze Zahl von 31–10000 für Makrosatelliten-DNA ist; n ist allgemein eine ganze Zahl von 2 bis 1000, wobei sowohl für n als auch für x größere Werte in Betracht kommen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann alternativ im Rahmen der PCR als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt werden, der an eine randomisierte Nucleotidsequenz mit einer Länge von 3 bis 30, vorzugsweise von 4 bis 20, höchst bevorzugt von 6 bis 10 Nucleotiden, auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer ein solcher gewählt werden, der an eine Nucleotidsequenz mit einer Länge von 3 bis 30, vorzugsweise von 4 bis 20, höchst bevorzugt von 6 bis 10 Nucleotiden, auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

Auch über diese Maßnahme lässt sich ein genetischer Fingerabdruck in Form eines Musters von Amplifikaten von Fragmenten der genomischen Information des interessierenden Organismus erstellen. Dazu wird ein Vorwärts-PCR-Primer hergestellt, der 3 bis 10 willkürlich ausgewählte Nucleotide aufweist. Der Rückwärts-PCR-Primer wird entsprechend gewählt. Der Erfinder hat herausgefunden, dass sich aus statistischen Gründen bei einer Vielzahl von Organismen entsprechende Nucleotidsequenzen über das Genom verteilt finden lassen. Im Rahmen der PCR-Reaktion werden dann die dazwischenliegenden Fragmente der genomischen Information des Organismus amplifiziert, die nach Erkenntnissen des Erfinders aus statistischen Gründen ebenfalls eine sehr hohe Organismusspezifität aufweisen, da ein Großteil des Genoms informationsfrei ist, und sich deshalb zur Herstellung von organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremolekülen eignen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im Rahmen der PCR alternativ als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt, der an eine auf ein Virusgenom zurückführbare Nucleotidsequenz auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer wird ein solcher gewählt, der an eine auf ein Virusgenom zurückführbare Nucleotidsequenz auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

Auch mit dieser Maßnahme lassen sich im Rahmen eines DNA-Fingerprintings Amplifikate von solchen Genomfragmenten erhalten, die die Herstellung speziespezifischer hybridisierbarer Nucleinsäuremoleküle ermöglichen. Auf ein Virusgenom zurückführbare Nucleotidsequenzen lassen sich aufgrund von Sequenzhomologien identifizieren. So erfindungsgemäß von einer auf ein Virusgenom zurückführbaren Nucleotidsequenz gesprochen, wenn Abschnitte der genomischen Information von zumindest 10 Nucleotiden eine Homologie mit einem entsprechenden Abschnitt eines Virusgenoms von zumindest 30%, vorzugsweise von zumindest 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% und höchst bevorzugt von zumindest 100% aufweisen.

Die Homologien lassen sich bspw. mittels der Software MegAlign des Lasergene Programms von DNAStar Inc. bestimmen.

Auf ein Virusgenom zurückführbaren Nucleotidsequenzen sind im Stand der Technik umfassend beschrieben, vgl. Cooper und Geoffrey (2000), „The Cell – A molecular approach", 2. Auflage, Sunderland (MA): Sinauer Associates, Inc.; Brown, T. A. (2002), "Genomes 2. Auflage, New York und London: Garland Science; Pearson und Morrow (1981), "Discrete-length repeated sequences in eukaryotic genomes", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 78, Seiten 4016–4020; Bernardi, G. (2005), "Structural and evolutionary genomics – natural selection in genome evolution", Elsevier Science Publications, und Baltimore, D. (1985), "Retroviruses and retrotransposons: the role of reverse transcription in shaping the eukaryotic genome", Cell, 40 (3), Seiten 481–482. In dem dieser Anmeldung beigefügten Sequenzprotokoll wird unter SEQ ID-Nr. 17 ein Beispiel einer auf ein Virusgenom zurückführbaren Sequenz angegeben, aus der sich geeignete PCR-Primer ableiten lassen. Diese Sequenz stammt aus der Publikation von Shull und Hamer (1996), "Genetic differentiation in the rice blast fungus revealed by the distribution of the Fosbury retrotransposon", Fungal Genetics and Biology 20 (1), Seiten 59–69. Weitere Beispiele für solche Sequenzen lassen sich lassen sich auf der „Medline"-Website des „National Center for Biotchnology Information" (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ unter dem Stichwort LTR finden. Der Inhalt der vorstehend genannten Publikationen und Website ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im Rahmen der PCR alternativ als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt, der an eine Nucleotidsequenz eines transposablen Elements auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer wird ein solcher gewählt, der an eine Nucleotidsequenz eines transposablen Elements auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

Transposable oder transponierbare Elemente sind mobile genetische Elemente, d. h. DNA-Bereiche, die ihre Position innerhalb des Genoms ändern können. Der Erfinder hat erkannt, dass solche transposablen Elemente ähnlich wie bspw. Satelliten-DNA über das Genom verteilt vorliegen und dazwischenliegende Genomabschnitte meist intergenisch und hochvariable zwischen Organismen bzw. Individuen sind. Auch transposable Elemente, die gleichzeitig auf Virusgenom zurückführbare Sequenzen darstellen können, sind im Stand der Technik beschrieben; vgl. vgl. Cooper und Geoffrey (a. a. O.); Brown, T. A. (a. a. O.); Pearson und Morrow (a. a. O.); Bernardi, G. (a. a. O.) und Baltimore, D. (a. a. O.).

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im Rahmen der PCR als Vorwärts-Primer vorzugsweise ein solcher gewählt, der an eine repetitive Nucleotidsequenz eines Telomers oder Centromers auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-Primer wird ein solcher gewählt, der an eine repetitive Nucleotidsequenz eines Telomers oder Centromers auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

Auch mit dieser Maßnahme gelingt es nach Erkenntnissen des Erfinders einen genetischen Fingerabdruck von der genetischen Information des Organismus in Form eines Musters von Amplifikaten von Genomfragmenten zu erstellen. So ist es bekannt, dass in den Centromer- und Telomerbereichen von Chromosomen Wiederholungen von Hunderten oder Tausenden hintereinandergeschalteten DNA-Abschnitten liegen, die in ihrem Aufbau dem von Satelliten-DNA entsprechen. Diese repetitiven Nucleotidsequenzen weisen ebenfalls eine sehr hohe Variabilität zwischen Individuen auf und eignen sich deshalb gleichermaßen zur Entwicklung von hochspezifischen PCR-Sonden und Primern zum Nachweis dieser Individuen bzw. Organismen. Repetitive Nucleotidsequenzen in den Centromer- und Telomerbereichen von Chromosomen sind im Stand der Technik umfassend beschrieben; vgl. Brown, T. A. (a. a. O.); Griffiths, et al. (1999), „Modern genetic analysis", New York: W. H. Freeman & Co.; Cooper und Geoffrey (a. a. O.) und Alberts et al. (2002), "Molecular biology of the cell" 4. Auflage, New York and London: Garland Science. In dem beigefügten Sequenzprotokoll wird ein Beispiel zu einer solchen Sequenz unter SEQ ID-Nr. 18 gegeben das aus Borovkov und McClean (1993), „A tandemly repeated sequence from the Plasmopara halstedii genome", Gene 124 (1), Seiten 127–130 stammt und von dem Erfinder bereits erfolgreich genutzt wurde, um ein organismusspezifisches hybridisierbares Nukleinsäuremolekül herzustellen, das geeignet ist Plasmopara halstedii mit hoher Sensitivität und Spezifität nachzuweisen (siehe auch das Ausführungsbeispiel). Die vorstehend genannten Publikationen sind durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Der Erfinder hat erkannt, dass Fragmente von genomischer Information, die mittels eines DNA-Fingerprintings von Organismen gewonnen werden können, eine sehr hohe Variabilität nicht nur zwischen Organismen verschiedener Spezies sondern auch zwischen forma specialis und sogar Individuen aufweisen und sich deshalb zur Herstellung von organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremolekülen, bspw. in Form von PCR-Primern und/oder Hybridisierungssonden, besonders eignen. Diese Fragmente liegen i. d. R. zwischen repetitiven DNA-Sequenzen, die über das Genom des Mikroorganismus hinweg statistisch verteilt sind, wie bspw. zwischen Satelliten-DNA oder auch zwischen solchen auf ein Virus-Genom zurückführbaren Nucleotidsequenzen, zwischen transposablen Elementen oder zwischen repetitiven Nucleotidsequenzen eines Telomers oder Centromers. Auch Nukleotidsequenzen die zwischen randomisierten kurzen Nucleotidsequenzen von 3 bis 30 Nucleotiden liegen, können zu diesem Zweck genutzt werden.

Vor diesem Hintergrund betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls mit einer Nucleotidsequenz, die zwischen zwei Elementen auf der genetischen Information eines Organismus liegt, zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls, vorzugsweise eines PCR-Primers, wobei die zwei Elemente jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Satelliten-DNA-Nucleotidsequenz, auf Virusgenom zurückführbare Nucleotidsequenz, Nucleotidsequenz eines transposablen Elementes, repetitive Nucleotidsequenz eines Telomers/Centromers.

Im beiliegenden Sequenzprotokoll sind Beispiele für Nucleotidsequenzen solcher Nucleinsäuremoleküle genannt. Diese Nucleinsäuremoleküle leiten sich aus den Genomen der Pflanzenpathogene Peronospora arborescens, Peronospora swinglei s. l. und Fusarium oxysporum ab und werden sowohl 5'- als auch 3'-wärts von Mikrosatelitten oder Single Sequence Repeats (SSRs) flankiert. Diese beispielhaften Nucleotidsequenzen sind im beiliegenden Sequenzprotokoll unter SEQ ID-Nr. 1 bis 4 gelistet; vgl. auch Tabelle 1.

Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Nucleinsäuremolekül, das eine der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 4 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine hierzu komplementäre Nucleotidsequenz aufweist.

Die genannten Nucleinsäuremoleküle haben sich als besonders geeignet erwiesen, um als Matrize für die Herstellung von hybridisierbaren Nucleinsäuremolekülen zu fungieren, mit denen die Organismen Peronospora arborescens, Peronospora swinglei s. l. sowie Fusarium oxysporum in eine biologischen Probe nachgewiesen werden können.

Erfindungsgemäß ist es dabei bevorzugt, wenn die vorstehend genannten Nucleinsäuremoleküle eine Nucleotidsequenz von 3 bis 812, vorzugsweise von 10 bis 64, weiter vorzugsweise 12 bis 48, weiter vorzugsweise 14 bis 36, weiter vorzugsweise 16 bis 27 aufeinanderfolgenden Nucleotiden aus einer der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 4 oder einer hierzu komplementäre Nucleotidsequenz aufweisen.

Mit dieser Maßnahme werden bereits Nucleinsäuremoleküle bereit gestellt, die einen Abschnitt mit einer ausreichenden Länge aufweisen, um als PCR-Primer für den Nachweis der Organismen Peronospora arborescens, Peronospora swinglei s. l. sowie Fusarium oxysporum zu fungieren. Diese PCR-Primer sind in der Lage an solche Nucleinsäuremoleküle zu hybridisieren, die eine der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 4 oder eine hierzu komplementäre Sequenz aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nucleinsäuremolekül, das zumindest 20%, bevorzugt zumindest 30%, weiter bevorzugt 40%, vorzugsweise 50%, weiter vorzugsweise 60%, weiter vorzugsweise 70%, weiter vorzugsweise 80%, weiter vorzugsweise 90%, weiter vorzugsweise 95%, weiter vorzugsweise 99% Sequenzhomologie mit den vorstehenden Nucleinsäuremolekülen aufweist.

Auch mit solchen Nucleinsäuremolekülen können aufgrund der hohen Homologie hochselektiv und spezifisch in einer biologischen Probe die drei genannten pflanzenpathogenen Mikroorganismen nachgewiesen werden. Die Homologien lassen sich leicht mittels dem Fachmann bekannter Verfahren ermitteln, bspw. einer BLAST-Analyse oder mittels des MegAlign Moduls des Lasergene Programms von DNAStar Inc.. Die angegebenen Identitäten beziehen sich auf das gesamte vorstehend genannte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül bzw. auf einen Abschnitt hiervon mit ≥ 10 Nucleotiden.

Ein weiterer Gegenstand betrifft ein solches Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eines der vorstehend genannten Nucleinsäuremoleküle hybridisiert.

Auch ein solches Nucleinsäuremolekül weist die Eigenschaften der zuvor beschriebenen Nucleinsäuremoleküle auf und ist deshalb zum spezifischen Nachweis der Pflanzenpathogene geeignet. Unter stringenten Bedingungen werden solche verstanden, unter denen nur nahezu perfekt, d. h. zu 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% basengepaarte Nucleinsäurestränge gebildet werden und stabil bleiben. Stringente Bedingungen lassen sich bspw. durch die Veränderung der Salzkonzentrationen, dem pH-Wert, der Temperatur etc. in dem Medium einstellen, in dem die Bindung der Nucleinsäurestränge erfolgen soll.

Weitere Kriterien, die der Fachmann bei der Ausgestaltung von PCR-Primern berücksichtigen kann, finden sich in Sambrook und Russel (a. a. O.), Chapter 8, Table 8.3, der Inhalt dieser Tabelle ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn nach Schritt 2 und vor Schritt 3.1 weitere folgende Schritte durchgeführt werden: 2.1 Inkubation der genetischen Information des Organismus mit zumindest einer Restriktionsendonuclease zum Erhalt einer Mischung von Restriktionsfagmenten, und 2.2 Ligation von Oligonucleotiden einer definierten Nucleotidsequenz (Adaptorsequenz) an die freien Enden der Restriktionsfragmente zum Erhalt von Fragmenten der genomischen Information, wobei die Amplifizierung in Schritt 3.1 mittels Polymerase-Kettenraktion (PCR) erfolgt und als Vorwärts-Primer ein solcher gewählt wird, der an die Adaptorsequenz auf dem ersten DNA-Strang des Organismus hybridisiert, und als Rückwärts-PCR-Primer ein solcher gewählt wird, der an die Adaptorsequenz auf dem zu dem ersten DNA-Strang komplementären DNA-Strang des Organismus hybridisiert.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine im Rahmen des DNA-Fingerprintings etablierte Methode mit der Bezeichnung „amplified fragment length polymorphism" (AFLP) verwendet wird, die ebenfalls zum Erhalt eines Musters von Amplifikaten von Genomfragmenten mit erfindungsgemäß gewünschten Eigenschaften führt. Im ersten Schritt wird die genomische Information des interessierenden Organismus mit einer Restriktionsendonuclease mit bekannter Schnittstellenspezifität geschnitten. Im nächsten Schritt werden kurze Nucleinsäuremoleküle als sog. Adaptoren bereitgestellt, die durch den Fachmann derart ausgestaltet werden, dass sie komplementär zu den Enden der generierten Restriktionsfragmente sind und ferner Hybridisierungsstellen für PCR-Primer für den folgenden PCR-Schritt aufweisen. Die Adaptoren weisen demnach eine dem Fachmann bekannte Sequenz auf, die sich an der Restriktionsschnittstelle und der Sequenz der PCR-Primer für die anschließende Amplifikation orientiert. Im nächsten Schritt erfolgt eine Amplifikation der Ligationsprodukte bzw. der genomischen Fragmente mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Dazu werden Primer verwendet, die zu den Adaptoren passen. Als Amplifikat wird dann das zwischen den Adaptoren liegende Genomfragment erhalten. Fakultativ könne Maßnahmen zur Reduzierung der Anzahl der genomischen Fragmente ergriffen werden, sollte diese aufgrund der gewählten Restriktionsendonuclease besonders hoch und damit nur schlecht handhabbar sein. Hierfür können bspw. weiterer Amplifikationen nachgeschaltet werden, was zu einer Reduzierung der genomischen Fragmente führt. Das AFLP-Verfahren ist bspw. beschrieben in Weising et al. (a. a. O.). Diese Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn zur Erstellung des genetischen Fingerabdrucks in Schritt 3 folgendes Verfahren durchgeführt wird: 3.1.1 Inkubation der genetischen Information mit zumindest einer Restriktionsendonuclease zum Erhalt einer Mischung von Fragmenten der genomischen Information, 3.1.2 Ligation der Fragmente der genomischen Information in Vektoren, 3.1.3 Einbringung der Vektoren in Wirtsorganismen, fakultativ 3.1.3' Ausplattierung der Wirtsorganismen auf Kultivierungsplatten, 3.1.4 Amplifizierung der Vektoren in den Wirtsorganismen, 3.1.5 Isolierung der amplifizierten Vektoren zum Erhalt einer Mischung von Amplifikaten von Fragmenten der genomischen Information, und 3.2 Vereinzelung der in der Mischung enthaltenen Amplifikaten zum Erhalt eines Musters von Amplifikaten von Fragmenten der genomischen Information.

Diese Maßnahme stellt nach Erkenntnissen des Erfinders eine alternative Vorgehensweise zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks dar, die mittels laborüblicher Reagenzien und Methoden zuverlässig durchgeführt werden kann.

Die Vereinzelung in Schritt 3.2 des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt bspw. mittels einer chromatographischen und/oder elektrophoretischen Methode.

Besonders geeignet sind gelelektrophoretische Verfahren, bei denen die Amplifikate durch die Wanderung in einem elektrischen Feld bspw. entsprechend ihrer Größe voneinander getrennt werden. Geeignet sind jedoch auch chromatographische Verfahren, wie die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), sowie sämtliche Verfahren, die zur Trennung von in einer Mischung vorliegenden Nucleinsäuremolekülen unterschiedlicher Zusammensetzung und/oder Länge und/oder Ladung geeignet sind. Derartige Verfahren sind dem Fachmann allgemein bekannt; vgl. Sambrook und Russell (a. a. O.).

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, wenn in Schritt 4 zumindest ein solches Amplifikat Isoliert wird, das in Relation zu den übrigen Amplifikaten überdurchschnittlich stark amplifiziert wurde.

Wie der Erfinder feststellen konnte, eignen sich solche Amplifikate, die in hoher Menge vorliegen, besonders gut als Matrize zur Herstellung eines speziespezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls. Die solchen Amplifikaten zugrundeliegende Abschnitte liegen in der genomischen Information des interessierenden Organismus entweder in hoher Kopienzahl vor oder bilden bei der Amplifizierung kaum störende Sekundärstrukturen aus. Solche besonders gut amplifizierbaren Abschnitte lassen sich bspw. nach gelelektrophoretischer Auftrennung der Mischung von Amplifikaten und anschließender Anfärbung mit einer geeigneten Substanz, bspw. Ethidiumbromid, anhand einer besonders stark ausgeprägten bzw. prominenten Gelbande erkennen. Die Gelbanden können bspw. densidometrisch vermessen und es kann ein Durchschnitt der Messwerte gebildet werden. Eine „überdurchschnittlich" starke Amplifizierung eines Amplifikates liegt vor, wenn einer Gelbande in der Densidometrie überdurchschnittliche Werte zugeordnet werden können. Besonders bevorzugt ist es, wenn ein überdurchschnittlich amplifiziertes Amplifikat doppelt, dreifach, vierfach, fünfach, oder zehnfach so stark amplifiziert wird, wie der Durchschnitt der Amplifikate. Die Isolierung eines solchen überdurchschnittlich stark amplifizierten Amplifikates erfolgt bspw. dadurch, dass die entsprechende Bande aus dem Gel ausgeschnitten wird und das darin enthaltenen Amplifikat mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren eluiert wird.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es ferner bevorzugt, wenn nach Schritt 4 und vor Schritt 5 folgende weitere Schritte erfolgen: 4.1 Einfügung des isolierten Amplifikats in einen Vektor, 4.2 Einbringen des Vektors in einen geeigneten Organismus, und 4.3 Isolieren des Vektors aus dem Organismus zum Erhalt von zumindest einem isolierten Amplifikat.

Durch diese Maßnahmen werden Ansatzstellen für die anschließende Sequenzierung geschaffen. Die Organismen, vorzugsweise Mikroorganismen wie Escherichia coli, „reparieren" den Vektor und machen damit das Amplifikat besonders gut sequenzierbar. Das im Vektor enthaltene Amplifikat steht dadurch für die anschließenden Verfahrensschritte in optimaler Form zur Verfügung.

In Schritt 6 des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise ein solcher Abschnitt ausgewählt, der eine Länge von 3 bis 1000 Nucleotiden, von vorzugsweise 10 bis 64, weiter vorzugsweise 12 bis 48, weiter vorzugsweise 14 bis 36, weiter vorzugsweise 16 bis 27 Nucleotiden aufweist, wobei weiter bevorzugt das anschließend in Schritt 7 hergestellte Nucleinsäuremolekül als PCR-Primer ausgestaltet wird.

Erfahrungsgemäß weisen Hybridisierungssonden bzw. PCR-Primer die vorstehend genannte Anzahl von Nucleotiden auf, die in ihrer Sequenz komplementär zu der nachzuweisenden Zielsequenz sind. Hybridisierungssonden und PCR-Primer können eine Länge von 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 150 bzw. 200 bis 2000 Nucleotiden aufweisen, und deren Sequenz komplementär zu der Zielsequenz ist. Optimalerweise liegt die Anzahl der Nucleotide bei 20 ± 10. Kriterien, die der Fachmann bei der Ausgestaltung von PCR-Primern berücksichtigt finden sich in Sambrook und Russel (a. a. O.), Chapter 8, Table 8.3, der Inhalt dieser Tabelle ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Der Erfinder konnte mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bereits eine Vielzahl von organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremolekülen herstellen, die in dem beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID-Nr. 5 bis 15 aufgeführt sind; vgl. auch Tabelle 2.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ferner ein Nucleinsäuremolekül, das eine der Nucleotidsequenzen SEQ ID Nr. 5 bis 15 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder eine hierzu komplementäre Nucleotidsequenz aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nucleinsäuremolekül, das zumindest 20%, bevorzugt zumindest 30%, weiter bevorzugt 40%, vorzugsweise 50%, weiter vorzugsweise 60%, weiter vorzugsweise 70%, weiter vorzugsweise 80%, weiter vorzugsweise 90%, weiter vorzugsweise 95%, weiter vorzugsweise 99% Sequenzhomologie mit dem vorstehenden Nucleinsäuremolekül aufweist.

Auch mit solchen Nucleinsäuremolekülen kann aufgrund der hohen Homologie hochselektiv und speziespezifisch ein pflanzenpathogener Mikroorganismus nachgewiesen werden. Die Homologien lassen sich leicht mittels dem Fachmann bekannter Verfahren ermitteln, bspw. einer BLAST-Analyse oder mittels des MegAlign Moduls des Lasergene Programms von DNAStar Inc. Die angegebenen Identitäten beziehen sich auf das gesamte vorstehend genannte erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül bzw. auf einen Abschnitt hiervon mit ≥ 10 Nucleotiden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an das zuvor beschriebene Nucleinsäuremolekül hybridisiert.

Auch ein solches Nucleinsäuremolekül weist die Eigenschaften des zuvor beschriebenen Nucleinsäuremoleküls auf und ist deshalb zum spezifischen Nachweis der genannten Mikroorganismen geeignet. Bezüglich der Bestimmung von stringenten Bedingungen wird auf die weiter oben gegebene Definition verwiesen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit, das zumindest eines der zuvor genannten Nucleinsäuremoleküle, eine Beschreibung zur Verwendung des Nucleinsäuremoleküls sowie ggf. Puffer und Chemikalien aufweist.

Derartige Kits können bspw. für jeden nachzuweisenden Mikroorganismus als Diagnosekit zusammengestellt werden. Ein solches Diagnosekit enthält dann bspw. die für den jeweiligen nachzuweisenden pathogenen Organismus hochselektiven PCR-Primer sowie eine DNA-Probe des entsprechenden Organismus als Positivkontrolle. Ferner enthält ein solches Diagnosekit eine Beschreibung mit genauen Informationen dazu, wie das anschließende Diagnoseverfahren durchzuführen ist. Es versteht sich, dass das Kit für die Durchführung des Diagnoseverfahrens geeignete Puffer, Chemikalien und sonstige Hilfsstoffe enthalten kann. Die Bereitstellung eines solchen Kits hat den Vorteil, dass alle erforderlichen Chemikalien und Informationen bereitgestellt werden, so dass auch von ggf. wenig geschultem Personal ein entsprechendes Nachweisverfahren fehlerfrei durchgeführt werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Organismus in einer biologischen Probe, das folgende Schritte aufweist: 1. Bereitstellung einer Nucleinsäure enthaltenden biologischen Probe, 2. Isolierung der Nucleinsäure aus der Probe, 3. Unterziehung der isolierten Nucleinsäure einer Polymerase-Kettenraktion (PCR), 4. Feststellung, ob in Schritt 3 eine Amplifikation der isolierten Nucleinsäure erfolgt ist, und 5. Korrelation einer positiven Feststellung in Schritt 4 mit dem Vorhandensein des Organismus in der Probe, und Korrelation einer negativen Feststellung in Schritt 4 mit der Abwesenheit des Organismus in der Probe, wobei in Schritt 3 als PCR-Primer zumindest ein Nucleinsäuremolekül verwendet wird, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften und Merkmale ergeben. Die Ausführungsbeispiele schränken die Reichweite der Erfindung jedoch keinesfalls ein.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Herstellung eines organismusspezifischen Nucleinsäuremoleküls1. Biologische Probe

Als biologische Probe werden Mycel und Sporangien von Peronospora swinglei s. l., dem Falschen Mehltau des Basilikums, bereit gestellt. „s. l." bedeutet sensu lato, lateinisch für „im weiteren Sinne", da die Identität des Erregers nicht abschließend geklärt ist.

2. Isolierung der genomischen Information

5 mg der Sporangien werden in einem Reaktionsgefäß von. 2 ml, mittels eines hierfür geeigneten Gerätes, bspw. einer Schüttelmühle, unter Zugabe von Mahlkörpern, bspw. kleinen Eisenkügelchen, zerkleinert.

Die zerkleinerten Sporangien werden mit 500 μl einer Detregenz-Lösung versetzt, um die Membranen des Organismus zu zerstören und somit die genomische DNA freizusetzen. Die Lösung kann bspw. bestehen aus 0,1 M Tris pH 8, 0.05 M EDTA, 2% SDS, Proteinase K.

Die zerkleinerten Sporangien werden in dem Reaktionsgefäß mit der oben genannten Lösung für mehrere Minuten, bspw. 30 min bei 65°C, inkubiert.

Das Reaktionsgefäß wird bspw. für 5 min bei 10 000 s/t2·9,81 zentrifugiert, um Zelltrümmer zu sedimentieren.

Die flüssige Phase wird abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu der flüssigen Phase wird eine proteinausfällende, bevorzugterweise eine phasentrennenden Lösung, bspw. Chloroform und Isoamylalkohol in Verhältnis 24 zu 1, beispielsweise in gleicher Menge wie die bereits im Reaktionsgefäß befindlichen Flüssigkeit hinzugegeben.

Die Phasen werden gemischt, bspw. durch mehrfaches Schwenken des Reaktionsgefäßes entlang der Längsachse.

Das Reaktionsgefäß wird gemischt, bspw. für 10 min bei 10 000 s/t2·9,81, um die Phasen der Proteinfällung zu trennen.

Die wässrige Lösung wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

Es erfolgt die Zugabe einer DNA-ausfällenden Lösung, bspw. Isopropanol mit einem Volumen von 50% des Volumens der überführten wässrigen Phase.

Daran an schließt sich eine Inkubation mit der DNA-ausfällenden Lösung, bspw. für 20 min bei 4°C.

Das Reaktionsgefäß wird bspw. für 20 min bei 10 000 s/t2·9,81 und 4°C zentrifugiert, um die DNA zu sedimentieren.

Der Überstand wird abgenommen.

Die sedimentierte DNA wird getrocknet, bspw. durch Abblasen mit moderatem Luftstrom.

Die DNA wird in Pufferlösung oder Wasser, bspw. bidestilliertem Wasser, gelöst.

3. Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks

Einer PCR-Reaktion wird in einem PCR-geeigneten Reationsgefäß angesetzt, bspw. bestehend aus 2,5 μl 10x PCR-Puffer, 2,5 μl einer 2mM Lösung der vier Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs), 2,5 μl Magnesiumchloridlösung (20 mM), 1 U einer thermostabilen DNA-Polymerase, bspw. Taq DNA-Polymerase, 1 μl einer bspw. 25 mM Lösung des PCR-Primers t3B (5'-AGGTCGCGGTTCGAATCC-3'; SEQ ID-Nr. 16). Der Primer ist so ausgestaltet, dass er an den Mikrostelliten t3B binden kann. Der Ansatz wird mit Wasser auf 25 μl aufgefüllt.

Es erfolgt die Durchführung der PCR, bspw. mit folgenden Bedingungen: Die Inkubation in einem Thermocycler erfolgt gemäß der gerätespezifischen Modalitäten. Zunächst erfolgt bspw. eine Inkubation, bspw. bei 94°C für 2 min. Anschließend erfolgt eine Inkubation bei bspw. 94°C, für 1 min. Danach eine Inkubation, bspw. bei 56°C für 1 min. Anschließend erfolgt eine Inkubation, bspw. bei 72°C für 2 min. Die letzten drei Schritte werden anschließend bspw. 30 mal wiederholt. Es kann sich dann bspw. eine abschließende Inkubation, bspw. bei 72°C für 4 min durchgeführt werden.

Die in der PCR erhaltenen Amplifikate werden aufgetrennt, bspw. mittels Gelelektrophorese, bspw. in einem Agarosegel. Dieses kann bspw. hergestellt werden, indem 1 g Agarose in ein Gefäß gegeben werden, auf 100 μl mit einer innenhaltigen Flüssigkeit aufgefüllt wird, bspw. mit Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE). Danach wird die PCR-Reaktionslösung in eine präformierte Vertiefung des Agarosegelsgegeben, bspw. nach Versetzen mit 1/6 vol. Glycerin und ggf. Farbstoffen, die bei der Elektrophorese in die gleiche Richtung laufen wie die DNA-Fragmente im Agarosegel und der Kontrolle des Fortschreitens der Elektrophorese diesen. Die Elektrophorese selbst erfolgt in einer dafür vorgesehenen Elektrophoresekammer, die mit einer zum Gel isotonischen Innenhaltigen Lösung gefüllt ist, bevorzugterweise mit derselben die zur Herstellung des Agarosegels verwandt worden ist. Durch Anlegen einer Spannung, bspw. 140 V, wird die Wanderung der DNA-Fragmente durch das Agarosegel erzwungen, die durch das selektive Rückhaltevermögen, welches insbesondere auf der Größe der wandernden Fragmente beruht, aufgetrennt werden. Anschließend erfolgt eine Färbung mit einem an Nukleinsäuren assozierenden oder bindenden Farbstoff, bspw. Ethidiumbromid, bspw. durch inkubieren des Agarosegels für eine halbe Stunde in einem ethidiumbromidhaltigen Färbebad.

4. Isolierung eines Amplifikates

Eine besonders gut amplifizierte Bande, hier bspw. im Bereich von 400 bis 900 bp, wird aus dem Agarosegel ausgeschnitten.

Die Nukleinsäure, die in dieser Bande enthalten ist, wird eluiert, bspw. mittels eines gängigen Gelextraktionskits, bspw. des QIAquick Gel Extraction Kits, nach Maßgabe des Herstellers QIAGEN.

Es folgt ein Einbringen und Vervielfältigen der erhaltenen Nukleinsäuremoleküle in einen PCR-Fragment-Klonierungvektor mittels eines handelüblichen PCR-Fragment-Klonierungskits, bspw. des TOPO TA Cloning Kits der Fima Invitrogen nach Maßgabe des Herstellers.

Das nun in einen Vektor eingeschlossene Nukleinsäurefragment, das in Schritt 3 erzeugt und in Schritt 4 ausgewählt und aufgereinigt wurde, wird isoliert, bspw. mittels eines handelsüblichen Plasmidpräparationskits, bspw. des GeneElute HP Plasmid Midiprep Kits der Firma Sigma, ensprechend den Anweisungen des Herstellers.

5. Sequenzierung des isolierten Nukleinsäuremoleküls

Es folgt eine Sequenzierung der Plasmide aus Schritt 4 die das in Schritt 3 erzeugte und in Schritt 4 ausgewählte und aufgereinigte Nukleinsäuremolekül enthalten, und zwar mittels vektorspezifischer Sequenzierprimer und gängiger Verfahren, bspw. mittels des BigDye v3.1 Terminator Cycle Sequencing Kits von Applied Biosystems, gemäß den Angaben des Herstellers und anschließender Aufklärung der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls, bspw. mittels eines Kapillarsequenziergerätes, bspw. des Geräts AbiPrism 3730x1 DNA Analyzers von Applied Biosystems, gemäß der Angaben des Herstellers.

Im Falle dieses Ausführungsbeispiels wurde die Nukleotidsequenz SEQ ID-Nr. 2 ermittelt.

In der Tabelle 1 werden einige weitere Beispiele von Nucleotidsequenzen aus dem Genom von verschiedenen Pflanzenpathogenen gegeben, die sowohl 5'- als auch 3'-wärts von Mikrosatelitten wie dem t3B, oder Single Sequence Repeats (SSRs) flankiert werden.

OrganismusFlankierende ElementeHochvariables Fragment [SEQ ID-Nr.]Peronospora arborescensMikrosatellit t3B; beidseitig1Peronospora swinglei s. l.Mikrosatellit t3B; beidseitig2Fusarium oxysporumSingle Sequence Repeats (SSRs); beidseitig, Sequenz: [GACA]43Fusarium oxysporumMikrosatellit t3B; beidseitig4
Tabelle 1: Beispiele von Nucleinsäuremolekülen bzw. Nucleotidsequenzen, die zur Herstellung eines organismusspezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremoleküls geeignet sind.

6. Auswahl eines zur Herstellung eines spezifischen hybridisierbaren Nukleinsäuremoleküls geeigneten Abschnitts

Aufgrund der in Schritt 5 aufgeklärten Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls wurden zwei hybridisierbare Nukleinsäuremoleküle entworfen, welche als PCR-Primer eingesetzt werden können. Das hybridisierbare Nukleinsäuremolekül, das als S_Ps_F bezeichnet wurde und als Vorwärts-PCR-Primer eingesetzt werden kann, weist die Sequenz 5'-tgctctcgcaggtctgactacc-3' auf (SEQ ID-Nr. 7). Das hybridisierbare Nukleinsäuremolekül, das als S_Ps_R bezeichnet wurde und als Rückwärts-PCR-Primer eingesetzt werden kann, weist die Sequenz 5'-cacgcaaatccctacctctgcc-3' auf (SEQ ID-Nr. 8).

Zwei weitere hybridisierbare Nukleinsäuremoleküle wurden als Primer für eine verschachtelte oder nested-PCR ausgestaltet, bei der eine zweite Amplifikation basierend auf der ersten Amplifikation genutzt wird, um die Empfindlichkeit noch weiter zu erhöhen. Das hybridisierbare Nukleinsäuremolekül, das als S_Ps_Fn bezeichnet wurde und als Vorwärts-PCR-Primer eingesetzt werden kann, weist die Sequenz 5'-gtcttaacgagaccgcgtggtc-3' (SEQ ID-Nr. 9) auf. Das hybridisierbare Nukleinsäuremolekül, das als S_Ps_Rn bezeichnet wurde und als Rückwärts-PCR-Primer eingesetzt werden kann, weist die Sequenz 5'-atgacggcaggtgctgtcgttc-3' (SEQ ID-Nr. 10) auf.

Diese Nukleotidfolgen wurden so gewählt, dass sie nach Stand der Wissenschaft spezifisch hybridisieren und auch nach Datenbankabgleich (GenBank) mit höchster Wahrscheinlichkeit organismusspezifisch sind, da sie sich einzeln in Teilen nur in wenigen und kombiniert in keiner Sequenz eines in GenBank katalogisierten Nukleinsäuremoleküls wieder finden.

In der nachstehenden Tabelle 2 sind einige Beispiele von PCR-Primern gelistet, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens generiert wurden.

Tabelle 2: Beispiele von speziespezifischen hybridisierbaren Nucleinsäuremolekülen zum Nachweis von ausgewählten Pflanzenpathogenen.

7. Herstellung eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle, das den in Schritt (6) ausgewählten Abschnitt aufweist

Die Herstellung eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle, das den in Schritt 6 ausgewählten Abschnitt aufweist, erfolgt bspw. mittels einer 96 Column DNA Synthesizer Workstation der Firma PolyGen nach Maßgabe des Herstellers. Zahlreiche kommerzielle Anbieter, bspw. die Firma Sigma-Aldrich, bieten die Herstellung von Nukleotidoligomeren und -polymeren an.

Beispiel 2: Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle zum spezifischen Nachweis eines Organismus in einer biologischen Probe

Der Organismus kann nun mittels einer PCR nachgewiesen werden, bspw. entsprechend Schritt 3 aus Beispiel 1.

Der Nachweis erfolgt dabei in drei Schritten. Im ersten Schritt wird eine Probe zur Verfügung gestellt, welche möglicherweise genomhaltige Bestandteile (bspw. Zellen oder Mycel) des nachzuweisenden Organismus, in diesem Falle Peronospora swinglei s.l. enthält. Dies kann beispielsweise Saatgut sein. Im zweiten Schritt wird DNA aus der zur Verfügung gestellten Probe extrahiert, bspw. entsprechend Schritt 2 aus Beispiel 1, in auf die Menge der Probe abgestimmter Form. In einem dritten Schritt wird eine Vervielfältigung eines Genomabschnittes des Zielorganismus, bspw. mittels PCR, bspw. entsprechend Schritt 3 aus Beispiel 1, und anschließender nested-PCR, durchgeführt.

Waren genomhaltige Teile des Erregers in der Probe vorhanden, erscheint in der anschließenden elektrophoretischen Auftrennung und Anfärbung eine im UV-Licht fluoreszierende Bande, die die Präsenz des Zielorganismus in der Probe verrät.

Handelt es sich bei der untersuchten Probe um den Teil einer Saatgutpartie, so kann diese vom Markt genommen werden und somit die Verbreitung des Zielorganismus, in diesem Falle eines gefährlichen Schaderregers unterbunden werden. Sequenzprotokoll

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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