Title:
Sekretierte Luziferase Lu164M3 und deren Verwendung
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz sowie die Aktivität und Verwendung von Lu164M3 sowie der Verwendung von sekretierten Luziferasen.




Inventors:
Erfinder wird später genannt werden
Application Number:
DE102007005804
Publication Date:
08/07/2008
Filing Date:
02/06/2007
Assignee:
Bayer HealthCare AG (Leverkusen, 51373, DE)
International Classes:



Foreign References:
WO2002042470A12002-05-30
Other References:
Alam et al., 1990
Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992
Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997
Snowdowne et al., 1984
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Claims:
1. Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfassen;
c) Fragmenten der Nukleinsäuremoleküle gemäß a) oder b), wobei die Fragmente funktionelle Luziferasen kodieren und den Bereich der Aminosäuren 17–20 (AQKT) bezogen auf SEQ ID NO: 2 umfassen.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche einen funktionalen Promotor 5' zur das Photoprotein kodierenden Sequenz enthält.

3. Rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche Nukleinsäuren nach Anspruch 2 enthalten.

4. Eukaryontische oder prokaryontische Zelle oder ein nicht humaner Organismus, einen Vektor gemäß Anspruch 3 enthaltend.

5. Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1 sind.

6. Polypeptid, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert ist.

7. Verfahren zur Expression der Luziferase Polypeptide gemäß Anspruch 6 in Bakterien, eukaryotischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

8. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines Luziferase Polypeptides gemäß Anspruch 6.

9. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die Luziferase MLuc7 erkannt werden.

10. Verwendung einer eine Luziferase kodierende Nuldeinsaüre gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 als Marker- oder Reportergen.

11. Verwendung einer Luziferase gemäß Anspruch 6 als Marker oder Reporter.

12. Antikörper, der spezifisch eine Luziferase gemäß Anspruch 6 erkennt.

13. Verwendung gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei neben der Luziferase MLuc7 mindestens ein weiteres Reportergen eingesetzt wird.

14. Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte und/oder zelluläre Luziferasen handelt.

15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte Luziferasen handelt.

16. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um die firefly Luziferase, oder um Luziferasen aus dem Organismus Metridia longa handelt.

17. Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei den weiteren sekretierten Luziferasen um Luziferasen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 handelt.

18. Verfahren gemäß Ansprüchen 10, 11, oder 13, wobei die Lumineszenzmessungen kinetisch ausgewertet werden.

19. Verfahren gemäß Ansprüchen 10, 11, 13 oder 18, wobei mehrere Zielproteine gemessen werden.

20. Verfahren zur Identifizierung von Zelllinien mit rekombinanten Genen, dadurch gekennzeichnet, dass eine sekretierte Luziferase als Reportergen eingesetzt wird und dass die Luziferase-Aktivität aus dem Überstand der kultivierten Zellen ermittelt wird.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei es sich bei den sekretierten Luziferasen um eine Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MLuc7, Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 handelt.

Description:

Die Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung der sekretierten Luziferase Lu164M3, sowie der Verwendung von sekretierten Luziferasen.

Luziferasen

Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.

Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.

Eine Übersicht über lumineszierende Organismen findet sich bei Wilson & Hastings 1998.

Bei den Luziferasen handelt es sich um Peroxidasen oder Mono- und Dioxygenasen. Die Enzym-Substrate, die die Ausgangssubstanzen für die lichtemittierenden Produkte bilden, heißen Luciferine. Sie sind von Species zu Species unterschiedlich. Die Quantenausbeute der Systeme liegt zwischen 0,1–0,9 Photonen je umgesetztem Substratmolekül.

Luziferasen lassen sich aufgrund ihrer Herkunft oder ihrer enzymatischen Eigenschaften klassifizieren. Luziferasen lassen sich ebenfalls durch ihre Substratspezifität voneinander unterscheiden. Zu den wichtigsten Substraten gehören Coelenterazine und Luciferin, sowie Derivate beider Substanzen.

Luziferase Substrate

Im Folgenden werden die Strukturen einiger Luziferasesubstrate beispielhaft dargestellt: CoelenterazineCoelenterazine fCoelenterazine eCoelenterazine cpCoelenterazine hCoelenterazine nFirefly LuziferinCypridia Luziferin

Sekretierte Luziferasen

Luziferasen, die vom Wirtsorganismus als rekombinantes- oder wilttyp-Protein aus dem Cytosol ins umgebende Milieu abgegeben werden, bezeichnet mal als sekretierte Luziferasen. Tabelle 1 zeigt eine Übersicht über sekretortische Luziferasen:

LuziferaseOrganismusRefenenzLu164Metridia longaWO 0242470 A1Lu22Metridia longaWO 0242470 A1LuALMetridia longaWO 0242470 A1Lu39Metridia longaWO 0242470 A1Lu45Metridia longaWO 0242470 A1Lu16Metridia longaWO 0242470 A1Lu52Metridia longaWO 0242470 A1Cypridina LuziferaseCypridina HilgendorfiiTsuji et al. 1974Gaussia LuziferaseGaussia princepsChristopoulos et al. 2002
Tabelle 1Übersicht über sekretierte Luziferasen

Die sekretierte Luziferase Lu164 ist ebenfalls beschrieben in Markova et al. 2004.

Reportersysteme

Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.

  • 1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
  • 2. Reportergen. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehört die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).

Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.

Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.

Sekretierte Luziferase Lu164M3

Bei der Suche nach Mutanten der sekretierten Luziferase Lu164 aus Metridia longa wurde überraschenderweise eine Mutante identifiziert (im weiteren als Lu164M3 genannt) und kloniert, deren biochemische und physikochemische Eigenschaften sich deutlich von den bisher identifizierten Luziferase Lu164 unterscheidet. Diese Eigenschaften werden im folgenden beschrieben:

Kinetik

Bei der Expression der sekretierten Luziferase Lu164M3 stellte sich überraschenweise heraus, das die Luziferase eine veränderte zeitliche Auflösung der Biolumineszenzreaktion (Kinetik) ausweißt. Der Verlauf der Biolumineszenzreaktion für Lu164M3 und Lu164 ist in 3 gezeigt. Deutlich ist die wesentlich schnellere Kinetik von Lu164M3 zu erkennen. Lu164M3 zeigt schon nach wenigen Sekunden einen Abfall der zu messenden Lumineszenz pro Sekunde als Lu164. Nach 50 Sekunden sind bereits 65–80% des Integralsignals von 90 Sekunden erfaßt. Lu164 zeigt einen wesentlich langsameren Abfall des Biolumineszenzsignals pro Sekunde, so daß auch noch nach 90 Sekunden ein deutliches Signal über Hintergrund meßbar ist. Lu164M3 unterscheidet sich daher kinetisch von den bisher beschriebenen sekretierten Luziferasen von Metridia longa. Lu164M3 kann aufgrund dieser Eigenschaft überraschenderweise in Kombination mit anderen Coelenterazin-abhängigen oder Coelenterazin-unabhängigen Luziferasen genutz werden, da eine kinetische Unterscheidung möglich ist.

Aktivität

Bei der Expression der sekretierten Luziferase Lu164M3 stellte sich überraschenweise heraus, das die Luziferase eine veränderte Aktivitätsverteilung der Biolumineszenzreaktion aufgrund der veränderten kinetischen Eigenschaften aufweist. Zu Beginn der Biolumineszenzreaktion ist die zu messende Aktivität von Lu164M3 pro Sekunde deutlich höher als von Lu164. Diese höhere Biolumineszenz ermöglicht eine höhere Sensitivität der verwendeten Meßmethode, da eine geringere Anzahl an Zellen, eine geringere Aktivierung der Lu164M3-Expression oder eine geringer Substratkonzentration eine Messung deutlich über dem Hintergrundsignal ermöglicht.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lu164M3 zur Verbesserung der Sensitivität, der Verwendung geringer Zellzahlen oder geringer Substratkonzentrationen.

Kinetische Auswertung

Die veränderten kinetischen Eigenschaften von Lu164M3 ermögliche eine differenzierte kinetische Auswertung der Biolumineszenz. Bei einer konkinuierlichen Messung über (zum Beispiel) 90 Sekunden können verschiedene Intervalle zur Auswertung herangezogen werden. Durch die Wahl des Messfensters kann daher zwischen den Luziferasen unterschieden werden. Die Form der Kinetikkurve kann in Abhängigkeit von den gewählten experimentellen Bedingungen variieren.

Die Länge und Auswahl der Messintervalle können sich an den jeweiligen Experimenten Bedingungen orientieren und sind flexible einsetzbar. Auch die Gesamtmesszeit ist aufgrund der dargestellten Daten flexible wählbar.

Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von Lu164M3.

Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52.

Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität sekretierter Luziferasen.

Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von erfindungsgemäßen Proteinen.

Multiplexing

Bei der Expression der sekretierten Luziferase Lu164M3 stellte sich überraschenweise heraus, das sich die Luziferase aufgrund ihrer veränderten Eigenschaften besonders für Multiplex-Reaktionen eignet. Die Luziferase Lu164M3 zeigt im Vergleich zu anderen Luziferasen eine deutlich schnellere Kinetik, wodurch eine Kombination mit anderen lumineszenten oder nicht-lumineszenten Messmethoden (readouts) möglich wird.

Um lumineszente Messverfahren zu kombinieren, ist es notwendig, dass sich die lumineszenten Systeme nicht gegenseitig inhibieren oder die jeweiligen Signale überstrahlen. Nach der Aktivierung des ersten Systems (zum Beispiel durch Substratzugabe) muss die Lumineszenz auf das Ausgangsniveau zurückgegangen sein, bevor die zweite Reaktion gestartet werden kann. Dies ist auch notwendig, wenn beide Systeme unabhängige Substrate verwenden. Lu164M3 verkürzt aufgrund ihrer schnellen Kinetik den Zeitraum zwischen den Messung deutlich. Eine Inaktivierung der Reaktion ist nicht notwendig. Da es sich bei der Luziferase Lu164M3 um eine sekretierte Luziferase handelt, ist eine Kombination auch mit intrazellulären Systeme (wie zum Beispiel Firefly Luziferase) möglich.

Auch anderere Luziferasen von Metridia longa eignen sich zur Kombination mit intrazellulären Systemen wie der Firefly Luziferase. Allerdings ist ein Inaktivierungsschritt notwendig, um die Restbiolumineszenz auf ein niedriges Niveau abzusenken. 6 zeigt beispielhaft die Kombination sekretierter Luziferasen (am Beispiel der Luziferase Lu164) aus Metridia longa mit der intrazelluläre Luziferase Firefly. Hierbei könne die Luziferasen entweder in der einer oder verschiedenen zellulären Systeme expremiert werden. Im gewählten Beispiel wurden die Luziferasen Firefly und Lu164 jeweils in Vektoren mit CRE-Promotoren stabil in CHO Zellen expremiert. Die Zellen wurden zur Messung kokultiviert und die cAMP-abhängigen Promotoren durch die Zugabe von Forskolin für 4 Stunden unter Standardbedingungen inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von Coelenterazin direkt zu den kultivierten Zellen. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe gestartet.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lu164M3 in multiplexen Ansätzen, bei denen Lu164M3 in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von Lu164M3 in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 in multipexen Ansätzen, bei denen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen in multipexen Ansätzen, bei denen sekretierte Luziferasen in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von sekretierten Luziferasen in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in multipexen Ansätzen, bei denen erfindungsgemäße Proteine in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.

Identifizierung der Luziferase Lu164M3

Zur Herstellung der Mutanten wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen und Deletionen eingefügt.

Die Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase Lu164M3 mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt in SEQ ID NO: 1.

Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente der sekretierten Luziferase Lu164M3. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische oder biochemische Eigenschaften aufweisen.

Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des Lu164M3 Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.

Ebenfalls sind Mutanten des Lu164M3 Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reportergen für die Technik des „high content screening" (HCS). HCS steht als Übergriff für moderne Mikroskopie-Technologien zur Zellanalyse. Kennzeichnend für HCS-Verfahren ist die quantitative Erfassung mehrerer Parameter auf zellulärer oder subzellulärer Ebene

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Sängerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Photoproteine und Ionenindikatoren, speziell Aequorin, Clytin, Obelin, Berovin und Bolinopsin.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 sich als sich als Markerprotein, speziell bei der FACS (Fluorescence activated cell sorter) Sortierung.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Fusionsproteine speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine, für Glykoproteine.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich für Systeme des Energietransfers speziell der FRET-(Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET-(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich zur Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen, für Transporter, für Ionenkanäle und Rezeptoren.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrate für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Komponenten von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mirkoskopie.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechslewirkungen (DNA deoxyribonucleic acid; RNA ribonucleic acid).

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Marker oder Fusionsproteine für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.

Die sekretierte Luziferase Lu164M3 eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.

Die an Nukleinsäure oder das Peptid des gekoppelten Protein Lu164M3 eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.

Das Protein Lu164M3 eignet sich als Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".

Das Protein Lu164M3 eignet sich als für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.

Das Protein Lu164M3 eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefen Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.

Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Protein Lu164M3 speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lu164M3 auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lu164M3 zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lu164M3 zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lu164M3 zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Lu164M3 zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke, Wasserpistolen.

Die Erfindung betrifft Organismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.

Die Erfindung betrifft Organismen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid expremieren.

Die Erfindung betrifft Organismen, die ein funkionelles Äquivalente von Lu164M3 expremieren.

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides.

Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen fluoreszierende Proteine erkannt werden.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine als Marker- und Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Die Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase Lu164M3 mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und der Nukleotidsequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 1.

Erfindungsgemäß ist ein Protein Lu164M3, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.

Erfindungsgemäß ist des weiteren ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Protein kodiert, dass die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.

Bestandteil der Erfindung ist ein rekombinanter RNA oder DNA-Vektor, welcher eine Nukleinsäure wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben umfasst.

Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptides in Bakterien, eukaryontischen Zellen, oder in in vitro Translationssystemen.

Bestandteil der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenen.

Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenproteinen..

Mutanten und Derivate sekretorischer Luziferasen

In 2 ist das Alignment der Luziferasen Lu164M3 und Lu164 dargestellt. Die Luziferase Lu164M3 stellt eine deutlich kürzeres Polypeptid dar, als das wildtyp Enzym Lu164.

Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate der Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.

Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 18 und 58 der Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.

Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 und 48 der Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.

Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 und 88 der Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.

Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 33 und 68 der Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.

Klonidentifizierung mit Sekretierten LuziferasenSingle Plate Clone Selection (SPCS)

Sekretorische Luziferasen, wie die erfindungsgemäßen Luziferasen, eignen sich als Reportergen zur Identifizierung von Zelllinien mit rekombinanten Genen. Hierzu werden stabile Reportergenzelllinien mit einer sekretorischen Luziferase wie z. B. Lu164M3 oder Lu164 hergestellt. Die Luziferaseexpression kann über Promotoren mit responsive Elementen reguliert werden. Durch Detektion der intrazellulären cAMP-Konzentration können CRE-Elemente (cAMP responsive element CRE) verwendet werden. Mit Hilfe einer solchen Zelllinie kann die Veränderung der cAMP-Konzentration durch die Modulation eines rekombinanten oder endogenen Zielgens (Targets) bestimmt werden. Zur Identifizierung von Zelllinien, die z. B. ein Gs gekoppelten G-Protein gekoppelten Rezeptor (GPCR) rekombinant expremieren, wird die oben beschriebene Zelllinie mit der cDNA des zu expremierenden GPCRs transfiziert. Die transfizierten Zellen werden anschließend auf Mikrotiterplatten (z. B. 384 oder 1536 Loch Platten) ausgesät und die transfizierten Zellen selektioniert. Sind ausreichend Zellen gewachen, wird der GPCR durch Zugabe des Agonisten aktiviert, was bei einem Gs-gekoppelten Rezeptor zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP Konzentration führt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg führt zu einer erhöhten Reportergenxpression. Bei sekretorischen Luziferasen kann deren enzymatische Aktivität direkt durch Zugabe des Substrates (bei Lu164M3 und Lu164 ist dies Coelenterazine) und anschließender Biolumineszenzmessung bestimmt werden, ohne die Zellen zu lysieren. Nach der Messung kann das Medium-Substratgemisch abgenommen und die darunterliegenden Zellen entnommen werden. Die entnommen Zellen stehen dann zur weiteren Kultivierung, Anzucht und Messung zur Verfügung. Bei herkömmlichen Systemen, die intrazelluläre Reportergen wie z. B. die Firefly Luziferse, verwenden, ist eine Dublizierung oder Multiplizierung der Aussaatplatte vor der Messung notwendig, da die Messung die Zellen zerstört und der Zugriff auf eine Kopieplatte notwendig wird. Hierbei können Dublikationsfehler auftreten, die mit der SPCS Methode vermeidbar sind. Die SPCS Methode ermöglicht 1. Verwendung einer deutlich nierigeren Anzahl an Mikrotiterplatten durch das fehlen der Dublikations- oder Multiplikationsschrittes, 2. Zeitersparnis durch das Fehlen des Dublikations- bzw. Multiplikationsschrittes mit der anschließenden Wachstumsphase, 3. direkte kinetische Auswertung einzelner Klone, 4. Materialersparnis, 5. direktes picken des gemessenen Klones in der bestehenden Wachstumsphase und Klonzusammensetzung.

In 5 ist das Ergebnis einer Klonidentifizierung mit Hilfe der SPCS-methode dargestellt. Als sekretierte Luziferase wurde Lu164 im Vektor pASM verwendet. Als Zielgen des zu identifizierenden Klons wurde ein Gs gekoppelter G-Protein gekoppelter Rezeptor im Vektor pcDNA3 verwendet. Durch die gewählte Darstellung kann der Induktionsfaktor für jeden Klon zu dem gewählten Zeitpunkt direkt bestimmt und der entsprechende Klon aus dem gleichen Loch isoliert werden. Durch die Festlegung z. B. des Messzeitpunktes, des Agonisten, der Kulturbedingungen oder der Messsysteme können Parameter späterer Messverfahren bei der Identifizierung der rekombinanten Klone mit einbezogen werden.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lu164M3 bei der Identifizierung Zellklonen von nach der SPCS-Methode.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der sekretierten Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 bei der Identifizierung von Zellklonen nach der SPCS-Methode.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen bei der Identifizierung von Zellklonen nach der SPCS-Methode.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen bei der Identifizierung Zellklonen von nach der SPCS-Methode.

Die Erfindung betrifft de Verwendung von biolumineszenten oder nicht biolumineszenten Reportergenn bei der Identifizierung von Klonen nach der SPCS-Methode.

Multiplex-Reaktionen mit sekretorsichen Luziferasen

Die Verwendung mehrerer Messverfahren in einem experimentellen Ansatz, ermöglicht die gekoppelte Messung verschiedenener Parameter oder pharmakologischer Zielgene. In zellbasierten Ansätzen können hierzu verschiederen Reportersysteme kombiniert werden. Die sekretierten Luziferase Lu164M3, sowie die sekretierten Luziferasen aus Metridia longa, können hierbei mit verschiedenen intrazellulären und sekretierten Reporter kombiniert werden. Die Kombination aus sekrertierten und intrazellulären Reportergenn wird im Folgenden beispielhaft vorgestellt. In einem zellbasierten Ansatz wurden die sekretierte Luziferase Lu164 mit der intrazellulären Luziferase Firefly kombiniert. Hierzu wurden die Luziferasen in Vektoren kloniert, die cAMP-abhängig die Expression der Luziferasen reguliert (pASM – vektoren). Beide Vektoren wurden in unabhängigen CHO Zelllinien transfiziert und die Zelllinien stabil kultiviert. Zur Durchführung einer Multiplex-Messung wurden beide Zelllinien auf Mikrotiterplatten kokultiviert und anschliessend mit Forskolin stimmuliert. Forskolin führt durch die Aktivierung der Adenylatzyklase zu einem Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration, die in beiden Zelllinien zur Expression der jeweiligen Luziferase führt. Zur Messung wurde die Mikrotiterplatte in ein Biolumineszenzmeßgerät eingebracht, das die Zugabe von Flüssigkeiten innerhalb des Messgerätes ermöglicht (schematische Darstellung in 6 und 7).

Nach der Zugabe des Substrates der sekrertierten Luziferase (hier Coelenterazine), wurde die Messung gestartet. Die Biolumineszenz wurde für ein Zeitinterval von 60 Sekunden gemessen. Anschließend erfolgte die Zugabe des zweiten Luziferasesubstrates (hier Firefly Luziferin) in Kombination mit einem Detergenz (hier Triton) zum Aufschluß der Zellen. Durch die Zugabe von Triton wird die Biolumineszenzreaktion der sekretierten Luziferase gestoppt und Lumineszenz auf das Hintergrundniveau abgesengt. Die hiervon unbeeinflusste Biolumineszenzreaktion der Firefly Luziferase kann anschließend gemessen werden. Die gesamte Messzeit betrug unter den vorliegenden Bedingungen 150 Sekunden. Dieses Verfahren kann sowohl mit Lu164M3, den sekretorischen Luziferasen von Metridia longa, oder anderen sekretorischen Luziferasen oder Reportergenn durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lu164M3 in Multiplex-Ansätzen.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 in Multiplex-Ansätzen.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen in Multiplex-Ansätzen.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in Multiplex-Ansätzen.

Nukleotid- und Aminosäuresequenzen

SEQ ID NO: 1 (Lu164M3 – Nukleotidsequenz)

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von: SEQ ID NO: 2 (Lu164M3 – Aminosäuresequenz)SEQ ID NO: 3 (Lu164 – Nukleotidsequenz – kodierend)

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von: SEQ ID NO: 4 (Lu164 – Aminosäuresequenz)

Beschreibung der Figuren

1: Die 1 zeigt die Vektorkarte des Konstruktes pcDNA3-Lu164M3.

2: Die 2 zeigt ein Alignment Lu164M3 mit Lu164 auf Aminosäureebene.

3: Die Figur zeigt das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von Lu164M3 bei einer konstanten Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an Lu164M3 durch Verdünnung des Zellüberstandes. X-Achse Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units RLU). Legende Angabe und Zuordnung des Verdünnungsfaktor (ausgehend vom unverdünnten Überstand).

4: Die Figur zeigt das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von Lu164 bei einer konstanten Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an Lu164 durch Verdünnung des Zellüberstandes. X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units RLU). Legende: Angabe und Zuordnung des Verdünnungsfaktor (ausgehend vom unverdünnten Überstand).

5: Die Figur zeigt die Verwendung der sekretorischen Luziferasen zur Identifizierung von Klonen nach dem System SPCS. X-Achse
Klonnummer (clone) in logarithmischer Darstellung. Y1 (linke Y-Achse)
relative Lichteinheiten (relative light units RLU). Y2 (rechte Y-Achse)
Induktionsfaktor zwischen der Biolumineszenzreaktion mit und ohne Agonisten des Zielgens. Als Reportergen wurde die sekretierte Luziferase Lu164 verwendet

6: Die Figur zeigt den schematischen Ablauf eines zellbasierenden Multiplex-Ansatzes unter Verwendung einer sekretorischen Luziferase in Kombination mit einer nicht-sekretorsichen Luziferase.

7: Die Abbildung zeigt das Ergebnis eines zellbasierten Multiplex-Ansatzes unter Verwendung einer sekretorischen Luziferase in Kombination mit einer nicht-sekretorsichen Luziferase anhand der Kinetiken der verschiedenen Messabschnitte. Angegeben sind die relative Lichteinheiten (relative light units: RLU, X-Achsen) pro Zeitintervall (Y-Achsen: Zeit in Sekunden).

Bei der Messung handelt es sich um einen Messvorgang von insgesamt 150 Sekunden

  • A. Kinetik nach Zugabe von Coelenterazine (Reaktion der sekretorischen Luziferase);
  • B. Kinetik nach der Zugabe von Triton + Firefly Luziferin; C. Kinetik der Firefly Luziferase

Reaktion.

Beispiele Beispiel 1Herstellung und Verwendung der Konstrukte

Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech zur konstitutiven Expression verwendet. Zur Detektion von Veränderungen der intrazellulären cAMP Konzentration, wurde die cDNA von Lu164 in den Vektor pASM kloniert. Der Vektor pASM enthält cAMP responsive Elemente (CRE), die die Promotoraktivität in Abhängigkeit von der cAMP Konzentration reguliert. Das Derivat des Vektors wurde als pASM-Lu164 bezeichnet. Das Derivat des Vektors pcDNA3 wurde als pcDNA3-Lu164M3 bzw. pcDNA3-Lu164M3 bezeichnet. Die Klonierungen erfolgte unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden. Die Vektoren pcDNA3-Lu164, pcDNA3-Lu164M3 und pASM-Lu164 wurden zur Expression von Lu164M3 und Lu164 in eukaryotischen Systemen verwendet.

Die 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-Lu164M3.

Beispiel 2Eukaryotische Expression

Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-Lu164M3, pcDNA3-Lu164 und pcDNA3 (ohne cDNA Insertion) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F12 Medium inkubiert. Die Messung der Biolumineszenz erfolge nach Substratzugabe mit einem Imaging-System. Die Messung verdünnter Überstaände erfolgte in Puffer A (pH 7,4) mit der Zusammensetzung 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM Hepes, 1 mM MgCl2 × 6H2O und 5 mM NaHCO3

Zur Herstellung stabiler Zelllinien wurden die transfizierten Zellen mit 2 mg/ml Geneticin selektioniert und die Biolumineszenzaktivität der Klone bzw. Überstände bestimmt.

Beispiel 3Sequenzvergleich

Um die Sequenzen der sekretierten Luziferasen vergleichen und darstellen zu können, wurde ein Alignment der Aminosäuresequenzen durchgeführt. Die 2 zeigt das Alignment der sekretierten Luziferasen auf Aminosäureebene.

Literatur/PatenteWO 0242470 A1

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

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